MXPA99001249A

MXPA99001249A - Quimeras de leucotoxina- hormona de liberacion de gonadotropina (gnrh)

Info

Publication number: MXPA99001249A
Application number: MXPA/A/1999/001249A
Authority: MX
Inventors: A Potter Andrew; Manns G John
Original assignee: University Of Saskatchewan
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2000-02-02

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos sistemas portadores, inmunológicos, el ADN que codifica para los mismos, y el uso de estos sistemas. Los sistemas portadores incluyen proteínas quiméricas que incluyen un polipéptido de leucotoxina fusionado a uno o más multímeros de GnRH seleccionados, que comprenden al menos una secuencia de decapéptido de GnRH de repetición, o al menos una unidad de repetición de una secuencia que corresponde al menos a un epítope de una molécula de GnRH seleccionada. De acuerdo con la invención, las secuencias de GnRH seleccionadas pueden ser las mismas, o pueden corresponder a diferentes derivados, análogos, variantes, o epítopes de GnRH siempre que las secuencias de GnRH sean capaces de producir la respuesta inmunitaria. La leucotoxina funciona para incrementar la inmunogenicidad de los multímeros de GnRH fusionados a la misma.

Description

QUIMERAS DE LEUCOTOXINA-HCRMONA DE LIBERACIÓN DE GONADOTROPINA (GnRH) Descripción Campo Técnico La presente invención se refiere en general a sistemas portadores, inmunológicos. En forma más particular, la invención se refiere a Quimeras de leucotoxina-GnRH gue incluyen más de una copia de un polipéptido de GnRH. Las quimeras demuestran inmunogenicidad mejorada en comparación a la inmunogenicidad de los polipéptido solos de GnRH.

Antecedentes de la Invención En los vertebrados, la síntesis y liberación de las dos hormonas gonadotrópicas , la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH) se regulan por un polipéptido referido como la hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) (anteriormente designado LHRH) .

Por consiguiente, un planteamiento para controlar la fertilidad en una población animal es reducir los niveles de GnRH, tal como por inmunización contra GnRH gue efectúa una reducción en los niveles de LH y FSH y el rompimiento concomitante de los ciclos estruales y espermatogénesis. Ver, por ejemplo (Adams y colaboradores, J. Ani . Sci. (1990) 68 : 2793-2802. Estudios recientes de la molécula de' GnRH han mostrado gue es posible aumentar los antisueros en respuesta a inyecciones repetidas de péptidos sintéticos de GnRH (Arimura y colaboradores, Endocrinology (1973) 9J3_ ( 5 ) : 1092-1103 ) . Además, los anticuerpos a GnRH se han promovido en un número de especies por conjugación guímica de GnRH a un portador adecuado y la administración del conjugado en un adyuvante apropiado (Cerelli y colaboradores, Proc. Natl. ACAD: Sci. (1982) 79_: 5392-5395 ) . Las proteínas de fusión recombinantes gue comprenden GnRH o análogos de GnRH también se han descrito para el uso en vacunas peptídicas para la castración inmunológica o inhibición de la función reproductiva de varios animales domesticados y de granja, (Meloen y colaboradores, Vaccine (1994) 1_2 (8) :741-746; Hoskinson y colaboradores, Aust. J.

Biotechnol. (1990) 4:166-170; y Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/19746, publicada el 12 de Noviembre de 1992; WO 91/02799, publicada el 7 de Marzo de 1991; WO 90/11298, publicada el 4 de Octubre de 1990 y WO 86/07383, publicada el 18 de Diciembre de 1986) . Sin embargo, los intentos se han guedado cortos en la provisión de productos de esterilización inmunológica, adecuados, debido a la pobre inmunogenicidad de los péptidos de GnRH y debido al hecho gue los protocolos de conjugación química son difíciles de controlar, volviendo a los conjugados de GnRH sustancialmente heterogéneos y pobremente definidos. Además, las vacunas peptídicas en base a GnRH se han encontrado con un éxito limitado en la provisión de efectos uniformes en sujetos animales, individuales aún después de la vacunación repetida. A este respecto, las construcciones de GnRH, han fallado al proporcionar un producto de vacuna de esterilización inmunológica, uniformemente exitoso, debido al hecho gue la GnRH es una "auto" molécula pegueña gue no se reconoce normalmente por el sistema inmunitario del sujeto, volviendo a la molécula pobremente inmunogénica e inherentemente inestable para inducir una inmunorrespuesta significante contra el GnRH endógeno. Se reconoce en general que la inmunogenicidad de antígenos virales, pegueñas proteínas o sustancias endógenas se puede incrementar de manera significante al producir formas inmunogénicas de estas moléculas gue comprenden copias múltiples de los epítopes seleccionados. A este respecto, las construcciones basadas en dos o cuatro repeticiones de péptidos 9- 21 de la glicoproteína D tipo 1 del virus de herpes simplex (Ploeg y colaboradores, J. I muno . Methods (1989) 124:211-217) , dos a seis repeticiones del NPNA de tetrapéptido, circumsporozoite , antigénico de Plasmodium falciparu (Lowell y colaboradores, Science (1988) 240:800-802), dos o cuatro copias del sitio inmunogénico principal de VPl del virus de la enfermedad de boca y pie (Broekhuij sen y colaboradores, J. Gen. Virol. (1987) 68 : 3137-3143) y las repeticiones en tándem del polipéptido similar a GnRH (Meloen y colaboradores, Vaccine (1994) 12_(8 ) : 741-746) , se ha mostrado que son efectivas en el incremento de la inmunogenicidad de estas moléculas.

Las proteínas pegueñas o sustancias endógenas también se pueden conjugar a un portador adecuado a fin de producir una inmunorrespuesta significante en un huésped estimulado. Los portadores adecuados son en general polipéptidos gue incluyen regiones antigénicas de una proteína derivada a partir de un material infeccioso tal como una proteína de superficie viral, o una secuencia peptídica portadora. Estos portadores sirven para estimular de manera no específica la actividad de las células auxiliares T para ayudar a dirigir el antígeno al antígeno que presentan las células para el procesamiento y presentación del péptido de una superficie celular en asociación con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) . Se han desarrollado varios sistemas portadores para este propósito. Por ejemplo, frecuentemente se acoplan pegúenos antígenos peptídicos a portadores proteicos tal como la hemocianina de lapa (Bittle y colaboradores, Nature (1982) 298 : 30-33) , toxoide de tétanos (Muller y colaboradores, Proc. Natl Acad. Sci. U.S. A (1983) 7_9: 569-573 ) , ovalbú ina, y ioglobina de esperma de ballena, para producir una inmunorrespuesta. Estas reacciones de acoplamiento dan por resultado típicamente la incorporación de varios moles del antígeno peptídico por mol de la proteína portadora. Aungue la presentación del antígeno peptídico en múltiples copias mejora en general la inmunogenicidad, los portadores pueden producir fuerte inmunidad no pertinente al antígeno peptídico y esto puede inhibir la respuesta inmunitaria a la vacuna del péptido en lá inmunización secundaria (Schutze y colaboradores, J. I mun. (1985) 135 : 2319-2322) . También se han basado en portadores en forma de partículas los sistemas de distribución de antígeno. Por ejemplo, se han usado partículas preformadas como plataformas sobre las cuales se pueden acoplar los antígenos y se incorporan. Se han desarrollado sistemas basados en proteosomas (Lowell y colaboradores, Science (1988) 240:800-802), los complejos inmunoes ti uladores (Morein y colaboradores, Nature (1984) 308 : 457-460) y las partículas virales tal como HBsAg (Neurath y colaboradores, Mol. Immunol (1989) 2_6:53-62) y la proteína de cápsula interior, del rotavirus (Redmond y colaboradores, Mol. Immunol. (1991) 28 : 269-278) .

También se han contemplado sistemas portadores gue usen proteínas quiméricas, producidas de manera recombinante, gue se automontan en partículas. Por ejemplo, el retrotransposon de levadura, Ty, codifica para una serie de proteínas que se montan en partículas individuales a virus (Ty-VLPs; Kingsman, S. M., y A. J. Kingsman Vacc. (1988) _6:304-306) . Se han insertado genes extraños en el gen TyA y se han expresado en levadura como una proteína de fusión. La proteína de fusión tiene la capacidad para auto ontarse en partículas de tamaño uniforme. Se han examinado otras partículas de proteína guimérica tal como HBsAg, (Valenzuela y colaboradores, Bio/Technol. (1983) 3_:323~326' Patente Norteamericana No. 4,722, 840; Delpeyroux y colaboradores, Science (1986) 233 : 472-475) , el antígeno del núcleo de la hepatitis B (Clarke y colaboradores, Vaccines 88 (Ed. H. Ginsberg, y colaboradores, 1988) pp . 127-131), Poliovirus (Burke y colaboradores, Nature (1988) 322 : 81-82) , y el virus del mosaico del tabaco (Haynes y colaboradores, Bio/Tecnol. (1986) _4:637-641) . Sin embargo, estos portadores se restringen en su utilidad por virtud del tamaño limitado del agente activo gue se puede insertar en la proteína estructural sin gue interfiera con el montaje de la partícula . Finalmente, se han contemplado sistemas guiméricos gue usan el polipéptido de la lecucotoxina de la Pasteurella hae olytica (LKT) fusionado a un antígeno fusionado. Ver, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nos. WO 93/08290, publicada el 29 de Abril de 1993 y WO 92/03558, publicada el 5 de Marzo de 1992, así como las Patentes Norteamericanas Nos. 5,238,823 y 5,273,889. La inclusión de una porción portadora de LKT en una quimera de antígeno peptídico suministra inmunogenicidad mejorada a la guimera al proporcionar epítopes de células T gue tienen una amplia reactividad a especies, produciendo de este modo una inmunorrespuesta dependiente de células T en los sujetos inmunizados. A este respecto, la inducción de la ayuda de células T, adecuada, es esencial en la generación de una respuesta inmunitaria a la porción del antígeno peptídico de la guimera, particularmente en donde el antígeno es una molécula endógena. Sin embargo, el uso de un portador de polipéptido de leucotoxina en combinación con múltiples epítopes del péptido de GnRH no se ha descrito hasta la fecha.

Descripción de la Invención La presente invención se basa en la construcción de nuevas fusiones génicas entre el gen de leucotoxina del péptido haemolytica, variantes del mismo, y una o más secuencias de nucleótidos gue codifican para múltiples polipéptido de GnRH. Estas construcciones producen proteínas quiméricas gue exhiben una inmunogenicidad sorprendentemente mejorada, en comparación a la reacción inmunológica producida por la administración de GnRH sola. De esta manera, en una modalidad, la presente invención se refiere a una proteína guimérica que comprende un polipéptido de leucotoxina fusionado a uno o más multímeros en donde cada ultímero comprende más de un multímero de GnRH seleccionado. La porción de leucotoxina de la quimera actúa para incrementar la autoinmunogenicidad de los polipéptidos de GnRH. En forma más particular, los multímeros de GnRH usados en la presente pueden corresponder a más de una copia del polipéptido de GnRH, seleccionado, o epítope, o múltiples repeticiones en tándem de un polipéptido de GnRH, seleccionado, o epítope. Además, los multímeros de GnRH se pueden localizar en la terminal carboxi y/o amino del polipéptido de leucotsxina, en sitios internos al polipéptido de leucotoxina, o cualquier combinación de estos sitios. Cada multímero de GnRH también puede corresponder a una molécula de la fórmula general GnRH-X-GnRH. En donde X se selecciona a partir del grupo gue consiste de un enlace peptídico, un grupo separador de aminoácido y [GnRH]n, en donde n es mayor que o igual a l, y además, en donde "GnRH" puede comprender cualquier polipéptido de GnRH. En una modalidad particular, se proporciona una proteína quimérica que comprende un polipéptido de leucotoxina fusionado a dos multímeros de GnRH. En esta molécula, el C-término de uno de los multímeros de GnRH se fusiona al N-término del polipéptido de leucotoxina, y el N-término del polipéptido de leucotoxina se fusiona al N-término del otro multímero de GnRH. También se describen composiciones de vacuna que comprenden las proteínas quiméricas con un vehículo farmacéuticamente aceptable, así como métodos para presentar uno o más multímeros de GnRH seleccionados, a un sujeto huésped por la administración en una cantidad efectiva de las presentes composiciones de vacuna. En otra modalidad, la invención se dirige a construcciones de ADN que codifican para las proteínas quiméricas. Las construcciones de ADN que comprenden una primera secuencia de nucleótido que codifica para un polipéptido de leucotoxina enlazado operablemente a una o más secuencias de nucleótidos, seleccionadas, cada secuencia de nucleótidos, seleccionada que codifica para más de una copia de un polipéptido de GnRH o epítope. En aún otra modalidad, la invención se refiere a cartuchos de expresión comprendidos de las construcciones de ADN descritas anteriormente enlazadas operablemente a las secuencias de control que dirigen la transcripción de las mismas, por lo cual las construcciones se pueden transcribir y traducir en una célula huésped. En otra modalidad, la invención se dirige a células huésped transformadas con estos cartuchos de expresión. Otra modalidad de la invención proporciona un método para producir un polipéptido recombinante. El método comprende (a) proporcionar una población de células huésped descritas anteriormente y (b) cultivar la población de células bajo condiciones por las cuales el polipéptido quimérico codificado por el cartucho de expresión se expresa. Estas y otras modalidades de la presente invención vendrán a la mente fácilmente para aquellos expertos en la técnica en la vista de la descripción en la presente.

Breve Descripción de las Figuras La Figura ÍA y IB muestran las secuencias de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de las construcciones de GnRH usadas en las funciones génicas del polipéptido quimérico de leucotoxina de GnRH. La Figura ÍA representa GnRH-1 gue incluye una copia individual de un decapéptido de GnRH; la Figura IB representa GnRH-2 gue incluye cuatros copias de un decapéptido de GnRH cuando n=l, y ocho copias de GnRH cuando n=2, etc.

La Figura 2 representa la estructura de plásmido pAA352 en donde tac es promotor híbrido trp: : lac de E. coli; bla representa el gen de ß-lacta asa (resistencia a la ampicilina) ; ori es el origen de plásmido en base a ColEl de replicación; lktA es el gen estructural de leucotoxina de P. haemolytica; lacl es el represor del operon lac de E. coli. La dirección de transcripción/ transducción del gen de leucotoxina se indica por la fecha. El tamaño de cada componente no se dibuja a escala.

Las Figuras 3-1 hasta 3-9 muestran las secuencias de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la leucotoxina 352 (LKT 352) . Se muestran tanto el gen estructural para LKT 352 como las secuencias de las regiones del vector de blangueo.

La Figura 4 muestra la estructura del plásmido pCB113 que porta una función génica de leucotoxina GnRH (LKT-GnRH) .

Las Figuras 5-1 hasta 5-8 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína quimérica de LKT-GnRH a partir de pCB113. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína quimérica de LKT-GnRH a partir de pCB112 son idénticas a las secuencias de la proteína quimérica derivada a partir de pCB113 excepto gue la secuencia para la GnRH de múltiple copia se insertó dos veces como se describe anteriormente con respecto a la Figura 4.

La Figura 6 muestra la estructura del plásmido pCBlll gue porta una fusión génica de leucotoxina-GnRH (LKT-GnRH) .

Las Figuras 7-1 hasta 7-5 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína guimérica de LKT-GnRH a partir de pCBlll. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína de fusión LKT-GnRH a partir de pCB114 son idénticas a las secuencias de la proteína guimérica derivada a partir de pCBlll excepto gue la secuencia para la GnRH de múltiple copia se insertó dos veces como se describe anteriormente con respecto a la Figura 6.

Las Figuras 8-1 hasta 8-2 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada del punto de fusión de extremo romo del gen de leucotoxina truncado del plásmido pCBlll (Figura 8-2), donde un fragmento de ADN integral (de aproximadamente 1300 pb de longitud) se removió de LKT 352 por digestión con las enzimas de restricción BstBl y Nael (Figura 8-1) - Las Figuras 9-1 hasta 9-6 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína guimérica de LKT-GnRH a partir de pCB122.

La Figura 10 muestra la estructura del plásmido pAAlOl que porta el polipéptido de leucotoxina de LKT 101 gue carece de actividad citotóxica .

La Figura 11 representa la secuencia de aminoácidos pronosticada del polipéptido de leucotoxina de LKT 101.

La Figura 12 muestra una comparación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH, en suero, promedio, en cerdos castrados, verracos no tratados y verracos inmunocastrados (vacunados con las proteínas de fusión de leucotoxina-GnRH) como se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 13 muestra una comparación de los niveles séricos promedio de testosterona en cerdos castrados, verracos no tratados y verracos inmunocastrados (vacunados con proteínas de fusión de leucotoxina-GnRH) como se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 14 muestra una comparación de la eficiencia de conversión de alimento (expresada como la relación de Kg de alimento : Kg de ganancia de peso (en cerdos castrados, verracos no tratados y verracos inmunocas trados ) vacunados con proteínas de fusión de leucotoxina-GnRH) como se describe en el Ej emplo 10.

La Figura 15 muestra una comparación de los títulos séricos de anticuerpos anti-GnRH, promedio, en animales inyectados con una composición de vacuna que contiene una proteína de fusión de LKT : : GnRH : : 8 copias, o una composición de vacuna que contiene una proteína de fusión de GnRH 8 copias: : LKT : : GnRH 8 copia, como se describe en el Ej emplo' 11.

La Figura 16 muestra una comparación del peso ovárico promedio (mg) , el peso uterino promedio (mg) , y el estradiol sérico promedio (mg) , en animales de control (barras sólidas) en animales tratados con una composición de vacuna que contiene la proteína de fusión de GnRH 8 copias :: GnRH :: LKT :: 8 copias como se describe en el Ejemplo 13 (barras con tramas cruzadas) .

La Figura 17 representa una comparación en los niveles de androstenona de grasa en cerdos castrados, verracos, animales castrados tardíos, y animales inmunocastrados (vacunados con proteína de fusión de leucotoxina-GnRH) como se describe en el Ej emplo 14.

Descripción Detallada La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, biología, tecnología de ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura, ver por ejemplo Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, Vols. I y II (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization ( B . D . Hames &S.J. Higgins eds.); Animal Cell Culture (R.K. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; las series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications ) .

A. Definiciones En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se proponen para gue se definan como se indica a continuación . El término "hormona de liberación de gonadotropina" o "GnRH" se refiere a un decapéptido segregado por el hipotálamo gue controla la liberación tanto de la hormona leutinizante (LH) como de la hormona de estimulación del folículo (FSH) en vertebrados (Fink, G., British Medical Bulletin (1979) 3_5: 155-160 ) . Las secuencia de aminoácidos de GnRH se conserva altamente entre vertebrados, y especialmente en mamíferos. A este respecto, la GnRH derivada a partir de la mayoría de los mamíferos incluyendo GnRH humana, bovina, porcina y bovina (anteriormente designada LHRH) tiene la secuencia de aminoácidos pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (Murad y colaboradores, Hormones and Hor one Antagonists, en The Pharmacological Basis of Therapeutics, Sexta Edición (1980) y Seeburg y colaboradores, Nature (1984) 311 : 366-668) .

Como se usa en la presente un "polipéptido de GnRH" incluye una molécula derivada a partir de una secuencia nativa de GnRH, así como a los polipéptidos de GnRH, producidos recombinantemente o sintetizados de manera qui ica gue tienen las secuencias de aminoácidos gue son sustancialmente homologas a la GnRH negativa y gue permanecen inmunogénicas, como se describe posteriormente. De esta manera, el término abarcar los derivados de GnRH gue incluyen cualguiera de las adiciones, sustituciones y/o supresiones de aminoácidos, individuales o múltiples, gue se presenten de manera interna o en los términos amino o carboxi del péptido. Por consiguiente, bajo la invención, un "polipéptido de GnRH" incluye moléculas gue tienen una secuencia nativa, moléculas tal como se representa en la Figura 1 (gue tiene un residuo Gln N-terminal en lugar de un residuo de pyroGlu) , y moléculas con otras adiciones, sustituciones y/o supresiones de aminoácidos gue mantienen la capacidad para producir la formación de anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con la GnRH que se presenta de manera natural. Particularmente contempladas en la presente son secuencias repetidas de los polipéptidos de GnRH tal como en el oligómero representado en la Figura IB (en donde cada uno de los polipéptidos de GnRH seleccionados comprende una sustitución de Gln N-terminal, y en donde además cada otro polipéptido de GnRH comprende una sustitución de residuo de Asp en la posición 2) . Los epítopes de GnRH también se capturan por la definición. El término "epítope" se refiere a un sitio en un antígeno hapteno al cual se une una molécula de anticuerpo específica. Puesto gue GnRH es una molécula muy pegueña, la identificación de epítopes de la misma gue son capaces de producir una respuesta de anticuerpos se logra fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica. Ver por ejemplo Geysen y colaboradores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 8J 3998-4002 (método general de sintetización rápida de péptidos para determinar la localización de los epítopes inmunogénicos en un antígeno dado); Patente Norteamericana No. 4,708,871 (procedimientos para identificar y sintetizar técnicamente los epítopes de los antígenos); Geysen y colaboradores, Molecular Immunology (1986) 2_3:709-715 (técnica par identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo dado) .

Como se usa en la presente, el término "epítope de células T" se refiere a una característica de una estructura peptídica gue es capaz de inducir inmunidad de células T hacia la estructura peptídica o un hapteno asociado. A este respecto, se acepta en la técnica gue los epítopes de células T comprenden determinantes peptídicos lineales gue asumen conformaciones extendidas dentro de la hendidura de unión de péptido de las moléculas MHC, (Unanue y colaboradores, Science (1987) 236 : 551-557) . La conversión de los polipéptidos a determinantes peptídicos lineales, asociados con la clase II de MHC (en general entre -14 aminoácidos de longitud se llama "procesamiento de antígeno" gue se lleva a cabo por células que presentan el antígeno (APC) . En forma más particular, un epítope de células gue se define por características locales de una estructura peptídica corta, tal como las propiedades de las secuencia de aminoácidos primaria gue comprende la carga e hidrofobicidad, y ciertos tipos de estructura secundaria, tal como helicidad, que no dependen del plegado del polipéptido completo. Además, se cree gue los péptidos cortos capaces del reconocimiento por células T opcionales son en general estructuras anfipáticas gue comprenden un lado hidrófobo (para la interacción con la molécula de MHC) y un lado hidrófilo (para la interacción con el receptor de células T), (Margalit y colaboradores, Computer Aprediction of T-cell Epítopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker , Inc, ed. G.C. Woodrow y colaboradores, (1990) pp.109-116) y además que las estructuras anfipáticas tienen una configuración a-helicoidal (ver, por ejemplo, Spouge y colaboradores, J. Immunol. (1987) 138:204-212; Berkower y colaboradores, J. Im unol (1986) 136 : 2498-2503) . Por lo tanto, los segmentos de proteínas que incluyen epítopes de células T se pueden pronosticar fácilmente usando numerosos programas de computadora. (Ver, por ejemplo, Margalit y colaboradores, Computer Prediction of T-cell Epítopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc., ed. G.C. Woodrow y colaboradores, (1990) pp . 109-116) . Estos programas comparan en general la secuencia de aminoácidos de un péptido a secuencias conocidas para inducir una respuesta de células T, y buscan para patrones de aminoácidos gue se cree gue se reguieren para un epítope de células T.

Una "proteína inmunogénica" o "secuencia de aminoácidos inmunogénicos" es una proteína o secuencia de aminoácidos, respectivamente, gue produce una respuesta inmunológica en un sujeto al cual se administra. Bajo la invención, un "inmunógeno de GnRH" .se refiere a una molécula de GnRH gue, cuando se introduce en un sujeto huésped, estimula una respuesta inmunológica. A este respecto, un inmunógeno de GnRH incluye un multímero gue corresponde a más de un polipéptido de GnRH seleccionado; y, en forma más particular, a un multímero gue tiene repeticiones ya sea múltiples o en tándem de las secuencias de polipéptido de GnRH, seleccionado, repeticiones múltiples o en tándem de los epítopes de GnRH, seleccionado, o cualguier combinación concebible de los mismos . Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o vacunas en desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria, celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Usualmente, esta respuesta incluye, pero no se limita a una o más de los siguientes efectos; la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T ?d, dirigida específicamente un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Una respuesta inmunológica se puede detectar usando los varios inmunoensayos bien conocidos en la técnica. El término "polipéptido de leucotoxinas" "polipéptido de LKT" se pretende para un polipéptido gue incluye al menos un epítope de células T gue se deriva a partir de una proteína que corresponde a la familia de moléculas caracterizadas por las moléculas de aminoácido de consenso, del término carboxi Gly-Gly-X-Gly-X-Asp (Highlander y colaboradores, DNA (1989) 8_:15-28), donde X es Lys, Asp, Val o Asn. Estas proteínas incluyen, entre otras, leucotoxinas derivadas a partir de P. hae olyticia y Actinobacillus pleuropneumoniae , así como la alfa-hemolisina de E. coli (Strathdee y colaboradores, Infect. Immun . (1987) 55:3233-3236; Lo, Can. J. Vet. Res. (1990) 54:521-528) . Esta familia de toxinas se conoce como la familia "RTX" de toxina (Lo, Can. J. Vet. Res. (1990) 5_4: S33-S35 ) . Además, el término "polipéptido de leucotoxina" se refiere a un polipéptido de leucotoxina que se sintetiza químicamente, se aisla a partir de un organismo que expresa el mismo, o se produce de manera recombinante. Además, el término se propone para una proteína homogénica gue tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a una secuencia de aminoácidos contigua encontrada en la molécula de leucotoxina nativa, particular. De esta manera, el término incluye tanto secuencias de longitud completa como parciales, así como análogos. Aungue las leucotoxinas de longitud completa, nativas, exhiben actividad citotóxica, el término "leucotoxina" también se propone para moléculas gue permanecen inmunogénicas aún carentes del cráter citotóxico de las leucotoxinas nativas. Las secuencia de nucleótidos y las secuencia de aminoácidos correspondientes para varias leucotoxinas se conoce. Ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 4,957,739 y 5,005,400; Lo y colaboradores, Infect. Immun . (1985) 5_0: 667-67; Lo y colaboradores, Infect. Immun . (1987) 55:1987-1996; Strathdee y colaboradores, Infect. I mun (1987) 5_5: 3233-3236; Highlander y colaboradores, DNA ( 1989) 8_: 15-28 ; Welch, Mol. Microbiol. (1991) .5:521-528. En las quimeras producidas de acuerdo con la presente invención, una secuencia de polipéptido de leucotoxina seleccionado imparte inmunogenicidad mejorada a uno o más multímeros de GnRH fusionados al proporcionar, entre otras cosas, epítopes de células T gue comprende pegúenos segmentos peptídicos en el intervalo de 5 a 14 aminoácidos de longitud gue son capaces de volverse complejos con las moléculas de la clase II de MHC para la presentación A, o la activación de, células T auxiliares. Como se discute posteriormente además, estos epítopes de células T ocurren a todo lo largo de la molécula de leucotoxina y se piensa gue se concentran en las porciones del N-término de la leucotoxina, es decir, entre los residuos de aminoácidos 1 a 199. Como se usa en la presente, un polipéptido de leucotoxina "gue carece de actividad citotóxica" se refiere a un polipéptido de leucotoxina como se describe anteriormente que carece de citotoxicidad significante en comparación a una leucotoxina de longitud completa, nativa (tal como la leucotoxina de p. haemolítica de longitud completa descrita en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,055,400 y 4,957,739) que mantiene una inmunogenicidad y al menos un epítope de células T. Los polipéptidos de leucotoxina se pueden probar para la actividad citotóxica usando cualguiera de los ensayos conocidos tal como el ensayo de liberación de lactato-deshidrogenasa, descrito por Korzeniewski y colaboradores, Journal of Im unological Methods 6_4: 313-320 en donde se mide la citotoxidad por la liberación de la lactato-deshidrogenasa a partir de los neutrófilos bovinos. Una molécula de leucotoxina se identifica como citotóxica si provoca una liberación estadísticamente significante de lactato-deshidrogenasa en comparación a una molécula no citotóxica de control . La provisión de las guimeras de LKT-GnRH comprende polipéptidos de leucotoxina que carecen de actividad citotóxica que proporciona varios beneficios importantes. De manera inicial, un polipéptido de leucotoxina que carece de actividad citotóxica es deseable puesto que la inyección de una toxina activa en un sujeto puede dar por resultado la muerte celular localizada (PMN y macrófagos) y a su vez, provoca una respuesta inflamatoria severa y abscesos en el sitio de inyección. A este respecto, la actividad citotóxica gue da por resultado la muerte de los macrófagos puede conducir a una presentación reducida en antígenos y por lo tanto una respuesta inmunitaria sub-óptima. La remoción de la porción citotóxica como se encuentra en los polipéptidos de LKT no citotóxicos usados en la producción de las proteínas de fusión de la invención también da por resultado un gen de LKT truncado gue es capaz de ser expresado a niveles mucho más alto que la LKT de longitud completa. Además, el uso de los polipéptido de LKT no citotóxicos en las fusiones construidas en la presente gue mantienen suficiente antigenicidad de células T reduce la cantidad completa del antígeno leucotoxina-GnRH gue necesita ser administrado a un sujeto huésped para producir una suficiente respuesta de células B a los polipéptidos de GnRH seleccionados. Los ejemplos particulares de los polipéptidos de leucotoxina inmunogénicos gue carecen de actividad citotóxicas incluyen LKT 352, LKT 111, y LKT 101 gue se describen en detalle posteriormente. Por "LKT 352" se guiere decir una proteína gue se deriva a partir del gen lk tA presente en el plásmido pAA352 (Figura 2 , No . de Acceso de ATCC 68283) . La secuencia de nucleótidos y la presente secuencia de aminoácidos de este gen se describen en la Publicación Internacional No. WO 91/15237 y se muestran en la Figura 3. El gen codifica por una leucotoxina truncada, gue tiene 914 aminoácidos y un peso molecular estimado de aproximadamente 99 kDa, que carece de la porción citotóxica de la molécula. El gen truncado producido de esta manera se expresa a niveles mucho más alto gue la molécula de longitud completa (más de 40 % de la proteína del total de la célula contra menos del 1 % de la proteína total de la célula para la forma de longitud completa) y se purifica de manera más fácil. La KT352 derivada no se deriva necesariamente de manera física de la secuencia presente en el plásmido gue AT52. En cambio, se puede generar de cualguier manera gue incluye, por ejemplo, la síntesis guímica o producción recombinante. Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína necesita solo se sustancialmente homologa a la secuencia representada. De esta manera, las variaciones de la secuencia pueden estar presentes siempre gue el polipéptido de LKT funcione para mejorar la inmunogenicidad del antígeno con el cual se asocia aún también carece de actividad citotóxica. Por "LKT 111" se quiere decir un polipéptido de leucotoxina gue se deriva a partir del gen LKTA presente en el plásmido pCBlll (Figura 6, No. de Acceso de ATCC No. 69748) . La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestran en la Figura 7. El gen codifica para una versión acortada de la leucotoxina gue se desarrolló a partir del gen de leucotoxina recombinante presente en el plásmido pAA352 (Figura 2, No. de Acceso de ATCC 68283) por la remoción de un fragmento de ADN interno de aproximadamente 1300 pb de longitud. El polipéptido de LKT 111 tiene un peso molecular estimado de 52 kDa (en comparación al polipéptido de LKT 352 y 99 kDa), pero mantiene las porciones del N-término LKT 352 gue contiene los epítopes de células T que son necesarios para la suficiente inmunogenicidad de células T, y las porciones del C-término de LKT 352 gue contiene sitios de restricción convenientes para el uso en la producción de las proteínas de fusión de la presente invención. Bajo la invención, el péptido de leucotoxina LKT 111 no es necesariamente derivado de manera física a partir de la secuencia presente en el plásmido pCBlll. En cambio, se puede generar de cualquier manera, que, incluye, por ejemplo, por síntesis química o reproducción recombinante. Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína necesita ser solo sustancialmente homologa a la secuencia representada. De esta manera, las variaciones de la secuencia se pueden presentar siempre que la proteína funcione para mejorar la inmunogenicidad del antígeno con el cual está asociado y carece de citotoxicidad. Por "LKT 101" se guiere decir un polipéptido de leucotoxina gue se deriva a partir del gen lktA presente en el plásmido pAAlOl (Figura 10, No. de Acceso de ATCC 67883) la secuencia de aminoácido pronosticada de la leucotoxina de P. haemolítica producida a partir de la construcción de pAAlOl se representa en la Figura 11. El polipéptido de LKT 101 se representa a partir de una forma truncada del gen de IktA gue contiene el extremo 5' del gen hasta el único sitio de endonucleasa de restricción Pstl. El gen truncado se fusionó al gen de ß-galactosidasa (lacZ) para facilitar la purificación del polipéptido de LKT 101. Bajo la invención, el péptido de leucotoxina de LKT 101 no se deriva necesariamente de manera física a partir de la secuencia presente en el plásmido pAAlOl. En cambio, se puede generar de cualguier manera, gue incluye, por ejemplo por síntesis guímica, o producción recombinante.

Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína solo necesita ser sustancialmente homologa a la secuencia representada. De esta manera, las variaciones de la secuencia pueden estar presentes siempre gue la proteína funcione para mejorar la inmunogenicidad del antígeno con el cual está asociado y carece de citotoxicidad. Una guimera de polipéptido de leucotoxina-GnRH exhibe "inmunogenicidad incrementada" cuando posee una gran capacidad para producir un respuesta inmunitaria que los correspondientes o más multímeros de GnRH solos. Esta inmunogenicidad incrementada se puede determinar al administrar los controles del polipéptido de la leucotoxina-GnRH, y de multímero de GnRH, particulares, a los animales, y al comparar los títulos de anticuerpos anti-GnRH obtenidos de esta manera usando ensayos normales tal como radioin unoensayo y ELISA, bien conocidos en la técnica. Proteínas o polipéptidos "recombinantes" se refieren a polipéptidos producidos por técnicas de ADN recombinante; es decir, producidos a partir de células transformadas por una construcción de ADN exógeno gue codifica para el polipéptido deseado. Proteínas o polipéptidos "sintéticos" son aquellos preparados por síntesis química. Una "secuencia de codificación" de ADN o "una secuencia de nucleótidos que codifica para" una proteína particular, es una secuencia de ADN que se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo o in vitro cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas . Los límites de la secuencia de codificación se determinada por el codon de inicio en el término 5' (amino) y el codon finalizador de traducción en el término 3' (carboxi) . Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, secuencia procarióticas, ADNc a partir de ARNc eucariótico, secuencias de ADN genómico a partir de ADN eucariótico (por ejemplo, mamífero), y aún secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de transcripción usualmente se localizará en 3' a la secuencia de codificación. "Secuencias de control" de ADN se refiere colectivamente a las secuencias promotoras, sitios de unión de ribosoma, señales de poliadenilación, secuencia de terminación de transcripción, dominios regulares en la dirección 3 ' , intensificadores , y similares, gue proporcionan colectivamente la transcripción y la traducción de una secuencia de codificación en una célula huésped. Una secuencia de codificación se "enlaza operablemente a" otra secuencia de codificación cuando la ARN-polimerasa transcribirá las dos secuencias de codificación en el ARNm, gue luego se traducen en un proteína guimérica codificado por las dos secuencias de codificación. Las secuencias de codificación no necesitan estar contiguas entre sí siempre gue la secuencia transcripta se procese finalmente para producir la proteína guimérica deseada. Una secuencia de control se "enlaza operablemente a" una secuencia de codificación cuando controla la transcripción de la secuencia de codificación. Una secuencia de control "dirige la transcripción" de una secuencia de codificación en una células cuando la ARN-polimerasa unirá la secuencia promotora y transcribirá la secuencia de codificación en el ARNm, gue luego se traduce en el proteína codificado por la secuencia de codificación. Una "célula huésped" es una células gue se ha transformado, o es capaz de la transformación por una secuencia de ADN exógeno.

Una células se ha "transformado" por el ADN exógeno cuando este ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. El ADN éxógeno puede estar integrado, o no (enlazado covalentemente) al ADN cromosómico constituyendo el genoma de la célula. En células procariótas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno se puede mantener en un elemento episómico, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada de manera estable es una en la cual el ADN exógeno ha llegado a ser integrado en el cromosoma, de modo gue se hereda por las células hijas a través dé la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariótica para establecer líneas de células o clones comprendidos de una población de células hijas gue contienen el ADN exógeno . Dos secuencias de ADN o polipéptidos son "sustancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente 80 % (preferentemente al menos cerca de 90 %, y en forma más preferente al menos cerca de 95 % (de los nucleótidos o aminoácidos se igualan sobre un intervalo definido de la molécula) . Las secuencias de ADN gue son sustancialmente homologas se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas, como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas están dentro de la habilidad de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook. y colaboradores, supra; DNA Cloning, vols I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. Una región "heteróloga" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro o unido a otra molécula de ADN gue no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. De esta manera, cuando la región heteróloga modifica para un gen bacteriano, el gen se flangueará usualmente por el ADN gue no flanquea el gen bacteriano en el genoma de la bacteria fuente. Otro ejemplo de la secuencia de codificación heteróloga es una construcción donde la secuencia de codificación misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas gue tienen diferente codones del gen nativo) . Las variaciones alélicas o los eventos mutantes gue se presentan de manera natural no ocasionan una región heteróloga de ADN, como se usa en la presente.

Por "sujeto vertebrado" se guiere decir cualguier miembro del subphylum chordata gue incluye, pero sin limitación, mamíferos tal como roedores, ganado, cerdos, ovejas, cabras, caballos y hombre; animales domésticos tal como perros y gatos; pájaros, incluyendo domésticos, silvestres y pájaros de caza tal como gallos y gallinas gue incluyen pollos, guajolotes y otros pájaros gallináceos. El término no denota una generación particular. De esta manera, los animales adultos y recién nacidos se proponen para ser cubiertos.

B. Métodos Generales El punto central de esta invención es el descubrimiento gue los polipéptido de leucotoxina, cuando se acoplan a repeticiones de polipéptido de GnRH, seleccionado (o multímeros) son capaces de conferir inmunogenicidad superior a las porciones de GnRH asociadas. A este respecto, los polipéptidos de leucotoxina actúan como proteínas portadoras gue presentan multímeros de GnRH seleccionados al sistema inmunitario de un sujeto en una forma altamente inmunogénica. De esta manera, las proteínas guiméricas construidas bajo la invención se pueden formular en composiciones de vacuna que proporcionan inmunogenicidad mejorada a los polipéptidos de GnRH representados con los mismos. La porción del gen de leucotoxina a los polipéptidos GnRH seleccionados también facilita la purificación de la proteína guimérica a partir de células que usan las mismas. Por consiguiente, se ejemplifica en la presente quimeras de leucotoxina que incluyen leucotoxina fusionada a más de un polipéptido de GnRH. Las modalidades particulares de la presente invención incluyen quimeras que contienen un polipéptido de leucotoxina fusionado a uno o más multímeros de GnRH, en donde los multímeros tienen al menos una secuencia de decapéptidos , de GnRH de repetición, o al menos una unidad de repetición de una secuencia que corresponde a al menos un epítope de una molécula de GnRH seleccionada. Además las secuencias de péptidos de GnRH, seleccionadas pueden todas las mismas, o pueden corresponder a diferentes derivados, análogos, variantes o epítopes de GnRH siempre gue mantengan la capacidad para producir una respuesta inmunitaria. Una secuencia de nucleótidos representativa de un megapéptido de GnRH se representa en la Figura ÍA.

La presente secuencia de GnRH se modifica por la sustitución de un residuo de glutamina en el N-término en lugar del ácido piroglutámico gue se encuentra en la secuencia nativa. Esta sustitución particular vuelve a una molécula gue mantiene la estructura nativa de ácido glutámico, pero también conserva la estructura sin cambio de piroglutamato . Por consiguiente, el péptido resultante no reguiere ciclización del residuo de ácido glutámico y se puede producir en ausencia de las condiciones necesarias para efectuar la ciclización. Debido a gue la secuencia de GnRH es relativamente corta, se puede generar fácilmente usado técnicas sintéticas, como se describe en detalle posteriormente. Bajo la invención, una secuencia de polipéptido de leucotoxina se usa para conferir inmunogenicidad en polipéptidos de GnRH asociados (como una proteína portadora) a fin de ayudar a producir una respuesta inmunitaria adecuada hacia la GnRH endógena en un sujeto invertebrado. De esta manera, la inmunización con GnRH puede regular la efectividad en un sujeto vacunado por el rompimiento de los ciclos de estro o espermatogénesis. Se puede encontrar una discusión detallada de GnRH en la Patente Norteamericana No. 4,975,420. Es un objeto particular de la invención proporcionar una alternativa confiable y efectiva para procedimientos de esterilización invasivos practicados concurrentemente en la cría de animales domésticos y de granja, tal como la castración guirúrgica, la ovariohis terectomia Quirúrgica y similares. La inmunosupresión de la actividad reproductiva en sujetos vertebrados usando quimeras de leucotoxina-GnRH construidas de acuerdo con la presente invención proporciona una alternativa efectiva ya se las construcciones efectúan la inactivación uniforme de la actividad reproductiva a los animales inmunizados. A este respecto, un producto de vacuna de esterilización, adecuado, debe servir para inactivar de manera uniforme las capacidades reproductivas en animales individuales en respuesta a un mínimo de vacunaciones a fin de proporcionar una alternativa exitosa a procedimientos quirúrgicos. Esta característica es particularmente importante para la inmunoesterilización de animales de rebaño, y en particular en donde se desea inmunocas trar lechones machos para prevenir la "mancha de los verracos" que se produce por la síntesis de los esteroides sexuales en el funcionamiento normal de los testículos de los lechones machos. Ver, por ejemplo, Meloen y colaboradores, Vaccine (1994) 1_2 ( 8 ) :741-746. Los intentos anteriores para desarrollar este producto no han producido resultados debido a la insuficiente inmunogenicidad de los péptidos de GnRH y/o los sistemas portadores relacionados, de la incapacidad importante de varias vacunas anteriores basadas en GnRH para inducir suficientes respuestas inmunitarias hacia al GnRH endógeno. También es un objeto particular de la invención proporcionar un método para reducir el incidente de tumores mamarios en sujetos mamíferos usando las moléculas de fusión de leucotoxina-GnRH producidas en la presente en una vacuna para bloguear las funciones ováricas reguladas por GnRH tal como la producción de las hormonas ováricas, estrógeno y progesterona en sujetos vacunados. El papel de estrógeno y progesterona en la etiología de los tumores mamíferos está bien establecido. Estos esteroides ováricos son importantes en las etapas tempranas del cáncer, pero una vez gue se han llegado a establecer los tumores mamarios, algunos tumores llegan a ser dependientes de los esteroides. Ver, por ejemplo, the Texbook of Endocrinology, 7 h Edition, Wilson y colaboradores (eds), (1985)pp 68-69. El estrógeno y progesterona también se conocen gue son carcinogénicos y principalmente responsables de los tumores mamarios en perros . Por consiguiente, las quimeras del polipéptido de leucotoxina-GnRH contempladas en la presente comprenden una o más porciones de GnRH que tienen una pluralidad de secuencias de polipéptido que GnRH, seleccionado a fin dar un antígeno de péptido de GnRH, más inmunogénico. Esta característica se basa en el reconocimiento gue las proteínas endógenas en general se pueden volver antígenos efectivos por la ultimeri zación de sus epítopes como se describe en detalle anteriormente. En forma más particular, las porciones de GnRH de las presentes quimeras de leucotoxina de GnRH pueden comprender repeticiones ya sea múltiples o en tándem de las secuencia de GnRH, seleccionadas, repeticiones múltiples en tándem de los epítopes de GnRH seleccionados, o cualquier combinación concebible de los mismos. Los epítopes de GnRH se pueden identificar usando técnicas como se describe en detalles anteriormente, o fragmentos de las proteínas de GnRH se pueden probar para la inmunogenicidad y los fragmentos activos usados en las composiciones en lugar del polipéptido completo. Cuando más de un multímero de GnRH se incluye en las moléculas quiméricas, cada porción de GnRH puede ser la misma o diferente de las otras porciones de GnRH incluidas en la molécula. La secuencia de una porción de GnRH particular usada en la presente se representa en la Figura IB, en donde cuatro secuencias de GnRH, indicadas en (1), (2), (3), y (4) respectivamente se separan por secuencias espaciadoras de aminoácidos de terceto que comprende varias combinaciones de residuos de serina y glicina. En el presente oligómero, cada secuencia de GnRH diferente (agüellas indicadas en (2) y (4), respectivamente) contienen una sustitución de aminoácido no conservadora en la segunda posición del decapéptido de GnRH gue comprende un residuo de Asp en lugar del residuo de His encontrado en la secuencia de GnRH nativa. La secuencia multimérica de GnRH, alternante, producida de esta manera da un péptido de antígeno de GnRH, altamente inmunogénico para el uso en las proteínas de infusión de esta invención. Otros análogos de GnRH gue corresponden a cualquiera de las adiciones, sustituciones y/o supresiones de aminoácido, individuales o múltiples también se contempla particularmente para el uso en ya sea secuencias multiméricas repetitivas o alternantes. En una función particular de leucotoxina-GnRH, se fusionan cuatro copias de la porción de GnRH representadas en la Figura IB a una molécula de leucotoxina tal gue la molécula de leucotoxina se plantea en su N- y C-término con dos copias del presente multímero de GnRH. Además, la porción de GnRH particular representada en la Figura IB contiene secuencias espaciadoras entre las porciones de GnRH. El uso estratégico de varias secuencias espaciadoras entre los polipéptido de GnRH seleccionados se usa en la presente para conferir inmunogenicidad incrementada en las presentes construcciones. Por consiguiente, bajo la invención, una secuencia espaciadora seleccionada puede codificar para una amplia variedad de porciones de uno o más aminoácidos de longitud. Los grupos espaciadores seleccionados pueden proporcionar de manera preferentemente sitios de escisión de enzimas de modo que la guimera expresada se pueda procesar por enzimas proteolíticas in vivo (por APC o similar) para producir el número de péptidos, cada uno de los cuales contiene al menos un epítope de células) T derivado de la porción portadora (porción de leucotoxina), y que se fusiona preferentemente a una secuencia de polipéptido de GnRH, sustancialmente completa. Los grupos espaciadores se pueden construir de modo que la región de unión entre las porciones de GnRH seleccionadas comprende una secuencia claramente extraña al sujeto inmunizado, confiriendo de esta manera inmunogenicidad mejorada en los péptidos de GnRH asociados. Adicionalmente, las secuencias espaciadoras se pueden construir para proporcionar antigenicidad de células T, tal como aquellas secuencias que codifican para las secuencias peptídicas amfipática y/o a-helicoidales que se reconocen en general en la técnica como gue proporcionan epítopes y células T, auxiliares, inmunogénicos. La lección de los epítopes de células T particulares gue se va a proporcionar por las secuencias espaciadoras puede variar dependiendo de las especies particulares de vertebrados gue se van a vacunar. Aunque las porciones de GnRH particulares se ejemplifican, las cuales incluyen secuencias espaciadoras, también es un objeto de la invención proporcionar uno o más multímeros de GnRH que comprende secuencias de GnRH, directamente adyacentes (sin la intervención de secuencias espaciadoras) . El complejo de polipéptido de leucotoxina-GnRH se puede producir convenientemente de una manera recombinante como una proteína quimérica. Las porciones de GnRH en la quimera se pueden fusionar 5' y/o 3' a la porción de leucotoxina de la molécula, una o más porciones de GnRH se pueden localizar en sitios internos a la molécula de leucotoxina, o la quimera puede comprender cualquier combinación de las porciones de GnRH en estos sitios. La secuencia de nucleótidos que codifica para la leucotoxina a uno de p-haemolítica de longitud completa se ha determinado. Ver por ejemplo, Lo, Infect. Immun (1987) 55:1987-1966; Patente Norteamericana No. 5,055, 400. Adicionalmente, se describen en la presente varias secuencias leucotoxinas variantes. De manera similar, las secuencias de codificación para la GnRH porcina, bovina, y ovina se ha determinado (Mrad y colaboradores, Hormones and Hormone Antagonists, in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Sexta Edición (1980), y el ADNc para la GnRH humana se ha clonado de modo que su secuencia está bien establecida (Seeburg y colaboradores, Nature (1984) 311 : 666-668) . Los polipéptidos adicionales de GnRH de secuencias conocidas se han descrito, tal como la molécula de GnRH gue se presenta en salmón y gallinas (Publicación Internacional No. 86/07383, publicada el 18 de Diciembre de 1986) . La secuencia de codificación de GnRH está altamente conservada en vertebrados, particularmente en mamíferos, y las secuencias de GnRH porcina, bovina, ovina y humana son idénticas entre sí. Los genes de leucotoxina y GnRH deseados se pueden clonar, aislar y ligar conjuntamente usando técnicas recombinantes conocidas en general en la técnica. Por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra. De manera alternativa, las secuencias de ADN gue codifican para las proteínas quiméricas se pueden preparar de manera sintética en lugar de ser clonadas. La secuencia de ADN se puede diseñar con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular. En general, se seleccionarán los codones preferidos para el resto propuesto si la secuencia se usará para la expresión. La secuencia completa se monta del oligonucleótidos de traslape preparados por métodos normales y se monta en una secuencia de codificación completa. Ver por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair y colaboradores. Sience (1984)223:1299; Jay y colaboradores J. Biol. Chem. (1984) 259: 6311. Una vez gue la secuencia de codificación para las proteínas quiméricas se han preparado o asilado, se pueden clonar en cualquier vector adecuado o replicón. Se conocen numerosos vectores de clonación por aquellos expertos en la técnica, y la selección de un vector apropiado es una materia de elección. Los ejemplos de vectores de ADN recombinantes para la clonación en células huésped que se pueden transformar incluyen el bacteriófago lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli),pKT230 (bacterias gram-negativas ) , pGV1106 (bacterias gram-negativas), pLAFRl (bacterias gra -negativas), pME290 (bacterias gram-negativas no se E. coli), pHV14 (E.coli y Bacillus subtilis), pDB9 (Bacillua) , pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces ), Yip5 (Saccharomyces), Ycpl9 (Saccharomyces) y virus de papiloma bovino (células de mamífero) . Ver, en general, DNA Cloning : Vol . s I «S II, Supra:T. Maniatis y colaboradores, supra; B. Perbal, supra. El gen de infusión se puede colocar bajo el control de un promotor, sitio de unión de ribosoma (para la expresión bacteriana) y opcionalmente, un operador (referido colectivamente en la presente como elementos de "control"), de modo gue la secuencia de ADN gue codifica para la proteína guimérica se transcribe en el ARN en la célula huésped transformada por un vector gue contiene esta obstrucción de expresión. La secuencia de codificación puede contener o no un péptido de señal o secuencia guía. Las proteínas quiméricas de la presente invención se pueden expresar usando, por ejemplo, el promotor nativo de P. haemolítica, el promotor de tac de E. coli o el promotor del gen de la proteína A, (spa) en la secuencia de señal. Las secuencias guías se pueden remover por el huésped bacteriano en el procesamiento pos t- transduccional . Ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397. Además de las secuencias de control, puede ser deseable accionar secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias de proteína con relación al crecimiento de la célula huésped. Las secuencias reguladoras se conocen por aquellos expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen aquellos que provocan la expresión de un gen gue se va activar o desactivar en respuesta a un estímulo químico físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores, en el vector, por ejemplo, secuencia intensi ficadoras . Un vector de expresión se construye de modo que la secuencia de codificación de la fusión particular se localice en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, la colocación y orientación de la secuencia de codificación con respecto a las secuencias de control gue es tal gue la secuencia de codificación se transcribe bajo el "control" de las secuencias de control (es decir, ARN-polimerasa gue une la molécula de ADN en las se secuencias de control, transcribe la secuencia de codificación) . La modificación de las secuencias gue codifican para la proteína guimérica particular de interés puede ser deseable para lograr este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia, de modo que se puede unir a la secuencia de control con orientación apropiada, es decir, para mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden ligar a la secuencia de codificación antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritas anteriormente. De manera alternativa, la secuencia de codificación se puede clonar directamente en un vector de expresión que contiene ya las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado. En algunos casos, puede ser deseable adicionar secuencias gue provoquen la secreción del polipéptido a partir del organismo huésped, con la escisión subsecuente de la señal segregadora. También puede ser deseable producir mutantes o análogos de las proteína quiméricas de interés. Los mutantes o análogos se pueden preparar por la supresión de una porción de la secuencia que codifica o para la proteína, por la inserción de una secuencia, y/o por la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar la secuencia de nucleótidos, tal como la mutagénesis dirigida a la secuencia, son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, T. Maniatis y colaboradores, supra; DNA Cloning, Vols. I, y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. Se conocen en la' técnica un número de vectores de expresión procarióticos. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; ver también las Solicitudes de Patentes Británicas GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; y la Solicitud de Patente Europea 103,395. Los vectores de expresión de levadura también se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; también ver las Solicitudes de Patentes Europeas Nos. 103,409; 100,561; 96,491. Dependiendo del sistema de expresión y el huésped seleccionado, las proteínas de la presente invención se producen al cultivar célula huésped transformada por el vector de expresión descrito anteriormente bajo condiciones por las cuales expresa la proteína de interés. La proteína guimérica luego se aisla de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión segrega la proteína en el medio de cultivo, la proteína se puede purificar directamente en el medio. Si la proteína no se segrega, se aisla de los lisados celulares. La selección de las condiciones apropiadas de crecimiento y los métodos de recuperación están dentro de la habilidad de la técnica . Las proteínas guiméricas de la presente invención también se pueden producir por síntesis guímica, tal como por síntesis peptídica de fase sólida, en base a las secuencias determinadas de aminoácidos. Estos métodos se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ver por ejemplo J. N. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co . , Rockford, IL (1984) y G. Barany y R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, Nueva York, (1980), pp . 3-254, for solid phase peptide synthesis techniques; y M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis , Synthesis , Biology, supra, Vol. 1, for classical solution synthesis. Se pueden inmunizar sujetos contra la GnRH endógena por a administración de composiciones de vacuna gue incluyen las presentes proteínas guiméricas de leucotoxina GnRH. Antes de la inmunización, puede ser deseable incrementar adicionalmente la inmunogenicidad de una proteína guimérica particular. Esto se puede lograr de cualguiera de varias maneras conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la proteína de fusión de polipéptido de leucotoxina-GnRH se puede administrar enlazada a un portador secundario. Por ejemplo, se puede conjugar un fragmento con un portador macromolecular. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tal como: Proteínas; polisacáridos, tal como sefarosa, agarosa, celulosa, cuentas de' celulosa y similares, aminoácidos poliméricos tal como ácido poliglutámico, polilisina y similares; copolímeros de aminoácidos; y partículas de virus inactivas. Los substratos proteicos especialmente útiles son albúminas séricas, hemocianina de lapa, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, y otras proteínas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los substratos proteicos se pueden usar en su forma nativa o su contenido de grupos funcionales se pueden modificar, por ejemplo, por succinilación de los residuos de lisina o la reacción con Cys- tiolactona . También se puede incorporar un grupo de sulfidrilo en el portador (o polipéptidos de GnRH seleccionados) por ejemplo, por la reacción de las funciones amino con 2-iminotiolano o el éster de N-hidroxisuccinimida de 3- ( 4-ditiopiridil-propionato . Los portadores adecuados también se pueden modificar para incorporar brazos espaciadores. Tal como hexametilen-diamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar. Para la unión de los péptidos. Otros portadores adecuados para las proteínas guiméricas de la presente invención incluyen los polipéptidos VP6 de rotavirus, o los fragmentos funcionales de los mismos, como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,071,651. También útil es un producto de fusión de una proteína viral de un inmunógeno de leucotoxina-GnRH, donde este producto de fusión se hace por métodos descritos en la Patente Norteamericana No. 4,722,840. Aún otros portadores adecuados incluyen células, tal como linfocitos, puesto gue la presentación en esta forma imita el modo natural de presentación en el sujeto, gue ocasiona el estado inmunizado. Alternativamente, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden acoplar a eritrocitos, preferentemente los propios eritrocitos del sujeto. Los métodos para acoplar los péptidos a las proteínas o células son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las proteínas quiméricas de la presente invención también se pueden administrar vía un virus portador que expresa al mismo. Los virus portadores que encontraron uso en la presente incluyen, pero no se limitan a, los virus de vaccinia y viruela, adenovirus, virus del herpes. A manera de ejemplo, los recombinantes de virus de vaccinia expresan las nuevas proteínas quiméricas se pueden construir como sigue. El ADN gue codifica para la proteína guimérica particular de leucotoxina-GnRH se inserta primero en un vector apropiado de modo gue está adyacente a un promotor de vaccinia y las secuencias de ADN de vaccinia de flangueo, tal como la secuencia gue codifica para la timidina-cinasa (TK) . Este vector luego se usa para transfectar células gue se afectan simultáneamente con vaccinia. La recombinante homologa sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica para la proteína quimérica en el genoma viral. El TK-recombinante resultante se puede seleccionar al cultivar las células en la presencia de 5-bromodesoxiuridina y placas virales de recolección resistentes a la misma. También es posible inmunizar un sujeto con las presentes proteínas guiméricas, ya sea administradas solas, o mezcladas con un vehículo excipiente farmacéuticamente aceptable. Típicamente, las vacunas se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección se pueden preparar. La preparación también se puede emulsionar o el ingrediente activo se encapsula en los vehículos de liposoma. El ingrediente inmunogénico activo frecuentemente se mezcla con vehículos que contienen excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los vehículos adecuados son por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tal como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de amortiguación al pH, o adyuvantes gue mejoran la eficacia de la vacuna. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, dipéptidos muramílicos, avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas y otras sustancias conocidas en la técnica. Los métodos actuales para preparar estas formas de dosis se conocen, o serán aparentes por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18a edición, 190. La composición o acumulación que se va administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad de la proteína adecuada para lograr el estado inmunizado deseado en el sujeto que se trata. Las formulaciones de vacuna adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios, y en algunos casos, formulaciones en aerosol, intranasales u orales, y formulaciones de liberación sostenida. Para los supositorios, la conclusión de vehículo incluirá aglutinantes y portadores tradicionales, tal como polialcalinglicoles o triglicéridos . Estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas gue contienen el ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente 0.5 % hasta aproximadamente 10 % (p/p), en forma preferente cerca de 1 % hasta 2 %. Otros vehículos incluyen estos excipientes normalmente empleados como por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, magnesia, estearato, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Las composiciones de vacuna orales se pueden tomar en la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen desde cerca de 1 % hasta aproximadamente 30 % del actividad inhibitoria. En forma preferente cerca de 2 % hasta aproximadamente 20 %. Las formulaciones intranasales incluirán usualmente vehículos gue no causen irritación a la mucosa intestinal ni rompan significativamente la función ciliar. Los diluyentes tal como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas se pueden emplear con la presente invención. Las formulaciones nasales también pueden contener conservadores tal como, pero no limitados a clobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un agente tensioactivo para mejorar la absorción de las presentes proteínas por la mucosa nasal . Las formulaciones de liberación sostenida o controlada se hacen al incorporar las proteínas guiméricas en los portadores o vehículos tal como liposomas, polímeros impermeables no reabsorbibles tal como copolímeros de acetato de etilenvinilo y copolímeros Hytrel®, polímeros hinchables tal como hidrogeles, o polímeros reabsorbibles tal como colágeno y ciertos poliácidos o poliésteres tal como aquellos usados para hacer suturas reabsorbibles. Las proteínas quiméricas también se pueden presentar usando minibombas implantadas, bien conocidas en la técnica. Adicionalmente, las proteínas quiméricas (o complejos de las mismas) se pueden formular en composiciones de vacuna ya sea en formas neutrales o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos aminovirus de los polipéptidos activos) y gue se forman en los ácidos inorgánicos tal como por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o sales orgánicos tal como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas tal como por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o de fierro, y bases orgánicas tal como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol , histidina, procaína y similares . Para inmunizar un sujeto, una guimera de leucotoxina-GnRH seleccionada se administra parenteralmente, usualmente por la inyección intramuscular en un vehículo apropiado. Sin embargo, también son aceptables otro modo de administración tal como . inyección intravenosa, subcutánea y distribución intranasal. Las formulaciones de vacuna inyectables contendrán una cantidad efectiva del ingrediente activo en un vehículo, la cantidad exacta que se administra fácilmente por una persona experta en la técnica. El ingrediente activo puede variar típicamente desde cerca de 1 % hasta aproximadamente 95 % (p/p) d ella composición, o es más alta o más baja si es apropiado. La cantidad gue se va administrar depende del animal que se va a tratar, la capacidad del sistema inmunitario del animal para sintetizar los anticuerpos, y el grado de producción deseado.

Con las presentes formulaciones de vacuna, aproximadamente 1 µg a 1 mg en forma más general 5 µg a 200 µg del polipéptido de GnRH por ml de solución inyectada, debe ser adecuado para formular una respuesta inmunológica cuando se administra. A este respecto, la relación de GnRH a leucotoxina en los antígenos de leucotoxiná en los antígenos de leucotoxina-GnRH de las presentes formulaciones de vacuna variarán en base a las porciones particulares de polipéptido de leucotoxina GnRH, seleccionadas para construir estas moléculas. En forma más particular, en los polipéptidos de leucotoxina-GnRH usados en la producción de las formulaciones de vacuna bajo la invención, habrá cerca de 1 a 40 % de GnRH, en forma preferente de 3 a 30 % y en forma más preferente cerca de 7 a 27 % de polipéptido de GnRH por molécula de fusión. Los incrementos en el porcentaje de GnRH presentes con los antígenos de LKT-GnRH reduce la cantidad del antígeno total gue se debe administrar a un sujeto a fin de producir una respuesta de zonas B efectiva a GnRH. Las dosis efectivas se pueden establecer fácilmente por un experto en la técnica mediante ensayos de rutina que establezcan las curvas de respuesta de dosis. El sujeto se inmuniza por la administración del polipéptido de leucotoxina-GnRH en al menos una dosis, y en forma preferente dos dosis. Además, el animal se puede administrar tantas dosis como se requiere para mantener un estado de inmunidad.

A continuación están ejemplos de las modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente, y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención en ninguna manera.

C . Experimental Materiales y Métodos Las enzimas se compraron de fuentes comerciales, se usaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los radionucleótidos y filtros de nitrocelulosa también se compraron de fuentes comerciales. En la clonación de los fragmentos de ADN, excepto donde se señala, todas las manipulaciones de ADN se hicieron de acuerdo con procedimientos normales. Ver Sambrook y colaboradores, supra. Las enzimas de restricción, T4-ADN-ligasa, ADN-polimerasa E. coli, fragmento Klenow y otros reactivos biológicos se compraron de proveedores comerciales y se usaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los fragmentos de ADN de doble hebra se separaron en geles de agarosa . Se prepararon genotecas de ADNc y genómicas por técnicas normales en pUC13 y el bacteriófago lambda gtll, respectivamente. ver DNA CLONING: Vols I y II, supra. La cepa B122 del serotipo 1, biotipo A, ("Al") de P. haemolítica se aislo del pulmón de un becerro gue murió de pasteurolosis neumótica y se almacenó a -70°C en sangre desfibrilada . Se llevó a cabo la propagación de rutina en placas de agar de sangre o en el caldo de infusión de cerebro y corazón (Difco Laboratories, Detroit, MI) complementado con suero de caballo al 5 % (p/p) (Gibco Canadá Ltd, Burlington, Canadá) . Todos los cultivos se incubaron a 37°C.

Ejemplo 1 Aislamiento del Gen de Leucotoxina de P haemolítica Para aislar el gen de leucotoxina, las bibliotecas génicas de Al (cepa B122) de P. haemolítica se construyeron usando técnicas normales. Ver Lo y colaboradores, Infect. I mun . , supra; DNA CLONING: Vols. I y II, supra; y Sambrook y colaboradores, supra. Se construyó una biblioteca genómica en el vector de plásmido pUC3 y una genoteca de ADN construida en el bacteriófago lambda gtll. Los clones resultantes se usaron para transformar E. coli y se mezclaron las colonias individuales y se detectaron para la reacción con suero de un becerro que había sobrevivido a una infección de P. haemolítica y que se ha reforzado con un sobrenadante de cultivo concentrado de P. haemolítica para incrementar los niveles de anticuerpo anti-leucotoxina . Se detectaron las colonias positivas para su capacidad para producir leucotoxina al incubar los lisados celulares con los neutrófilos bovinos y al medir subsecuentemente la regulación de lactato-deshidrogenasa de estos últimos . Las varias colonias positivas se identificaron y estos recombinantes se analizaron por la correlación con endonucleasas de restricción. Un clon pareció ser idéntico a un gen de leucotoxina clonado previamente. Ver Lo y colaboradores, Infect. Immun . , supra. Para confirmar esto, los fragmentos más pegúenos se re-clonaron y se compararon las correlaciones de restricción. Se determinó gue aproximadamente 4 kilopares de bases de ADN se han clonado. Los clones progresivamente más grandes se aislaron para llevar a cabo un recorrido cromosómico (dirección de 5' a 3') a fin de aislar los recombinantes de longitud completa gue son de aproximadamente 8 kb de longitud. La construcción general se llamó pAA114. Esta construcción contuvo la secuencia completa del gen de leucotoxina. El lktA, un fragmento de endonucleasa de restricción Mael a partir de pAA114 gue contuvo el gen de leucotoxina completo, se trató con el fragmento Klenow de la ADN-polimerasa I más los trifosfatos de nucleótidos y se ligó en el sitio Smal del vector de clonación pUC13. Este plásmido se llamó pAA179. De este, se hicieron dos construcciones de expresión en el vector basado en el ptac PGH432:lacI digerido con Smal. Uno, pAA342, consistió del fragmento 5'-AhaIII del gen de IktA mientras gue el otro, pAA345, contuvo el fragmento Mael completo descrito anteriormente. El clon pAA342 expresó un péptido de leucotoxina truncado a altos niveles mientras gue el pAA345 expresó la leucotoxina de longitud completa a muy bajos niveles. Por lo tanto, el extremo 3' del gen IktA (fragmento de BamHl de Styl a partir de pAA345) se ligó al pAA342 digerido con Styl Ba Hi, produciendo el plásmido pAA352. La estructura de pAA352 se muestra en la Figura 2 y la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la leucotoxina de P. haemolítica producida a partir de la construcción de pAA352 (posteriormente LKT 352) se muestra en la Figura 3. Se expresaron de pAA114 varias expresiones truncadas del gen de leucotoxina. Estas formas truncadas son funciones con el gen de B-galactosidasa (lacZ) . Dos fragmentos, LTX1.1 y LTX3.2, a partir de la digestión doble EcoRV PstI, se aislaron a partir de pAA114 como fragmentos de restricción, purificados (1.0 kb y 2.1 kb, respectivamente) . Estos fragmentos se clonaron en el vector de clonación pTZldR gue se ha digerido con HincII y Pstl. El vector resultante, llamado pLTX3P.l, se usó para transformar la cepa JM105 de E. coli. Las células transformadas se identificaron al colocar en placa en el medio gue contiene ampicilina más Xgal e IPTG. Las colonias azules indicaron la presencia de un gen de lacZ funcional. Se analizó el ADN de las células transformadas por la digestión con endonucleasa de restricción y se encontró gue contiene el extremo 5' del gen de leucotoxina (lktC y lktA) . Un fragmento de 5' de EcoRV/Pstl de leucotoxina (a partir de pLTX3P.l) se subclonó en el vector de clonación pBR325 que se ha digerido con EcoRl y Pstl. El plásmido de pBR325 también contuvo el promotor nativo de leucotoxina (obtenido de pLTX3.1) y un gen de lacZ de longitud completa, sin promotor. La construcción resultante se usó para transformar JM105 de E. coli y se aislaron las colonias azules del agar de Xgal. La nueva construcción se llamó pAAlOl (ATCC No. 67883) y se representa en la Figura 10. La secuencia de aminoácidos pronosticada de la leucotoxina de P. haemolítica producida a partir de la construcción de pAAlOl (posteriormente LKT 101) se representa en la Figura 11.

Ejemplo 2 Construcción de Fusiones de LKT-GnRH Las fusiones representativas de LKT-GnRH se construyeron como sigue. Los oligonucleótidos gue contienen las secuencias gue corresponden a GnRH de hebra individual y GnRH como cuatro repeticiones múltiples se construyeron en un Ensamblador Génico de Pharmacia usando la química de fosforamidita normal. Las secuencias de estos nucleótidos se muestran en las Figuras ÍA y IB. Los presentes oligonucleótidos se fijan y ligan en el vector pAA352 (No. 68283 de ATCC, y descrito posteriormente), gue se ha digerido con la endonucleasa de restricción Ba Hl. Este vector contiene el gen de leucotoxina de P. haemolítica. El ADN ligado se usó para transformar la cepa MH300 de E. coli. Los transformantes que tienen los insertos de oligonucleótidos se identificaron por la correlación con endonucleasas de restricción.

Una secuencia de repetición en tándem, de GnRH de ocho copias se preparó al fijar los oligonucleótidos de GnRH de cuatro copias y ligándolos en un vector gue se ha digerido con las endonucleasas de restricción Ba Hl. Los oligómeros se diseñaron para inhabilitar el sitio BamHl en la dirección 5' cuando se insertaron y para asegurar gue la inserción de copias adicionales del oligómero se orientaron en el marco de lectura apropiado. La secuencia del presente oligonucleótido se muestra en la Figura IB. El ADN del plásmido a partir de la cepa MH3400 de E. coli luego se aisló y se usó para transformar la cepa JM105. Los plásmidos recombinantes se designaron pCB113 (LKT 352:4 GnRH 4 copias, No. de acceso de ATCC 69749) y pCB112 (LKT 352:GnRH de 8 copias) . El plásmido recombinante pCB113 se muestra en la Figura 4. El plásmido 112 es idéntico a pCB113 excepto gue la secuencia de GnRH de múltiples copias (que corresponde al oligómero de la Figura IB) se insertó dos veces como se describe anteriormente. La secuencia de nucleótidos de la fusión de LKT-GnRH recombinante de pCB113 se muestra en la Figura 5. La secuencia de nucleótidos de la fusión de pCB112 de LKT-GnRH, recombinante es idéntica excepto gue la secuencia de GnRH de múltiples copias se insertó dos veces.

Ejemplo 3 Construcción del Péptido Portador de LKT, Acortado Una versión acortada del péptido de leucotoxina recombinante se construyó a partir del gen recombinante presente en el plásmido pAA352 (como se describe anteriormente) . El gen de LKT acortado se produjo al suprimir un fragmento de ADN interno de aproximadamente 1300 pb de longitud del gen de LKT recombinante como sigue. " El plásmido pCB113, (No. de Acceso 69749 de ATCC) gue incluye el polipéptido de KLKT 352 fusionado a cuatro copias del polipéptido de GnRH, se digirió con la enzima de restricción BstBl (New England Biolanbs) . El plásmido linealizado resultante luego se digirió con la nucleasa de frijol (farmacia) para remover los términos salientes, de hebra individual producidos por la decisión con BstBl . El ADN romo luego se digirió con la enzima de restricción Nael (New England Bilabs) , y el ADN digerido se cargó en un gel de agarosa al 1 % en donde los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis. Un fragmento de ADN grande de aproximadamente 6190 pb se aisló y purificó a partir del gel de agarosa usando un equipo Gene Clean (Bio 101), y el fragmento purificado se dejó ligar por sí mismo al vectirofago de uso, T4- ADN ligasa (Pharmacia) . La mezcla de ligación resultante se usó para transformar las células JM105 de E. coli, competentes, y los clones positivos se identificaron por su capacidad para producir una proteína delgada gue tiene un peso molecular de aproximadamente 57 KDa. El plásmido recombinante formado así se designó pCBlll, (No. de Acceso de ATCC 69748), y produjo un polipéptido de leucotoxina cortado (referido posteriormente como LKT 111) fusionado a cuatro copias del polipéptido de GnRH. La estructura de pCBlll se muestra en la Figura 6. El plásmido pCB114 es idéntico a pCBlll excepto que la secuencia de GnRH de múltiples copias (que corresponde al oligómero de la Figura IB) se insertó dos veces. La secuencia de nucleótidos de la fusión recombinante de LKT-GnRH de pCBlll se muestra en la Figura 7, la secuencia de nucleótidos de la fusión LKT-GnRH recombinante de pCBlll es idéntica excepto gue la secuencia de GnRH de múltiples copias se insertó dos veces. La secuencia de nucleótidos del punto de fusión de ligando de los presentes clones se ha confirmado al secuenciar con un eguipo de secuenciación de bacteriófago T7-polimerasa (Pharmacia) . La secuencia de nucleótidos de estos puntos de fusión se muestran en la Figura 8.

Ejemplo 4 Construcción de una Fusión de LKT-GnRH gue tiene Multímeros de GnRH, Amino-Terminales y Carboxil- Terminales, de 8 Copias Una molécula de fusión recombinante de LKT-GnRH que tiene dos multímeros de GnRH de 8 copias, uno arreglado en el N' -término del LKT 111 del otro arreglado en el C -término de LKT 111, se construyó de la secuencia de fusión de LKT-GnRH obtenida a partir del plásmido pCB114 al ligar la secuencia de GnRH de múltiples copias (que corresponde al oligómero de la Figura IB) dos veces en el extremo 5' de la secuencia de codificación de LKT 111. Una molécula de ácido nucleico, sintética, que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos: 5 ' -ATGGCTACTGTTATAGATCGATCT-3 ' se ligó en el extremo 5' de las secuencias de GnRH de múltiples copias. La molécula de ácido nucleico, sintética codifica para una secuencia de 8 aminoácidos (Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser ) . La molécula recombinante resultante contiene así en el orden dado en la dirección 5' a 3' : la molécula sintética de ácido nucleico; una secuencia de nucleótidos que codifica para un primer multímero de GnRH de 8 copias; una secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido de LKT acortado (LKT 111); y una secuencia de nucleótidos que codifica para un segundo multímero de GnRH de 8 copias. La molécula recombinante se recircularizó, y la molécula resultante se usó para transformar células JM105 de E. coli, competentes. Se identificaron los clones positivos por su capacidad para producir una proteína agregada que tiene un peso molecular de aproximadamente 4 KDa. El plásmido recombinante formado así se designó pCB122 gue produce el polipéptido de LKT 111 fusionado a las 16 copias del polipéptido de GnRH. La secuencia de nucleótidos de la fusión de LKT-GnRH recombinante de pCB122 se muestra en las Figuras 9-1 hasta 9-6.

Ejemplo 5 Purificación de las Fusiones LKT-antígeno Las fusiones recombinantes de LKT-GnRH de los Ejemplos 2, 3 y 4 se usaron purificando usando el siguiente procedimiento. Para cada fusión, se inocularon 5 a 10 colonias de cepas de E. coli transformadas, en 10 mL de caldo TB complementado con 100 microgramos/mL de ampicilina y se incubaron a 37°C durante 6 horas en un agitador G10, 220 rpm. Se diluyeron cuatro mL de este cultivo en cada uno de los dos matraces Fernbach con desviadores, gue contiene 400 mL del caldo TB + ampicilina y se incubaron durante la noche como se describe anteriormente. Las células se recolectaron por centrifugación durante 10 minutos a 4000 rpm en botellas de polipropileno, 500 mL de volumen, usando un rotor GS4 Sorvall. El sedimento se redispersó en un volumen igual de caldo de TB gue contiene ampicilina gue se ha precalentado a 37°C (es decir, 2 x 400 ml), y las células se incubaron durante 2 horas como se describe anteriormente. 3.2 mL del isopropil-B, D-tiogalactopiranosido (IPTG, Gibco/BRL), 500 mM en agua, (concentración final = 4 M) , se adicionaron a cada cultivo a fin de inducir la síntesis de las proteínas de fusión recombinantes. Los cultivos se incubaron durante dos horas. Las células se recolectaron por centrifugación como se describe anteriormente, se redispersaron en 30 mL de Tris-clorhidrato 50 mM, sucrosa al 25 % (p/v), pH 8.0 y se congelaron a -70°C. Las células congeladas se descongelaron a temperatura ambiente después de 60 minutos a -70°C, y se adicionaron 5 ml de lisozima (Sigma, 20 mg/mL en Tris-HCl 250 mM, pH 8.0) . La mezcla se sometió a vórtice a alta velocidad durante 10 segundos y luego se colocó en hielo durante 15 minutos. Las células luego se adicionaron a 500 L de amortiguador de lisis en un bazo de precipitado de 1000 L y se mezcló por agitación con una pipeta de 2 L . El bazo de precipitado gue contiene la suspensión de células Usadas se colocó en hielo y se trató con sonido durante un total de 2.5 minutos (explosiones de 5-30 segundos con 1 minuto de enfriamiento entre cada una) con un aparato sonicador Braun, sonda larga, ajustado a 100 wats de potencia. Se colocaron volúmenes iguales de la solución en tubo centrífuga SS34 de teflón y se centrifugaron durante 20 minutos a 10,000 rpm en un rotor Sorvall SS34. Los sedimentos se redispersaron en un total de 100 mL de agua doblemente destilada, estéril, al someterlos en vórtice a alta velocidad, y repetir el paso de centrifugación. Se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se combinaron en 20 mL de Tri-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 8.0 (solución salina amortiguada con Tris) y la suspensión se congeló durante la noche a -20°C. La suspensión recombinante se descongeló a temperatura ambiente y se adicionó a 100 L de guanidina-Hcl 8 M (Sigma) en solución salina amortiguada con Tris y se mezcló vigorosamente. Se colocó una barra agitadora magnética en la botella y la muestra solubilizada se mezcló a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución se transfirió a un matraz Erlen eyer de 2000 mL y 1200 L de la solución salina amortiguada con Tris se adicionó rápidamente. Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas adicionales. Se colocaron alícuotas de 500 mL en bolsas de diálisis (Spectrum, diámetro 63.7 mm, corte de PM 6,000-8,000, #32670, de Fisher scientific) y estas se colocaron en bazos de precipitados de 400 L que contienen 3500 mL de la solución salina amortiguada con fosfato 9 Guanidina-HCl 0.5 M. Los bazos de precipitado se colocaron en un cuarto a 4°C en un agitador magnético durante la noche después de lo cual se reemplazó el amortiguador de diálisis con solución salina amortiguada con Tris + Guanidina-HCl 0.1 M y la diálisis se continuó durante 12 horas. El amortiguador luego se reemplazó con solución salina amortiguada con Tris + Guanidina-HCl 0.05 M y la diálisis se continuó durante la noche. El amortiguador se reemplazó con solución salina amortiguada con Tris (no guanidina), y la diálisis se continuó durante 12 horas. Esto se repitió tres veces más. La solución final se vertió en una botella de rodillo de plástico de 200 mL (Corning), y se adicionaron 13 mL de PMSF 100 mM (en etanol) para inhibir la actividad de la proteasa. La solución se almacenó a -20°C en alícuotas de 100 L . Para confirmar gue las proteínas de fusión se han aislado, se diluyeron alícuotas de cada preparación 20 veces en agua doblemente destilada, se mezclaron con un volumen igual del amortiguador de muestra SDS-PAGE, se colocaron en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y se corrieron a través de geles de poliacrilamida al 12 %. También se corrieron los controles de leucotoxina, recombinantes . Todas las proteínas de fusión se expresaron a altos niveles como cuerpos de inclusión. Los pesos moleculares pronosticados basados en las secuencia de ADN de las proteínas de fusión fueron 104, 869 (LKT 352::GnRH de 4 copias, de pCB113); 110, 392 (LKT 352::GnRH de 8 copias, de PCB112); 57,542 (LKT 111 : : GnRH de 4 copias, de pCB113), 63, 241 (LKT 111 : GnRH de 8 copias de pCB114); y 73,886 (GnRH de 8 copias:LKT 111 : : GnRH de 8 copias de pCB122) . Los pesos moleculares pronosticados se la molécula de LKT 152 recombinante fue de 99,338, y el peso molecular pronosticado de la molécula de LKT 111 recombinante fue de 51, 843.

Ejemplo 6 Actividad Inmunológica In Vivo de las Fusiones de LKT-GnRH Para probar la capacidad de las fusiones de LKT-GnRH para inducir una respuesta inmunológica ante LKT-GnRH in vivo, y para comparar esta respuesta a otros conjugados portadores de GnRH, se realizó el siguiente ensayo de vacunación: Tres grupos de 8 caballos machos, de aproximadamente 8 semanas de edad (35-50 kg) se usaron, los cuales estaban libres de patógenos específicos. Los animales se mantuvieron en una instalación de enfermedad mínima y se vacunaron en el día 0 y 21 del ensayo con las siguientes formulaciones: Grupo 1- placebo que consistió de solución salina formulada en el adyuvante Emulsigen Plus gue contiene 15 mg de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDa) (2 ml ) ; Grupo 2- LKT 352-GnRH (250 µg de LKT, preparado como se describe en los ejemplos previos) formulado en el mismo adyuvante (2 ml ) ; Grupo 3- VP6-GnRH, 0.5 µg de P6 Y 5 µg de GnRH, formulado en el mismo adyuvante (2 ml ) . La preparación de VP6 se hizo como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,071,651, usando el péptido de unión descrito en la presente. Las muestras de sangre se tomaron en los días 0, 21 y 35, se dejaron coagular, se centrifugaron a 1500 g, y se removió el suero. Los títulos de anticuerpos séricos contra GnRH se midieron usando el procedimiento RÍA de Silversides y colaboradores, J. Reprod. Immunol . (1985) 7_:171- 184. Los resultados de este ensayo indicaron gue son aquellos animales inmunizados con la formulación de LKT 352-GnRH produjeron títulos significantes contra GnRH (títulos > 1:70) . Ni el placebo ni los grupos de VP6-GnRH produjeron títulos anti-GnRH. Previamente, las múltiples vacunaciones con dosis de GnRH de más de 100 µg, conjugadas a otras proteínas portadoras, se requirieron, para inducir los títulos antihormonas. Estos resultados indican que el sistema portador de LKT-GnRH proporciona un inmunógeno grandemente mejorado sobre los sistemas portadores anteriores .

Ejemplo 7 Efecto Inmunológico In Vivo de Múltiples Copias de GnRH en Tándem Ligadas de LKT Para probar la capacidad de las proteínas de fusión de LKT-GnRH, recombinantes, que contienen múltipoles repeticiones de polipéptidos de GnRH para inducir una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Cultivos de E. coli que contienen los plásmidos pCB113 y pCB175 (que tienen 4 y 8 copias de GnRH ligado a LKT 352, respectivamente) y un plásmido gue tiene una copia de GnRH ligado a LKT 352 se prepararon como se describe anteriormente. Las vacunas de cada uno de estos cultivos se formularon para contener el equivalente de 5 µg de GnRH en 0.2 mL de Emulsigen Plus. A tres grupos de 10 ratones y hembras se les dio dos inyecciones subcutáneas 23 días después y se recolectaron las muestras sanguíneas en los días 23, 35 y 44 después de la inyección principal. Se midieron los títulos de anticuerpos séricos contra GnRH a diluciones finales de 1:100 y 1:1000 usando un procedimiento de radioinmunoensayo normal. Si menos del 5 % del GnRH yodado se unió, el anticuerpo pareció ser indet ectable . Los títulos de anticuerpos obtenidos de esta manera se resumen en la Tabla 1. Los resultados de este estudio indican que dosis iguales de GnRH presentados como repeticiones en tándem múltiples (GnRH de cuatro u ocho copias) da una mejora dramática en la producción de anticuerpos sobre el GnRH de copia individual (como se mide al unir a GnRH nativo, yodado) . Además, los resultados anteriores indican que una proteína de fusión que comprende una repetición en tándem de GnRH de cuatro copias ligada a LKT 352 representa una forma antígena de GnRH, inmunogénica, efectiva, aungue se puede tener influencia en la inmunogenicidad por la dosis o la especie. * respuesta promedio es la unión promedio de I125-GnRH de solo aquellos animales con unión en exceso 5% Tabla 1 Ejemplo 8 Actividad Inmunológica In Vivo y Efecto Biológico de las Fusiones de LKT 352:: GnRH y LKT 111 : : GnRH Para probar la capacidad de las proteínas de fusión que comprenden múltiples repeticiones en tándem de GnRH (ligadas a ya sea LKT 352 ó LKT 111) para producir una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo y para manifestar un infecto biológico in vivo, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Cultivos de E. coli que contienen los plásmidos pCB113 y pCBlll (GnRH de 4 copias ligado a LKT 352 ó LKT 111, respectivamente) se prepararon como se describe anteriormente. Las vacunas de cada uno de estos cultivos anteriores se formularon para contener el equivalente de 5 µg de GnRH en 0.2 ml del adyuvante VSA-3 (un adyuvante modificado Emulsigen Plus) con una vacuna de control que comprende 0.2 L del adyuvante también que se prepara. Tres grupos de ratones Swiss machos se les dio dos inyecciones cutáneas 21 días después, con las inyecciones iniciales (día 0) dadas a las 5-6 semanas de edad. En el día 49, los sujetos se sacrificaron . La actividad inmunológica de las presentes fusiones de GnRH yodo de LKT se valoró al medir los títulos de anticuerpos anti-GnRH usando un procedimiento de radioinmunoensayo normal a una dilución sérica de 1:1000. El efecto biológico de las fusiones de GnRH-LKT se cuantificó por radioinmunoensayo normal de los niveles séricos de testosterona con duna sensibilidad de 25 pg/ml, y el tejido testicular pesó y se examinó de manera histológica. Los resultados de este ensayo se resumen en la Tabla 2. En el ensayo, todos los animales inyectados con antígenos de GnRH : LKT fueron niveles de anticuerpos fácilmente detectables, sin embargo, la fusión LKT lll::GnRH (del plásmido pCBlll) mostró inmunogenidad superior como se indica por la uniformidad de respuesta y el título. La testosterona sérica (producida por las células Leydin tes t icuiares ) se segrega de una manera pulsátil, y por consiguiente, se esperan bajos valores y variabilidad extrema de los niveles séricos, en sujetos animales normales. Bajo el ensayo, el grupo de control (gue recibió inyecciones de vacuna de adyuvante de 0.2 ml ) tuvo niveles séricos normales de testosterona, mientras gue ambos grupos de sujetos tratados tuvieron esencialmente testosterona sérica indetectable . Además bajo el ensayo, la evaluación histológica del tejido testicular reveló grados variables de atrofia de las células de Leydig, un diámetro del tubo seminífero reducido e interrupción de espermatogénesis en los sujetos tratados. Sin embargo, el peso testicular permaneció cercano a lo normal en los animales tratados, aún en la presencia de altos títulos de anticuerpos anti-GnRH, aungue hubo una clara evidencia de regresión testicular en 2 de 5 sujetos que recibieron las funciones de LKT lll::GnRH de 4 copias. Por consiguiente, estos resultados muestran que múltiples copias de GnRH ligadas a ya sea el LKT 352 ó LKT 111 comprenden potentes inmunógenos; y además, se indica que la vacunación con las presentes proteínas de fusión acciona la producción de anticuerpos que son capaces de neutralizar la GnRH endógena in vivo, y que es discernible un efecto biológico in vivo, concomitante, en los sujetos animales gue reciben estas vacunaciones. de unión de I -GnRH a dilución sérica 1:1000 t ng/ml Tabla 2 Ejemplo 9 Actividad Inmunológica In Vivo de las Fusiones LK :: GnRH en Sujetos Porcinos Para probar la capacidad de las proteínas de fusión que comprenden múltiples repeticiones en tándem de GnRH (ligadas a ya sea LKT 352 ó LKT 111) para producir respuestas inmunológicas anti-GnRH in vivo en sujetos porcinos, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Los cultivos de E. coli gue contienen los plásmidos pCB113, pCBlll, pCB175 y PCB114 (LKT 352::GnRH de 4 copias, LKT lll::GnRH de 4 copias, LKT 352::GnRH de 8 copias, y LKT lll::GnRH de 8 copias, respectivamente) se prepararon como se describen anteriormente. Las vacunas de cada uno de los cultivos anteriores se formularon para contener el eguivalente de 50 µg de GnRH y se administraron en el adyuvante de VSA-3 en un volumen de 2.0 mL . Cuatro grupos de 5 machos y 5 hembras de caballos destetados, de 35 días de edad (en el día 0), se inyectaron en el día 0 y se reinyectaron en el día 21 del ensayo. Se recolectaron las muestras sanguíneas en los días 0, 21 y 35, con los títulos de anticuerpo anti-GnRH y gue se midieron a una dilución final de 1:1000 usando el procedimiento normal de radioinmunoensayo. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 3. Bajo el ensayo, los anticuerpos anti-GnRH no se pudieron detectar en ninguno de los sujetos antes de la inmunización, pero se detectaron fácilmente en la mayoría de los sujetos por el día 35 (un sujeto en el grupo de tratamiento 4 murió debido a una infección no relacionada al tratamiento) . Los resultados en este ensayo indican que las proteínas de fusión que comprenden las múltiples repeticiones de GnRH ligadas a ya sea un polipéptido portador de LKT 352 ó LKT 111 forman inmunógenos útiles en los sujetos porcinos. Basándose en los pesos moleculares pronosticados del GnRH del decapéptido GnRH (1200), y el polipéptido de LKT 111 (52,000) y el polipéptido de LKT 352 (100,000), los porcentajes de GnRH en las fusiones de antígeno de LKT-GnRH son como sigue: 4.9 % (LKT 352:: GnRH de 4 copias); 8.5 % (LKT 111 : : GnRH de 4 copias); 9.3 % (LKT 352::GnRH de 8 copias, y 15.7 % (LKT lll::GnRH de 8 copias) . Por consiguiente, el resultado práctico obtenido de esta manera indica que al usar las fusiones de LKT-GnRH que comprenden el portador de polipéptido de LKT 111, la cantidad total del antígeno (LKT-GnRH) administrado al sujeto se puede reducir a la mitad (en comparación a las composiciones de vacunación que usan el sistema de polipéptido portador de LKT 352) para obtener una respuesta anti-GnRH equivalente.

Tabla 3 Ejemplo 10 Evaluación de la Eficacia de la Vacuna de Inmunocastración de LKT: : GnRH de 8 Copias Para evaluar la eficacia y utilidad comercial de una formulación y vacuna que contiene la proteína de fusión de LKT lll::GnRH de 8 copias, se llevó a cabo el siguiente ensayo de vacunación. Un cultivo de E. coli que contiene el plásmido pCB114 (LKT 111: :GnRH de 8 copias) se preparó como se describe anteriormente. Se preparó una formulación de vacuna a partir del cultivo anterior que contuvo el equivalente de 50 µg de GnRH. La formulación de vacuna se administró en el adyuvante VSA-3 un volumen final de 2.0 ml . Tres grupos de tratamiento, con 30 cerdos machos (verracos) cada uno, se establecieron. Los tres grupos consistieron de 30 cerdos castrados (verracos castrados guirúrgicamente antes de la madurez sexual), 30 cerdos castrados de control y 30 inmunocastrados (cerdos castrados por vacunación con el inmunógeno de GnRH) . Al destete (día 21) , los animales del grupo de verracos y cerdos castrados de control se inyectaron con placebo (adyuvante VSA-3 solo) , mientras que el grupo inmunocastrado se inyectó con la formulación de vacuna descrita anteriormente. Cuando los animales alcanzaron un peso predeterminado alrededor de 3 semanas antes de la matanza, al grupo inmunocastrado se le dio una dosis de refuerzo de la vacuna, mientras gue los grupos de verracos y cerdos castrados de control se les administró nuevamente las inyecciones de placebo. Las mediciones incluyeron los títulos séricos de anticuerpos a GnRH, niveles sanguíneos de testosterona, rasgos de los animales muertos, comportamiento animal, eficiencia de alimentación, velocidad de ganancia de peso, y niveles de androsterona en la glándula salivar y grasa corporal (como una medida de la mancha de los verracos) (a) Títulos de Anticuerpos Séricos Anti-GnRH: Se valoró la actividad inmunológica de la formulación de vacuna de fusión del gen GnRH de 8 copias-LKT, al medir los títulos de anticuerpo-GnRH usando un procedimiento de radioinmunoensayo normal a una dilución sérica de 1:50000. Una comparación de los títulos de anticuerpos séricos en los tres grupos experimentales proporcionan en la Figura 12.

Como se puede ver, los títulos de anticuerpos anti-GnRH se incrementaron dramáticamente en los verracos inmunocastrados (vacunados) y permanecieron los animales significativamente en exceso de la cantidad mínima requerida para producir un efecto biológico (aproximadamente de 10 a 20 % de unión en la Figura 12) durante 20 días después de la vacunación. (b) Efecto Biológico de la Vacuna de Inmunocas tración en el Tamaño de las Glándulas Sexuales : El efecto biológico de la formulación de vacuna de la fusión de GnRH de 8 copias-LKT se determinó al comparar el peso y medidas de las glándulas sexuales de los verracos de control y los verracos inmunocastrados (vacunados), así como al valorar y comparar los niveles séricos de testosterona en estos dos grupos experimentales. En particular, las glándulas vulvouretrales y los testículos de los animales se pesaron y se midieron. Los resultados se representan posteriormente en la Tabla 4. Como se puede ver, el peso promedio de las glándulas vulvouretrales en los animales vacunados se redujo aproximadamente 32 % con relación a los animales de control. Además, el peso promedio de los testículos en los vacunados se redujo aproximadamente 25 % con relación a los animales de control. Estos resultados son consistentes con la producción reducida de testosterona de los testículos en los animales vacunados. * media ± errores normales Los niveles séricos de testosterona, promedio, y en los tres grupos experimentales se determinó usando un radioinmunoensayo normal de niveles séricos de testosterona, con una sensibilidad de 25 pg/ml. Los ensayos se llevaron a cabo en el día 0, día 7, día 14, día 21 después de las inmunizaciones de refuerzo (y vacunaciones de placebo en los grupos de verracos de control y cercos castrados . Los resultados de los ensayos se representan en la Figura 13. Como se puede ver, los niveles suero de testosterona de los animales castrados disminuyeron después de la vacunación, mientras gue los niveles en los verracos de control se incrementaron. c) Composición del Animal Muerto Los aspectos comerciales de la composición del animal muerto de los animales de cada grupo experimental se valoraron después de la matanza de los animales. En particular, los pesos corporales promedio del contenido de grasa se determinaron, se tomaron mediciones promedio al nivel del lomo, y se determinó el peso promedio de las piernas y lomos cortado) los resultados de las valoraciones de los cuerpos muertos se reportan en la Tabla 5. Como se puede ver, los datos de los cuerpos muertos muestran gue los verracos de control y los inmunocastrados (animales vacunados) tuvieron composiciones de los cuerpos muertos, muy similares, mientras gue los cerdos castrados tuvieron apreciablemente más grasa corporal, menos carne sin grasa. Además, el desempeño del crecimiento de los cerdos castrados alcanzó la meseta durante los últimos 24 días de vida (resultados no mostrados) . Estos datos de los cuerpos muertos son consistentes con el objetivo de tener las composiciones de los cuerpos muertos de los animales inmunocastrados que imita a los verracos de control para todos los pocos días finales de su periodo de crecimiento. (d) Conversión de Alimentos La eficiencia de conversión de alimento de los animales de cada uno de los grupos experimentales se midió durante el periodo de esta matanza. En particular, se expresó la eficiencia promedio de la conversión elemento como la conversión de kg de alimento : kg de ganancia de peso en los animales. Los resultados se representan en la Figura 4. Como se puede ver, la conversión de elemento en los verracos de control y los inmunocastrados (animales vacunados) fue de aproximadamente 10 % más eficiente gue la conversión de elemento en los cerdos castrados. e) Niveles Componentes de la Mancha de los Verracos La capacidad de la formulación de vacuna de la fusión de GnRH de 8 copias-LKT para reducir la mancha de los verracos en animales vacunados se valoró al ensayar los niveles de androstenona (un componente de la mancha de los verracos) en la grasa y glándula salival de los animales de cada uno de los grupos experimentales. Se cuantificaron los niveles de androstenona por un método químico normal en los especímenes de grasa y glándula salival contenidos de cada grupo. Los resultados se reportan en la Tabla 6. Como se puede ver, los verracos de control tuvieron concentraciones de androstenona apreciablemente más alta con relación a los cerdos castrados y los inmunocastrados (animales vacunados ) . *p menos gue .01 Todos los resultados anteriores indican gue las formulaciones de vacuna de inmunocas tración gue contienen las moléculas de fusión de LKT: : GnRH de 8 copias, cortas, proporciona una alternativamente comercialmente viable a los métodos de castración guirúrgicos .

Ejemplo 11 Comparación de la Actividad Inmunogénica In Vivo de las Moléculas de Fusión gue Tienen uno o dos Multímeros de GnRH A fin de comparar la capacidad de las proteínas de fusión de LKT-GnRH que comprende ya sea un multímero individual de GnRH (que contiene 8 repeticiones en tándem de GnRH) ó dos multímero de GnRH (ambos que contienen 8 repeticiones en tándem de GnRH) , para producir una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo, se llevaron a cabo varios ensayos de vacunación. Los cultivos de E. coli gue contienen los plásmidos pCB114 (un multímero de GnRH de 8 copias) legado al C'-término de LKT 111), y pCB122 (los multímeros de GnRH de 8 copias, uno ligado al N-tér ino de LKT 111 y otro legado al C'-término de LKT 111) se prepararon como se describe anteriormente) . Las vacunas derivadas de los cultivos que contienen el plásmido pCB114 se formularon para contener 160 µg de las molécula de fusión (25 µg totales de GnRH) en un volumen final de 2 ml del adyuvante VSA-3. Las vacunas derivadas de los cultivos gue contienen el plásmido pCB122 se formularon para contener 185 µg de las moléculas de fusión (50 µg totales de GnRH) en un volumen final de 2 ml del adyuvante de VSA-3. De esta manera, una cantidad de la molécula portadora de LKT se mantuvo constante (135 µg totales de LKT por formulación) y no más preparaciones. Formulaciones de vacuna se usaron en los siguientes ensayos de vacunación. ( a) Título de Anticuerpos Anti-GnRH y Actividad Funcional de las Moléculas de Anticuerpos Anti-GnRH Se llevó a cabo una comparación entre los títulos de anticuerpos anti-GnRH producidos por las dos formulaciones de vacuna experimentales, en donde la capacidad de los anticuerpos producidos para bloguear el efecto del GnRH producido de manera endógena también se valoró. En particular, se establecieron tres grupos de cerdos machos como sigue: 50 animales se inyectaron con la proporción de vacuna de multímero de GnRH individual (fusiones de LKT lll::GnRH de 8 copias, obtenidas de pCB114. Se inyectaron 10 animales con la composición de vacuna del multímero de GnRH plural (fusiones de GnRH de 8 copias:: LKT 111:: GnRH de 8 copias obtenidas a partir de pCB122), y se inyectaron 10 animales de control con 2 ml del adyuvante VSA-3 solo . Las vacunaciones se llevaron a cabo en el destete (21 días de edad, y los animales se reforzaron 30 días después. Se recolectó sangre a los 14 y 28 días después de la inmunización de refuerzo. El suero se obtuvo y se valoró para el título de anticuerpos anti-GnRH y los niveles séricos de la hormona reutilizante (LH) . Se determinaron los títulos séricos de los anticuerpos anti-GnRH a una dilución sérica final de 1:5000 usando GnRH yodada en un radioinmunoensayo normal. Los niveles sérico de LH se valoraron usando LH porcina y como una norma de referencia en un radioinmunoensayo normal. Los resultados de los ensayos, dados como valores promedio ± errores estándar, se reportan en la Tabla 7. Como se puede ver por los datos representados en la Tabla 7, los títulos de anticuerpos anti-GnRH son más altos en los animales inyectado con la composición de vacuna de multímero de GnRH plural (GnRH de 8 copias:: LKT 111: : GnRH de 8 copias) que de lo que se ve con los animales que recibieron la vacuna de multímero de GnRH individual (LKT 111:: GnRH de 8 copias) . Además, los animales que recibieron la vacuna del multímero de GnRH plural tuvieron menores niveles séricos de GnRH. Esta reducción en la LH sérica refleja la cantidad de los anticuerpos anti-GnRH producidos en los animales inmunizados para bloquear el efecto de la GnRH producida de manera endógena. Finalmente, 100 % de los animales gue recibieron la vacuna de un multímero de GnRH plural, respondieron a la vacuna al producir anticuerpos anti-GnRH, mientras gue 90-92 % de los animales gue recibieron los multímero de GnRH individuales, respondieron. (b) Comparación de los Títulos Anti-GnRH y la Valoración del Efecto de las Dosis Incrementadas de Vacuna La inmunogenicidad de las dos formulaciones de vacuna (el antígeno de multímero individual de GnRH 8 copias y el antígeno de multímero plural de GnRH 16 copias) se valoró nuevamente como sigue: dos grupos experimentales de 20 cerdos machos cada uno se establecieron. Los animales en el primer grupo se vacunaron al destete (día 21 de edad) con 160 µg de la preparación antígena del multímero individual, y luego se reforzaron 33 días después con la misma dosis. Los animales en el segundo grupo se vacunaron al destete (día 21 de edad con 185 µg de la preparación de antígeno de multímero plural y también se reforzaron 33 días después. Se recolectó la sangre a los 8, 14 y 24 días después de las inyecciones de refuerzo, y se valoró el suero para las moléculas de anticuerpo anti-GnRH a una dilución final de 1:5000 usando el radioinmunoensayo normal como se describe previamente. Los resultados se presentan en la Figura 15. Como se puede ver, la respuesta de anticuerpos a la vacuna de multímero plural (GnRH de 8 copias: : LKT lll::GnRH de 8 copias) fue más alta (P < .001) que para la vacuna de multímero individual (LKT 111: : GnRH de 8 copias) . Con referencia aún a la Figura 15, la línea horizontal al 20 % en el eje Y representa un título de anticuerpo gue, en ensayos previos no se reportó en la presente, se ha mostrado gue suprime la secreción de LH en los animales vacunados. Una vez más el 100 % de los animales que recibieron la vacuna del multímero GnRH plural respondieron (produjeron anticuerpos anti-GnRH), mientras gue cerca de aproximadamente 90-92 % de los animales gue recibieron la vacuna de multímero individual respondieron. A fin de determinar si la inmunogenidad incrementada, observada con la vacuna del multímero de GnRH plural es debida a la dosis incrementada del antígeno de GnRH (por ejemplo, 50 µg de GnRH en la vacuna [GnRH de 8 copias:: LKT 111:: GnRH de 8 copias], en comparación a 25 µg de GnRH en la vacuna [LKT 111:: GnRH de 8 copias]), el siguiente estudio se llevó a cabo. Se vacunaron tres grupos de 20 cerdos cada uno al destete (21 días de edad) y se reforzaron aproximadamente 30 días después con la composición de vacuna de multímero GnRH individual (fusiones de LKT 111:: GnRH de 8 copias obtenidas de pCB114) a las siguientes dosis: 50 µg, 150 µg, y 450 µg de la proteína de fusión, respectivamente. se recolectó la sangre a los 14, 28 y 64 días después de la inyección de refuerzo. Se valoró el suero para los anticuerpos anti-GnRH a una dilución final de 1:5000 como se describe anteriormente. Los resultados se reportan en la Tabla 8. Como se puede ver, no se obtuvo incremento apreciable en los títulos de anticuerpos anti-GnRH en respuesta a la vacunación con las dosis incrementadas de la composición de vacuna, de multímero GnRH individual. Esto indica gue la inmunogenidad incrementada observada con la vacuna de multímero de GnRH plural (fusiones de GnRH de 8 copias: : LKT lll::GnRH de • 8 copias, obtenidas de pCB122) no es debido a la concentración incrementada del antígeno de GnRH; en cambio, la inmunogenidad incrementada es probablemente debida a la estructura tridimensional de la molécula de fusión del LKT-GnRH particular, o en la presentación física del antígeno de GnRH a las células que producen los anticuerpos.

Ejemplo 12 Estudio de Respuesta de Dosis con Moléculas de Fusión de LKT-GnRH gue tienen los Multlmero de GnRH A fin de determinar las dosis óptimas de las composiciones de vacuna formadas a partir de las proteína de fusión de LKT-GnRH gue comprende los multímeros de GnRH (ambos que tienen 8 repeticiones en tándem de GnRH) , se llevó a cabo el siguiente estudio de respuesta de dosis in vivo. Los cultivos de E. coli gue contienen el plásmido pCB122 (dos multímero de GnRH de 8 copias, uno ligado al N' -término de LKT 111 y el otro ligado al C'"-término del LKT 111) se prepararon como se describe anteriormente. Siete vacunas derivadas a partir de los cultivos gue contienen el plásmido pCB122 se formularon a las siguientes dosis de la proteína total de fusión: 0 µg (control); 1 µg; 5 µg; 10 µg; 20 µg; 40 µg; y 80 µg, cada uno en un volumen final de 1 mL de adyuvante VSA-3. Se montaron siete grupos experimentales de 20 animales cada uno, se vacunaron con las formulaciones de vacuna descritas anteriormente. Se tomó una muestra sanguínea en el día 35 después de la vacunación, y se unieron los títulos de anticuerpos anti-GnRH a una dilución final de 1:100 en un inmunoensayo normal como se describe anteriormente. Los resultados del ensayo se reportan en la Tabla 9. Los títulos se expresan como % de unión como antes. Como se puede ver, estadísticamente 0 µg de la proteína de fusión fue diferente de todos los otros valores. La dosis de proteína de fusión de 1 µg (p < .009) que los otros valores obtenidos a partir de los grupos que reciben el antígeno de proteína. La dosis de 5 µg fue menor que la dosis de 20 µg (p < 0.06), sin embargo, todos los valores para las dosis por arriba de la proteína de fusión total de 10 µg fueron estadísticamente similares. Estos datos muestran gue la dosis óptima de la vacuna derivada de la proteína de fusión del plásmido pCB122 (GnRH de 8 copias: : LKT lll::GnRH de 8 copias) es aproximadamente 20-40 µg de la proteína de fusión.

Ejemplo 13 Inmunización de GnRH de Ratas Hembras A fin de valorar los efectos biológicos de la inmunización de GnRH de sujetos hembras, se llevó a cabo el siguiente estudio. Se prepararon como se describe anteriormente cultivos de E. coli gue contienen el plásmido pCB122 (dos multímeros de GnRH de 8 copias, uno ligado al N' -término de LKT 111 y el otro ligado al C -término de LKT 111. Se formuló una vacuna derivada de los cultivos gue contiene 185 µg de las moléculas de fusión (50 µg totales de GnRH) en un volumen final de 1 µl del adyuvante VSA-3. La formulación luego se usó en el siguiente sello de vacunación para valorar el efecto de la inmunización de GnRH en el peso ovárico, peso uterino, y concentración sérica de estrógeno en sujetos hembras . Dos grupos experimentales de ratas Sprague Dawley, hembras, 10 animales por grupo, se montó. A un grupo de control (Grupo 1) se le administró una inyección de placebo (adyuvante VSA-3 solo) en el día 0 del ensayo. Los animales en el segundo grupo recibieron una inyección individual de la formulación de vacuna de GnRH/LKT. Los títulos anticuerpos-GnRH se inspeccionaron después del tratamiento, y los animales del grupo 2 mostraron un aumento del título que empieza 21 días después de la inyección para alcanzar niveles máximos a aproximadamente el día 50 del estudio, después de los cuales niveles declinan gradualmente hasta que los animales se sacrifican en el día 224 del estudio . Luego se determinaron y registraron el peso ovárico, peso uterino niveles génicos de estradiol. Los resultados de esta invención se representan en la Figura 16. Como se puede ver, los pesos ováricos en los animales tratados (inmunizados con la formulación de vacuna de GnRH-LKT) se redujeron dramáticamente con relación a los animales de control. El examen histológico del tejido no reveló folículos activos en el tejido ovárico. También se redujeron dramáticamente los pesos uterinos en los animales tratados. El peso uterino proporciona un buen reflejo de las concentraciones séricas de estrógeno, y se relacionan a la secreción de esteroide godonal . Además, los niveles séricos de estradiol se redujeron en los animales tratados hasta aproximadamente 20 pg/ml, mientras gue el estradiol sérico fue de aproximadamente 50 pg/ml en los animales de control puesto que el estrógeno se deriva del ovario, se espera gue el estradiol sérico se reduzca en los animales tratados. Estos resultados muestran que las inmunizaciones de GnRH/LKT de la presente invención son efectivas en el control de la función ovárica, indicando una alternativa viable a procedimientos tal como la ovariectomía o tratamiento con antagonistas de GnRH.

Ejemplo 14 Inmunocastración de Sujetos Porcinos Machos Usando las Molécula de Fusión de LKT-GnRH gue Tienen Dos Multímeros de GnRH A fin de determinar la capacidad de las composiciones de vacuna formadas a partir de las proteínas de fusión de LKT-GnRH que tienen dos multímeros de GnRH (ambos gue contienen 8 repeticiones en tándem de GnRH) para reducir la androsterona en la grasa, se llevó a cabo el siguiente estudio. Se prepararon como se describe anteriormente cultivos de E. coli que contienen el plásmido pCBl22 (dos multímeros de GnRH de 8 copias, uno ligado a N' -término del LKT 111 y el otro ligado al C -término de LKT 111. Las composiciones de vacuna derivadas a partir de los cultivos se prepararon también como se describe anteriormente. Se formaron cuatro grupos experimentales de sujetos porcinos machos como sigue: Grupo 1, que comprende 6 cerdos castrados (animales machos castrados quirúrgicamente a unos pocos días de nacimiento); Grupo 2, gue comprende 7 verracos (machos intactos dejados intactos a todo lo largo del estudio); Grupo 3, gue comprende 6 castrados tardíos (machos intactos dejados intactos hasta aproximadamente 135 días de edad momento en el cual los animales se anestesian y se castran quirúrgicamente; y Grupo 4, el cual comprende 10 machos intactos que se inmunizaron con la composición de vacuna de LKT-GnRH al destete (21 días de edad) y aproximadamente a los 135 días de edad. Después de 42 días, el estudio se terminó, y los animales se sacrificaron. Los niveles de androstenona en grasa (un componente de la mancha de los verracos) en los especímenes de grasa de los animales en cada grupo experimental se cuantificaron por metodología guímica normal. Los resultados se representan en la Figura 17. Como se puede ver en la figura, la androsterona en grasa fue similar en los cerdos castrados (Grupo 1), los castrados tardíos (Grupo 3) y los inmunocastrados (Grupo 4), tratado con la vacuna de LKT-GnRH, y todos los tres grupos tuvieron mejores niveles de androstenona en grasa con relación a los verracos del grupo 2. Varios aspectos de la composición del animal muerto en los animales experimentales también se determinaron. En particular, el peso del cuerpo del animal muerto, las mediciones de la grasa en la espalda, el peso testicular (donde es apropiado) y la longitud de la glándula vulvo-uretral (BU) se determinaron en cada grupo, y se representan posteriormente en la Tabla 10 las mediciones promedio. La glándula BU es dependiente de la testosterona para el mantenimiento o tamaño y función .

Como se puede ver en la Tabla 10, tanto el peso testicular como la longitud de la glándula BU se redujo significantemente en los animales inmunocastrados del Grupo 4 con relación a los verracos no tratados del grupo 2, indicando gue la composición de vacuna de LKT-GnRH fue efectiva en la reducción de los niveles y/o efectos de la testosterona sérica en animales vacunados.

Ejemplo 15 Predicción de los Epítopes de Células T en las Moléculas de LKT 352 y LKT 111, Recombinantes A fin de pronosticar los epítopes potenciales de células T en las secuencias del polipéptido de leucotoxina, empleadas en las guimeras de LKT-GnRH de la presente invención, el método propuesto por Margalit y colaboradores (Margalit y colaboradores, J. Immunol (1987) 138:2213) se realizó en la secuencia de aminoácidos que corresponde a los números 1 hasta 199 de la molécula de LKT como se representa en la Tabla 11. Bajo el método, la secuencia de aminoácidos de la secuencia del polipéptido de leucotoxina se comparó a otras secuencias conocidas que inducen una respuesta de células T y a patrones de tipos de aminoácidos que se cree que se requieren para un epítope de células T. Los resultados de la comparación se representan en la Tabla 11. Como se puede ver por los resultados predictivos obtenidos de esta manera, existen varias secuencias cortas en el péptido de leucotoxina que se identifican como los potenciales epítopes de células T usando los criterios sugeridos por Margalit y similares (supra) . En forma más particular, se identificaron 9 secuencias como gue tienen una secuencia ( cargada/Gly-hidrófoba-hidrófoba-polar-Gly) , (indicada como el patrón "1" en la Tabla 11), y se identificaron tres secuencias como que tienen una secuencia (carga/Gly-hidrófoba-hidrófoba-polar/Gly) (indicada por el patrón "2" en la Tabla 12) . Al acoplar estos datos con la actividad anti-GnRH in vivo producida por ambos de los sistemas portadores de LKT 352 y LKT 111 en los Ejemplos 7 y 8 anteriores, se indica gue los epítopes de células T críticos se retienen en la molécula de LKT 111, acortada, y gue estos epítopes están contenidos probablemente dentro de la porción N-terminal terminal de las moléculas de LKT 352 y LKT 111.

Tabla 11 Patrones de la Secuencia de LKT gue Corresponden a los Potenciales Epítopes de Células T Secuencias de Aminoácidos de LKT gue Muestran el Patrón "1" GTID (aa's 27-30) GITG (aa's 66-69) GVIS (aa's 69-72) HVAN (aa's 85-88) KIVE (aa's 93-96) DLAG (aa's 152-155) KVLS (aa's 162-165) DAFE (aa's 171-174) KLVQ (aa's 183-186) GIID (aa's 192-195) Secuencia de Aminoácidos de LKT que Muestran el Patrón "2" RYLAN (aa's 114-118) KFLLN (aa's 124-128) KAYVD (aa's 167-171) E emplo 16 Predicción de la Estructura Física de la Estructura Física de las Proteínas de Fusión de LKT-GnRH Obtenidas a partir de pCB122 A fin de pronosticar la estructura física de los epítopes de células B de las molécula de infusión de GnRH de 8 copias::: LKT 111 : : GnRH de 8 copias, obtenidas a partir de la construcción de pCB112, la secuencia de aminoácidos de pCB122 (representa en las Figuras 9-1 hasta 9-6) se analizó usando métodos descritos previamente para determinar la estructura física de la proteína. Rost y colaboradores (1993) J. Mol. Biol. 232 : 584-599. En particular, se realizó la predicción por un sistema de redes neurales donde los datos de entrada consistieron de múltiples alineaciones de secuencia. El análisis de red se realizó usando el programa MaxHo (Sander y colaboradores, 1991) Porteins 9_:56- 68, del entrenamiento para la accesibilidad del solvente de residuo se tomó de Kabsch y colaboradores (1983) Biopolymers 22_: 2577-2637. El análisis de la red neuronal valoró cada aminoácido de la secuencia de pCB122, y pronosticó si el residuo estaría presente en una asa, hélice o estructura expuesta. En la predicción, las 8 copias de GnRH en la terminal amino entre la molécula de pCB122 se pronosticaron de que existen principalmente como una estructura de asa, mientras que las 8 copias de GnRH en la terminal carboxilo tienen una mezcla de estructura pronosticadas (asa, hélice y residuos expuestos) . Estos datos sugieren que la inmunogenidad mejorada observada con las moléculas de fusión de GnRH de 8 copias:LKT lll::GnRH de 8 copias, obtenidas a partir de la construcción de pCB122 se pueden relacionar a las diferentes estructuras tridimensionales de los antígenos de GnRH en la molécula .

D . Aplicabilidad Industrial Las guimeras de leucotoxina-GnRH de la presente invención son de uso en la provisión de inmunógenos que, cuando se administran a un huésped reactivado, sirven para administrar el huésped contra la GnRH endógena, gue a su vez actúa para inhibir la función reproductiva o la capacidad del huésped . No obstante, los usos específicos ejemplificados en esta especificación, las nuevas moléculas quiméricas descritas en la presente proporcionan un medio para obtener proteínas de fusión que comprenden más de un polipéptido de GnRH, que se presenta en repeticiones ya sea múltiples o en tándem, y que se fusionan a los epítopes inmunogénicos suministrados por la porción de polipéptido de leucotoxina de la molécula (en algunos casos por las secuencias peptídicas espaciadoras que se presentan entre las secuencias de GnRH seleccionadas) . Las presentes proteínas quiméricas construidas bajo la presente invención proporcionan inmunogenidad mejorada a las secuencias peptídicas de GnRH, fusionadas, permitiendo gue un huésped vertebrado inmunizado monte una respuesta inmunitaria efectiva hacia la GnRH endógena; efectuando una interrupción en la síntesis de liberación de las dos hormonas gonadotrópicas, la hormona leutinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH) y volviendo al huésped temporalmente estéril. De esta manera, las nuevas construcciones de leucotoxina-GnRH se pueden emplear en vacunas de inmunoesterilización para proporcionar una alternativa a los procedimientos de esterilización invasivos practicados corrientemente en la cría de animales domésticos y de granja. Las moléculas de fusión de leucotoxina-GnRH también se pueden usar para incidencia de tumores mamarios en sujetos mamíferos usando vacunas que comprenden estas moléculas para bloquear las funciones ováricas tal como la producción de las hormonas ováricas, estrógeno y progesterona. De esta manera, los sujetos caninos y felinos esterilizados inmunológicamente desarrollaran piometra (infección el útero), puesto que los animales inmunizados no produjeron progesterona lo que predispone a esta condición. Otros usos contemplados de las presentes moléculas de fusión incluyen el control de población, por ejemplo, la interrupción de las capacidades de reproducción en las poblaciones silvestres de roedores. A este respecto, las moléculas de fusión de LKT-GnRH se pueden usar como una alternativa a las medidas de control de población practicadas corrientemente, tal como envenenamiento y similares. Los productos de fusión de la presente invención también se pueden administrar en construcciones que tienen componentes de liberación tanto lenta como rápida. De esta manera, se puede evitar la necesidad de múltiples vacunaciones. Además, puesto que la secuencia de aminoácidos de GnRH se conserva altamente entre las especies, se puede producir un producto de vacuna de fusión de leucotoxina-GnRH individual que exhibirá una amplia efectividad entre especies. De esta manera, las varias proteínas quiméricas que comprenden leucotoxina fusionada a los polipéptido de GnRH seleccionados se han descrito. Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se han descrito en algún detalle, se entiende que se pueden hacer variaciones obvias sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas .

Depósitos de las Cepas Útiles en la Práctica de la Invención Se hizo un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas, con la American Type Culture Collection (ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. El número de acceso indicado se asignó después de la prueba de viabilidad exitosa, y se pagaron las tazas requeridas. Los depósitos se hicieron bajo las provisiones del tratado de Budapest en el reconocimiento internacional de depósito de microorganismos para el propósito de procedimientos de patente y las regulaciones subyacentes (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables durante un periodo de treinta (30 años) a partir de la fecha de depósito y al menos cinco (5) años después de la petición más reciente para la presentación de una muestra del depósito por el depositario. Los organismos estarán disponibles por la ATCC bajo los términos del tratado de Budapest, que asegura la disponibilidad permanente y no restringida de los cultivos a uno determinado por el Comisionado Norteamericano de Patentes y Marcas que se va a titular a ésta de acuerdo con 35 USC § 122 y las reglas del comisionado de acuerdo a esto (gue incluyen 37 CFR §1.12) . En el otorgamiento de una patente, todas las restricciones de la disponibilidad al público de los cultivos depositados se removerán irrevocablemente. Estos depósitos se proporcionan solo como conveniencia para aquellos expertos en la técnica, y no son una admisión que un depósito se requiera bajo 35 USC § 122. Las secuencias de ácido nucleico de estos plásmidos, así como las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por estas, se incorporan en la presente por referencia y se controlan en el caso de cualquier conflicto con la descripción en la presente. Se puede pedir una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados, y no se otorga por este modo esta licencia .

Cepa No . Fecha de Depósito No. de ATCC P. haemolítica 1 de Febrero de 1989 53863 serotipo 1 B122 pAAlOl en JM105 1 de Febrero de 1989 67883 de E . coli pAA352 en W1485 30 de Marzo de 1990 68283 E . coli PCB113 en JM105 1 de Febrero de 1995 69749 E . coli pCBlll en JM105 1 de Febrero de 1995 69748 E . coli LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: UNIVERSITY OF SASKATCHEWAN (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: QUIMERAS DE GnRH- LEUCOTOXINA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 34 (iv) : DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: GOWLING, STRATHY & HENDERSON (B) CALLE: SUITE 2600, 160 ELGIN STREET (C) CIUDAD: OTTAWA (D) ESTADO: ONTARIO (E) PAÍS: CANAD (F) CÓDIGO POSTAL: K1P 1C3 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD CORRIENTE: (A) NUMERO DE SOLICITUD: PCT/CA97/00559 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-AGOS-1997 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA "DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO (A) NOMBRE: ERRATT, JUDY A.: (B) NUMERO DE REGISTRO: (C) NUMERO DE ORDEN/REFERENCIA: 08-876788WO (ix) INFORMACIÓN DE LA TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO: (613)233-1781 (B) TELEFAX: (613)563-9869 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..30 (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 1 CAG CAT TGG AGC TAC GGC CTG CGC CCT GGC 30 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: : Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 147 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..147 (xi) DESCRIPCIÓN P7?RA LA SEQ. ID No: 3: CAG CAT TGG AGC TAC GGC CTG CGC CCT GGC AGC GGT TCT CAA (SAT TGG 48 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp 15 20 25 AGC TAC" GGC CTG CGT CCG GGT GGC TCT AGC CAG CAT TGG AGC TAC GGC 96 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Glp His Trp Ser Tyr Gly 30 35 40 CTG CGC CCT GGC AGC GGT AGC CAA GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCG 144 Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Glr. Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 45 50 SS GGT 147 Gly 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 49 aminoácidos (B ) TIPO : aminoácido ( D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi ) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ . ID No : 4 ; Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp 1 5 10 15 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly 20 25 30 Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 35 40 .45 Gly ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2794 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1.2778 (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 5: ATG GCT ACT GTT ATA «3AT CTA AGC TTC CCA AAA ACT «3GG GCA AAA AAA 48 MeC Ala Thr Val He Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys 50 55 60 65 ATT ATC CTC TAT ATT CCC CAA AAT TAC CAA TAT GAT ACT GAA «CA GGT 96 He He Leu Tyr He Pro Gln Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly 70 75 80 AAT GGT TTA CAG GAT TTA GTC AAA GCG GCC GAA GAG TTG GGG ATT GAG 144 Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly He Glu 85 90 95 GTA CAA AGA GAA GAA CGC AAT AAT ATT GCA ACÁ GCT CAA ACC AGT TTA 192 Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asn He Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu 100 105 110 GGC ACG ATT CAA ACC GCT ATT GGC TTA ACT GAG CGT GGC ATT GTG TTA 240 Gly Thr He Gln Thr Ala He Gly Leu Thr Glu Arg Gly He Val Leu 115 ' 120 125 TCC GCT CCA CAA ATT GAT AAA TTG CTA CAG AAA ACT AAA GCA GGC CAA 288 Ser Ala Pro Gln He Asp Lys Leu Leu Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln 130 135 140 145 GCA TTA GGT TCT GCC GAA AGC ATT GTA CAÁ AAT GCA AAT AAA GCC AAA 336 Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser He Val Gln Asn Ala Aen Lys Ala Lys 150 155 160 ACT GTA TTA TCT GGC ATT CAA TCT ATT TTA GGC TCA GTA TTG GCT GGA 384 Thr Val Leu Ser Gly He Gln Ser He Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly 165 170 1 5 ATG GAT TTA GAT GAG GCC TTA CAG AAT AAC AGC AAC CAA CAT GCT CTT 432 Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asp Asp Ser Asn Gln His Ala Leu 180 1B5 190 GCT AAA GCT GGC TTG (SAG CTA ACÁ AAT TCA TTA ATT «SAA AAT ATT GCT 480 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Leu He Glu Asn He Ala 195 200 205 AAT TCA GTA AAA ACÁ «CTT «3AC GAA TTT GGT GAG CAA ATT AGT CAA TTT 528 Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln He Ser Gln Phe 210 215 220 225 (3GT TCA AAA CTA CAA AAT ATC AAA G-GC TTA GGG ACT TTA GGA GAC AAA 576 Gly Ser Lys Leu Gln Asn He Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys 230 235 240 CTC AAA AAT ATC GGT GGA CTT «3AT AAA GCT GGC CTT GGT TTA (SAT GTT 624 Leu Lys Asn He Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val 245 250 255 ATC TCA GGG CTA TTA TCG GGC GCA ACÁ GCT GCA CTT GTA CTT GCA GAT 672 He Ser .Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp 260 265 270 AAA AAT GCT TCA ACÁ GCT AAA AAA GTG GGT GCG «3GT TTT I3AA TTG GCA 720 Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 275 280 285 AAC CAA GTT GTT GGT AAT ATT ACC AAA <3CC GTT TCT TCT TAC ATT TTA 768 Asn Gln Val Val Gly Asn He Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr He Leu 290 295 300 305 GCC CAA CGT GTT GCA GCA GGT TTA TCT TCA ACT G-GG CCT GTG GCT GCT 816 Ala Gln.Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 310 31S 320 TTA ATT GCT TCT ACT GTT TCT CTT GCG ATT AGC CCA TTA GCA TTT GCC 864 Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala He Ser Pro Leu Ala Phe Ala 325 330 335 GGT ATT GCC GAT AAA TTT AAT CAT GCA AAA AGT TTA GAG AGT TAT GCC 912 Gly He Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala 340 345 3S0 GAA CGC TTT AAA AAA TTA GGC TAT GAC GGA GAT AAT TTA TTA GCA 3AA 960 Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu 355 360 365 TAT CAG CGG GGA ACÁ GGG ACT ATT GAT GCA TCG GTT ACT GCA ATT AAT 1008 Tyr sln Arg Gly Thr Gly Thr lie Asp Ala Ser Val Thr Ala He Asn 370 375 380 385 ACC GCA TTG GCC GCT ATT GCT GGT GGT GTG TCT GCT GCT GCA GCC GGC 1056 Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Ala Gly 390 395 400 TCG GTT ATT GCT TCA CCG ATT GCC TTA TTA GTA TCT GGG ATT ACC GGT 1104 Ser Val He Ala Ser Pro He Ala Leu Leu Val Ser Gly He Thr Gly 405 410 415 GTA ATT TCT ACG ATT CTG CAA TAT TCT AAA CAA GCA ATG TTT GAG CAC 1152 Val He Ser Thr lie Leu Gln Tyr Ser Lys Glp Ala Met Phe Glu His 420 425 430 GTT GCA AAT AAA ATT CAT AAC AAA ATT GTA GAA TGG GAA AAA AAT AAT 1200 Val Ala Asn Lys He His Asn Lys He Val Glu Trp Glu Lys Asn Asp 435 440 445 CAC GGT AAG AAC TAC TTT GAA AAT GGT TAC GAT GCC CGT TAT CTT GCG 1248 His Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala 450 455 460 4S5 AAT TTA CAA GAT AAT ATG AAA TTC TTA CTG AAC TTA AAC AAA GAG TTA 1296 Asn Leu Gln Asp Asn. Met Lys Phe Leu Leu Asn Leu Asn Lys Glu Leu 470 475 480 CAG GCA GAA CGT GTC ATC GCT ATT ACT CAG CAG CAA TGG GAT AAC AAC 1344 Gln Ala Glu Arg Val He Ala He Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn 485 490 495 ATT GGT GAT TTA GCT GGT ATT AGC CGT TTA GGT GAA AAA GTC CTT AGT 1392 He Gly Asp Leu Ala Gly He Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser 500 505 510 GGT AAA GCC TAT GTG GAT GCG TTT GAA GAA GGC AAA CAC ATT AAA GCC 1440 Gly Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Lys His He Lys Ala 515 520 525 GAT AAA TTA GTA CAG TTG GAT TCG GCA AAC GGT ATT ATT GAT GTG AGT 1488 Asp Lys Leu Val Gln Leu Asp Ser Ala Asn Gly He He Asp Val Ser 530 535 540 545 AAT TCG GGT AAA GCG AAA ACT CAG CAT ATC TTA TTC AGA ACG CCA TTA 1536 Asn Ser Gly Lys Ala Lys Thr Gln His He Leu Phe Arg Thr Pro Leu 550 555 560 TTG ACG CCG GGA ACÁ GAG CAT CGT GAA CGC GTA CAA ACÁ GGT AAA TAT 1584 Leu Thr Pro Gly Thr Glu His Arg Glu Arg Val Gln Thr Gly Lys Tyr 565 570 575 GAA TAT ATT ACC AAG CTC AAT ATT AAC CGT GTA GAT AGC TGG AAA ATT 1632 Glu Tyr He Thr Lys Leu Asn He Asn Arg Val Asp Ser Trp Lys He - 580 585 590 ACÁ GAT GGT GCA GCA AGT TCT ACC TTT GAT TTA ACT AAC GTT GTT CAG 1680 Thr Asp Gly Ala Ala Ser Ser Thr Phe Asp Leu Thr Asn Val Val Gln 595 600 605 CGT ATT GGT ATT GAA TTA GAC AAT GCT GGA AAT GTA ACT AAA ACC AAA 1728 Arg He Gly He Glu Leu Asp Asn Ala Gly Asn Val Thr Lys Thr Lye 610 615 620 625 GAA ACÁ AAA ATT ATT GCC AAA CTT GGT GAA GGT «GAT GAC AAC GTA TTT 1776 Glu Thr Lys He He Ala Lys Leu Gly Glu Gly Asp Asp Asn Val Phe 630 635 640 GTT GGT TCT GGT ACG ACG GAA ATT GAT GGC GGT GAA GGT TAC GAC CG-A 1824 Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu He Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg 645 650 655 GTT CAC TAT AGC CGT GGA AAC TAT GGT GCT TTA ACT ATT GAT GCA ACC 1872 Val His Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Leu Thr He Asp Ala Thr 660 665 670 AAA GAG ACC GAG CAA GGT AGT TAT ACC GTA AAT CGT TTC GTA GAA ACC 1920 Lys Glu Thr Glu Gln Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Phe Val Glu Thr 675 680 685 GGT AAA GCA CTA CAC GAA GTG ACT TCA ACC CAT ACC GCA TTA GTG GGC 1968 Gly Lys Ala Leu His Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Val Gly 690 695 700 705 AAC CGT GAA GAA AAA ATA GAA TAT CGT CAT AGC AAT AAC CAG CAC CAT 2016 Aan Arg- Glu Glu Lys He Glu Tyr Arg His Ser Asn Asn Gln His His 710 715 720 GCC GGT TAT TAC ACC AAA GAT ACC TTG AAA GCT GTT GAA GAA ATT ATC 2064 Ala Gly Tyr Tyr Thr Lys A3p Thr Leu Lys Ala Val Glu Glu He lie 725 730 735 GGT ACÁ TCA CAT AAC GAT ATC TTT AAA GGT AGT AAG TTC AAT GAT GCC 112 Gly Thr Ser His Asn Asp He Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala 740 745 750 TTT AAC GGT GGT GAT GGT GTC GAT ACT ATT GAC GGT AAC GAC GGC AAT 2160 Phe Asn Gly Gly Asp Gly Val Asp Thr He Asp Gly Asn Asp Gly Asn 75S 760 765 GAC CGC TTA TTT GGT GGT AAA GGC GAT GAT ATT CTC GAT GGT GGA AAT 2208 Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asp Asp He Leu Asp Gly Gly Asn 770 775 780 785 GGT GAT GAT TTT ATC GAT GGC GGT AAA GGC AAC GAC CTA TTA CAC GGT 2256 Gly Asp Asp Phe He Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu His Gly 790 795 800 GGC AAG GGC GAT GAT ATT TTC GTT CAC CGT AAA GGC GAT GGT AAT GAT 2304 Gly Lys Gly Asp Asp He Phe Val His Arg Lys Gly Asp Gly Asn Asp 805 810 815 ATT ATT ACC GAT TCT GAC GGC AAT GAT AAA TTA TCA TTC TCT G-AT TCG 2352 He He Thr Asp Ser Asp Gly Asn Asp Lys Leu Ser Phe Ser Asp Ser '820 825 830 AAC TTA AAA (SAT TTA ACÁ TTT GAA AAA GTT AAA CAT AAT CTT GTC ATC 2400 Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Val He 835 840 845 ACG AAT" AGC AAA AAA GAG AAA GTG ACC ATT CAA AAC TGG TTC CGA GAG 2448 Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr He Gln Asn Trp Phe Arg Glu 850 855 860 865 GCT GAT TTT GCT AAA GAA GTG CCT AAT TAT AAA GCA ACT AAA GAT GAG 2496 Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu 870 875 880 AAA ATC GAA GAA ATC ATC GGT CAA AAT GGC GAG CGG ATC ACC TCA AAG 2544 Lys He Glu Glu He He Gly Gln Asn Gly Glu Arg He Thr Ser Lys 885 890 895 CAA GTT GAT GAT CTT ATC GCA AAA GGT AAC GGC AAA ATT ACC CAA GAT 2592 Gln Val Asp Asp Leu He Ala Lys Gly Asn Gly Lys He Thr Gln Asp 900 905 910 GAG CTA TCA AAA GTT GTT GAT AAC TAT GAA TTG CTC AAA CAT AGC AAA 2640 Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys 915 920 925 AAT GTG ACÁ AAC AGC TTA GAT AAG TTA ATC TCA TCT GTA AGT GCA TTT 2688 Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val Ser Ala Phe 930 935 940 945 ACC TCG TCT AAT GAT TCG AGA AAT GTA TTA GTG GCT CCA ACT TCA ATG 2736 Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met 950 955 960 TTG GAT «CAÁ AGT TTA TCT TCT CTT CAA TTT GCT AGG GGA TCC 2778 Leu Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser 965 970 975 TAGCTAGCTA GCCATG 2794 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 6 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 926 aminoácidos (B ) TIPO : aminoácido ( D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 6: Met Ala 'Thr Val He Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys 1 5 10 15 He He Leu Tyr lie Pro Gln Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly 20 25 30 Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly He Glu 35 40 45 Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asn He Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu 50 55 60 Gly Thr He Gln Thr Ala He Gly Leu Thr Glu Arg Gly He Val Leu 65 70 75 80 Ser Ala Pro Gln He Asp Lys Leu Leu Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln 85 90 95 Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser He Val Gln Asn Ala Asn Lya Ala Lys 100 105 lio Thr Val Leu Ser Gly He Gln Ser He Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly 115 120 125 Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asn Asn Ser Asn Glp His Ala Leu 130 135 140 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Leu He Glu Asn He Ala 145 150 155 160 Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln He Ser Gln Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Leu Gln Asn He Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys 180 185 190 Leu Lys Asn He Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val 195 200 205 He Ser Oly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp 210 215 220 Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 225 230 235 240 Asn Gln Val Val Gly Asn He Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr He Leu 245 250 255 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 260 265 270 Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala He Ser Pro Leu Ala Phe Ala 275 280 285 Gly He Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala 290 295 300 Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu 305 310 315 320 Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr He Asp Ala Ser Val Thr Ala He Asn 325 330 335 Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Ala Gly 340 345 350 Ser Val He Ala Ser Pro He Ala Leu Leu Val Ser Gly He Thr Gly 355 360 365 Val He Ser Thr He Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His 370. 375 380 Val Ala Asn Lys He His Asn Lys He Val Glu Trp Glu Lys Asn Asn 385 390 395 400 His Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala 405 410 415 sn Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Leu Asn Leu Asn Lys Glu Leu 420 425 430 Gln Ala Glu Arg Val He Ala He Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn 435 440 445 He Gly Asp Leu Ala Gly He Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser 450 455 460 Gly Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Lys His He Lys Ala 465 470 475 480 Asp Lys Leu Val Gln Leu Asp Ser Ala Asn Gly He He Asp Val Ser 485 490 495 Asn Ser Gly Lys Ala Lys Thr Gln His He Leu Phe Arg Thr Pro Leu 500 505 510 Leu Thr Pro Gly Thr Glu His Arg Glu Arg Val Glp Thr Gly Lys Tyr 515 520 525 Glu Tyr He Thr Lys Leu Asn He Asn Arg Val Asp Ser Trp Lys He 530 535 540 Thr Asp Gly Ala Ala Ser Ser Thr Phe Asp Leu Thr Asn Val Val Gln 545 550 555 560 Arg He Gly He Glu Leu Asp Asn Ala Gly Asn Val Thr Lys Thr Lys 565 570 575 Glu Thr Lys He He Ala Lys Leu Gly Glu Gly Asp Asp Asn Val Phe 580 585 590 Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu He Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg 595 600 605 Val His. Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Leu Thr He Asp Ala Thr 610 615 S20 Lys Glu Thr Glu Gln Gly Ser Tyr Thr Val A=n Arg Phe Val Glu Thr 625 630 635 S40 Gly Lys Ala Leu His Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Val Gly 645 650 655 Asn Arg Glu Glu Lys He Glu Tyr Arg His Ser Asn Asn Gln His His 660 665 670 Ala Gly Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Leu Lys Ala Val Glu Glu He lie 675 680 68S Gly Thr Ser His Asn Asp He Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala 690 695 700- Phe Asn Gly Gly Asp Gly Val Asp Thr He Asp Gly Asn Asp Gly Asn 705 710 715 720 Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asp Asp He Leu Asp Gly Gly Asn 725 730 735 Gly Asp Asp Phe He Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu His Gly 740 745 750 Gly Lys Gly Asp Asp He Phe Val His Arg Lys Gly Asp Gly Asn Asp 755 760 765 He He Thr Asp Ser Asp Gly Asn Asp Lys Leu Ser Phe Ser Asp Ser 770 775 780 Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Val He 785 790 795 800 Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr He Gln Asn Trp Phe Arg Glu 805 810 815 Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu 820 825 830 Lys He Glu Glu He He Gly Gln Asn Gly Glu Arg He Thr Ser Lys 835 840 845 Gln Val Asp Asp Leu He Ala Lys Gly Asn Gly Lys He Thr Gln Asp 850 855 860 Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys 865 870 875 880 Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val Ser Ala Phe 885 890 895 Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met 900 905 910 Leu Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser 915 920 925 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2934 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS ostt st-tt o?>tt sett dsv EXV "31 X«? TISI B V «XV *-rq? B ??o JTS nß-i na1} ? o -las SXI Z XVO VDD XXD VXO XXD VDO XDO VDV VDD DDO DDX VXX VXD OOO VDX DXV oett sett oett X dsv t?at ??o ns-i -??o BXV e??; dev na-i ??3 ? o a?? usv S?7 nal iZ9 XXD XVD VXX XDO XXD DDO XDO VW XVD XXD VDD XOD DXV XW VW DLLD sttt ottt sott S?T ds ??o pai oq? ??o ns-i ??o e?-r a?? usv ?3 n»? s?«? ßs -^TO 9¿S W DVO VOO VXX XDV OOO VXX DDO VW DXV XW WD VXD WV VDX XOO oott seoT oeoi aqd u?o a s a?i u?o p?o -XD sqd p?o dsv mi aqx s i XB J*-S USV 8 5 XXX WD XOV XXV WD OVO XDO XXX WD DVD XXD VDV VW VXO VDX XW «T BXV 08i> XDD XDD O?OT S9ot ?9ot ssot nai X SJ.H u?o us aas e usv u?o pa«? «T " O ds mi s •?-'W ee* XXD XDO VD D DW DOV DW XW DVD VXX DO DVD XVD VXX XVO oxv osot st>ot o?ot ^TD «XV t-a XB? aas ID TIBÍ a?? aas u?o s?i -XD aas ns-i XB? aqx tBe VDO XDO OXX VXD VDX DDD VXX XXV XDX WD XIV DDO IDI VXX VXO IDV seot oeot ssot s?-? X s?«? usv « V us u?o X ? a?i aas po «XV aas -^TO ns-i X 9e WV DDD WV XW VDO XW WD VXD XXV DDV WO DDO XDX XOO VXX VDO oeot stot otot UXO o XV s?i j:q? SJÍM u?o nai naa s?a dsv a?i u?o o a BXV aas 882 WD DOD VDD VW XDV VW OVO VXD DXX VW XVD XXV WD VDD XDO DDX soot ooot S66 T«? s>XI **XO Bxy n?o aux na-i X?o 3X1 «XV arqx u?o s?i aqx ? o 0t>Z VII DIO XIV DDD XDD OVO DV VII DDO XXV XDD DDV WD XIV ODV DDO 066 S86 086 SZ.6 nai ;tas qi uo B V oq? XV »XI usv usv Bav p?o n?o Bv u?o X ? Z6X VXX XOV DDV WD XDO VDV VDO XXV IW XW DDD WD WD VOV WD VXD Oí.6 S96 096 ?TO 5 1 ??o nai n?o n?o BXV XV SA ?«? tisi dsv u?o pai ??o usv itt DVD XXV DDO DXX DVD WD DDO SDO VW DXD VXX XVD DVD VXX XDD XW SS6 056 S«><S . ^TO «XD n?o aqx dsv ?x u?o LXÁX USV u?o o »XI a?x nai 'a?? a?? 96 -l-8 V^D WO XDV XVD XVX WD DVX XW WD DDD XXV XVX DXD DXV XXV s?i e?i aqx BX *3a 8* W W XDV XDO DXV • L :°N ai Oas vi vwa NOioaiHosaa (t*) tedS'i -NOIOYZ?YOOT: (ß) 17171- AAA AAT GCT TCA ACÁ GCT AAA AAA CTG GGT GCG GGT TTT GAA TTG GCA 720 Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 1155 1160 1165 AAC CAA GTT GTT GGT AAT ATT ACC AAA GCC GTT TCT TCT TAC ATT TTA 768 Asn Gln Val Val Gly Asn He Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr He Leu 1170 1175 1180 GCC CAA CGT GTT GCA GCA GGT TTA TCT TCA ACT GGG CCT GTG GCT G-CT 816 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 1185 1190 1195 TTA ATT GCT TCT ACT GTT TCT CTT GCG ATT AGC CCA TTA GCA TTT GCC 864 Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala He Ser Pro Leu Ala Phe Ala 1200 1205 1210 GGT ATT GCC GAT AAA TTT AAT CAT GCA AAA AGT TTA GAG AGT TAT GCC 912 Gly He Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala 1215 1220 1225 1230 GAA CGC TTT AAA AAA TTA GGC TAT GAC GGA GAT AAT TTA TTA GCA GAA 960 Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn. Leu Leu Ala Glu 1235 1240 1245 TAT CAG CGG GGA ACÁ GGG ACT ATT GAT GCA TCG GTT ACT GCA ATT AAT 1008 Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr He Asp Ala Ser Val Thr Ala He Asn 1250 1255 1260 ACC GCA TTG GCC GCT ATT GCT GGT GGT GTG TCT GCT GCT GCA GCC GGC 1056 Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Ala Gly 1265 1270 1275 TCG GTT ATT GCT TCA CCG ATT GCC TTA TTA GTA TCT GGG ATT ACC GGT 1104 Ser Val He Ala Ser Pro He Ala Leu Leu Val Ser Gly He Thr Gly 1280 1285 1290 GTA ATT TCT ACG ATT CTG CAA TAT TCT AAA CAA GCA ATG TTT GAG CAC 1152 Val He Ser Thr He Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His 1295 " 1300 1305 1310 GTT GCA AAT AAA ATT CAT AAC AAA ATT GTA GAA TCG GAA AAA AAT AAT 1200 Val Ala Asn Lys He His Asn Lys He Val Glu Trp Glu Lys Asn Asn 1315 1320 1325 CAC GGT AAG AAC TAC TTT GAA AAT GGT TAC GAT GCC CGT TAT CTT GCG 1248 His Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala 1330 1335 1340 AAT TTA CAA GAT AAT ATG AAA TTC TTA CTG AAC TTA AAC AAA GAG TTA 1296 Asn Leu Gln Asp Asp Met Lys Phe Leu Leu Asn Leu Asn Lys Glu Leu 1345 1350 1355 CAG GCA GAA CGT GTC ATC GCT ATT ACT CAG CAG CAA TGG GAT AAC AAC 1344 Gln Ala Glu Arg Val He Ala He Thr Gln Glp Gln Trp Asp Asn Asn 1360 1365 1370 ATT GGT GAT TTA GCT GGT ATT AGC CGT TTA GGT GAA AAA GTC CTT AGT 1392 He Gly Asp Leu Ala Gly He Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser 1375 1380 1385 1390 GGT AAA GCC TAT GTG GAT GCG TTT GAA GAA GGC AAA CAC ATT AAA GCC 1440 Gly Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Lys His He Lys Ala 1395 1400 1405 GAT AAA TTA GTA CAG TTG GAT TCG GCA AAC GGT ATT ATT GAT GTG AGT 1488 Asp Lys Leu Val Glp Leu Asp Ser Ala Asn Gly He He Asp Val Ser 1410 1415 1420 AAT TCG GOT AAA GCG AAA ACT CAG CAT ATC TTA TTC AGA ACG CCA TTA 536 Asn Ser Gly Lys Ala Lys Thr Gln His He Leu Phe Arg Thr Pro Leu 1425 1430 1435 TTG ACG CCG GGA ACÁ GAG CAT CGT GAA CGC GTA CAA ACÁ GGT AAA TAT 1584 Leu Thr Pro Gly Thr Glu His Arg Glu Arg Val Gln Thr Gly Lys Tyr 1440 1445 1450 GAA TAT ATT ACC AAG CTC AAT ATT AAC CGT GTA GAT AGC TGG AAA ATT 1632 Glu Tyr He Thr Lys Leu Asn He Asn Arg Val Asp Ser Trp Lys He 1455 1460 1465 1 70 ACÁ GAT GGT GCA GCA AGT TCT ACC TTT GAT TTA ACT AAC GTT GTT CAG 1680 Thr Asp Gly Ala Ala Ser Ser Thr Phe Asp Leu Thr Asn Val Val Gln 1475 1480 1435 CGT ATT GGT ATT GAA TTA GAC AAT GCT GGA AAT GTA ACT AAA ACC AAA 1728 Arg He Gly He Glu Leu Asp Asn Ala Gly Asn Val Thr Lys Thr Lys 1490 1495 1500 GAA ACÁ AAA ATT ATT GCC AAA CTT GGT GAA GGT GAT GAC AAC GTA TTT 1776 Glu Thr Lys He He Ala Lys Leu Gly Glu Gly Asp Aep Asn Val Phe 1505 1510 1515 GTT GGT -TCT GGT ACG ACG GAA ATT GAT «3GC GGT GAA GGT TAC GAC CGA 1824 Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu He Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg 1520 1525 1530 GTT CAC TAT AGC CGT GGA AAC TAT GGT GCT TTA ACT ATT GAT GCA ACC 1872 Val His Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Leu Thr He Asp Ala Thr 1535 1540 1545 1550 AAA GAG ACC GAG CAA GGT AGT TAT ACC GTA AAT CGT TTC GTA GAA ACC 1920 Lys Glu Thr Glu Gln Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Phe Val Glu Thr 1555 1560 1565 GGT AAA GCA CTA CAC GAA GTG ACT TCA ACC CAT ACC GCA TTA GTG GGC 1968 Gly Lys Ala Leu His Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Val Gly 1570 1575 1580 AAC CGT GAA GAA AAA ATA GAA TAT CGT CAT AGC AAT AAC CAG CAC CAT 2016 Asn Arg Glu Glu Lys He Glu Tyr Arg Hie Ser Asn Asn Gln His His 1585 1590 1595 GCC GGT TAT TAC ACC AAA GAT ACC TTG AAA GCT GTT GAA GAA ATT ATC 2064 Ala Gly Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Leu Lys Ala Val Glu Glu He He 1600 1605 1610 GGT ACÁ TCA CAT AAC GAT ATC TTT AAA GGT AGT AAG TTC AAT GAT GCC 2112 Gly Thr Ser His Asn Asp He Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala 1615 1620 1625 1630 TTT AAC GGT GGT GAT GGT GTC GAT ACT ATT GAC GGT AAC GAC GGC AAT 2160 Phe Asn Gly Oly Asp Gly Val Asp Thr He Asp Gly Asn Asp Gly Asn 1635 1640 1645 GAC CGC TTA TTT GGT GGT AAA GGC GAT GAT ATT CTC GAT GGT GGA AAT 2208 Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asp Asp He Leu Asp Gly Gly Asn 1650 1655 1660 GGT GAT GAT TTT ATC GAT GGC GGT AAA GGC AAC GAC CTA TTA CAC GGT 2256 Gly Asp Asp Phe He Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu His Gly 1665 1670 1675 GGC AAG GGC GAT GAT ATT TTC GTT CAC CGT AAA GGC GAT GGT AAT GAT 2304 Gly Lys Gly Asp Asp He Phe Val His Arg Lys Gly Asp Gly Asn Asp 1680 1685 1690 ATT ATT ACC GAT TCT GAC GGC AAT GAT AAA TTA TCA TTC TCT GAT TCG 2352 He He Thr Asp Ser Asp Gly Asn Asp Lys Leu Ser Phe Ser Asp Ser 1695 1700 1705 1710 AAC TTA AAA GAT TTA ACÁ TTT GAA AAA GTT AAA CAT AAT CTT GTC ATC 2400 Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Val He 1715 1720 1725 ACG AAT AGC AAA AAA GAG AAA GTG ACC ATT CAA AAC TGG TTC CGA GAG 2448 Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr He Gln Asn Trp Phe Arg Glu 1730 1735 1740 GCT GAT TTT GCT AAA GAA GTG CCT AAT TAT AAA GCA ACT AAA GAT GAG 2496 Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu 1745 1750 1755 AAA ATC GAA GAA ATC ATC GGT CAA AAT GGC GAG CGG ATC ACC TCA AAG 2544 Lys He Glu Glu He He Gly Gln Asn Gly Glu Arg He Thr Ser Lys 1760 1765 1770 CAA GTT 'GAT GAT CTT ATC GCA AAA GGT AAC GGC AAA ATT ACC CAA GAT 2592 Gln Val Asp Asp Leu He Ala Lys Gly Asn Gly Lys He Thr Gln Asp 1775 1780 1785 1790 GAG CTA TCA AAA GTT GTT GAT AAC TAT GAA TTG CTC AAA CAT AGC AAA 2640 Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys 1795 1800 1805 AAT GTG ACÁ AAC AGC TTA GAT AAG TTA ATC TCA TCT GTA AGT GCA TTT 2688 Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val Ser Ala Phe 1810 1815 1820 ACC TCG.TCT AAT GAT TCG AGA AAT GTA TTA GTG GCT CCA ACT TCA ATG 2736 Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met 1825 1830 1835 TTG GAT CAA AGT TTA TCT TCT CTT CAA TTT GCT AGG GGA TCT CAG CAT 2784 Leu Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser Gln His 1840 1845 1850 TGG AGC TAC GGC CTG CGC CCT GGC AGC GGT TCT CAA GAT TGG AGC TAC 2832 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr 1855 1860 1865 1870 GGC CTG CGT CCG GGT GGC TCT AGC CAG CAT TGG AGC TAC GGC . CTG CGC 2880 Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 1875 1880 1885 CCT GGC AGC GGT AGC CAA GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCG GGT GGA 2928 Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly 1890 1895 1900 TCC TAG 2934 Ser 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 977 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 8: Met Ala Thr Val He Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys 1 5 10 ?s He He Leu Tyr He Pro Gln Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly 20 25 30 Asn Gly. Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly He Glu 35 40 45 Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asp He Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu SO 55 60 Gly Thr He Gln Thr Ala He Gly Leu Thr Glu Arg Gly He Val Leu 65 70 75 80 Ser Ala Pro Gln He Asp Lys Leu Leu Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln 85 90 95 Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser He Val Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys 100 105 110 Thr Val Leu Ser Gly He Gln Ser He Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly 115 120 125 Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asn Asn Ser Asn Gln His Ala Leu 130 135 140 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Leu He Glu Asn He Ala 145 150 155 160 Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln He Ser Glp Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Leu Gln Asn He Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys 180 185 190 Leu Lys Asn He Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val 195 200 205 He Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp 210 215 220 Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 225 230 235 240 Asn Gln Val Val Gly Asn He Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr He Leu 245 250 255 Ala Gln ?rg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 260 265 270 Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala He Ser Pro Leu Ala Phe Ala 275 280 285 Gly He Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala 290 295 300 Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu 305 310 315 320 Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr He Asp Ala Ser Val Thr Ala He Asn 325 330 335 Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Ala Gly 340 345 350 Ser Val He Ala Ser Pro He Ala Leu Leu Val Ser Gly He Thr Gly - 355 360 365 Val He Ser Thr He Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His 370 375 380 Val Ala Asn Lys He His Asn Lys He Val Glu Trp Glu Lys Asn Asn 385 390 395 400 His Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala 405 410 415 Asn Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Leu Asn Leu Asn I-ys Glu Leu 420 425 430 Gln Ala Glu Arg Val He Ala He Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn 435 440 445 He Gly Asp Leu Ala Gly He Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser 450 455 460 Gly Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Lys His He Lys Ala 465 470 475 480 Asp Lys Leu Val Gln Leu Asp Ser Ala Asn Gly He He Asp Val Ser 485 490 495 Asn Ser Gly Lys Ala Lys Thr Gln His He Leu Phe Arg Thr Pro Leu 500 505 510 Leu Thr Pro Gly Thr Glu His Arg Glu Arg Val Gln Thr Gly Lys Tyr 515 520 525 Glu Tyr He Thr Lys Leu Asp He Asn Arg Val Asp Ser Trp Lys He 530 535 540 Thr Asp Gly Ala Ala Ser Ser Thr Phe Asp Leu Thr Asn Val Val Gln 545 S50 555 560 Arg He Gly He Glu Leu Asp Asn Ala Gly Asn Val Thr Lys Thr Lys 565 570 575 Glu Thr Lys He He Ala Lys Leu Gly Glu Gly Asp Asp Asn Val Phe 580 585 590 Val Gly Ser Gly Thr Thr Glu He Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg 595 600 605 Val His Tyr Ser Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Leu Thr He Asp Ala Thr 610 ' 515 620 Lys Glu Thr Glu Gln Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Phe Val Glu Thr 625 630 535 640 Gly Lys Ala Leu His Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Val Gly 645 650 655 Asn Arg Glu Glu Lys He Glu Tyr Arg His Ser Asn Asn Gln His His 660 665 670 Ala Gly Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Leu Lys Ala Val Glu Glu He He 675 680 685 Gly Thr Ser His Asn Asp He Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala 690 695 700 Phe Asn Gly Gly Asp Gly Val Aep Thr He Asp Gly Asn Asp Gly Asn 705 710 715 720 Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asp Asp He Leu Asp Gly Gly Asn 725 730 735 Gly Asp Asp Phe He Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu His Gly 740 745 750 Gly Lys Gly Asp Asp He Phe Val His Arg Lys Gly Asp Gly Asn Asp 755 760 765 He He Thr Asp Ser Asp Gly Asn Asp Lys Leu Ser Phe Ser Asp Ser 770 775 780 Asn Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Val He 785 790 795 800 Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr He Gln Asn Trp Phe Arg Glu 805 810 815 Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu 820 825 830 Lys He Glu Glu He He Gly Gln Asn Gly Glu Arg He Thr Ser Lys '835 840 845 Gln Val Asp Asp Leu He Ala Lys Gly Asn Gly Lys He Thr Gln Asp 850 855 860 Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys 865 870 875 880 Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val Ser Ala Phe 885 890 895 Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met 900 905 910 Leu Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser Gln His 915 920 925 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr 930 935 940 Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 945 950 955 960 Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly 965 970 975 Ser ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1635 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..1632 (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 9: ATG GCT ACT GTT ATA GAT CTA AGC TTC CCA AAA ACT GGG GCA AAA AAA 43 Met Ala Thr Val He Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys 980 985 990 ATT ATC CTC TAT ATT CCC CAA AAT TAC CAA TAT GAT ACT GAA CAA GGT 96 He He Leu Tyr He Pro Gln Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly 995 1000 1005 AAT GGT TTA CAG GAT TTA GTC AAA GCG GCC GAA GAG TTG GGG ATT GAG 144 Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly He Glu 1010 1015 1020 1025 GTA CAA AGA GAA GAA CGC AAT AAT ATT GCA ACÁ GCT CAA ACC AGT TTA 192 Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn A3n He Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu 1030 1035 1040 GGC ACG ATT CAA ACC GCT ATT GGC TTA ACT GAG CGT GGC ATT GTG TTA 240 Gly Thr He Gln Thr Ala He Gly Leu Thr Glu Arg Gly He Val Leu 1045 1050 1055 TCC GCT CCA CAA ATT GAT AAA TTG CTA CAG AAA ACT AAA GCA GGC CAA 288 Ser Ala Pro Gln He Asp Lys Leu Leu Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln 1060 1065 1070 GCA TTA GGT TCT GCC GAA AGC ATT GTA CAA AAT GCA AAT AAA GCC AAA 336 Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser He Val Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys 1075 1080 1085 ACT GTA, TA TCT GGC ATT CAA TCT ATT TTA GGC TCA GTA TTG GCT GGA 384 Thr Val Leu Ser Gly He Gln Ser He Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly 1090 . 1095 1100 1105 ATG GAT TTA GAT GAG GCC TTA CAG AAT AAC AGC AAC CAA CAT GCT CTT 432 Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asp Asn Ser Asn Glp His Ala Leu 1110 1115 1120 GCT AAA GCT GGC TTG GAG CTA ACÁ AAT TCA TTA ATT GAA AAT ATT GCT 480 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asp Ser Leu He Glu Asn He Ala 1125 1130 1135 AAT TCA GTA AAA ACÁ CTT GAC GAA TTT GGT GAG CAA ATT AGT CAA TTT 528 Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln He Ser Gln Phe 1140 1145 1150 GGT TCA AAA CTA CAA AAT ATC AAA GGC TTA GGG ACT TTA GGA GAC AAA 576 Gly Ser Lys Leu Gln Asn He Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys 1155 1160 1165 CTC AAA AAT ATC GGT GGA CTT GAT AAA GCT GGC CTT GGT TTA GAT GTT 624 Leu Lys Asn He Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val 1170 1175 1180 1185 ATC TCA GGG CTA TTA TCG GGC GCA ACÁ GCT GCA CTT GTA CTT GCA GAT 672 He Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp 1190 1195 1200 AAA AAT GCT TCA ACÁ GCT AAA AAA GTG GGT GCG GGT TTT GAA TTG GCA 720 Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 1205 1210 1215 AAC CAA GTT GTT GGT AAT ATT ACC AAA GCC GTT TCT TCT TAC ATT TTA 768 Asn Gln Val Val Gly Aen He Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr He Leu 1220 1225 1230 GCC CAA CGT GTT GCA GCA GGT TTA TCT TCA ACT GGG CCT GTG GCT GCT 816 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 1235 1240 1245 TTA ATT GCT TCT ACT GTT TCT CTT GCG ATT AGC CCA TTA GCA TTT GCC 864 Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala He Ser Pro Leu Ala Phe Ala 1250 1255 1260 1265 GGT ATT GCC GAT AAA TTT AAT CAT GCA AAA AGT TTA (SAG AGT TAT GCC 912 Gly He Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala 1270 1275 1280 GAA CGC TTT AAA AAA TTA GGC TAT GAC GOA GAT AAT TTA TTA GCA GAA 960 Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu 1285 1290 1295 TAT CAG CGG GGA ACÁ GGG ACT ATT GAT GCA TCG GTT ACT GCA ATT AAT 1008 Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr He Asp Ala Ser Val Thr Ala He Asn 1300 1305 1310 ACC GCA TTG GCC GCT ATT GCT GGT GGT GTG TCT GCT GCT GCA GCC AAC 1056 Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Ala Asn 1315 1320 1325 TTA AAA GAT TTA ACÁ TTT GAA AAA GTT AAA CAT AAT CTT GTC ATC ACG 1104 Leu Lys Asp Leu Thx Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Val He Thr 1330 1335 1340 1345 AAT AGC AAA AAA GAG AAA GTG ACC ATT CAA AAC TGG TTC CGA GAG GCT 1152 Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr He Gln Asn Trp Phe Arg Glu Ala 1350 1355 1360 GAT TTT GCT AAA GAA GTG CCT AAT TAT AAA GCA ACT AAA GAT GAG AAA 1200 Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys 1365 1370 1375 ATC GAA GAA ATC ATC GGT CAA AAT GGC GAG CGG ATC ACC TCA AAG CAA 1248 He Glu Glu He He Gly Gln Asn Gly Glu Arg He Thr Ser Lys Gln 1380 1385 1390 GTT GAT GAT CTT ATC GCA AAA GGT AAC GGC AAA ATT ACC CAA GAT GAG 1296 Val Asp Asp Leu He Ala Lys Gly Asn Gly Lys He Thr Gln Asp Glu 1395 1400 1405 CTA TCA AAA GTT GTT GAT AAC TAT GAA TTG CTC AAA CAT AGC AAA AAT 1344 Leu Ser Lys Val Val Aep Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys Asn 1410 ' 1415 1420 1425 GTG ACÁ AAC AGC TTA GAT AAG TTA ATC TCA TCT GTA AGT GCA TTT ACC 1392 Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val Ser Ala Phe Thr 1430 1435 1440 TCG TCT AAT GAT TCG AGA AAT GTA TTA GTG GCT CCA ACT TCA ATG TTG 1440 Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asp Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met Leu 1445 1450 1455 GAT CAA AGT TTA TCT TCT CTT CAA TTT GCT AGG GGA TCT CAG CAT TGG 1488 Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser Gln His Trp 1460 1465 1470 AGC TAC GGC CTG CGC CCT GGC AGC GGT TCT CAA GAT TGG AGC TAC GGC 1536 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly 1475 1480 1485 CTG CGT . CCG GGT GGC TCT AGC CAG CAT TGG AGC TAC GGC CTG CGC CCT 1584 Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 1490 1495 1500 1505 GGC AGC GGT AGC CAA GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCG GGT GGA TCC 1632 Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser 1510 1515 1520 TAG 1635 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 10 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 544 aminoácidos (B ) TIPO : aminoácido ( D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi ) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ . ID No : 10 : Met Ala Thr Val He Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys 1 5 10 15 He He Leu Tyr He Pro Gln Asp Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly 20 25 30 Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly He Glu 35 40 45 Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asn He Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu 50 55 60 Gly Thr He Gln Thr Ala He Gly Leu Thr Glu Arg Gly He Val Leu 65 70 75 80 Ser Ala Pro Gln He Asp Lys Leu Leu Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln 85 90 95 Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser He Val Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys 100 105 110 Thr Val Leu Ser Gly He Gln Ser He Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly 115 120 125 Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asn Asn Ser Asn Gln His Ala Leu 130 135 140 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Leu He Glu Asn He Ala 145 • 150 155 160 Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln He Ser Gln Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Leu Gln Asn He Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys 180 185 190 Leu Lys Asn He Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val 195 200 205 He Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp 210 215 220 Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 225 230 235 240 Asn Gln Val Val Gly Asn He Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr He Leu 245 250 255 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 260 265 270 Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala He Ser Pro Leu Ala Phe Ala - 275 280 285 Gly He. Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala 290 295 300 Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu 305 310 315 320 Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr He Asp Ala Ser Val Thr Ala He Asn 325 330 335 Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Ala Asn 340 345 350 Leu Lys Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asp Leu Val He Thr 355 350 365 Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr He Gln Asn Trp Phe Arg Glu Ala 370 375 380 Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys 385 390 395 400 He Glu Glu He lie Gly Gln Asn Gly Glu Arg He Thr Ser Lys Gln 405 410 415 Val Asp Asp Leu He Ala Lys Gly Asn Gly Lys He Thr Gln Asp Glu 420 425 430 Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys Asn 435 440 445 Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val Ser Ala Phe Thr 450 455 460 Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met Leu 465 470 475 480 Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly Ser Gln His Trp 485 490 495 Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly 500 505 510 Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 515 520 525 Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser 530 535 540 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..42 (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 11 GCT GCA GCC GGC TCG GTT ATT TTC TCT GAT TCG AAC TTA AAA 42 Ala Ala Ala Gly Ser Val He Phe Ser Asp Ser Asn Leu Lys 545 550 555 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 12: Ala Ala Ala Gly Ser Val He Phe Ser Asp Ser Asn Leu Lys 1 5 10 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..18 (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 13: GCT GCA GCC AAC TTA AAA 18 Ala Ala Ala Asn Leu Lys 15 20 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 14 Ala Ala Ala Asn Leu Lys 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2102 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: unión ( 1..2085, 2089..2100) (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 15: ATG GCT ACT GTT ATA GAT CGA TCT CAG CAT TGG AGC TAC GGC CTG CGC 48 Met Ala Thr Val He Asp Arg Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 15 CCT GGC AGC GGT TCT CAA GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCG GGT GGC 96 Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly 20 25 30 TCT AGC CAG CAT TGG AGC TAC GGC CTG CGC CCT GGC AG-C GGT AGC CAA 144 Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln 35 40 45 GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCG GGT GGA TCT CAG CAT TGG AGC TAC 192 Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Gln His Trp Ser Tyr 50 55 60 GGC CTG CGC CCT GGC AGC G-GT TCT CAA GAT TC3G AGC TAC C3GC CTG CGT 240 Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 65 70 75 80 CCG GGT GGC TCT AGC CAG CAT TGG AGC TAC GGC CTG CGC CCT GGC AGC 288 Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr sly Leu Arg Pro Gly Ser 85 90 95 GGT AGC CAA GAT TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCG GGT GGA TCT AGC TTC 336 Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Phe 100 105 110 CCA AAA ACT GGG GCA AAA AAA ATT ATC CTC TAT ATT CCC CAA AAT TAC 384 Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys He He Leu Tyr He Pro Glp Asp Tyr -115 120 125 CAA TAT GAT ACT GAA CAA GGT AAT GGT TTA CAG GAT TTA GTC AAA GCG 432 Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala 130 135 140 GCC GAA GAG TTG GGG ATT GAG GTA CAA AGA GAA GAA CGC AAT AAT ATT 480 Ala Glu Glu Leu Gly He Glu Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asp He 145 150 155 160 GCA AC GCT CAA ACC AGT TTA GGC ACG ATT CAA ACC GCT ATT GGC TTA 528 Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu Gly Thr He Gln Thr Ala He Gly Leu 165 170 175 ACT GAG CGT GGC ATT GTG TTA TCC GCT CCA CAA ATT GAT AAA TTG CTA 576 Thr Glu Arg Gly He Val Leu Ser Ala Pro Gln He Asp Lys Leu Leu 180 185 190 CAG AAA ACT AAA GCA GGC CAA GCA TTA GGT TCT OCC GAA AGC ATT GTA 624 Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser He Val 195 200 205 CAA AAT GCA AAT AAA GCC AAA ACT GTA TTA TCT GGC ATT CAA TCT ATT 672 Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Ser Gly He Gln Ser He 210 215 220 TTA GGC TCA GTA TTO GCT GGA ATG GAT TTA GAT GAG GCC TTA CAG AAT 720 Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asp 225 230 235 240 AAC AGC AAC CAA CAT GCT CTT GCT AAA GCT GGC TTG GAG CTA ACÁ AAT 768 Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn 245 2S0 255 TCA TTA ATT GAA AAT ATT G-CT AAT TCA GTA AAA ACÁ CTT GAC GAA TTT 816 Ser Leu He Glu Asp He Ala Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe 260 265 270 GGT GAG CAA ATT AGT CAA TTT GGT TCA AAA CTA CAA AAT ATC AAA GGC 864 Gly Glu Gln He Ser Gln Phe Gly Ser Lys Leu Gln Asn He Lys Gly 275 280 285 TTA GGG ACT TTA GGA GAC AAA CTC AAA AAT ATC GGT GGA CTT GAT AAA 912 Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Asn He Gly Gly Leu Asp Lys 290 295 300 GCT GGC CTT GGT TTA GAT GTT ATC TCA GC3G CTA TTA TCG GGC GCA ACÁ 960 Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val He Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr 305 310 31S 320 GCT GCA CTT GTA CTT GCA GAT AAA AAT GCT TCA ACÁ GCT AAA AAA GTG 1008 Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val 325 330 335 GGT GCG GGT TTT GAA TTG GCA AAC CAA GTT GTT GGT AAT ATT ACC AAA 1056 Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala Asn Gln Val Val Oly Asn He Thr Lys 340 345 350 GCC GTT TCT TCT TAC ATT TTA GCC CAA CGT GTT GCA GCA GGT TTA TCT 1104 Ala Val Ser Ser Tyr He Leu Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser 355 360 365 TCA ACT GGG CCT GTG GCT GCT TTA ATT GCT TCT ACT GTT TCT CTT GCG 1152 Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala 370 375 380 ATT AGC CCA TTA GCA TTT GCC GGT ATT GCC GAT AAA TTT AAT CAT GCA 1200 He Ser Pro Leu Ala Phe Ala Gly He Ala Asp Lys Phe Asp His Ala 385 390 395 400 AAA AGT TTA GAG AGT TAT GCC GAA CGC TTT AAA AAA TTA GGC TAT G-AC 1248 Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp 405 410 415 GGA GAT AAT TTA TTA GCA GAA TAT CAG CGG GGA ACÁ GGG ACT ATT GAT 1296 Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr He Asp 420 425 430 GCA TCG GTT ACT GCA ATT AAT ACC GCA TTG GCC GCT ATT GCT GGT GGT 1344 Ala Ser Val Thr Ala He Asn Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly 435 440 445 GTG TCT GCT GCT GCA GCC GAT TTA ACÁ TTT GAA AAA GTT AAA CAT AAT 1392 Val Ser Ala Ala Ala Ala Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn 450 455 460 S69 069 STH aas «TV TIS-I aas D A?o oad Bx r»a-? A?o 3012 DO XVD DDV XDD VXD DVX DDLL VOO XOO ODD XOD DXD DOD S89 089 S¿9 Á aas dax dsv u?o aas A?o aas A o oa x^ nai A?o oA? aas <ÍXX F 0Z DVX DOV ODX XVD WD DOV XOO DDV DOO XDD DOD OXD DOD DVX DOV DOX 0¿9 S99 099 STH u?o aas aas A?o A?o oad Bxv na«? A?o - x aas <^ ? sv UXD aas 91OZ XVD OVD DDV XDX DDO XDD ODD XDD OXD DDD DVX DOV OOX XVO WD XDX SS9 0S9 Sl>9 A?o aas A?o oaa Bx nai A?o aAx xas dax SXH u?o aas A?o A?o o a 896T XOD DOV DOO XDD DOD OXD DDO DVX DDV ODX XVD DVD XDX VOO XDO ODD 0t9 S 0C9 S29 ß p q ??o XÁLJ. aas dax dsv ?o aas A?o aas A?o oad B v na-? A?o 036T XOD OXD DDO DVX DOV OOX IVD WD DDV XDD DDV DDD ÍDD DDD OXD DOD 0£9 ST9 0T9 oA? as d STH UXD as as A?o A?o o Bav nal A?o ^^S as ^l ZL X DVX DOV DOX XVD DVD. DOV XDX DOD XDD DDD XDD OXD DOO DVX. DDV OOX S09 009 ?6S dsv XD aas -^ZO as A?o o d B v I A?o Ax aas dax SXH UX aas *Z8T XVD WD XDX XDO DOV DDD XDD DOD OXD DDD DVX DDV OOX XVD OVD XDX 06S S8S 08S A?o M BXV aqd u?o pa-? aas aas nar aas o dsv nal 3S aas aqx 9LÍ.T VOO ODV XDD XXX WD XXD XDX IDX VXX XDV WD XVD DXX DXV VDX XDV S?S 0Z.S S9S oaa «XV T«? nai ? usv Bxv aas dsv usv aas aas *rqi »qd «TV aas 8Z¿I VDD XDD DXD VXX VXO XW VDV DDX XVO XW XDX ODX DDV XXX YOD XDV 09S SSS OSS ?t-S X ? aas as »XI pa<? s?«? dsv riai aas usv aqx X ? USV S I a»s SXH 089T VXO XDX VDX DXV VXX OW XVD VXX DDV DW VDV OXO XW WV- DOV XVD ofrs ses oes sAi nai n i n?o aA usv dsv T«? T«? s?i aas na-? n?o dsv o aqx 3e9T WV DL1D OXX WO XVX DW XVD XXD XXO VW VDX VXD DVO XVO WD DDV ses oes sts ail sA-i A?o usv ?o sA«? BXV a?i nai dsv dsv I«? u?o eAn aas -3 ? frSSt XXV VW DDO DW XOD VW VDD DXV XXD XVO XVD XXD WO OW VDX DDV ots sos oos a?i BXÍ ?X A?o usv u?o A?o a?i a?i n?o "XO ©TI S T n?o dsv sAi 9eST DXV ODD OVO DOD XW WD XOO DXV DXV WO WO DXV VW DVD XVO WV S6?> 06l SBí- ?tíX «TV sA-i ? usv oaa ?«? p?o e n «XV s d dsv «TV n-TO Ba *qd 88?t D VDD WV XVX XW .^DD DXO WD VW XDD XXX XVD XDO OVO VDD DXX 081- S?t 0LV S91> dax usv ?o »ti aqx ? BA<I p?o sAq sA«? aas us aqx a?? ?«? n -i 0??>t ?>?) D V WD XXV DDV OXD WV OVO VW VW DOV XW ODV DXV DXO XXD 291-2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 699 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: :16 Met Ala Thr Val He Asp Arg Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 15 Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly 20 25 30 Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln 35 40 45 Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Gln His Trp Ser Tyr 50 55 60 Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 65 70 75 80 Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser 85 90 95 Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Phe 100 105 110 Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys He He Leu Tyr He Pro Gln Asn Tyr 115 120 125 Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala 130 135 140 Ala Glu Glu Leu Gly He Glu Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asn He 14S 150 155 160 Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu Gly Thr He Gln Thr Ala He Gly Leu • 165 170 175 Thr Glu Arg Gly He Val Leu Ser Ala Pro Gln He Asp Lye Leu Leu 180 185 190 Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser He Val 195 200 205 Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Ser Gly He Gln Ser He 210 - 215 220 Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asn 225 230 235 240 Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu slu Leu Thr Asn 245 250 255 Ser Leu He Glu Asn He Ala Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe 260 265 270 Gly Glu Gln He Ser Gln Phe Gly Ser Lys Leu Gln Asn He Lys Gly 275 280 285 Leu Gly Thr Leu Gly Aep Lys Leu Lys Asn He Gly Gly Leu Asp Lys 290 295 300 Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val He Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr 305 310 315 320 Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val 325 330 335 Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala Asn Gln Val Val Gly Asn He Thr Lys 340 345 350 Ala Val Ser Ser Tyr He Leu Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser 355 360 365 Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala Leu He Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala 370 375 380 He Ser Pro Leu Ala Phe Ala Gly He Ala Asp Lys Phe Asn His Ala 385 390 395 400 Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp 405 410 415 Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr He Asp 420 425 430 Ala Ser Val Thr Ala He Asn Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly 435 440 445 Val Ser Ala Ala Ala Ala Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn 450 455 460 Leu Val He Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr He Gln Asn Trp 465 470 475 480 Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala Lya Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr 485 490 495 Lys Asp Glu Lys He Glu Glu He He Gly Gln Asn Gly Glu Arg He SOO 505 510 Thr Ser Lys Gln Val Asp Asp Leu He Ala Lys Gly Asn Gly Lys He 515 520 525 Thr Gln Asp Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys 530 535 540 His Ser Lys Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val 545 550 555 560 Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro 565 570 575 Thr Ser Met Leu Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly 580 585 590 Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp 595 600 605 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr 610 615 620 Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 625 630 635 640 Pro Gly Gly Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly 645 650 655 Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His 660 665 670 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr 675 680 685 Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ala Ser His 690 695 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1403 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 17: Met Gly Thr Arg Leu Thr Thr Leu Ser Asn Gly Leu Lys Asn Thr Leu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Lys Ser Gly Leu His Lys Ala Gly Gln Ser Leu Thr Gln 20 25 30 Ala Gly Ser Ser Leu Lys Thr Gly Ala Lys Lys He He Leu Tyr He 35 40 45 Pro Gln Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly Asn Gly Leu Gln Asp 50 55 60 Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly He Glu Val Gln Arg Glu Glu 65 70 75 80 Arg Asn Asn He Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu Gly Thr He Gln Thr 85 90 95 Ala He Gly Leu Thr Glu Arg Gly He Val Leu Ser Ala Pro Gln He 100 105 110 Asp Lys 'Leu Leu Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln Ala Leu Gly Ser Ala 115 120 125 Glu Ser He Val Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Ser Gly 130 135 140 He Gln Ser He Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly Met Asp Leu Asp Olu 145 150 155 160 Ala Leu Gln Asn Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu 165 170 175 Glu Leu Thr Asn Ser Leu He Glu Asn He Ala Asn Ser Val Lys Thr 180 185 190 Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln He Ser Gln Phe Gly Ser Lys Leu Gln 195 200 205 Asn He Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Asn He Gly 210 215 220 Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val He Ser Gly Leu Leu 225 230 235 240 Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Ser Thr 245 250 255 Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala Asn Gln Val Val Gly 260 265 270 Asn He Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr He Leu Ala Gln Arg Val Ala 275 280 285 Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala Leu He Ala Ser Thr 290 295 300 Val Ser Leu Ala He Ser Pro Leu Ala Phe Ala Gly He Ala Asp Lys 305 , 310 315 320 Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Phe Lys Lys 325 330 335 Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Thr 340 345 350 Gly Thr He Asp Ala Ser Val Thr Ala He Asn Thr Ala Leu Ala Ala 355 360 355 He Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Gly Arg Arg He Arg Gly He 370 375 380 Pro Gly Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly 385 390 395 400 Val Thr Glp Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp 405 410 415 Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg 420 425 430 Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala 435 440 445 Val Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val 450 455 460 Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro He Tyr 465 470 475 480 Thr Asn Val Thr Tyr Pro He Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr 485 490 495 Glu Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr Phe Asn Val Asp Glu Ser 500 505 510 Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg He He Phe Asp Gly Val Asn Ser 515 520 525 Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp Val Gly Tyr Gly Gln Asp 530 535 540 Ser Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser Ala Phe Leu Arg Ala Gly . S45 550 555 560 Glu Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg Trp Ser Asp Gly Ser Tyr 565 570 575 Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser Gly He Phe Arg Asp Val 580 585 590 Ser Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln He Ser Asp Phe His Val Ala 595 600 605 Thr Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser Arg Ala Val Leu Glu Ala Glu Val 610 615 620 Glp Met Cys Gly Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Arg Val Thr Val Ser Leu 625 630 635 g40 Trp Gln Gly Glu Thr Gln Val Ala Ser Gly Thr Ala Pro Phe Gly Gl? 645 650 555 Glu He He Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Ala Asp Arg Val Thr Leu Ara 660 665 670 Leu Aen Val Glu Asn Pro Lys Leu Trp Ser Ala Glu He Pro Asn Leu 675 680 685 Tyr Arg Ala Val Val Glu Leu His Thr Ala Asp Gly Thr Leu He Glu 690 695 700 Ala Glu Ala Cys Asp Val Gly Phe Arg Glu Val Arg He Glu Aen Gly 705 710 715 720 Leu Leu Leu Leu Asn Gly Lys Pro Leu Leu He Arg Gly Val Asn Arg 725 730 735 His Glu His His Pro Leu His Gly Gln Val Met Asp Glu Gln Thr Met 740 745 750 Val Gln Asp He Leu Leu Met Lys Gln Asn Asn Phe Asn Ala Val Arg 755 760 765 Cys Ser His Tyr Pro Asn His Pro Leu Trp Tyr Thr Leu Cys Asp Arg 770 775 780 Tyr Gly Leu Tyr Val Val Asp Glu Ala Asn He Glu Thr His Gly Met 785 790 795 800 Val Pro Met Asn Arg Leu Thr Asp Asp Pro Arg rp Leu Pro Ala Met 805 810 815 Ser Glu Arg Val Thr Arg Met Val Gln Arg Asp Arg Asn His Pro Ser 820 825 830 Val He He Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Gly His Gly Ala Asn His 835 840 845 Asp Ala Leu Tyr Arg Trp He Lys Ser Val Asp Pro Ser Arg Pro Val 850 855 860 Gln Tyr Glu Gly Gly Gly Ala Asp Thr Thr Ala Thr Asp He He Cys 865 . 870 875 880 Pro Met Tyr Ala Arg Val Asp Arg Asp Gln Pro Phe Pro Ala Val Pro 885 890 895 Lys Trp Ser He Lys Lys Trp Leu Ser Leu Pro Gly Glu Thr Arg Pro 900 905 910 Leu He Leu Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Leu Gly Gly 915 920 925 Phe Ala Lys Tyr Trp Gln Ala Phe Arg Gln Tyr Pro Arg Leu Gln Gly 930 935 940 Gly Phe Val Trp Asp Trp Val Asp Gln Ser Leu He Lys Tyr Asp Glu 945 950 955 960 Asn Gly Asn Pro Trp Ser Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp Thr Pro 965 970 975 Asn Asp Arg Gln Phe Cys Met Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr 980 985 990 Pro His Pro Ala Leu Thr Glu Ala Lys His Gln Gln Glp Phe Phe Gln 995 1000 1005 Phe Arg Leu Ser Gly Glp Thr He Glu Val Thr Ser Glu Tyr Leu Phe 1010 1015 1020 Arg His Ser Asp Asn Glu Leu Leu His Trp Met Val Ala Leu Asp Gly 1025 1030 1035 10 0 Lys Pro Leu Ala Ser Gly Glu Val Pro Leu Asp Val Ala Pro Gln Gly 1045 1050 1055 Lys Gln Leu He Glu Leu Pro Glu Leu Pro Gln Pro Glu Ser Ala Gly 1060 1065 1070 Gln Leu Trp Leu Thr Val Arg Val Val Gln Pro Asn Ala Thr Ala Trp 1075 1080 1085 Ser Glu Ala Gly His He Ser Ala Trp Gln Gln Trp Arg Leu Ala Glu 1090 1095 1100 Asn Leu Ser Val Thr Leu Pro Ala Ala Ser His Ala He Pro His Leu 1105 1110 1115 1120 Thr Thr Ser Glu Met Asp Phe Cys He Glu Leu Gly Asn Lys Arg Trp 1125 1130 1135 Gln Phe Asn Arg Gln Ser Gly Phe Leu Ser Gln Met Trp He Gly Asp 1140 1145 1150 Lys Lys Gln Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asp Gln Phe Thr Arg Ala Pro 1155 1160 1165 Leu Asp Asn Asp He Gly Val Ser Glu Ala Thr Arg He Asp Pro Asn 1170 1175 1180 Ala Trp Val Glu Arg Trp Lys Ala Ala Gly His Tyr Gln Ala Glu Ala 1185 1190 1195 1200 Ala Leu Leu Gln Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ala Asp Ala Val Leu lie 1205 1210 1215 Thr Thr Ala His Ala Trp Glp His Gln Gly Lys Thr Leu Phe He Ser 1220 1225 1230 Arg Lys Thr Tyr Arg He Asp Gly Ser Gly Gln Met Ala He Thr Val 1235 1240 1245 Asp Val Glu Val Ala Ser Asp Thr Pro His Pro Ala Arg He Gly Leu 1250 1255 1260 Asp Cys Gln Leu Ala Gln Val Ala Glu Arg Val Asn Trp Leu Gly Leu 1265 1270 1275 1280 Gly Pro Gln Glu Asn Tyr Pro Asp Arg Leu Thr Ala Ala Cys Phe Asp 1285 1290 1295 Arg Trp Asp Leu Pro Leu Ser Asp Met Tyr Thr Pro Tyr Val Phe Pro 1300 1305 1310 Ser Glu Asn Gly Leu Arg Cys Gly Thr Arg Glu Leu Asn Tyr Gly Pro 1315 1320 1325 His Gln Trp Arg Gly Asp Phe Gln Phe Asn He Ser Arg Tyr Ser Gln 1330 1335 1340 Gln Gln Leu Met Glu Thr Ser His Arg His Leu Leu His Ala Glu Glu 1345 1350 1355 136Q Gly Thr Trp Leu Asn He Asp Gly Phe His Met Gly He Gly Gly Aso 1365 1370 37S ^ Asp Ser Trp Ser Pro Ser Val Ser Ala Glu Phe Gln Leu Ser Ala Gly 1380 1385 ?390 Arg Tyr His Tyr Gln Leu Val Trp Cys Glp Lys 1395 1400 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 18 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 10 aminoácidos (B ) TIPO : aminoácido (C ) TIPO DE HEBRA: individual ( D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado (B) LOCALIZACION: 1 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Esta posición es piroGlu. " (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 18: Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado (B) LOCALIZACION: 3 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El aminoácido es sa ubicación puede ser ya sea Lys, Asp, Val o Asn." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : sitio modificado (B) LOCALIZACION: 5 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El aminoácido es esa ubicación puede ser ya sea Lys, Asp, Val o Asn." (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 19: Gly Gly Xaa Gly Xaa Asp 1 5 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 20: ATGGCTACTG TTATAGATCG ATCT 24 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácido (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 21: Met Ala Thr Val He Asp Arg Ser 1 5 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 22 Gly Thr He Asp 1 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 23 Gly He Thr Gly 1 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 24: Gly Val He Ser 1 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 25; His Val Ala Asn 1 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 26: Lys He Val Glu 1 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 27 Asp Leu Ala Gly 1 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácido (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 28 'Lys Val Leu Ser 1 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 29: Asp Ala Phe Glu 1 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácido (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 30: Lys Leu Val Gln 1 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal ;ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi ) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ . ID No : 31 Gly líe He Asp 1 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal iii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 32 Arg Tyr Leu Ala Asn 1 5 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácido (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 33 Lys Phe Leu Leu Asn 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34 CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácido (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 34: Lys Ala Tyr Val Asp 1 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína guimérica, caracterizada porgue comprende un polipéptido de leucotoxina fusionado a un primero y segundo multímeros, en donde el C-término del primer multímero se fusiona al N-término del polipéptido de leucotoxina y el N-término del segundo multímero se fusiona al C-tér ino del polipéptido de leucotoxina, y en donde además cada uno de los multímeros comprende más de un polipéptido de GnRH.

2. La proteína guimérica de conformidad con-la reivindicación 1, caracterizada porgue el primero y el segundo multímeros de GnRH son diferentes y comprenden moléculas de acuerdo con la fórmula general [GnRH-X-GnRH] n, en donde: GnRH comprende un polipéptido de GnRH; X se selecciona a partir del grupo gue consiste de un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácido y un polipéptido de leucotoxina/ y n es un número entero mayor gue o igual a 1.

3. La proteína guimérica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue el primero y segundo multímeros de GnRH son los mismos y comprenden moléculas de acuerdo con la fórmula general [GnRH-X-GnRH] n, en donde: GnRH comprende un polipéptido de GnRH; X selecciona a partir del grupo gue consiste de un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácido, y un polipéptido de leucotoxina; y n es un número entero mayor gue o igual a 1.

4. La proteína guimérica de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizada porgue X es un grupo espaciador de aminoácidos gue tiene al menos un epítope de células T, auxiliar.

5. La proteína guimérica de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizada porgue n es 4.

6. La proteína guimérica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el polipéptido de leucotoxina carece de actividad citotóxica .

7. La proteína guimérica de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizada porgue el polipéptido de leucotoxina es LKT 352.

8. La proteína guimérica de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porgue el primer multímero comprende además la secuencia de aminoácidos (Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser ) fusionada al N-término de la misma.

9. La proteína guimérica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 9-1 hasta 9-6, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente eguivalente a ésta.

10. Una composición de vacuna, caracterizada porgue comprende la proteína guimérica de cualguiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Un método para presentar multímeros seleccionados de GnRH a un sujeto gue comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 10.

12. Una construcción de ADN, gue codifica para una proteína guimérica, en donde la proteína guimérica comprende un polipéptido de leucotoxina fusionado a un primero y segundo multímeros en donde el C-término del primer multímero se fusiona al N-término del polipéptido de leucotoxina y el N-tér ino del segundo multímero se fusiona al C-término del polipéptido de leucotoxina, y en donde además cada uno de los multímeros comprende más de un polipéptido de GnRH seleccionado, la construcción de ADN está caracterizada porgue comprende: una primera secuencia de nucleótidos gue codifica para el primer multímero de GnRH; y una segunda secuencia de nucleótidos gue codifica para el segundo multímero de GnRH; en donde la primera y segunda secuencias de nucleótidos se enlazan operablemente por una tercera secuencia de nucleótidos gue codifica para un polipéptido de leucotoxina.

13. La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porgue el primero y segundo multímeros de GnRH son diferentes y comprenden moléculas de acuerdo con la fórmula general [GnRH-X-GnRH] n, en donde: GnRH comprende un polipéptido de GnRH; X selecciona a partir del grupo gue consiste de un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácido, y un polipéptido de leucotoxina; y n es un número entero mayor gue o igual a 1.

14. La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porgue el primero y segundo multímeros de GnRH son los mismos y comprenden moléculas de acuerdo con la fórmula general [GnRH-X-GnRH] n, en donde: GnRH comprende un polipéptido de GnRH; X selecciona a partir del grupo gue consiste de un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácido, y un polipéptidq de leucotoxina; y n es un número entero mayor gue o igual a 1.

15. La construcción de ADN de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 13 a 14, caracterizada porgue X es un grupo espaciador de aminoácido gue tiene al menos un epítope de células T, auxiliar .

16. La construcción de ADN de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 13 a 14, caracterizada porque que n es 4.

17. La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el polipéptido de leucotoxina carece de actividad citotóxica .

18. La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porgue el polipéptido de leucotoxina es LKT 352.

19 La construcción de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-18, caracterizada porque el primer multímero comprende además la secuencia de aminoácidos (Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser ) fusionada al N-término de la misma.

20. La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la proteína guimérica comprende la secuencia de aminoácidos representada en las Figuras 9-1 hasta 9- 6, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente eguivalente a ésta.

21. Un cartucho de expresión, caracterizado porgue está comprendido de: (a) la construcción de ADN de cualguiera de las reivindicaciones 12-20; y (b) secuencias de control gue dirigen la transcripción de la construcción, por lo cual la construcción se puede transcribir y traducir en una célula huésped.

22. Una célula huésped formada con el cartucho de expresión en la reivindicación 21.

23. Un método para producir un polipéptido recombinante, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una población de célula huésped de acuerdo con la reivindicación 22; y (b) cultivar la población de células bajo condiciones por las cuales el polipéptido ya codificado por el cartucho de expresión se exprese.

24. Un método para reducir la incidencia en tumores mamarios en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de vacuna de la reivindicación 10, al sujeto.