ES2280115T3

ES2280115T3 - Composiciones inmunologicas para modular la miostatina en sujetos vertebrados.

Info

Publication number: ES2280115T3
Application number: ES99904660T
Authority: ES
Inventors: Christopher A. Barker; Mohamad Morsey
Original assignee: MetaMorphix International Inc
Current assignee: MetaMorphix International Inc
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2007-09-01
Anticipated expiration: 2019-02-19
Also published as: DE69934970T2; BR9907995A; DE69934970D1; US20030065137A1; ATE419353T1; CY1108074T1; DK1770162T3; EP1056845B1; EP1056845A1; PT1056845E; CY1108889T1; AU2507399A; DE69940230D1; IL137831A0; PT1770162E; CA2323607C; CA2323607A1; CA2687533C; AU765014B2; EP1770162A1

Abstract

Inmunoconjugado de miostatina que comprende un multímero de miostatina que comprende una molécula según la fórmula general (MP-X-MP)y, en la que MP es un péptido de miostatina, en el que cada uno de dichos péptidos de miostatina comprende independientemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) los aminoácidos 3 - 15 de la SEQ ID NO: 6; b) los aminoácidos 3 - 17 de la SEQ ID NO: 8; c) los aminoácidos 3 - 16 de la SEQ ID NO: 10; d) los aminoácidos 3 - 22 de la SEQ ID NO: 16; e) los aminoácidos 3 - 19 de la SEQ ID NO: 18; f) los aminoácidos 3 - 18 de la SEQ ID NO: 20, y; g) los aminoácidos 3 - 18 de la SEQ ID NO: 22; X se selecciona del grupo que consiste en un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácidos, y [MP]n, en la que n es superior o igual a 1, e y es superior o igual a 1; y en el que dicho multímero de miostatina se une a un polipéptido de leucotoxina.

Description

Composiciones inmunológicas para modular la miostatina en sujetos vertebrados.

Campo técnico

Se describen composiciones para aumentar la síntesis muscular y tratar enfermedades en sujetos vertebrados.

Más particularmente, se describen composiciones inmunológicas para reducir la actividad de la miostatina en sujetos vertebrados.

Antecedentes de la invención

Los productores de ganado han utilizado tradicionalmente programas de reproducción para seleccionar animales que dan cantidades máximas de proteínas con rendimientos aceptables tal como se mide por la eficacia de la alimentación, la función reproductora y salud general. En diversas razas, se han observado reses que presentan un aumento de la masa muscular debido tanto a hipertrofia como a hiperplasia de las células musculares. La incidencia de este estado, que se denomina en lo sucesivo como musculatura doble, es más pronunciada en las reses azul belga. La masa muscular se aumenta en aproximadamente el 20% con una disminución de la masa grasa y la masa ósea en estos animales (Shahin y Berg, Can. J. Anim. Sci. (1985) 65: 279-293). Además, las reses azul belga utilizan la alimentación eficazmente y dan lugar a un porcentaje superior de cortes de carne deseables (Casas et al., J. Anim. Sci. (1997) 75 (Sup 1): 149). La musculatura doble en las reses azul belga es hereditaria y se piensa que es recesiva, ya que los heterocigotos pueden ser normales o tener sólo un pequeño aumento de la masa muscular.

A pesar de las ventajas de este estado, las reses de musculatura doble a menudo tienen características indeseables. Por ejemplo, debido a que a los terneros son generalmente un 10-38% más pesados de lo normal, son frecuentes las distocias, que requieren partos con cesáreas. Los animales también presentan una reproducción anómala debido a los aparatos reproductores poco desarrollados y tienen otras anomalías anatómicas tales como macroglosia. Otras razas de reses, tales como la piamontesa del norte de Italia, tienen diversos grados de musculatura doble y además presentan muchas de estas características indeseables.

La característica de musculatura doble identificada en algunas razas de cabeza de ganado se han indicado ahora para las mutaciones en el gen de miostatina (Grobet et al., Nature Genetics (1997) 17: 71-74; Kambadur et al., Genome Research (1997) 7: 910-915; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 12457-12461). Esta mutación parece dar como resultado principalmente un aumento en el número de células musculares (hiperplasia) en lugar de un aumento en el tamaño de las fibras musculares individuales (hipertrofia). Un estado denominado en lo sucesivo como hipertrofia muscular se ha identificado además en la raza Pietrain de cerdos. Este estado no se relaciona con el gen de miostatina y se ha identificado como una mutación en un gen responsable para el transporte de calcio.

McPherron et al., Nature (1997) 387: 83-90, han identificado un miembro de la superfamilia de proteínas factor de crecimiento de transformación \beta (TGF-\beta) en ratones, denominado en lo sucesivo factor de crecimiento/de diferenciación 8 (GDF-8). GDF-8 actúa como un regulador negativo para el crecimiento del músculo esquelético y se expresa en músculos esqueléticos adultos y en desarrollo. Los experimentos de desactivación de genes en ratones han dado como resultado mutantes homocigóticos que son un 30% más grandes los ratones de tipo natural. Este aumento en el tamaño se debe principalmente a un aumento de la masa muscular, pesando los músculos individuales de los mutantes 2-3 veces más que los de ratones de tipo natural (McPherron et al., Nature (1997) 387: 83-90). McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 12457-12461 y Grobet et al., Nature Genetics (1997) 17: 71-74 evaluaron secuencias genómicas similares en diversas especies, incluyendo reses, y informaron que las reses de musculatura doble tenían defectos en el gen que codifica para una proteína altamente homologa a GDF-8. Esta proteína se llama ahora miostatina.

Por tanto, parece que la miostatina se produce por las células musculares y regula la proliferación y la diferenciación de los mioblastos. En las reses azul belga y piamontesa, se piensa que los defectos naturales en los genes dan como resultado una producción de una proteína anómala o una cantidad reducida de miostatina, que tienen el efecto de aumentar el crecimiento muscular.

Se ha identificado el gen de la miostatina de diversas especies de vertebrados, incluyendo ratón, rata, ser humano, babuino, reses, cerdo, oveja, pollo, pavo, y pez cebra, y se han secuenciado las proteínas (McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 12457-12461). La secuencia proteica de miostatina está altamente conservada en todas estas especias. De manera similar, se han determinado las secuencias de nucleótidos para miostatina de ratón, rata, ser humano, babuino, reses, cerdo, oveja, pollo y pavo. Véanse por ejemplo la patente de los EE.UU. número 5.827.733 para las secuencias de nucleótidos de miostatina murina y humana; la publicación internacional número WO 99/02667 para la secuencia de nucleótidos de miostatina bovina; la publicación internacional número WO 98/33887, para las secuencias de nucleótidos de miostatina de rata, ser humano, babuino, bovina, porcina, ovina, de pollo y de pavo.

La secuencia de nucleótidos del gen de miostatina predice una proteína de aproximadamente 376 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 43 kDa. Esta proteína contiene una secuencia líder de secreción y un sitio de tratamiento proteolítico que libera un péptido de 13 kDa, que contiene 9 residuos de cisteína. La miostatina clonada expresada en células de ovario de hámster chino da dos proteínas. La primera tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 52 kDa y la segunda aproximadamente 15 kDa. En condiciones no reductoras, estas proteínas parecen formar dímeros con pesos moleculares de aproximadamente 101 kDa y 25 kDa (McPherron et al., Nature (1997) 387: 83-90).

Los investigadores han propuesto la administración de genes de miostatina mutada a sujetos animales para la producción de especies transgénicas que tienen un aumento del tejido muscular. Véase por ejemplo, la publicación internacional número WO 98/33887. Sin embargo, tales enfoques plantean varios inconvenientes. Por ejemplo, debido a que el gen de miostatina se vuelve activo durante la fase embrionaria, la producción de miostatina reducida produce un desarrollo del músculo excesivo en el útero. Por tanto, animales transgénicos que incluyen genes mutados probablemente requeriría partos con cesáreas, una carga seria para los productores de animales grandes. Adicionalmente, existe una oposición pública a animales modificados mediante ingeniería genética para consumo humano y serían deseables otros métodos de producción de tales animales.

Otros enfoques incluyen el uso de antígenos de miostatina para obtener anticuerpos frente a miostatina: publicación internacional número WO9902667. Aunque se han descrito algunos epítopos de miostatina (publicación internacional número WO94/21681), existe la necesidad de proporcionar epítopos adecuados que pueden inducir un aumento de la masa muscular.

Descripción de la invención

La invención se refiere a determinadas composiciones inmunológicas para modular la actividad de miostatina endógena en sujetos vertebrados. Pueden tratarse diversos estados en vertebrados, incluyendo seres humanos y otros animales, tales como una variedad de trastornos que provocan la degeneración o desgaste del músculo. Debido a la naturaleza ubicua de la miostatina, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento encuentran su uso en una amplia variedad de sujetos vertebrados, tal como se describe más adelante.

Sorprendentemente, estos resultados se consiguen mediante técnicas inmunológicas. Se conoce bien en la técnica que la inmunización frente a moléculas endógenas, tales como la miostatina, es problemática debido a que el sistema inmunitario no reconoce tales moléculas "del propio organismo". Por tanto, se proporciona una solución a un problema que se encontraría normalmente inmunizando frente a una sustancia endógena.

Polipéptidos de miostatina de varios microorganismos se describen en las figuras 1A-1D (SEO ID NOS: 27-36).

Los péptidos de miostatina consisten en de aproximadamente 3 a aproximadamente 200 aminoácidos y se derivan de una región de miostatina seleccionada del grupo que consiste en la región de miostatina que abarca e incluye los aminoácidos de 1 a 350, aminoácidos de 1 a 275, aminoácidos de 25 a 300, aminoácidos de 50 a 325,; y aminoácidos de 75 a 350, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36).

Un péptido de miostatina puede comprender la secuencia de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO: 37), la secuencia de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 38) o la secuencia de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 39).

Un multímero de miostatina puede construirse uniendo dos o más inmunógenos de miostatina seleccionados, en el que cada uno de los inmunógenos comprende independientemente al menos 3 aminoácidos que definen al menos un epítopo de miostatina. Cada uno de los inmunógenos de miostatina seleccionados consiste independientemente en de aproximadamente 3 a aproximadamente 200 aminoácidos, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 aminoácidos, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 aminoácidos. Cada uno de los inmunógenos de miostatina seleccionados en el multímero puede comprender independientemente un péptido de miostatina seleccionado tal como se describió anteriormente. El multímero puede comprender una molécula con unidades de repetición según la fórmula general (MP-X-MP)y, en la que MP es un péptido de miostatina, X se selecciona del grupo que consiste en un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácidos, un polipéptido de leucotoxina y [MP]n, en la que n es mayor que o igual a 1, e y es mayor que o igual a 1.

Un inmunoconjugado de miostatina puede producirse uniendo al menos un péptido o multímero de miostatina, tal como se describió anteriormente, a un vehículo inmunológico.

Pueden producirse composiciones de vacuna que comprenden el péptido de miostatina, el multímero de miostatina y/o el inmunoconjugado de miostatina, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Pueden obtenerse polinucleótidos que codifican para los péptidos de miostatina, los multímeros de miostatina y los inmunoconjugados de miostatina anteriores, así como los vectores recombinantes que comprenden los polinucleótidos, las células huésped transformadas con los vectores recombinantes y métodos para producir recombinantemente los péptidos de miostatina, multímeros de miostatina e inmunoconjugados de miostatina.

La presente invención trata el problema de provocar una respuesta inmunitaria frente a un inmunógeno de miostatina en un sujeto vertebrado para reducir la actividad de miostatina endógena en el sujeto vertebrado y para conducir al menos a uno de los siguientes efectos biológicos:

(a) un aumento del peso corporal;

(b) un aumento de la masa muscular;

(c) un aumento del número de células musculares;

(d) un aumento del tamaño de las células musculares;

(e) una reducción del contenido en grasa corporal;

(f) un aumento de la resistencia muscular;

(g) un aumento de los tejidos de las glándulas mamarias;

(h) un aumento de la lactancia;

(i) un aumento del apetito o captación de alimentos; o

(j) un aumento de la duración de vida del sujeto vertebrado.

Estos son efectos deseables, útiles para tratar un trastorno que comprende la degeneración o desgaste del músculo en un sujeto vertebrado.

Estos efectos pueden conseguirse administrando polinucleótidos o composiciones de vacuna adecuadas al sujeto.

La invención proporciona una composición adecuada de este tipo, la invención proporciona un conjugado de un multímero de miostatina unido a un polipéptido de leucotoxina, en el que el multímero tiene la fórmula general (MP-X-MP)_{y}, tal como se definió anteriormente, y MP se selecciona de los aminoácidos 3 - 15, inclusive de la SEQ ID NO: 6; los aminoácidos 3 - 17, inclusive, de la SEQ ID NO: 8; los aminoácidos 3 - 16, inclusive de la SEQ ID NO: 10; los aminoácidos 3 - 22, inclusive de la SEQ ID NO: 12; los aminoácidos 3 - 25, inclusive de la SEQ ID NO: 14; los aminoácidos 3 - 22, inclusive de la SEQ ID NO: 16; los aminoácidos 3 - 18, inclusive de la SEQ ID NO: 20; y los aminoácidos 3 - 18, inclusive, de la SEQ ID NO: 22.

Las realizaciones preferidas de la presente invención se exponen en las reivindicaciones 2-16.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1D muestran una comparación de miostatina derivadas de varias especies tal como sigue: de ratón (SEQ ID NO: 27); de rata (SEQ ID NO: 28); humana (SEQ ID NO: 29); de babuino (SEQ ID NO: 30); bovina (SEQ ID NO: 31); porcina (SEQ ID NO: 32); ovina (SEQ ID NO: 33); de pollo (SEQ ID NO: 34); de pavo (SEQ ID NO: 35); y de pez cebra (SEQ ID NO: 36). Los aminoácidos se enumeran de derecha a izquierda de las secuencias.

La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 4) del péptido MYOS 1. MYOS 1 incluye el sitio de escisión proteolítica, Arg-Ser-Arg-Arg, y el extremo N-terminal de la proteína activa.

La figura 3 representa la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 6) del péptido MYOS 3.

La figura 4 representa la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de nucleótidos correspondiente (SEQ ID NO: 8) del péptido MYOS 5.

La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 10) del péptido MYOS 7.

La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 11) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 12) del péptido MYOS 9.

La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 13) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 14) del péptido MYOS 11.

La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 15) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 16) del péptido MYOS 13.

La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 17) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 18) del péptido MYOS 15.

\newpage

La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 19) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 20) del péptido MYOS 17.

La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 21) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 22) del péptido MYOS 19. MYOS 19 incluye el sitio de escisión proteolítica, Arg-Ser-Arg-Arg.

La figura 12 muestra la posición aproximada de los péptidos MYOS 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 dentro de la secuencia de miostatina.

La figura 13 muestra las secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 23) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 24) para una región activa de miostatina reconstruida que contiene tres conjuntos de ligadores de (Arg-Ser) insertados en la secuencia en las posiciones de nucleótidos 55 - 60, 139 - 144 y 241 - 246 y en el extremo C-terminal.

La figura 14 es un diagrama del plásmido pCB150, que codifica para un vehículo polipeptídico de leucotoxina y se utiliza para crear vectores de expresión de miostatina tal como se describen en los ejemplos.

Las figuras 15A-15D muestran la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 25) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 26) del polipéptido que porta leucotoxina presente en el plásmido pCB150. Se insertan repeticiones oligoméricas de miostatina en el sitio BamH1 presente en la posición nucleotídica 3334.

La figura 16A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la figura 16B muestra la secuencia de aminoácidos prevista (SEQ ID NO: 2) de una miostatina representativa para su uso con la presente invención. El sitio de escisión proteolítica se encuentra en las posiciones 263 - 266 de la figura 16B. La región activa de la miostatina del polipéptido abarca los aminoácidos 264 - 375.

La figura 17 muestra un perfil de hidrofilicidad de la proteína miostatina. El perfil se calculó utilizando una longitud de grupo promedio de seis aminoácidos. Los tres puntos más altos de hidrofilicidad se encuentran en las posiciones de aminoácidos 263 - 268, que abarcan el sitio de escisión proteolítica; las posiciones 31 - 37; y las posiciones 106 - 111.

La figura 18 muestra la cantidad de aumento de peso en los animales tratados con inmunógenos de péptido de miostatina, tal como se describe en los ejemplos.

Descripción detallada

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología de ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; la serie, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan editoriales, Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell editoriales, Blackwell Scientific Publications).

A. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretenden definir tal como se indica a continuación.

Por "inmunógeno de miostatina" se quiere decir un polipéptido derivado de una molécula de miostatina que provoca una respuesta inmunológica tal como se define a continuación. El término incluye moléculas que provocan una respuesta inmunológica sin un vehículo, adyuvante o inmunoestimulante inmunológico asociado, así como polipéptidos de miostatina que pueden convertirse en inmunogénicos, o más inmunogénicos, mediante la asociación con una molécula portadora, adyuvante o inmunoestimulante o mediante mutación de una secuencia nativa, y/o mediante incorporación dentro de una molécula que contiene múltiples unidades de repetición de al menos un epítopo de una molécula de miostatina. El término puede utilizarse para referirse a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoléculas antigénicas derivadas de miostatina.

Un inmunógeno de miostatina puede derivarse a partir de cualquiera de las diversas secuencias de miostatina conocidas, incluyendo sin limitación, polipéptidos de miostatina derivados de rata, ser humano, babuino, reses, cerdo, oveja, pollo, pavo y pez cebra (véase, McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 12457-12461). La secuencia proteínica de miostatina está altamente conservada a través de estas especies (véase las figuras 1A-1D).

Tal como se usa en el presente documento un "inmunógeno de miostatina" también incluye una molécula derivada de una secuencia de miostatina nativa, así como polipéptidos de miostatina producidos de manera recombinante o sintetizados químicamente, incluyendo la secuencia de referencia de miostatina de longitud completa, así como péptidos de miostatina que siguen siendo inmunogénicos, tal como se describe a continuación.

Un "péptido de miostatina" es un inmunógeno de miostatina, tal como se describe en el presente documento, que incluye menos de la longitud completa de la molécula de miostatina de referencia en cuestión y que incluye al menos un epítopo tal como se define a continuación. Por tanto, una composición de vacuna que comprende un péptido de miostatina incluiría una parte de la molécula de longitud completa pero no la molécula completa de miostatina en cuestión.

Por "multímero de miostatina" se quiere decir una molécula que tiene más de una copia de un inmunógeno de miostatina seleccionado, péptido o epítopo de miostatina, o múltiples repeticiones en tándem de un inmunógeno de miostatina, péptido o epítopo de miostatina seleccionados. El multímero de miostatina de la invención corresponde a una molécula tal como se describe en la reivindicación 1.

Por tanto, Y puede definir de 1-40, o más unidades de repetición, más preferiblemente, de 1-30 unidades de repetición y lo más preferiblemente, de 1-20 unidades de repetición.

Adicionalmente, si los péptidos de miostatina se unen o bien químicamente o bien de manera recombinante a un vehículo, los péptidos de miostatina puede unirse al extremo 5' y al extremo 3', o pueden flanquear el vehículo en cuestión. Además, el multímero de miostatina puede situarse en sitios internos del vehículo. Los multímeros de miostatina se tratan en más detalle a continuación.

Una "respuesta inmunológica" frente a un inmunógeno o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos y/o celular frente al inmunógeno o vacuna de interés. Normalmente, una respuesta de este tipo incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos; la producción de anticuerpos, células B, células T cooperadoras, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta, dirigidas específicamente hacia un inmunógeno o inmunógenos incluidos en una composición o vacuna de interés. Puede detectarse una respuesta inmunológica utilizando cualquiera de los diversos ensayos bien conocidos en la técnica, tales como inmunoensayos convencionales y ensayos de neutralización, que incluyen inmunotransferencia de tipo Western, inmunotransferencia puntual y ensayos de inmunoafinidad. La presencia de respuestas inmunológicas mediadas por células puede determinarse utilizando ensayos de células citotóxicas CTL, bien conocidas en la técnica, tal como el ensayo descrito en Erickson et al. J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; y Doe et al. Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376.

Un epítopo se refiere a cualquier parte o región de una molécula con la capacidad o potencial para provocar, y combinarse con un anticuerpo específico frente a miostatina. Para los fines de la presente invención, un epítopo polipeptídico normalmente incluye de al menos aproximadamente 3 aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 5 aminoácidos, y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos a 20-30 o más aminoácidos, de la molécula de referencia. No hay limite superior crítico para la longitud del fragmento, que puede comprender casi la longitud completa de una secuencia proteica, o incluso una proteína de fusión que comprende dos o más epítopos de una proteína en cuestión.

Los epítopos en las moléculas polipeptídicas pueden identificarse utilizando cualquiera de las diversas técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, pueden determinarse epítopos lineales por ejemplo, sintetizando simultáneamente un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a las partes de la molécula proteica, y haciendo reaccionar a los péptidos con los anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en la técnica y se describen en por ejemplo, la patente de los EE.UU. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. Similarmente, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos tal como por ejemplo cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo Epitope Mapping Protocols, véase anteriormente. También pueden usarse los programas informáticos que formulan las escalas de hidropatía de la secuencia de aminoácidos de la proteína, que utilizan las propiedades hidrófobas e hidrófilas de cada uno de los 20 aminoácidos, tal como se describe en por ejemplo, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132; y Hopp y Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 3824-3828, para determinar las partes antigénicas de una molécula dada. Por ejemplo, la técnica de Hopp y Wood asigna a cada aminoácido un valor de hidrofilicidad numérico y después promedios de manera repetitiva de estos valores a lo largo de la cadena peptídica. Los puntos de hidrofilicidades promedio locales más altas son indicadores de las partes antigénicas de la molécula.

Por "vehículo inmunológico" se quiere decir cualquier molécula que cuando está asociada con un inmunógeno de miostatina de interés, confiere inmunogenicidad a esa molécula, o potencia la inmunogenicidad de la molécula. Ejemplos de vehículos adecuados incluyen macromoléculas metabolizadas lentamente, grandes tales como: proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, perlas de celulosa y similares; aminoácidos poliméricos tales como poli(ácido glutámico), polilisina, y similares, copolímeros de aminoácidos, partículas de virus inactivas; toxinas bacterianas tales como toxoides de difteria, tetánico, de cólera, moléculas de leucotoxina y similares. Los vehículos se describen en más detalle a continuación.

Un inmunógeno de miostatina se "une" a una molécula portadora específica cuando el inmunógeno se acopla químicamente a, o se asocia con el vehículo, o cuando el inmunógeno se expresa a partir de una molécula de ADN quimérica que codifica para el inmunógeno y el vehículo de interés.

Un "inmunoconjugado" es un inmunógeno de miostatina tal como un péptido o multímero de miostatina que se une a una molécula portadora, tal como se definió anteriormente.

El término "polipéptido de leucotoxina" o "polipéptido de LKT" propone un polipéptido que se deriva de una proteína que pertenece a la familia de moléculas caracterizada por la secuencia de aminoácidos consenso carboxi-terminal Gly-Gly-X-Gly-X-Asp (Highlander et al. (1989) DNA 8: 15-28), en la que X es Lys, Asp, Val o Asn. Tales proteínas incluyen, entre otras, leucotoxinas derivadas de P. haemolytica y Actinobacillus pleuropneumoniae, así como alfa hemolisina de E. coli (Strathdee et al. (1987) Infect. Immun. 55: 3233-3236; Lo (1990) Can. J. Vet. Res. 54: S33-S35; Welch (1991) Mol. Microbiol. 5: 521-528). Esta familia de toxinas se conoce como la familia "RTX" de toxinas (Lo (1990) Can. J. Vet. Res. 54: S33-S35). Además, el término "polipéptido de leucotoxina" se refiere a un polipéptido de leucotoxina que se sintetiza químicamente, se aísla de un microorganismo que expresa la misma, o se produce de manera recombinante. Además, el término propone una proteína inmunogénica que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos contiguos encontrada en la molécula de leucotoxina nativa particular. Por tanto, el término incluye ambas secuencias de longitud completa y parcial, así como análogos. Aunque las leucotoxinas de longitud completa nativas presentan actividad citotóxica, el término "leucotoxina" además propone moléculas que siguen siendo inmunogénicas aún faltando el carácter citotóxico de leucotoxinas nativas. Se conocen las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos para varias leucotoxinas. Véase por ejemplo las patentes de los EE.UU. números 4.957.739 y 5.055.400; Lo et al. (1985) Infect. Immun. 50: 667-67; Lo et al. (1987) Infect. Immun. 55: 1987-1996; Strathdee et al. (1987) Infect. Immun. 55: 3233-3236; Highlander et al. (1989) DNA 8: 15-28; y Welch (1991) Mol. Microbiol. 5: 521-528. En realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan quimeras de leucotoxinas que tienen una secuencia polipeptídica de leucotoxina seleccionada que confiere inmunogenicidad mejorada a uno o varios multímeros de miostatina unidos a
ello.

Ejemplos particulares de polipéptidos de leucotoxina inmunogénica para su uso en la presente invención son moléculas de leucotoxina truncadas descritas en las patentes de los EE.UU. números 5.476.657 y 5.837.268. Estas moléculas truncadas incluyen LKT 352, LKT 111 y LKT 114. LKT 352 se deriva del gen lktA presente en el plásmido pAA352 (número de registro ATCC 68283). La secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de este gen se describen en la patente de los EE.UU. número 5.476.657. El gen codifica una leucotoxina truncada, que tiene 941 aminoácidos y un peso molecular estimado de aproximadamente 99 kDa. LKT11 es un polipéptido de leucotoxina derivado del gen lktA presente en el plásmido pCB111 (número de registro ATCC 69748). La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos correspondiente se describen en la patente de los EE.UU. 5.837.268. El gen codifica para una versión acortada de leucotoxina que se desarrolló a partir del gen de leucotoxina recombinante presente en el plásmido pAA352 (número de registro ATCC 68283) eliminando un fragmento de ADN interno de aproximadamente 1300 pb de longitud. El polipéptido LKT 111 tiene un peso molecular estimado de 52 kDa (comparado con el polipéptido LKT 352 de 99 kDa), pero conserva partes de los epítopos de células T que contienen el extremo N-terminal de LKT 352 que son necesarios para la suficiente inmunogenicidad de células T, y partes de los sitios de restricción convenientes que contienen el extremo C-terminal de LKT 352 para su uso en la producción de proteínas de fusión para su uso en la presente invención. LKT 114 se deriva del gen presente en el plásmido pAA114 (descrito en la patente de los EE.UU. número 5.837.268) y se muestra en las figuras 15A-15D en el presente documento. LKT 114 difiere de LKT 111 en virtud de una deleción de aminoácidos adicional de la parte interna de la molécula.

"Adyuvantes" se refieren a agentes que actúan de manera no específica para aumentar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno particular, reduciendo por tanto la cantidad de antígeno necesaria en cualquier vacuna administrada, y/o la frecuencia de inyección necesaria con el fin de generar una respuesta inmunitaria adecuada frente al antígeno de interés. Véase por ejemplo, A.C. Allison J. Reticuloendothel. Soc. (1979) 26: 619-630.

Proteínas, polipéptidos o péptidos "nativos" son proteínas, polipéptidos o péptidos aislados de la fuente en la que se producen las proteínas naturalmente. Polipéptidos "recombinantes" se refieren a polipéptidos producidos mediante técnicas de ADN recombinante; es decir a partir de células transformada mediante un constructo de ADN exógeno que codifica para el polipéptido deseado. Polipéptidos "sintéticos" son aquellos preparados mediante síntesis químicas.

Por "polinucleótido" se quiere decir una secuencia de nucleótidos incluyendo, pero sin limitación, ARN tal como ARNm, ADNc, secuencias de ADN genómico e incluso secuencias de ADN sintético. Además el término capta secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN.

Un "vector" es una replicón, tal como un plásmido, fago o cósmico, al que puede estar unido otro segmento de ADN de tal modo como para ocasionar la replicación del segmento unido.

Una "secuencia codificante de ADN" o una "secuencia que codifica" una proteína particular, es una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vitro o in vivo, cuando se coloca bajo el control de elementos reguladores apropiados. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' y un codón de parada de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (por ejemplo mamíferos), e incluso secuencias de ADN sintético. Se localizará normalmente una secuencia de terminación en 3' con respecto a la secuencia codificante.

El término "elementos de control" de ADN se refiere colectivamente a promotores, sitios de unión a ribosoma, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en el sentido 5', potenciadores, y similares, que se proporcionan colectivamente para la transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula huésped. No todas estas secuencias de control necesitan estar siempre presentes en un vector recombinante, siempre que el gen deseado pueda transcribirse y traducirse.

"Operablemente unido" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes así descritos se configuran como para realizar sus funciones habituales. Por tanto, los elementos de control operablemente unidos a una secuencia codificante pueden efectuar la expresión de la secuencia codificante. Los elementos de control no necesitan ser contiguos con la secuencia codificante, siempre que actúen para dirigir la expresión de los mismos. Por tanto, por ejemplo, las secuencias transcritas aún no traducidas que intervienen pueden estar presentes entre un promotor y la secuencia codificante y el promotor puede considerarse todavía "operablemente unido" a la secuencia codificante.

Un elemento de control, tal como un promotor, "dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando la ARN polimerasa unirá el promotor y transcribirá la secuencia codificante en ARNm, que entonces se traduce en el polipéptido codificado por la secuencia codificante.

Una "célula huésped" es una célula que se ha transformado, o puede transformarse, por una molécula de ácido nucleico exógeno.

Una célula se ha "transformado" por ADN exógeno cuando tal ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. El ADN exógeno puede o no estar integrado (unido de manera covalente) en el ADN cromosómico que forma el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno puede mantenerse en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable es una en la que el ADN exógeno se vuelve integrado en el cromosoma de tal modo que las células hijas lo heredan a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra mediante la capacidad de la célula eucariota de estabilizar líneas celulares o clones que se comprenden de poblaciones de células hijas que contienen ADN exógeno.

El término "derivado de", tal como se usa en el presente documento indica una fuente u origen real o teórico de la molécula o inmunógeno sujeto. Por ejemplo, un inmunógeno que se "deriva de" una molécula de miostatina particular tendrá similitud de secuencia próxima con una parte relevante de la molécula de referencia. Por tanto, un inmunógeno que se "deriva de" una molécula de miostatina particular puede incluir toda la secuencia de miostatina de tipo natural, o puede alterarse mediante inserción, deleción o sustitución de residuos de aminoácidos, siempre que la secuencia derivada se proporcione para un inmunógeno que corresponda a la molécula de miostatina marcada. Los inmunógenos derivados de una molécula indicadora contendrán al menos un epítopo específico hacia la molécula indicada.

Por "sujeto vertebrado" se quiere decir cualquier miembro del filum cordata, incluyendo, sin limitación, mamíferos tales como reses, ovejas, cerdos, cabras, caballos y seres humanos; animales domésticos tales como perros, gatos; y aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como gallos y gallinas incluyendo pollos, pavos y otras aves gallináceas; y peces. El término no indica una edad o género particular. Por tanto, pretenden cubrirse tanto los animales machos y hembras adultos como los recién nacidos, así como los fetos y huevos.

Las composiciones servirán para "reducir la actividad de miostatina". Esta reducción de la actividad puede ser una reducción de los niveles circulantes de miostatina normalmente encontrados en un sujeto vertebrado, o una reducción de los niveles circulantes de miostatina en sujetos con enfermedades que dan como resultado niveles circulantes elevados de miostatina. Una reducción de la actividad de miostatina resulta generalmente de la inactivación de la miostatina circulante mediante anticuerpos generados frente al inmunógeno peptídico de miostatina administrado al sujeto en cuestión. Sin embargo, la reducción de la actividad no se limita a un modo de inactivación en particular, pero puede ser el resultado de una disminución de la producción o secreción de miostatina dentro de la circulación. Sin querer restringirse a una teoría en particular, los inmunógenos peptídicos de miostatina pueden provocar la producción de anticuerpos que eviten que la miostatina se escinda para liberar la parte activa de la proteína, o evitar que la proteína se una a su receptor. Alternativamente, los anticuerpos pueden eliminar la miostatina secretada de la circulación u otros líquidos corporales antes de que alcance el sitio activo.

La reducción de la actividad de la miostatina puede manifestarse de diversas maneras. Por ejemplo, la reducción de la actividad de miostatina puede dar como resultado un aumento del peso molecular, una masa muscular potenciada, resistencia muscular aumentada, una alteración de la razón de músculo con respecto a grasa, un aumento de la masa muscular libre de grasa, un aumento del tamaño y/o número de células musculares, una reducción del contenido en grasa corporal, un aumento de la duración de vida en una vertebrado normal o enfermo, un aumento del apetito o captación de alimentos, una mejora de la calidad de vida, y en mamíferos, un aumento de los tejidos de las glándulas mamarias y lactancia.

Por "que mejora la masa muscular" se quiere decir que el animal al que se administra una composición de la presente invención presenta un aumento en el tamaño de las células musculares (hipertrofia) o en el número de células musculares (hiperplasia). El aumento puede ser en las fibras musculares de tipo 1 y/o de tipo 2. El término "músculo" tal como se usa en el presente documento pretende captar los tipos de tejidos análogos en peces. Los métodos para determinar la "masa muscular potenciada" se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el contenido en músculo puede medirse antes y tras la administración de una péptido de miostatina de la invención usando técnicas habituales, tales como peso bajo agua (véase por ejemplo Bhasin et al. New Eng. J. Med. (1996) 335: 1-7) y absorciometría de rayos x de energía dual (véase por ejemplo, Bhasin et al. Mol. Endocrinol. (1998) 83: 3155-3162). Un aumento del tamaño del músculo puede ser evidente por un aumento de peso de al menos aproximadamente el 5-10%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 10-20% o más.

B. Métodos generales

Se han desarrollado las composiciones inmunológicas para modular la producción de miostatina endógena. Aunque la miostatina generalmente se reconoce como "propia del cuerpo" y por tanto no inmunogénica, las composiciones descritas en el presente documento proporcionan sorprendentemente un medio para producir una respuesta inmunológica en un sujeto inmunizado con las mismas.

En consecuencia, la invención se refiere a multímeros de miostatina inmunogénicos tal como se describe en las reivindicaciones 1-16 para su uso para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado. Puesto que la proteína miostatina se secreta, la inmunización activa o pasiva de animales jóvenes sirve para aumentar la masa muscular pero evita los problemas asociados con otras anomalías que se producen a partir de los cambios inducidos durante el periodo embrionario. Por tanto, por ejemplo, los programas de vacunación pueden iniciarse poco después del nacimiento para conseguir la hipertrofia y/o la hiperplasia. Alternativamente, la inmunización puede realizarse en una fase tardía del desarrollo (por ejemplo, reses en corrales reservados) para mejorar el rendimiento de proteína muscular. Adicionalmente, la inmunización puede realizarse de manera prenatal o a animales en el útero, para conseguir los resultados deseados.

Las composiciones y técnicas descritas en el presente documento pueden aplicarse igualmente a vertebrados que ponen huevos, tales como aves y peces. A este respecto, McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 12457-12461, han identificado genes de miostatina en aves y peces que son altamente homólogos a los genes de miostatina de mamíferos. Por tanto, el gen se conserva entre las especies y se piensa que cumple una función similar en todas las especies. Por tanto, por ejemplo, se inmunizan las aves y peces que ponen huevos para crear altos títulos de anticuerpos en el plasma materno. Puesto que los anticuerpos se transfieren al saco de la yema del huevo, estos anticuerpos pueden reducir la miostatina durante el periodo embrionario y provocar el aumento deseado del tamaño y/o del número de células musculares. Alternativamente, la inmunización puede realizarse in ovo.

Además, las vacunas descritas en el presente documento encontrarán su uso para el tratamiento de varios trastornos en seres humanos y otros animales que provocan o bien principalmente o bien por casualidad el desgaste muscular. Para el caso de parapléjicos y tetrapléjicos la atrofia muscular es un asunto grave. La ausencia de resistencia muscular es a menudo una limitación seria para un estilo de vida activa, saludable en sujetos ancianos. Adicionalmente, el desgaste muscular puede deberse a diversos cánceres, anorexia, caquexia, SIDA, y trastornos similares. Adicionalmente, el desgaste muscular puede deberse a diversos cánceres, anorexia, caquexia, SIDA y trastornos similares. Además, el desgaste muscular es un síntoma de diversas distrofias, tales como distrofia muscular pseudohipertrófica, distrofias facioescapulohumeral, distrofias musculares de las cinturas de las extremidades, distrofias musculares distales, miopatías oculares, y distrofias miotónicas. Estas enfermedades incluyen los trastornos conocidos como la distrofia muscular de tipo Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de tipo Duchenne, distrofia muscular de Landouzy, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de Erb, distrofia muscular de tipo Fukuyama, distrofia muscular de Gowers, distrofia muscular neuroaxonal infantil, distrofia muscular de Leyden-Möblus, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular pelvifemoral, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular escapulohumeral y distrofia muscular de Simmerlin.

La inmunización puede conseguirse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, el uso de vacunas peptídicas o inmunización de ADN. Tales métodos se describen en detalle a continuación.

1. Péptidos de miostatina

Los péptidos de miostatina generalmente incluyen de al menos aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 3 a aproximadamente 50 aminoácidos, incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 30 aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 aminoácidos, y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 25 aminoácidos o de 5 a aproximadamente 15 aminoácidos, de una proteína miostatina seleccionada.

Las proteínas de miostatina representativas de 10 especies de las que pueden derivarse los péptidos de miostatina, se muestran en las figuras 1A-1D. También se muestra en la figura 16B la secuencia de aminoácidos de miostatina bovina. El péptido incluirá al menos un epítopo que confiere inmunogenicidad a la molécula de miostatina. Ejemplos de péptidos de miostatina incluyen, pero no se limitan a, la región que abarca los aminoácidos 1 a 350, inclusive de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); la región de miostatina que abarca los aminoácidos 1 a 275, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); la región de miostatina que abarca los aminoácidos 25 a 300, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); la región de miostatina que abarca los aminoácidos 50 a 325, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); la región de miostatina que abarca los aminoácidos 75 a 350, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); la región de miostatina que abarca los aminoácidos 45 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); 100 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); la región de miostatina que abarca los aminoácidos 235 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS: 27-36); o de cualquier región que se piensa que incluye un epítopo de miostatina que puede provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se administra el péptido.

Los péptidos de miostatina pueden derivarse de una de las tres regiones de miostatina que presentan los puntos más altos de hidrofilicidad en el perfil de hidrofilicidad mostrado en la figura 17. Los tres puntos más latos de hidrofilicidad se encuentran en las posiciones de aminoácidos 263-268, que abarca el sitio de escisión proteolítica; las posiciones 31-37; y las posiciones 106-111. Por tanto, el péptido de miostatina comprende la secuencia de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO: 37) que abarca el sitio de escisión proteolítica; la secuencia de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 38) que corresponde a los aminoácidos 31-37 de miostatina; o la secuencia de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 39) que corresponde a los aminoácidos 106 a 111 de
miostatina.

Además se describe un péptido de miostatina que tiene una identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente el 75% con respecto a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 3-18, inclusive SEQ ID NO: 4 (MYOS 1, mostrados en la figura 2); los aminoácidos 3-15, inclusive de SEQ ID NO: 6 (MYOS 3, mostrados en la figura 3); los aminoácidos 3-17, inclusive, de SEQ ID NO: 8 (MYOS 5, mostrados en la figura 4); los aminoácidos 3-16, inclusive de SEQ ID NO: 10 (MYOS 7, mostrados en la figura 5); aminoácidos 3-22, inclusive de SEQ ID NO: 12 (MYOS 9, mostrados en la figura 6); los aminoácidos 3-25, inclusive de SEQ ID NO: 14 (MYOS 11, mostrados en la figura 7); los aminoácidos 3-22, inclusive de SEQ ID NO: 16 (MYOS 13, mostrados en la figura 8); los aminoácidos 3-19, inclusive, de SEQ ID NO: 18 (MYOS 15, mostrados en la figura 9); los aminoácidos 3-18, inclusive, de SEQ ID NO: 20 (MYOS 17, mostrados en la figura 10); o los aminoácidos 3-18, inclusive de SEQ ID NO: 22 (MYOS 19, mostrados en la figura 11). Las posiciones de los diversos péptidos MYOS anteriores en relación con miostatina de cadena completa se muestran en la figura 12. Algunos de los últimos péptidos forman la base de la invención.

El péptido de miostatina puede unirse a una molécula portadora inmunológica con el fin de formar un inmunoconjugado de miostatina, tal como se describe mas adelante.

Según realizaciones preferidas de la presente invención, el péptido de miostatina es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-16.

2. Inmunoconjugados de miostatina

Tal como se explicó anteriormente, miostatina es una molécula endógena y, como tal, puede desearse aumentar adicionalmente la inmunogenicidad del péptido de miostatina (o multímeros descritos a continuación) uniéndolo a un vehículo para formar un inmunoconjugado de miostatina. Esto es especialmente necesario si el inmunógeno de miostatina se administra a las mismas especies a partir de las cuales se deriva.

Vehículos adecuados son generalmente polipéptidos que incluyen regiones antigénicas de una proteína derivada de un material infeccioso tal como una proteína de superficie vírica, o una secuencia de péptidos portadores. Estos vehículos sirven para obtener la actividad de las células cooperadoras T estimuladas no específicamente y para ayudar directamente a un inmunógeno e interés frente a células que presentan antígenos (APC "antigen presenting cells") para la elaboración y presentación en la superficie celular en asociación con moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC "major histocompatibility complex").

Diversos sistemas portadores se han desarrollado para este propósito. Por ejemplo, haptenos peptídicos pequeños se acoplan a menudo a vehículos de proteínas tales como hemocianina de la lapa californiana (Bittle et al. (1982) Nature 298: 30-33), toxinas bacterianas tales como toxoide tetánico (Muller et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 569-573), ovalbúmina, polipéptidos de leucotoxina, y mioglobina de esperma de ballena, para producir una respuesta inmunitaria. Estas reacciones de acoplamiento dan como resultado normalmente la incorporación de varios moles de hapteno peptídico por mol de proteína portadora.

Otros vehículos adecuados incluyen polipéptidos VP6 de rotavirus, o fragmentos funcionales de los mismos, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.071.651. Además, es útil un producto de fusión de una proteína vírica y uno o varios epítopos de miostatina, productos de fusión que se obtienen mediante los métodos descritos en la patente de los EE.UU. número 4.722.840. Todavía otros vehículos adecuados incluyen células, tales como linfocitos, ya que la presentación de esta forma simula el modo natural de presentación en el sujeto, que aumenta el estado inmunizado. Alternativamente, los inmunógenos de miostatina pueden acoplarse a eritrocitos, preferiblemente los eritrocitos del propio sujeto. Los métodos de acoplamiento de péptidos a proteínas o células se conocen por los expertos en la técnica.

Los sistemas de administración pueden utilizar además vehículos particulados. Por ejemplo, se han usado partículas formadas previamente como plataformas en las que pueden acoplarse e incorporarse los inmunógenos. Además, los sistemas basados en proteosomas (Lowell et al. (1988) Science 240: 800-802) y los complejos de estimulación inmunitaria (Morein et al. (1984) Nature 308: 457-460) se conocen en la técnica.

Los sistemas portadores que usan proteínas quiméricas producidas de manera recombinante que se autoensamblan dentro de partículas también pueden usarse. Por ejemplo, el retrotrasposón de levaduras, Ty, codifica para una serie de proteínas que se ensamblan dentro de las partículas de tipo virus (Ty-VLPs; Kingsman et al. (1988) Vaccines 6: 304-306). Por tanto, un gen o fragmento del mismo, que codifica para el inmunógeno de miostatina puede insertarse dentro del gen TyA y expresarse en levaduras como una proteína de fusión. La proteína de fusión mantiene la capacidad de autoensamblarse en partículas de tamaño uniforme. Otros sistemas portadores de tipo virus útiles se basan en HBsAg (antígeno específico de la hepatitis B) (Valenzuela et al. (1985) Biol Technol. 3: 323-326; la patente de los EE.UU. número 4.722.840; Delpeyroux et al. (1986) Science 233: 472-475), antígeno central de la hepatitis B (Clarke et al. (1988) Vaccines 88 (Ed. H. Ginsberg, et al.) pág. 127-131), virus de la polio (Burke et al. (1988) Nature 332: 81-82), y el virus del mosaico del tabaco (Haynes et al. (1986) Biol Technol. 4: 637-641).

Los vehículos especialmente preferidos incluyen albúmina sérica, hemocianina de la lapa californiana, ovoalbúmina, mioglobina de esperma de ballena, moléculas de leucotoxina tal como se describieron anteriormente, y otras proteínas muy conocidas por los expertos en la técnica. Un polipéptido de leucotoxina particular, para su uso como un vehículo en el presente documento, se muestra en las figuras 15A-15D. Miostatina se inserta de manera conveniente dentro del sitio BamH1 presente en la posición nucleotídica 3334, tal como se describe más adelante en los ejemplos.

Los vehículos de proteínas pueden usarse en su forma nativa o puede modificarse su contenido en grupos funcionales mediante, por ejemplo, succinilación de residuos de lisina o reacción con Cys-tiolactona. También puede incorporarse un grupo sulfhidrilo dentro del vehículo (o antígeno), mediante, por ejemplo, la reacción de funciones amino con 2-iminotiolano o el éster de N-hidroxisuccinimida del propionato de 3-(4-ditiopiridilo). Vehículos adecuados también pueden modificarse para incorporar brazos espaciadores (tales como hexametilendiamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) para la unión de inmunógenos peptídicos.

Los vehículos pueden conjugarse físicamente al inmunógeno de miostatina de interés, usando reacciones de acoplamiento habituales. Alternativamente, pueden preparase las moléculas quiméricas de manera recombinante tal como mediante la fusión de un gen que codifica para un vehículo de polipéptido adecuado a una o varias copias de un gen, o fragmento del mismo, que codifica para un inmunógeno de miostatina seleccionado.

Los inmunógenos de miostatina también pueden administrarse por medio de un virus portador que expresa los mismos. Los virus portadores que encuentran uso en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, virus vaccinia y otros virus de la viruela, adenovirus y virus del herpes. A modo de ejemplo, los recombinantes del virus vaccinia que expresan las proteínas, pueden construirse tal como sigue. En primer lugar se inserta el ADN que codifica para una proteína particular dentro de un vector apropiado de tal modo que está adyacente a un promotor de vaccinia y las secuencias de ADN de vaccinia flanqueantes, tal como la secuencia que codifica para la timidinacinasa (TK, timidina cinasa). Este vector se usa entonces para transfectar las células que se infectan simultáneamente con vaccinia. La recombinación de homólogos sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica para el inmunógeno deseado dentro del genoma vírico. El recombinante de TK que resulta puede seleccionarse cultivando las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y tomando placas víricas resistentes a ello.

3. Multímeros de miostatina

La inmunogenicidad de los inmunógenos de miostatina también puede aumentarse significativamente produciendo formas inmunogénicas de las moléculas que comprenden múltiples copias de epítopos seleccionados. De esta forma, la miostatina endógena puede convertirse en un autoantígeno eficaz.

En consecuencia, se describen composiciones de vacunas que contienen multímeros de miostatina en cualquier forma peptídica o de ácido nucleico para su administración a un sujeto. El multímero de miostatina tendrá más de una copia de los inmunógenos, péptidos o epítopos seleccionados de miostatina, tal como se describió anteriormente, o múltiples repeticiones en tándem de un inmunógeno, péptido o epítopo seleccionado de miostatina. Por tanto, los multímeros de miostatina pueden comprender repeticiones o bien múltiples o bien en tándem de las secuencias de miostatina seleccionadas, repeticiones múltiples o en tándem de los epítopos de miostatina seleccionadas, o cualquier combinación concebible de los mismos. Los epítopos de miostatina pueden identificarse utilizando técnicas, tal como se describió en detalle anteriormente.

Por ejemplo, el multímero de miostatina puede corresponder a una molécula con unidades de repetición de la fórmula general (MP-X-MP)y en la que MP es un péptido de miostatina, X se selecciona del grupo que consiste en un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácidos y [MP]_{n}, en la que n es mayor o igual a 1, y es mayor o igual a 1, y además en la que "MP" puede comprender cualquier péptido de MP. Por tanto, el multímero de miostatina puede contener desde 2 - 64 o más péptidos de miostatina, más preferiblemente 2 - 32 ó 2 - 16 péptidos de miostatina. En la presente invención, MP se selecciona de los aminoácidos 3 - 15, inclusive de la SEQ ID NO: 6; los aminoácidos 3 - 17, inclusive, de la SEQ ID NO: 8; los aminoácidos 3 - 16, inclusive de la SEQ ID NO: 10; los aminoácidos 3 - 22, inclusive de la SEQ ID NO: 12; los aminoácidos 3 - 25, inclusive de la SEQ ID NO: 14; los aminoácidos 3 - 22, inclusive de la SEQ ID NO: 16; los aminoácidos 3 - 18, inclusive de la SEQ ID NO: 20; y los aminoácidos 3 - 18, inclusive, de la SEQ ID NO: 22. Si los inmunógenos de miostatina se unen, o bien química o bien recombinantemente a un vehículo, los péptidos de miostatina pueden unirse o bien al extremo 5', al extremo 3' o bien pueden flanquear al vehículo en cuestión. Además, el multímero de miostatina puede ubicarse en sitios internos en el vehículo.

Un vehículo particular para su uso con los multímeros de miostatina es un polipéptido leucotoxina, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, las repeticiones oligoméricas de miostatina pueden insertarse convenientemente en el sitio BamH1 presente en la posición nucleotídica 3334 del polipéptido leucotoxina mostrado en las figuras 15A-15D.

Tal como se explicó anteriormente, pueden estar presentes secuencias espaciadoras entre los restos de miostatina. Por ejemplo, los dímeros de Arg-Ser y Gly-Ser están presentes en los péptidos MYOS presentados como ejemplo en el presente documento, que proporcionan elementos espaciadores entre las secuencias de repetición de los péptidos de miostatina. La colocación estratégica de las diversas secuencias espaciadoras entre los inmunógenos de miostatina seleccionados puede utilizarse para conferir un aumento de la inmunogenicidad en los constructos objetivo. En consecuencia, una secuencia espaciadora seleccionada puede codificar para una amplia variedad de restos, tales como un ligador de un único aminoácido o una secuencia de dos o varios aminoácidos. Los grupos espaciadores seleccionados pueden proporcionar preferiblemente sitios de escisión de enzimas, de manera que el multímero expresado pueda procesarse mediante enzimas proteolíticas in vivo (mediante APC, o similares) para dar varios péptidos, cada uno de los cuales contiene al menos un epítopo de célula T derivado de la parte del vehículo, y que preferiblemente están unidos a una secuencia de péptido de miostatina sustancialmente completa.

Los grupos espaciadores pueden construirse de manera que la región de unión entre los restos de miostatina seleccionados comprende una secuencia claramente extraña para el sujeto inmunizado, confiriendo así inmunogenicidad aumentada a los péptidos de miostatina asociados. Adicionalmente, las secuencias espaciadoras pueden construirse de manera que se proporcione antigenicidad de células T, tales como aquellas secuencias que codifican para secuencias peptídicas anfipáticas y/o de \alpha-hélice, que generalmente se reconocen en la técnica como que proporcionan epítopos de células T cooperadoras inmunogénicas. La elección de los epítopos particulares de las células T que van a proporcionarse mediante tales secuencias espaciadoras puede variar dependiendo de la especie de vertebrados particular que va a vacunarse. Aunque se utilizan como ejemplo partes particulares de miostatina que incluyen secuencias espaciadoras, también se describe uno o más multímeros de miostatina que comprenden secuencias de miostatina directamente adyacentes (sin la intervención de las secuencias espaciadoras).

La secuencia multimérica de miostatina así producida produce un antígeno de miostatina altamente inmunogénico.

Los péptidos, inmunoconjugados y multímeros de miostatina, pueden producirse utilizando los métodos descritos más adelante, y utilizarse para la inmunización basada en ácidos nucleicos, métodos de inmunización basados en proteínas o producción de anticuerpos.

4. Métodos de inmunización basados en ácidos nucleicos

Generalmente, las vacunas basadas en ácidos nucleicos incluirán regiones relevantes que codifican para un inmunógeno de miostatina, con secuencias control adecuadas y, opcionalmente, secuencias de nucleótidos terapéuticas auxiliares. Las moléculas de ácido nucleico se preparan en la forma de vectores que incluyen los elementos necesarios para la transcripción y la traducción directas en una célula receptora.

Con el fin de aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto inmunizado, las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse junto con sustancias auxiliares, tales como agentes farmacológicos, adyuvantes, o en conjunción con la administración de vectores que codifican para modificadores de la respuesta biológica, tales como citocinas y similares. Otras sustancias auxiliares incluyen, pero sin limitarse a, sustancias que incrementan el aumento de peso, la masa muscular o la resistencia muscular, tales como hormonas de crecimiento, agentes que potencian el crecimiento, antagonistas beta, agentes de partición y antibióticos.

Las secuencias de nucleótidos seleccionadas para su uso pueden derivarse de fuentes conocidas, por ejemplo, aislando las mismas de células o tejido que contienen un gen o secuencia de nucleótidos deseados utilizando técnicas convencionales, o utilizando técnicas recombinantes o sintéticas.

Una vez que se han preparado o aislado las secuencias codificantes para los inmunógenos de miostatina, tales secuencias pueden clonarse en cualquier vector o replicón adecuado. Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es cuestión de elección. La unión a otras secuencias, por ejemplo, moléculas auxiliares o moléculas vehículo, se realiza utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Una o más partes de inmunógeno de miostatina de la quimera pueden unirse en 5' y/o 3' a una secuencia auxiliar o molécula vehículo deseadas. Alternativamente, una o más partes de inmunógeno de miostatina pueden ubicarse en sitios internos en la molécula vehículo, o tales partes pueden colocarse en ambas ubicaciones terminales e internas en la quimera.

Alternativamente, las secuencias de ADN que codifican para los inmunógenos de miostatina de interés, unidos opcionalmente a moléculas vehículo, pueden prepararse sintéticamente, en lugar de clonarse. Las secuencias de ADN pueden diseñarse con codones apropiados para la secuencia particular. La secuencia completa del inmunógeno se ensambla entonces a partir de oligonucleótidos solapantes preparados mediante métodos convencionales y se ensambla en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; y Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

La secuencia codificante se sitúa entonces bajo el control de elementos de control adecuados para su expresión en el tejido huésped adecuado in vivo. La elección de los elementos de control dependerá del sujeto que se va a tratar y del tipo de preparación utilizado. Por tanto, si se va a utilizar la maquinaria endógena de transcripción y traducción del sujeto para expresar los inmunógenos, se utilizarán los elementos de control compatibles con el sujeto particular. A este respecto, se conocen en la técnica varios promotores para su uso en los sistemas de mamíferos. Por ejemplo, los promotores típicos para la expresión en células de mamífero incluyen el promotor temprano de SV40, un promotor de CMV tal como el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor LTR del virus del cáncer de mama en el ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus herpes simple, entre otros. Otros promotores no virales, tales como un promotor derivado del gen de la metalotioneína murino, también encontrarán uso para la expresión en mamíferos.

Normalmente, también estarán presentes secuencias de poliadenilación y de la terminación de la transcripción, situadas en 3' con respecto al codón de terminación de la traducción. Preferiblemente, también está presente una secuencia para la optimización de la iniciación de la traducción, situada en 5' con respecto a la secuencia codificante. Ejemplos de señales de poliadenilación/terminador de la transcripción incluyen las derivadas de SV40, tal como se describe en Sambrook et al., citado anteriormente, así como la secuencia de terminación de la hormona de crecimiento bovina. También pueden diseñarse en los constructos, intrones que contienen sitios de corte y empalme del donante y del aceptor.

También pueden utilizarse elementos potenciadores en el presente documento para aumentar los niveles de expresión de los constructos. Ejemplos incluyen el potenciador génico temprano de SV40 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), el potenciador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) y elementos derivados del CMV humano (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), tal como los elementos incluidos en la secuencia del intrón A del CMV.

Una vez preparadas, las composiciones de vacuna de ácido nucleico pueden administrarse al sujeto utilizando métodos conocidos. A este respecto, se han descrito varias técnicas para la inmunización con ADN que codifican para antígenos, Véanse, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.589.466 concedida a Felgner et al.; Tang et al. (1992) Nature 358:152; Davis et al. (1993) Hum. Molec. Genet. 2: 1847; Ulmer et al. (1993) Science 258:1745; Wang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156; Eisenbraun et al. (1993) DNA Cell Biol. 12:791; Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:12476; Fuller et al. (1994) AIDS Res. Human Retrovir. 10:1433; y Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519. También pueden utilizarse métodos generales para administrar moléculas de ácido nucleico a las células in vitro, para la posterior reintroducción en el huésped, tal como la transferencia de genes mediada por liposomas. Véanse, por ejemplo, Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206-209; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278-281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. 39:219A; y Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288. Por tanto, las composiciones de vacuna de ácido nucleico pueden administrarse en cualquier forma líquida o particulada utilizando una variedad de técnicas conocidas. Las composiciones de vacuna típicas se describen más completamente más adelante.

5. Métodos de inmunización basados en proteínas

Las composiciones de vacuna basadas en proteínas también pueden producirse utilizando una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. En particular, los inmunógenos de miostatina pueden aislarse directamente a partir de fuentes naturales, utilizando técnicas de purificación convencionales. Alternativamente, los inmunógenos pueden producirse de manera recombinante utilizando los sistemas de expresión de ácidos nucleicos descritos anteriormente, y pueden purificarse utilizando técnicas conocidas. Los inmunógenos peptídicos también pueden sintetizarse, basándose en las secuencias de aminoácidos descritas o en secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de ADN de una molécula de interés, utilizando síntesis polimérica química, tal como síntesis de péptidos en fase sólida. Tales métodos se conocen por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), págs. 3-254, para las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, editores., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, citado anteriormente, Vol. 1, para la síntesis de solución clásica.

Los inmunógenos peptídicos también pueden producirse clonando las secuencias codificantes en cualquier vector o replicón de expresión adecuado. Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de elección. Ejemplos de vectores de ADN recombinante para clonación y de las células huésped a las que pueden transformar, incluyen el bacteriofago lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram-negativas), pGV1106 (bacterias gram-negativas), pLAFR1 (bacterias gram-negativas), pME290 (bacterias gram-negativas distintas a E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y el virus del papiloma bovino (células de mamífero). Véanse, generalmente, DNA Cloning: Vols. I y II, citado anteriormente; Sambrook et al., citado anteriormente; B. Perbal, citado anteriormente.

Por ejemplo, se ha determinado la secuencia codificante para miostatina de diversas especies de vertebrados, incluyendo ratón, rata, ser humano, babuino, reses, cerdo, oveja, pollo y pavo. Véanse, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.827.733 y número de registro U84OC5 de NCBI para la secuencia nucleotídica de la miostatina murina; la patente de los EE.UU. número 5.827.733, la publicación internacional número WO 98/33887, y número de registro AFO19627 de NCBI para la secuencia nucleotídica de la miostatina humana; la figura 16A en el presente documento, así como las publicaciones internacionales números WO 99/02667 y WO 98/33887, y número de registro AFO19620 de NCBI para la secuencia nucleotídica de la miostatina bovina; número de registro AFO19626 de NCBI para la secuencia nucleotídica de la miostatina del pez cebra; la publicación internacional número WO 98/33887, para las secuencias nucleotídicas de la miostatina de rata (véase también el número de registro AFO19624 de NCBI), babuino (véase también el número de registro AFO19619 de NCBI), porcina (véase también el número de registro AFO19623 de NCBI), ovina (véase también el número de registro AFO19622 de NCBI), pollo (véase también el número de registro AFO19621 de NCBI) y pavo (véase también el número de registro AFO19625 de NCBI). La secuencia de miostatina está altamente conservada en todas estas especies.

Partes de estas secuencias que codifican para péptidos de miostatina deseados, y si se desea, una secuencia que codifica para una proteína portadora, pueden clonarse, aislarse y ligarse juntas utilizando técnicas recombinantes generalmente conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente.

El gen puede colocarse bajo el control de un promotor, sitio de unión a ribosoma (para la expresión en bacterias) y, opcionalmente, un operador, de manera que la secuencia de ADN de interés se transcribe en ARN mediante un transformante adecuado. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o una secuencia líder. Los inmunógenos peptídicos pueden expresarse utilizando, por ejemplo, el promotor tac de E. coli o la secuencia señal y el promotor del gen de la proteína A (spa). Las secuencias líder pueden eliminarse por el huésped bacteriano en el tratamiento tras la traducción. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. números 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397. También pueden estar presentes secuencias auxiliares, tales como las descritas anteriormente.

Además de las secuencias control, puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las secuencias inmunogénicas con respecto al crecimiento de la célula huésped. Las secuencias reguladoras se conocen por los expertos en la técnica, y ejemplos incluyen aquellas que hacen que la expresión de un gen se active o se desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.

Un vector de expresión se construye de manera que la secuencia codificante particular se sitúa en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo la colocación y la orientación de la secuencia codificante con respecto a las secuencias control de manera que la secuencia codificante se transcribe bajo el "control" de las secuencias control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias control transcribe la secuencia codificante). Puede ser deseable la modificación de las secuencias que codifican para el inmunógeno de miostatina particular para lograr este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de manera que pueda unirse a las secuencias control en la orientación apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura. Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos anteriormente. Alternativamente, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias control y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos, puede ser deseable añadir secuencias que producen la secreción del inmunógeno desde el organismo huésped, con la escisión posterior de la señal de secreción. También puede ser deseable producir mutantes o un análogo del inmunógeno. Los mutantes o análogos pueden prepararse mediante la deleción de una parte de la secuencia que codifica para el inmunógeno, o si está presente, una parte de la secuencia que codifica para la molécula portadora deseada, mediante la inserción de una secuencia, y/o mediante la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y similares, se conocen bien por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; DNA Cloning, Vols. I y II, citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, citado anteriormente; Kunkel, T.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. BioTechniques (1987) 5:786; Zoller y Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468; Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA (1982) 79:6409.

Los inmunógenos de miostatina pueden expresarse en una amplia variedad de sistemas, incluyendo sistemas de expresión de insecto, mamífero, bacterianos, virales y de levadura, todos ellos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sistemas de expresión en células de insecto, tales como los sistemas de expresión en baculovirus, se conocen bien por los expertos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Boletín número 1555 (1987). Los materiales y los métodos para los sistemas de expresión en baculovirus/células de insecto están disponibles comercialmente en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). De manera similar, los sistemas de expresión en células bacterianas y de mamífero se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente. Los sistemas de expresión en levaduras también se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, Londres.

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También se conocen varias células huésped apropiadas para su uso con los sistemas anteriores. Por ejemplo, las líneas de células de mamífero se conocen en la técnica e incluyen líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) (ATCC), tal como, pero sin limitarse a, las células de ovario del hámster chino (CHO), las células HeLa, las células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón bovino Madin-Darby ("MDBK"), así como otras. De manera similar, huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp., encontrarán uso con los presentes constructos de expresión. Los huéspedes de levadura útiles en la presente invención incluyen, entro otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Células de insecto para su uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otras, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionados, los inmunógenos de miostatina se producen haciendo crecer células huésped transformadas mediante un vector de expresión descrito anteriormente en las condiciones en las que se expresa el inmunógeno. El inmunógeno expresado se aísla entonces de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta el inmunógeno en el medio de crecimiento, el producto puede purificarse directamente del medio. Si no se secreta, puede aislarse de los lisados celulares. La selección de las condiciones de crecimiento y los métodos de recuperación apropiados están dentro del conocimiento del experto en la técnica.

Una vez obtenidos, los péptidos de miostatina, con o sin el vehículo asociado, pueden formularse en composiciones de vacuna, tales como las composiciones de vacuna descritas más adelante adicionalmente, con el fin de provocar la producción de anticuerpos en un vertebrado objetivo.

6. Producción de anticuerpos

Los péptidos de miostatina también pueden utilizarse para generar anticuerpos para su uso en métodos de inmunización pasiva o para fines de inmunopurificación o inmunodiagnóstico. Normalmente, los péptidos útiles para producir anticuerpos habitualmente serán de al menos aproximadamente 3 - 5 aminoácidos de longitud, preferiblemente de 7 - 10 aminoácidos de longitud, y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente de 10 a 15 aminoácidos de longitud o más.

Los anticuerpos frente a los inmunógenos objetivo incluyen preparaciones de anticuerpos policlonales y monoclonales, antisueros monoespecíficos, así como preparaciones que incluyen anticuerpos híbridos, anticuerpos modificados, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos F(ab), fragmentos Fv, anticuerpos de dominio único, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y fragmentos funcionales de los mismos, que conservan especificidad para la molécula objetivo en cuestión. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir regiones variables, o fragmentos de regiones variables, que conservan la especificidad para la molécula en cuestión. El resto del anticuerpo puede derivarse de la especie en la que se utilizará el anticuerpo. Por tanto, si el anticuerpo va a utilizarse en un ser humano, el anticuerpo puede "humanizarse" con el fin de reducir la inmunogenicidad aunque conserve su actividad. Para una descripción de anticuerpos quiméricos, véanse, por ejemplo, Winter, G. y Milstein, C. (1991) Nature 349:293-299; Jones, P.T. et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann, L. et al. (1988) 332:323-327; y Carter, P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289. Tales anticuerpos quiméricos pueden contener, no sólo los sitios de combinación para la molécula objetivo, sino también los sitios de unión para otras proteínas. De esta forma, pueden generarse reactivos bifuncionales con especificidad seleccionada como diana tanto para antígenos externos como internos.

Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado, (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con el antígeno deseado, o su fragmento, o un antígeno mutado, tal como se describió anteriormente. Antes de la inmunización, puede ser deseable aumentar adicionalmente la inmunogenicidad de un inmunógeno particular. Esto puede llevarse a cabo de cualquiera de varias formas conocidas por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, la inmunización para la producción de anticuerpos se realiza generalmente mezclando o emulsionando la proteína en un excipiente adecuado, tal como solución salina, preferiblemente en un adyuvante, tal como el adyuvante completo de Freund, o en cualquiera de los adyuvantes descritos más adelante, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Al animal se le administra generalmente una inmunización de refuerzo 2 - 6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferiblemente utilizando el adyuvante incompleto de Freund, o similar. Los anticuerpos también pueden generarse mediante inmunización in vitro, utilizando métodos conocidos en la técnica. Entonces se obtienen antisueros policlonales a partir del animal inmunizado y tratado según procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370. Si se utiliza suero que contiene anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad, utilizando procedimientos conocidos.

Los anticuerpos monoclonales generalmente se preparan utilizando el método de Kohler y Milstein, Nature (1975) 256: 495-96, o una modificación del mismo. Normalmente, un ratón o rata se inmuniza tal como se describió anteriormente. Sin embargo, en lugar de sangrar al animal para extraer el suero, se extirpa el bazo (y opcionalmente varios nódulos linfáticos grandes) y se disocia en células individuales. Si se desea, las células del bazo pueden seleccionarse (tras la eliminación de las células no específicamente adherentes) mediante la aplicación de una suspensión celular a una placa o pocillo recubierto con el antígeno proteico. Las células B, que expresan inmunoglobulinas unidas a la membrana específicas del antígeno, se unirán a la placa, y no se enjuagarán con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células de bazo disociadas, se introducen entonces para unirse con las células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se siembran en placa mediante dilución limitante, y se someten a ensayo para determinar la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de inmunización (y que no se unen a los antígenos no relacionados). Los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales seleccionados se cultivan entonces o bien in vitro (por ejemplo, botellas de cultivo tisular o reactores de fibra huecos), o in vivo (como ascitis en ratones). Véanse, por ejemplo, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); véanse también las patentes de los EE.UU. números 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500, 4.491.632; y 4.493.890. Pueden seleccionarse paneles de anticuerpos monoclonales producidos frente al péptido de miostatina de interés, o fragmentos de los mismos, para diversas propiedades; es decir, para isótopo, epítopo, afinidad, etc.

También pueden obtenerse fragmentos funcionales de los anticuerpos frente al péptido de miostatina de interés y pueden producirse escindiendo una región constante, no responsable de la unión al antígeno, de la molécula de anticuerpo, utilizando por ejemplo, pepsina, para producir fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos contendrán dos sitios de unión al antígeno, pero carecerán de una parte de la región constante de cada una de las cadenas pesadas. De manera similar, si se desea, pueden producirse fragmentos Fab, que comprenden un sitio de unión al antígeno único, por ejemplo, mediante la digestión de anticuerpos policlonales o monoclonales con papaína. También pueden producirse los fragmentos funcionales, incluyendo sólo las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, utilizando técnicas convencionales. Estos fragmentos se conocen como Fv.

También pueden producirse anticuerpos quiméricos o humanizados utilizando los inmunógenos objetivo. Estos anticuerpos pueden diseñarse para minimizar las reacciones inmunológicas no deseadas atribuibles a regiones variables "framework" específicas de especie y constantes heterólogas presentes normalmente en anticuerpos monoclonales y policlonales. Por ejemplo, si los anticuerpos van a utilizarse en sujetos humanos, pueden crearse anticuerpos quiméricos sustituyendo las regiones constantes no humanas, en las cadenas pesadas o en las ligeras, o ambas, por las regiones constantes humanas, utilizando técnicas conocidas generalmente en la técnica. Véanse, por ejemplo, Winter, G. y Milstein, C. (1991) Nature 349:293-299; Jones, P.T. et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann, L. et al. (1988) 332:323-327; y Carter, P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289.

7. Composiciones de vacuna

Una vez que se producen las moléculas de miostatina de interés, se formulan en composiciones de vacuna para su administración en un sujeto vertebrado. La molécula de miostatina relevante se administra sola, o se mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Vehículos adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, o adyuvantes que mejoran la eficacia de la vacuna. Los adyuvantes adecuados se describen adicionalmente más adelante. Los métodos reales para preparar tales formas farmacéuticas se conocen, o serán evidentes, para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18ª edición, 1990. La composición o la formulación que va a administrarse contendrá una cantidad del inmunógeno de miostatina adecuada para lograr el estado inmunizado deseado en el sujeto que se está tratando.

Tal como se explicó anteriormente, las composiciones de vacuna pueden incluir adyuvantes para aumentar adicionalmente la inmunogenicidad del inmunógeno de miostatina. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, emulsionantes, muramil dipéptidos, avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas y otras sustancias conocidas en la técnica. Por ejemplo, los compuestos que pueden servir como emulsionantes en el presente documento incluyen agentes emulsionantes naturales y sintéticos, así como compuestos aniónicos, catiónicos y no iónicos. Entre los compuestos sintéticos, los agentes emulsionantes aniónicos incluyen, por ejemplo, las sales de potasio, sodio y amonio de ácido láurico y oleico, las sales de calcio, magnesio y aluminio de ácidos grasos (es decir, jabones metálicos), y sulfonatos orgánicos tales como laurilsulfato de sodio. Los agentes catiónicos sintéticos incluyen, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio, mientras que los agentes no iónicos sintéticos se ejemplifican mediante los ésteres de glicerilo (por ejemplo, monoestearato de glicerilo), ésteres y éteres de polioxietilenglicol, y los ésteres de ácidos grasos de sorbitano (por ejemplo, monopalmitato de sorbitano) y sus derivados de polioxietileno (por ejemplo, polyoxyethylene monopalmitato de sorbitano). Los agentes emulsionantes naturales incluyen goma arábiga, gelatina, lecitina y colesterol.

Otros adyuvantes adecuados pueden formarse con componentes de aceite, tales como un aceite individual, una mezcla de aceites, una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua. El aceite puede ser un aceite mineral, un aceite vegetal, o un aceite animal. Se prefiere el aceite mineral, o las emulsiones de aceite en agua en las que el componente de aceite es aceite mineral. A este respecto, un "aceite mineral" se define en el presente documento como una mezcla de hidrocarburos líquidos obtenidos a partir de vaselina mediante una técnica de destilación; el término es sinónimo de "parafina líquida", "vaselina líquida" y "aceite mineral blanco". El término también pretende incluir "aceite mineral ligero", es decir, un aceite que se obtiene de manera similar mediante la destilación de la vaselina, pero que tiene un peso específico ligeramente inferior que el aceite mineral blanco. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente. Un componente de aceite particularmente preferido es la emulsión de aceite en agua vendida con el nombre comercial de EMULSIGEN PLUS™ (que comprende un aceite mineral ligero, así como formalina al 0,05% y gentamicina 30 mcg/mL como conservantes) disponible de MVP Laboratories, Ralston, Nebraska, o el adyuvante VSA-3 que es una forma modificada del adyuvante EMULSIGEN PLUS™. Aceites animales adecuados incluyen, por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceite de halibut, aceite de róbalo, aceite de reloj anaranjado y aceite de hígado de tiburón, estando todos ellos disponibles comercialmente. Aceites vegetales adecuados incluyen, sin limitación, aceite de canola, aceite de almendras, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de soja, y similares.

Alternativamente, pueden utilizarse como adyuvantes varias bases nitrogenadas alifáticas con las formulaciones de vacuna. Por ejemplo, adyuvantes inmunológicos conocidos incluyen aminas, compuestos de amonio cuaternario, guanidinas, benzamidinas y tiouronios (Gall, D. (1966) Immunology 11:369-386). Los compuestos específicos incluyen bromuro de diemtildioctadecilamonio (DDA) (disponible de Kodak) y N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietilo)propanodiamina ("avridina"). Se ha descrito el uso de DDA como adyuvante inmunológico; véanse, por ejemplo, los boletines químicos del laboratorio de Kodak 56(1):1-5 (1986); Adv. Drug Deliv. Rev. 5(3):163-187 (1990); J. Controlled Release 7:123-132 (1988); Clin. Exp. Immunol. 78(2):256-262 (1989); J. Immunol. Methods 97 (2):159-164 (1987); Immunology 58(2):245-250 (1986); y Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 68(3):201-208 (1982). La avridina también es un adyuvante bien conocido. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.310.550 concedida a Wolff, III et al., que describe el uso de N,N-superior alquil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propanodiaminas en general, y la avridina en particular, como adyuvantes de vacunas. La patente de los EE.UU. número 5.151.267 concedida a Babiuk, y Babiuk et al. (1986) Virology 159:57-66, también se refieren al uso de la avridina como un adyuvante de vacuna.

Las composiciones de vacuna también pueden incluir sustancias auxiliares, tales como agentes farmacológicos, citocinas u otros modificadores de la respuesta biológica. Otras sustancias auxiliares incluyen, pero sin limitarse a, sustancias para incrementar el aumento de peso, la masa muscular o la resistencia muscular, tales como hormonas de crecimiento, agentes que potencian el crecimiento, antagonistas beta, agentes de partición y antibióticos.

Las vacunas se preparan normalmente como compuestos inyectables, o bien como disoluciones líquidas o bien como suspensiones, o bien como formas sólidas que son adecuadas para la disolución o la suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o el principio activo puede encapsularse en vehículos de liposomas u otros vehículos particulados utilizados.

Las composiciones de vacuna también pueden prepararse en forma sólida. Por ejemplo, las formulaciones particuladas sólidas pueden prepararse para su administración a partir de dispositivos inyectores sin aguja comercialmente disponibles. Alternativamente, pueden proporcionarse implantes de dosificación sólidos para su implantación en un sujeto. También pueden utilizarse formulaciones de liberación controlada o sostenida y se elaboran incorporando los inmunógenos de miostatina en vehículos o excipientes, tales como liposomas, polímeros impermeables no reabsorbibles, tales como copolímeros de acetato de etilenvinilo y copolímeros de Hytrel®, polímeros hinchables tales como hidrogeles, o polímeros reabsorbibles tales como el colágeno y ciertos poliácidos o poliésteres, tales como los utilizados para realizar suturas reabsorbibles.

Además, los inmunógenos pueden formularse en composiciones de vacuna en sus formas de sal o neutra. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico y fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

La composición de vacuna se formula para que contenga una cantidad eficaz del inmunógeno de miostatina, determinándose la cantidad exacta fácilmente por un experto en la técnica, en la que la cantidad depende del animal que va a tratarse, la capacidad del sistema inmunitario del animal para sintetizar anticuerpos, y el grado de inmunoneutralización de la miostatina deseado. Las formulaciones de vacuna que incluyen de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 1 mg, más generalmente de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 200 \mug de inmunógeno por dosis de disolución inyectada, deben ser adecuadas para aumentar una respuesta inmunológica cuando se administran. Si se utiliza una quimera péptido-vehículo, la razón de inmunógeno con respecto a vehículo en la formulación de vacuna variará basándose en el inmunógeno y el vehículo particulares seleccionados para construir tales moléculas. Las dosis eficaces pueden establecerse fácilmente por un experto en la técnica a través de ensayos de rutina estableciendo curvas de respuesta a la dosis.

El sujeto se inmuniza mediante la administración de las composiciones de vacuna en al menos una dosis, y preferiblemente dos o más dosis. Además, al animal se le pueden administrar tantas dosis como se requiera para mantener un estado de inmunidad.

Puede emplearse cualquier medio de administración farmacéutica para administrar la composición de vacuna al sujeto vertebrado. Por ejemplo, jeringas con aguja convencionales, inyectores de muelle o gas (aire) comprimido (patentes de los EE.UU. números 1.605.763 concedida a Smoot; 3.788.315 concedida a Laurens; 3.853.125 concedida a Clark et al.; 4.596.556 concedida a Morrow et al.; y 5.062.830 concedida a Dunlap), inyectores de chorro de líquido (patentes de los EE.UU. números 2.754.818 concedida a Scherer; 3.330.276 concedida a Gordon; y 4.518.385 concedida a Lindmayer et al.), e inyectores de partículas (patentes de los EE.UU. números 5.149.655 concedida a McCabe et al. y 5.204.253 concedida a Sanford et al.) resultan todos apropiados para la administración de las composiciones de vacuna.

Preferiblemente, la composición de vacuna se administra por vía intramuscular, subcutánea, intravenosa, subdérmica o intradérmica, al sujeto. Si se utiliza un inyector de chorro, se expulsa un único chorro de la composición de vacuna líquida a alta presión y velocidad, por ejemplo, 1200-1400 PSI, creando así una zona abierta en la piel y penetrando hasta profundidades adecuadas para la inmunización.

Los inventores han identificado péptidos y multímeros de miostatina y conjugados de los mismos, que pueden utilizarse para obtener una respuesta inmunitaria frente a miostatina y aumentar así la masa muscular. A continuación se muestran ejemplos de las realizaciones específicas.

C. Parte experimental

Ejemplo 1

Identificación de péptidos de miostatina inmunogénicos

Se identificaron varias regiones de la molécula de miostatina bovina como potencialmente inmunogénicas basándose en análisis asistidos por ordenador de la molécula de longitud completa usando diversos programas informáticos. Un programa usado formula escalas de hidropatía de la secuencia de aminoácidos de la proteína basándose en las propiedades hidrófobas e hidrófilas de cada uno de los 20 aminoácidos. Hopp y Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 3824-3828. La figura 17 describe un perfil de hidrofilicidad calculado usando una longitud de grupo promedio de seis aminoácidos. Los tres puntos de hidrofilicidad más altos de la molécula de miostatina se encontraron en las posiciones de aminoácidos 263-268, que se extienden por el sitio de escisión proteolítica y tiene la secuencia de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEC ID Nº: 37); las posiciones 31-37 que tienen la secuencia de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEC ID Nº: 38); y las posiciones 106-111 que tienen la secuencia de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEC ID Nº: 39).

Se realizó también el análisis de la proteína usando el programa PC/Gene, versión 6.60 (Intelligenetics Inc., Ginebra, Suiza). El análisis tridimensional de la proteína miostatina se realizó usando el programa Swiss-Pdb Viewer v2.6 (http://expasy.hcuge.ch/spdbv/mainpage.html).

A partir de esta información, se diseñó y construyó una serie de oligómeros de ADN representativos con un sintetizador de ADN Beckman Oligo 1000D usando la química de fosforoamidita. Los oligómeros se denominaron MYOS 1-20. Myos 1,2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (mostrados en las figuras 2 a 11, respectivamente) incluyen partes de la cadena de ADN codificante mientras que MYOS 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 incluyen partes de la cadena complementaria. La posición de estos péptidos con referencia a la molécula de miostatina de longitud completa se muestra en la figura 12.

Los oligómeros de ADN codificaban para péptidos con de 12 a 23 aminoácidos, flanqueados por 2 ligadores de aminoácidos para la unión a una molécula portadora (véase más adelante). Estos péptidos representaban colectivamente la parte activa completa de la proteína, así como tres secciones individuales en el sentido de 5' del sitio de escisión proteolítica que libera la proteína activa.

En particular, basándose en análisis asistidos por ordenador, se seleccionaron tres porciones de la proteína activa como dianas de inmunización primaria. Se preparó la primera parte combinando el par de oligonucleótidos designados MYOS 1 y 2 y contenía el sitio de escisión proteolítica y el extremo N-terminal de la proteína activa. MYOS 1 dio la tasa antigénica determinante más alta usando el programa informático de Hoop y Woods (véase la figura 17.). El análisis tridimensional de la parte activa de miostatina mostró que el péptido MYOS 1 está expuesto sobre la superficie de la proteína y por lo tanto es probable que se observe por el sistema inmune. MYOS 1 solapa también el sitio de escisión proteolítica, que libera la parte activa de la proteína. El bloqueo de este sitio usando anticuerpos frente a ello, impide la escisión de la proteína y la liberación de la parte activa de la proteína para impedir su efecto sobre el tejido muscular.

Se seleccionaron los otros segmentos de la proteína activa (MYOS 5 y 6 y MYOS 9 y 10) debido a que parecen formar un bucle y una hélice basándose en un análisis estructural tridimensional. Esta estructura de bucle está expuesta probablemente sobre la superficie de la proteína y por lo tanto puede observarse por el sistema inmune. Los anticuerpos generados frente a estas partes de la molécula se unen probablemente a la proteína miostatina y la eliminan de la circulación. Se reconstruyó la parte activa restante de la proteína a partir de pares de oligonucleótidos (MYOS 3 y 4, MYOS 7 y 8, MYOS 11 y 12, MYOS 13 y 14). El uso de la parte activa completa garantiza la estructura tridimensional apropiada para provocar una respuesta inmunitaria eficaz. Se seleccionó una de las regiones en el sentido de 5' de la parte activa de la proteína, (MYOS 15 y 16) basándose en análisis asistido por ordenador de epítopos probablemente antigénicos. Se seleccionaron las otras dos partes en el sentido de 5' de la proteína para que contuviesen el sitio de escisión proteolítica (MYOS 19 y 20, que contenían el sitio de escisión y aminoácidos inmediatamente en el sentido de 5' del sitio de escisión) o para que estuviesen cercanos a él (MYOS 17 y 18) de tal modo que un anticuerpo que se une al sitio interferiría con la actividad de la proteasa.

Basándose en comparaciones con otras secuencias de proteínas conocidas, la miostatina presenta áreas de homología con otras proteínas del factor \beta de crecimiento transformante. La proteína 6 morfogenética del hueso (BMP-6) presenta bastante homología con las regiones media y del extremo C-terminal de la parte activa de miostatina.

Ejemplo 2 Construcción de pCB150

Se diseñaron los oligómeros anteriores para fusionarse con el extremo 3' de un polinucleótido que codifica para una proteína portadora de leucotoxina (LKT) de 52 kDa, denominada proteína "LKT 114" en el presente documento. Este polinucleótido se derivó del gen lktA presente en el plásmido pCB114, descrito en la patente de los EE.UU. número 5.837.268. Este plásmido, la secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestran en las figuras 15A-15D en el presente documento y se describen también en la patente de los EE.UU. número 5.837.268. El gen codifica para una versión acortada de leucotoxina que se desarrolló a partir del gen de leucotoxina recombinante presente en el plásmido pAA352 (Nº de registro ATCC 68283 y descrito en la patente de los EE.UU. número 5.476.657) por eliminación de un fragmento de ADN interno de aproximadamente 1300 pb de longitud. El polipéptido LKT 144 tiene un peso molecular estimado de 52 kDa y contiene sitios de restricción convenientes para su uso en la producción de proteínas de fusión de la presente invención.

Se preparó el plásmido pCB150, que contenía la secuencia codificante de LKT 114, en la que se clonaron los oligonucleótidos MYOS, tal como sigue. Se aisló el gen de leucotoxina tal como se describe en las patentes de los EE.UU. número 5.476.657 y 5.837.268. En particular para aislar el gen de leucotoxina, se construyeron bibliotecas génicas de P. haemolytica A1 (cepa B122) usando técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Lo et al., Infect. Immun., anteriormente; DNA CLONING: Volúmenes I y II, anteriormente; y Sambrook et al., anteriormente. Se construyó una biblioteca genómica en el vector del plásmido pUC13 y se construyó una biblioteca de ADN en el bacteriófago lambda gt11. Se usaron los clones resultantes para transformar E. coli y se agruparon colonias individuales y se examinaron para la reacción con suero de una ternera que había sobrevivido a la infección por P. haemolytica y que había sido reforzado con un sobrenadante de cultivo concentrado de P. haemolytica para aumentar los niveles de anticuerpos anti-leucotoxina. Se examinaron las colonias positivas para su capacidad de producir leucotoxina incubando lisados celulares con neutrófilos bovinos y midiendo posteriormente la liberación de lactato deshidrogenasa desde los últimos.

Se identificaron varias colonias positivas y se analizaron estos recombinantes mapeando con endonucleasas de restricción. Un clon parecía ser idéntico al gen de leucotoxina clonado previamente. Véase, Lo et al., Infect. Immun., anteriormente. Para confirmar esto, se volvieron a clonar fragmentos más pequeños y se compararon los mapas de restricción. Se determinó que se habían clonado pares de ADN de aproximadamente 4 kilobases. Se aislaron clones progresivamente más grandes realizando un paseo cromosómico (dirección 5' a 3') con el fin de aislar recombinantes de longitud completa que fuesen de aproximadamente 8 kb de longitud. La construcción final se denominó pAA114. Esta construcción contenía la secuencia del gen de leucotoxina completa.

Se trató lktA, un fragmento de la endonucleasa de restricción MaeI de pAA114 que contenía el gen de leucotoxina completo, con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I más trifosfatos de nucleótidos y se ligó en el sitio SmaI del vector de clonación pUC13. Este plásmido se llamó pAA179. A partir de éste, se prepararon dos constructos de expresión en el vector basado en ptac pGH432:lacl digerido con Smal. Uno, pAA342, consistía en el fragmento 5'-AhaIII del gen lkta mientras que el otro, pAA345, contenía el fragmento MaeI completo descrito anteriormente. El clon pAA342 expresó un péptido de leucotoxina truncado a niveles altos mientras que pAA345 expresó leucotoxina de longitud completa a niveles muy bajos. Por lo tanto, el extremo 3' del gen lktA (fragmento StyI BamHI de pAA345) se ligó con pAA342 digerido con StyI BamHI, produciendo el plásmido pAA352. La leucotoxina de P. haemolytica producida a partir del constructo pAA352 se denomina en lo sucesivo en el presente documento como LKT 352.

Entonces se usó el plásmido pAA352 para preparar una versión acortada del polipéptido de leucotoxina recombinante. Se produjo el gen LKT acortado delecionando un fragmento de ADN interno de aproximadamente 1300 pb de longitud a partir del gen LKT recombinante tal como sigue. Se digirió el plásmido pCB113, (Número de registro ATCC 69749 y descrito en la patente de los EE.UU. número 5.837.268) que incluye el polipéptido LKT 352, con la enzima de restricción BstB1 (New England Biolabs). Entonces se digirió el plásmido linealizado resultante con nucleasa mung-bean (Pharmacia) para eliminar el extremo que sobresale de la cadena única producido por la digestión con BstB1. Se digirió después el ADN de extremo romo con la enzima de restricción Nae1 (New England Biolabs), y el ADN digerido se cargó sobre un gel de agarosa al 1% en el que se separaron los fragmentos de ADN por electroforesis. Se aisló un fragmento de ADN grande de aproximadamente 6190 pb y se purificó con gel de agarosa usando un kit Gene Clean (Bio 101), y el fragmento purificado se dejó ligar por sí mismo usando ligasa de ADN de bacteriófago T4 (Pharmacia). La mezcla de ligación resultante se usó para transformar células de E. coli JM105 competentes, y se identificaron los clones positivos por su capacidad de producir una proteína agregada que tenía un peso molecular apropiado. El plásmido recombinante formado así, se designó pCB114, (descrito en la patente de los EE.UU. número 5.837.568), y produce un polipéptido de leucotoxina acortado denominado "LKT 114".

Entonces se usó el plásmido pCB114 para producir el plásmido pSLKT-30. Se preparó el plásmido pSLKT-30 clonando el fragmento que codifica para la leucotoxina de pCB114 por PCR dentro del plásmido pAA352 (número de registro ATCC 68283 y descrito en la patente de EE.UU. número 5.476.657). Al hacer esto, se introdujeron mutaciones cerca del extremo C-terminal, dando como resultado cambios en dos aminoácidos respecto a la molécula de leucotoxina nativa. Por tanto, se volvió a clonar un fragmento de PCR del área afectada en el plásmido pSLKT-30. Específicamente, se creó un fragmento de pSLKT-30 por PCR usando LKT6 (SEC ID Nº: 40) como el cebador de PCR en el sentido de 5', y LKT13 (SEQ ID NO: 41) como el cebador de PCR en el extremo de 3':

1000

El fragmento contenía el cambio deseado y los sitios de restricción Nsi1 y Nco1. El fragmento aislado se digirió usando las enzimas de restricción Nsi1 y Nco1, como lo fue el plásmido pSLK-30. Se eliminó el fragmento Nsi1/Nco1 del plásmido y se sustituyó por el fragmento de PCR, dando como resultado de nuevo una mutación con respecto a la secuencia original. El plásmido se denominó pCB150. Se muestra un diagrama del plásmido pCB150 en la figura 14. La secuencia de ácidos nucleicos de LKT 114 del plásmido pCB150 se muestra en las figuras 15A-15D.

Ejemplo 3 Construcción de fusiones LKT-multímero de péptido de miostatina

Se usaron copias múltiples de cada par de oligómeros descritos en el ejemplo 1 para preparar repeticiones en tándem de secuencias codificantes de multímeros de péptido de miostatina unidos al gen LKT 114. Se reconstruyó también la parte activa completa de la proteína y se fusionó a LKT 114 para su uso como un agente de inmunización.

Se construyeron fusiones de LKT-péptido de miostatina tal como sigue. Se hibridaron y ligaron pares de oligonucleótidos del ejemplo 1 en el vector pUC19 (Pharmacia) que se habían digerido con la endonucleasa de restricción HincII. El ADN ligado se usó para transformar la cepa TOP10F' de E. coli (Invitrogen). Se identificaron los transformantes que contenían los insertos de oligonucleótidos por PCR y mapeo con endonucleasas de restricción.

Se diseñaron los pares de oligonucleótidos para unirse juntos ligando el sitio BamHI en el extremo frontal de un par de oligonucleótidos con el sitio BglII en el extremo posterior de una segunda copia del par de oligonucleótidos. Se inutilizaron los sitios de restricción en el punto de ligación, dejando un sitio BamHI en el extremo frontal de la repetición y un sitio BglII en el extremo posterior de la repetición. Se construyeron las repeticiones en tándem de cada par de oligonucleótidos digiriendo el plásmido que contenía los oligonucleótidos con endonucleasas de restricción BamHI y BglII para liberar el fragmento de oligonucleótido insertado. Entonces, se volvió a ligar este fragmento en el plásmido que contenía oligonucleótidos, que se había digerido con la endonucleasa de restricción BglII. El ADN ligado se usó para transformar la cepa TOP10F' de E. coli. Se identificaron los transformantes que contenían repeticiones de los insertos de oligonucleótidos por PCR y mapeo con endonucleasas de restricción. Se repitió este proceso hasta que se produjeron plásmidos pUC10 que contenían al menos cuatro copias repetidas y hasta 8 copias de cada par de oligonucleótidos en la orientación correcta.

Además de estar unidos a ellos mismos, algunos de los pares de oligonucleótidos se diseñaron también para unirse entre sí para volver a crear la región activa de la proteína miostatina tan estrechamente como sea posible. Esto se hizo ligando pares de oligonucleótidos MYOS 3/4 cortados con BamHI y BglII en el sitio BglII detrás del par de oligonucleótidos MYOS 1/2 en el vector pUC19. A esto le siguió la ligación en pares de oligonucleótidos MYOS 5/6 cortados con BstBI y BglII en el vector que contenía la región activa de miostatina reconstruida cortada con BstBI y BglII. El par de oligonucleótidos MYOS 7/8 se cortó con BamHI y BglII y se ligó en el vector que contenía la región activa de miostatina reconstruida. El par de oligonucleótidos MYOS 9/10 se cortó con EcoRI y se ligó dentro, el fragmento de EcoRI de la reconstrucción de miostatina de pUC19. El par de oligonucleótidos MYOS 11/12 se cortó con BamHI y BglII y se ligó dentro del vector que contenía la región activa de miostatina reconstruida en el sitio BglII. A esto le siguió la ligación en el par de oligonucleótidos MYOS 13/14 cortado con BsmI y BglII dentro del vector que contenía la región activa de miostatina reconstruida cortada con BsmI y BglII. Esto completó la reconstrucción de la secuencia codificante de la región activa de miostatina, que contenía tres conjuntos de dos ligadores de aminoácidos insertados en la secuencia de la región activa de miostatina en las posiciones 55-60, 139-144 y 241-246 y en el extremo C-terminal (véase la figura 13).

Se liberaron entonces las copias múltiples de cada par de oligonucleótidos y la reconstrucción de la región activa de miostatina, del plásmido pUC19 por digestión con las endonucleasas de restricción BamHI y BglII. Entonces se ligaron estos fragmentos de ADN en el plásmido pCB150. Se digirió el plásmido CB150 con la endonucleasa de restricción BamHI. El ADN ligado se usó para transformar la cepa TOP10F' de E. coli. Los transformantes que contenían los insertos de oligonucleótidos se identificaron por PCR y mapeo con endonucleasas de restricción. Los plásmidos recombinantes se designaron pJS121, pJS122, pJS123, pJS124, pJS125, pJS126, pJS127, pJS128, pJS129, pJS130, y pJS317.

El plásmido pJS121 contiene 6 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 1/2 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS122 contiene 8 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 3/4 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS123 contiene 8 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 5/6 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS124 contiene 8 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 7/8 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS125 contiene 6 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 9/10 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS126 contiene 4 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 11/12 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS127 contiene 6 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 13/14 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS128 contiene 4 copias de repetición del par de oligonucleótido MYOS 15/16 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS129 contiene 8 copias que se repiten del par de oligonucleótidos MYOS 17/18 fusionadas con LKT 114. El plásmido pJS130 contiene 4 copias de repetición del par de oligonucleótidos MYOS 19/20 fusionadas con LKT 114. El plásmido pCB317 contiene una copia única de la reconstrucción de la región activa de miostatina fusionada con LKT 114.

Ejemplo 4 Purificación de las fusiones LKT-péptido de miostatina

Las proteínas de fusión LKT recombinante-péptido de miostatina anteriores se expresaron como cuerpos de inclusión y se purificaron usando el siguiente procedimiento. Se inoculó un bucle de células de cada solución madre congelada en 10 ml de caldo TB en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Se complementó el caldo TB con 100 \mug/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante 12-16 horas en un agitador Innova 4000 a 250 rpm. Se usó el cultivo para inocular un litro de caldo TB en un matraz Erlenmeyer de 4 l. Se complementó el caldo TB con 100 \mug/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 3 horas en un agitador Innova 4000 a 250 rpm. Se añadió después 1 ml de una solución 1 M de IPTG (isopropil-B,D-tiogalactopiranósido) al cultivo para inducir la producción de proteína recombinante. El cultivo se incubó después durante dos horas adicionales. Se recogieron las células por centrifugación durante 10 min. a 6000 rpm en 3X botellas de polipropileno de 500 ml, usando un rotor JA 10 en una centrífuga Avanti J25. Se resuspendió el sedimento celular en 40 ml de sacarosa al 25%, Tris-clorhidrato 50 mM, pH 8,0 y se congeló a -70ºC durante 15 min. Las células congeladas se descongelaron a temperatura ambiente y se mezclaron con 10 ml de Lisozima (Sigma, 10 mb/ml en Tris-clorhidrato 250 mM, pH 8,9). Después de la incubación durante 15 minutos en hielo, se añadieron 300 ml de tampón de lisis (Triton X100 al 2%, EDTA 50 mM, Tris-clorhidrato 100 mM, pH 8,0) y se mezclaron por agitación. Entonces se sonicó la suspensión de células lisadas durante 4X arranques de 30 segundos a potencia completa con una sonda grande en un sonicador Misonix. Se dividió la disolución en 2X botellas de centrífuga de 250 ml y se centrifugó durante 25 min. a 10000 rpm en un rotor JA 14. Se lavaron los sedimentos del cuerpo de inclusión resuspendiendo en 100 ml de agua doblemente destilada y centrifugando para recoger los cuerpos de inclusión. Se repitió una vez más este procedimiento de lavado y se suspendió el sedimento del cuerpo de inclusión final en 10 ml de agua doblemente destilada y se almacenó a -20ºC hasta que se
necesitase.

Se sometieron a prueba todas las proteínas de fusión aisladas por SDS-PAGE para determinar su identidad por peso molecular, concentración y pureza, comparando las proteínas con patrones conocidos. Se solubilizaron alícuotas de 10 \mul de cada proteína de fusión con 10 \mul de urea 8 M y se mezclaron después 2 \mul de la proteína solubilizada con 100 \mul de 1X tampón de carga de SDS-PAGE. Las muestras de tampón de carga se calentaron hasta 94ºC durante 5 min. y se procesaron sobre un gel de poliacrilamida al 10%. Se procesó también LKT 114 recombinante de pCB150 como un control.

Ejemplo 5 Efecto biológico in vivo de las proteínas de fusión LKT-péptido de miostatina

Para probar la capacidad de las proteínas de fusión que comprenden múltiples copias de diversos péptidos de miostatina fusionados con una proteína portadora para manifestar un efecto biológico in vivo, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Se prepararon proteínas de fusión LKT recombinante-péptido de miostatina como se ha descrito anteriormente. Se prepararon vacunas para cada una, solubilizando cada una de las proteínas de fusión en una concentración final de urea 6 M (usada para la primera inyección) o guanidina-HCl 4 M (usada para todas las inyecciones posteriores). Se añadieron a alícuotas de 2,5 ml (usadas para las primeras dos inyecciones) o 1,5 ml (usadas para la última inyección) de adyuvante VSA-3 (un adyuvante Emulsigen Plus modificado), 1250 \mug de cada proteína solubilizada y se mezclaron con 5X5 arranques de segundos con un sonicador Misonix con una sonda de micropunta a un parámetro de potencia de 5. A estas mezclas, se añadieron 50 \mul de una disolución de timerosal al 1% y PBS pH 7,4 (solución salina de tampón fosfato) hasta un volumen final de 5 ml y las mezclas se sonicaron de nuevo. Se usó un volumen de 200 \mul para cada inyección. Cada inyección contenía 50 \mug de proteína de fusión. Se administró esta inyección inicial (día 0) a las 3-4 semanas de edad con inyecciones posteriores en los días 28 y 56.

Catorce grupos de tratamiento contenían cada uno 15 ratones CD1 Swiss. Los grupos de tratamiento fueron tal como sigue (véase la Tabla 1): Grupo 1 control sin vacunación, Grupo 2 control de adyuvante sólo, Grupo 3 control de proteína portadora pCB150, Grupos 4 a 13 proteínas de prueba pJS121 a pJS130, Grupo 14 proteína de prueba pCB317. Los ratones se pesaron semanalmente para determinar el aumento de peso a lo largo de curso del experimento de 98 días. Los resultados de este ensayo se resumen en la Tabla 2 y la figura 18. Se usó guanidina-HC1 como el agente solubilizante de elección ya que parece proporcionar estabilidad mejorada de la proteína por encima de la urea en la formulación de vacuna. La concentración de VSA-3 se redujo desde el 50% hasta el 30% en la formulación de vacuna en un esfuerzo por reducir las reacciones en el sitio de inyección.

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1

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2

3

Ejemplo 6 Análisis estadístico de los resultados del ensayo

Se realizó el análisis estadístico de los resultados del ensayo usando un paquete de software estadístico (Statistix Versión 1.0). En este ensayo, todos los grupos de control tenían pesos totales medios muy similares, mientras que varios grupos sometidos a prueba tenían pesos totales medios elevados. Se realizó ANOVA de una vía sobre el aumento de peso durante los 98 días del experimento. Una comparación LSD de las medias de prueba indicó que el grupo 13 de tratamiento era diferente de manera significativa con respecto cualquiera de los grupos de control. Los grupos de prueba 12 y 6 eran diferentes de manera significativa con respecto dos de los tres grupos de control. Los grupos de tratamiento se analizaron también agrupándolos en controles (grupos 1-3) y grupo de pruebas (grupos 4-14). Se realizó ANOVA de una vía sobre los aumentos de peso de estos dos grupos. Una comparación LSD de las medias de prueba indicó que el grupo que recibió un tratamiento de prueba era diferente de manera significativa con respecto al grupo de control.

Depósitos de cepas útiles para la práctica de la invención

Se realizó un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas en la colección americana de cultivos tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. El número de registro indicado se asignó después de probar la viabilidad satisfactoria, y se pagaran las tasas de honorarios. Los depósitos se realizaron según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para el propósito de procedimiento de patente y las regulaciones bajo él (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de cultivos viables durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito y al menos cinco (5) años después de la petición más reciente para la provisión de una muestra del depósito por el depositario. Los organismos estarán disponibles por la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, que garantiza la disponibilidad permanente y sin restricción de los cultivos para alguien determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas de los Estados Unidos para tener derecho a ello según la U.S.C. 35 Nº 122 y las normas del Comisionado con arreglo a ello (incluyendo C.F.R. 37 Nº 1.12). Tras la concesión de la patente, todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los cultivos depositados se eliminarán irrevocablemente.

4

Por tanto, se dan a conocer péptidos de miostatina inmunogénicos, multímeros e inmunoconjugados, así como métodos de preparación y uso de los mismos. Aunque se han descrito realizaciones preferidas del objeto de la invención en algún detalle, se entiende que pueden hacerse variaciones obvias sin apartarse del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas

<110> Biostar Inc.

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<120> MÉTODOS INMUNOLÓGICOS PARA MODULAR MIOSTATINA EN SUJETOS VERTEBRADOS

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<130> 08-882641WO

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<140> PCT/CA99/00128

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<141> 1999-02-19

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<150> 60/075.213

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<151> 1998-02-19

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<160> 36

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<170> Patente en ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1128

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<212> ADN

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<213> bof taurus

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<400> 1

5

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<210> 2

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> bof taurus

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<400> 2

6

7

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<210> 3

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(60)

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 1, Figura 2

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<400> 3

8

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<210> 4

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 4

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\sa{Gly Ser Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser}

\sac{Thr Glu Arg Ser}

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<210> 5

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 3, Figura 3

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(51)

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<400> 5

9

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<210> 6

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Gly Ser Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Arg}

\sac{Ser}

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<210> 7

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 5, Figura 4

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(57)

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<400> 7

10

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<210> 8

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Gly Ser Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg}

\sac{Tys Arg Ser}

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<210> 9

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<211> 54

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 7, Figura 5

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(54)

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<400> 9

11

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<210> 10

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\sa{Gly Ser Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe}

\sac{Arg Ser}

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<210> 11

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 9, Figura 6

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(72)

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<400> 11

12

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<210> 12

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\sa{Gly Ser Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val}

\sac{His Gln Ala Asn Pro Arg Arg Ser}

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<210> 13

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<211> 81

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 11, Figura 7

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(81)

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<400> 13

13

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<210> 14

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 14

14

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<210> 15

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 13, Figura 8

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(72)

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<400> 15

15

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<210> 16

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 16

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\sa{Gly Ser Glu Cys Gln Ile Ile Tyr Cys Lys Ile Pro Ala Met Val Val}

\sac{Asp Arg Cys Gly Cys Ser Arg Ser}

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<210> 17

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 15, Figura 9

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(63)

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<400> 17

16

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<210> 18

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 18

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\sa{Gly Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala}

\sac{Cys Leu Trp Arg Ser}

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<210> 19

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 17, Figura 10

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(60)

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400>20

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\sa{Gly Ser His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly}

\sac{Leu Thr Arg Ser}

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<210> 21

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante del péptido MYOS 19, Figura 11

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(60)

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<400> 21

18

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<210> 22

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg}

\sac{Ser Arg Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

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<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región activa de miostatina reconstruida, Figura 13

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(372)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

19

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<210> 24

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<211> 124

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

20

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<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vehículo de polipéptido de leucotoxina, Figuras 15A-15D

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1473)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

21

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

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<211> 490

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

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<211> 376

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

1001

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 376

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Papio hamadryas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

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<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> bof taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Sus scrofa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Ovis aries

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 34

1002

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

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<212> PRT

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<213> Meleagris gallopavo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 374

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

44

45

\hskip1.5cm

46

Claims

1. Inmunoconjugado de miostatina que comprende un multímero de miostatina que comprende una molécula según la fórmula general (MP-X-MP)y, en la que MP es un péptido de miostatina, en el que cada uno de dichos péptidos de miostatina comprende independientemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste
en

a) los aminoácidos 3 - 15 de la SEQ ID NO: 6;

b) los aminoácidos 3 - 17 de la SEQ ID NO: 8;

c) los aminoácidos 3 - 16 de la SEQ ID NO: 10;

d) los aminoácidos 3 - 22 de la SEQ ID NO: 16;

e) los aminoácidos 3 - 19 de la SEQ ID NO: 18;

f) los aminoácidos 3 - 18 de la SEQ ID NO: 20, y;

g) los aminoácidos 3 - 18 de la SEQ ID NO: 22;

X se selecciona del grupo que consiste en un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácidos, y [MP]n, en la que n es superior o igual a 1, e y es superior o igual a 1; y en el que dicho multímero de miostatina se une a un polipéptido de leucotoxina.

2. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que X comprende un grupo espaciador de aminoácidos que incluye al menos un epítopo de célula T cooperadora.

3. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que dicho multímero comprende al menos dos copias de la SEQ ID NO: 6.

4. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 3, en el que dicho multímero comprende ocho copias de la SEQ ID NO: 6 unidas a LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A-15D (SEQ ID NO: 26).

5. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que dicho multímero comprende al menos dos copias de la SEQ ID NO: 8.

6. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 5, en el que dicho multímero comprende ocho copias de la SEQ ID NO: 8 unidas a LKT 114 tal como se representa en las figuras 15A-15D (SEQ ID NO: 26).

7. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que dicho multímero comprende al menos dos copias de la SEQ ID NO: 10.

8. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 7, en el que dicho multímero comprende ocho copias de la SEQ ID NO: 10 unidas a LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A-15D (SEQ ID NO: 26).

9. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que dicho multímero comprende al menos dos copias de la SEQ ID NO: 16.

10. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 9, en el que dicho multímero comprende seis copias de la SEQ ID NO: 16 unidas a LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A-15D (SEQ ID NO: 26).

11. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que dicho multímero comprende al menos dos copias de la SEQ ID NO: 18.

12. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 11, en el que dicho multímero comprende cuatro copias de la SEQ ID NO: 18 unidas a LKT 114 tal, como se representa en las figuras 15A-15D (SEQ ID NO: 26).

13. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que dicho multímero comprende al menos dos copias de la SEQ ID NO: 20.

14. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 13, en el que dicho multímero comprende ocho copias de la SEQ ID NO: 20 unidas a LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A-15D (SEQ ID NO: 26).

15. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 1, en el que dicho multímero comprende al menos dos copias de la SEQ ID NO: 22.

16. Inmunoconjugado de miostatina según la reivindicación 15, en el que dicho multímero comprende cuatro copias de la SEQ ID NO: 22 unidas a LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A-15D (SEQ ID NO: 26).

17. Inmunoconjugado de miostatina según cualquiera de las reivindicaciones 1-1b para su uso como un medicamento.