KR100750695B1

KR100750695B1 - Ｇｄｆ-8 활성을 하향-조절하는 방법

Info

Publication number: KR100750695B1
Application number: KR1020027000866A
Authority: KR
Inventors: 토르벤 할키에르; 쇠렌 무리스텐; 스틴 클라이스너
Original assignee: 파멕사 에이/에스
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2007-08-22
Also published as: TR200200133T2; CN1384757A; EA200200182A1; AU5967500A; EE200200025A; JP2003506325A; US7056512B1; SK722002A3; EA005248B1; AU778470B2; NZ517058A; NO20016252D0; WO2001005820A3; HK1048937A1; MXPA01013232A; EP1200119A2; ZA200109901B; US7070784B1; NO20016252L; HUP0201861A2

Abstract

성장 분화 인자 8(GDF-8, 미오스타틴)에 대한 면역화에 의해 근육량을 증가시키는 신규한 방법을 제공한다. 바람직하게도 면역화는 동형의 GDF-8에 대하여 항체 생산을 유발할 수 있는 GDF-8 유사체의 투여에 의해 이루어진다. 면역원으로서 특히 바람직한 것은, 동형 GDF-8의 삼차 구조를 실질적으로 유지하면서 단일한 또는 다소의 외래성, 면역우성이며 난교잡성 T-세포 에피토프를 도입시켜 변형된 동형의 GDF-8이다. 또한 백신화에 유용한 방법 및 수단 뿐 아니라 GDF-8에 대한 핵산 백신화 및 생백신을 이용한 백신화를 제공한다. 이러한 방법과 수단은 핵산 단편, 벡터, 형질전환된 세포, 폴리펩타이드 및 약리적 배합물 뿐 아니라 유용한 면역원성 GDF-8 유사체를 동정하는 방법, 유사체와 약리적 배합물을 제조하는 방법을 포함한다.

Description

ＧＤＦ-8 활성을 하향-조절하는 방법{METHOD FOR DOWN-REGULATING GDF-8 ACTIVITY}

본 발명은 일반적으로 인체용 의약 뿐 아니라 동물과 가금류 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은, 특히 도살용 사육 동물에서 근육 발달의 조절과 증가를 향상시키는 것에 관한 것이다. 따라서, 도살용 동물에서 근육의 발달을 증가시키는 신규한 방법 및 수단을 제공한다.

일반적으로, 사육 동물의 성장률을 증가시키기 위한 별개의 두가지 의학적 접근이 있었다; 그 하나는 항생물질 또는 항생물질-같은 화합물을 사육 동물에게 투여하는 것이고, 다른 하나는 성장 호르몬을 투여하는 것이다.

동물의 성장률을 증진시키기 위해 사육 동물(특히, 돼지)에게 항생물질 및 항생물질-같은 화합물을 투여하는 것이 몇년 후 여러가지 문제점을 야기시키는 것으로 입증되었다. 이들 중 몇몇 화합물은 사람의 질병을 치료하기 위해 이용되는 항생물질과 화학적으로 밀접하게 관련되고, 사육 동물에 이러한 화합물을 확대시켜 이용하는 것은 인간의 미생물 발병원에 있어서 사람의 항생작용에 대한 교차-내성을 유발한다는 것이 입증되었다. 추가로, 이들 화합물을 이용할 때 1-3%의 비교적 낮은 성장률의 증가를 얻었다.

사육 동물에 성장 호르몬을 이용하는 경우 가격이 비싸고, 성장 호르몬의 비교적 짧은 반감기로 인해 다소 단기간으로 처치를 반복해야만 한다. 게다가, 처리된 동물로부터 얻은 고기에 남아 있는 성장 호르몬이 특히 유럽의 소비자들에게 몇가지 문제점을 야기시키고 있다.

GDF-8

1997년 5월, 골격의 근육 성장을 선택적으로 하향-조절하는 성장 조절 인자로서 GDF-8 또는 미오스타틴(myostatin)이 발견되었다(McPherron 등, Nature, 387, 83-90, 1997). GDF-8의 발현은 배아의 몸분절(somites)을 전개시키는 근육 분절획으로 제한되나, 또한 성충 동물체내를 통털어 다양한 근육 조직에서 발현된다.

GDF-8 녹-아웃 생쥐는 골격 근육량이 크게 증가한 것으로 나타났고, GDF-8 음성 생쥐에서 분리한 근육은 야생형 근육보다 약 2-3배 정도 무게가 많이 나갔다. 녹-아웃 생쥐는 야생형 생쥐보다 약 35% 높은 총 체중을 갖고, GDF-8 유전자가 결핍된 생쥐는 정상적인 생쥐에 비해 80% 이상의 근육 섬유를 갖는다. 녹-아웃 생쥐에서 관찰된 다량의 골격 근육 증대는, 그러나, 근육 섬유의 수 증가 뿐 아니라 현저한 근육 섬유의 비대에 기인한 것이다. GDF-8 녹-아웃 생쥐의 근육 횡단 면적은 근육의 종류에 따라 약 14 내지 49%까지 증가한다.

흥미롭게도, 또한 성장한 돌연변이 생쥐는 성장한 비-돌연변이 생쥐와 비교하여 증가된 근육량 증가율을 보인다. 추가로, 모든 GDF-8 음성 생쥐는 생존 가능하며 가임성인 것으로 보였다.

1997년 11월, 처음으로 GDF-8을 발견한 당사자는 근육량의 강한 증가가 특징인 소의 두 품종, 벨젼 블루(Belgian Blue)와 피드몬테스(Piedmontese)가 GDF-8 코딩 서열상 돌연 변이를 포함하고 이것이 그 큰 근육의 원인이 된다고 발표하였다(MaPherron and Se-Jin Lee, 1997, PNAs 94, 12457-12461). "이중 근육화(double muscling)" 현상은 과거 190년 동안 많은 품종의 축우에서 관찰되었고 이 동물들은 20-25% 증가한 평균 근육량을 갖는다. 또한 이들은 증가된 사료 효율을 보이나 여전히 고-품질의 고기를 제공한다.

그러나 GDF-8 녹-아웃 생쥐와 달리, 벨젼 블루 소는 대부분의 기타 기관에서 질량의 감소를 나타내었다. 이들 "천연 녹-아웃 소"에서는 또한 암컷의 번식력이 감소하고, 새끼의 생존 능력이 낮아지며 성적인 성숙이 지연된다.

"녹-아웃 소"에서 근육량의 상대적인 증가는 녹-아웃 생쥐에서 관찰된 것과 밀접하지는 않다 - 실제로 이것은 생쥐에서 관찰된 근육 비대의 정도에 상응한다. McPherron 등은 표준의 소가 선택적인 품종의 생산 후 근육 크기의 최대 한도까지 (그리고 획득가능한 근육 섬유의 최대 수까지) 생쥐에 근접할 수 있다는 한가지 이유를 추측하였다. 소에서 근육 섬유의 과증식 수 대 비대에 관한 자료는 발표되지 않았으나 이러한 가정과 녹-아웃 생쥐에서 관찰된 근육 비대를 기초로, 예컨대 벨젼 블루 소에서 관찰되는 근육량상 증가와 성장률은 근육의 비대와 보다 낮은 한도의 근육 과증식에 기인하여 커진다는 것을 예측할 수 있다.

GDF-8의 생리적인 역할

GDF-8의 발현은 골격 근육에 의해 크게 제한된다. 지방 조직에서는 낮은 수준의 발현이 존재하나, 그 중 심장근에서는 전혀 발현되지 않는다. GDF-8이 골격의 근육 성장에 대한 특이적인 음성 조절자로서 기능하는 것으로 보이나, 성인 개체에서 GDF-8의 생리적인 역할은 알려져 있지 않다. 생리적인 역할에 대한 추측은 근육 손상 후 유발되는 실제적인 비대 또는 재생상의 중요한 기능에 집중된다. 그러나 GDF-8은 또한 지방 조직의 성장을 억제한다. GDF-8이 동물의 발육 중 국부적으로 또는 전신적으로 작용하는가는 알려져 있지 않다.

GDF-8의 구조

GDF-8은 배아 발달에 수반되는 구조적-관련 단백질 군을 포함하는 형질전환 성장 인자 β(TGF-β) 상과에 속한다. 사람과 소의 GDF-8은 375 아미노산의 긴 전구체 단백질로서 제공된다. 그밖의 TGF-β 상과 단백질로서 GDF-8은 호모다이머에 결합된 디술파이드를 형성하는 약 109 아미노산의 보다 짧은 C-말단 단편으로 가수분해될 수 있다. 호모다이머는 생리적으로 활성을 갖는 GDF-8의 형태일 수 있다.

쥐과, 래트, 인간, 비비, 소과, 돼지, 양, 닭 및 칠면조 GDF-8의 아미노산 서열이 알려져 있고 GDF-8 분자는 고도로 보존된다(McPherron and Se-Jin Lee, PNAs, 94, 12457-12461, 1997). 쥐과, 래트, 인간, 돼지, 닭 및 칠면조 GDF-8의 서열은 C-말단 영역에서 100% 동일하고, 이들은 아마도 GDF-8의 생리적인 활성 부분을 포함할 것이다. 소과와 양, 양자의 GDF-8은 C-말단 영역에서 단지 두개의 아미노산 잔기만이 인간의 GDF-8와 다르다. 소과의 GDF-8은 위치 356-357에서 -Lys-Glu- 대신 -Glu-Gly- 서열을 갖고 양의 GDF-8은 두개의 보존적인 치환을 갖는다(Leu 및 Lys 대신, 각각 위치 316에서 Val 및 위치 333에서 Arg). 알려진 GDF-8 단백질 중 그 활성의 C-말단 영역에 잠재적인 N-글리코실화 부위를 포함하는 것은 없다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 사육 동물의 근육 성장율을 증가시키기 위해 성장 분화 인자 8(GDF-8)(또는 미오스타틴으로 알려짐)을 하향-조절할 수 있는 재조합 치료 백신을 제공하는 것이다. 추가로 본 발명의 목적은 근육 성장율을 증가시키기 위한 동물의 백신화 방법을 제공하는 것이다. 또한 자가 이식 GDF-8에 대한 자가 내성을 깨뜨릴 수 있는 GDF-8의 변종을 제공하려는 목적이 있다. 추가로 본 발명의 목적은 백신과 GDF-8 변종을 제조하는데 유용한 핵산 단편, 벡터 및 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

발명의 요약

돌연변이성 GDF-8 녹-아웃 동물 및 벨젼 블루와 피드몬테스에서 상호-관련된 발견을 기초로, 본 발명자들은 GDF-8에 대하여 유효하게 미-조정된 면역 반응을 유발시킴으로써 동물에서 GDF-8을 하향-조절할 수 있다는 이론을 전개하였다. 그러므로 본 발명은 기본적으로 동물에서 근육량을 증가시키기 위해 면역적으로 GDF-8을 하향-조절하는 방법 및 수단을 제공한다.

종래의 성장-강화법을 능가하는 이러한 접근의 이점은 여러가지이다. 우선 첫째로 본 접근법의 이용시 병리적인 미생물에서 교차-내성과 관련된 문제가 발생하지 않는다. 추가로, 본 처리를 수행한 동물에서 얻은 고기 중에 외생적으로 투여된 성장 호르몬이 잔존할 가능성이 없다. 마지막으로 벨젼 블루 및 피드몬테스와 같은 소의 품종 및 생산에 수반되는 윤리적인 문제점(카이사르의 구획법에 의해 많은 송아지가 태어나고 그밖이 기관은 크기가 감소됨)을, 출산 후(예컨대, 단지 성인기에만)까지 동물내 GDF-8의 하향-조절을 연기시킴으로써 완전히 해소할 수 있다 - 실제로, 근육량을 증가시킨 동물이 출산을 해야 할 필요가 없고 따라서 도살용으로 키워진 이들 동물에 대해 처치를 유보할 수 있다.

근육 섬유의 수와 종류는 배아기에 결정되므로, 성장한 사육용 동물에서 항-GDF-8 백신이 근육 섬유의 수를 증가시키지는 않을 것이다. 따라서, 항-GDF-8 백신이 GDF-8 녹-아웃 동물에서 보여진 것과 동일한 수준으로 GDF-8을 억제할 수 있는지는 확실히 불가능하거나 또는 불가능할 수 있다. 이것은 아마도 고기의 품질, 품종의 특성 및 지방비에 부정적인 영향을 주므로 바람직하지 않다. 그럼에도 불구하고 백신화 동물에서 이후 파르툼(partum) 근육의 비대로 인해 얻어지는 성장율 및/또는 5-25%의 최대 체중의 증가는 (현실적이지 않은 숫자 범위) 소, 돼지 및 가금류로부터 고기를 생산하는데 있어서 여전히 흥미로운 것이다.

TGF-β과의 그밖의 요소에 관한 GDF-8의 서열 동일성은 아미노산 수준에서 단지 30-40%이다. 이 낮은 서열 동일성이 GDF-8에 대하여 유발되는 항체의 교차-반응성에 관한 모든 있음직한 문제점을 발생시키지는 않을 것이다.

따라서, 그 가장 넓고도 일반적인 범위에서, 본 발명은 인간을 포함한 동물에서 성장 분화 인자 8(GDF-8)를 생체내 하향-조절하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은

-GDF-8 폴리펩타이드 또는 그 서브서열(subsequence)을 이용한 동물의 면역화가 GDF-8 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 유발하도록 배합되어진 한가지 이상의 GDF-8 폴리펩타이드 또는 그 서브서열, 및/또는

-GDF-8 아미노산 서열상에 한가지 이상의 변형을 도입한 결과 그 유사체를 이용한 동물의 면역화가 GDF-8 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 유발시키는 한가지 이상의 GDF-8 유사체의 면역적으로 유효한 양을 동물의 면역계에 제공하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 면역성 조성물을 1-4년에 걸쳐 해마다 주입시키는 것으로 소망하는 결과를 얻기에 충분하다고 예상되며, 반면 성장 호르몬과 항생물질 두가지 모두를 투여할 경우 대상 동물에 대한 보다 잦은 투여가 요구된다.

본 발명은 또한 이들의 서브셋을 코딩하는 핵산 단편 뿐 아니라 GDF-8 유사체에 관한 것이다. 또한 유사체나 핵산 단편을 포함하는 면역성 조성물이 본 발명의 일부가 된다.

또한 본 발명은 GDF-8 유사체를 포함하는 조성물의 제조 방법 뿐 아니라 GDF-8의 면역적으로 유효한 유사체를 동정하는 방법에 관한 것이다.

삭제

본 발명은 서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 또는 79-104 잔기들로부터 선택된 위치들이 외래 T_H 에피토프로 적어도 두 번 치환되거나; 서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 또는 105-109의 잔기들로부터 선택된 적어도 어느 한 위치에 외래 T_H 에피토프가 삽입된 GDF-8 폴리펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 GDF-8 폴리펩타이드를 면역학적으로 유효한 양으로 포함하는, GDF-8 활성을 생체 내 하향조절하여 동물의 근육량 증강용 면역 조성물로서, 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체, 베히클 또는 그들의 혼합물, 및 어쥬번트를 더 포함하는 것인 면역 조성물을 제공하며, 상기 어쥬번트는 면역 표적화 어쥬번트; 톡신, 사이토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조절 어쥬번트; 오일 배합물; 폴리머; 미셀 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; γ-이눌린; 및 캡슐화 어쥬번트로 구성되는 군에서 선택된다.
또한, 본 발명은 서열번호 12의 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 또는 79-104 잔기들로부터 선택된 위치들이 외래 T_H 에피토프로 적어도 두 번 치환되거나; 서열번호 12의 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 또는 105-109의 잔기들로부터 선택된 적어도 어느 한 위치에 외래 T_H 에피토프가 삽입된 GDF-8 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 치환 또는 삽입은 서열번호 12의 18-41 잔기들에서 일어나는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 또는 79-104 잔기들 중의 적어도 한 위치가 외래 T_H 에피토프로의 치환;
서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 또는 105-109 잔기들 중에서 적어도 한 위치에 외래 T_H 에피토프의 삽입;
서열번호 11 또는 12의 GDF-8 폴리펩타이드 내 루프 영역(loop area) 또는 탄력성 말단(flexible terminus)을 외래 T_H 에피토프로의 치환;
서열번호 11 또는 12의 GDF-8 폴리펩타이드 내 루프 영역 또는 탄력성 말단에 외래 T_H 에피토프의 삽입;
중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 삽입이 일어나는 GDF-8 폴리펩타이드로서, 여기에서 아미노산 삽입 및 치환의 수는 60을 초과하지 않는 것인 GDF-8 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 외래 T_H 에피토프는 난교잡성(promiscuous)인 것이 바람직하며, 또한 이러한 GDF-8 폴리펩타이드를 면역학적 유효량으로 포함하는, GDF-8 활성을 생체 내 하향조절하여 동물의 근육량 증강용 면역 조성물로서, 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체, 베히클 또는 그들의 혼합물, 및 어쥬번트를 더 포함하는 것인 면역 조성물을 제공한다.
정의
이후, 본 발명의 경계와 범위를 명확히 하기 위해 본 명세서와 청구항에 표시된 수많은 용어를 상세하게 정의 및 설명할 것이다.

"T-림프구" 및 "T-세포"라는 용어는 체액의 면역 반응에서 헬퍼(helper)능 뿐 아니라 면역 반응을 매개하는 다양한 세포를 초래하는 흉선 기원의 림프구를 일컬어 상호교환적으로 사용된다. 마찬가지로, "B-림프구"와 "B-세포"라는 용어를 항체-생산 림프구에 대하여 상호교환적으로 사용한다.

여기서 "GDF-8 폴리펩타이드"는 수많은 동물에서 유래한 상기-논의된 GDF-8 단백질의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(완전한 GDF-8을 갖는 실질적인 양의 B-세포 에피토프를 공유하는 그 분획)를 의미함은 물론, 다른 종들에서 분리된 이들 두 단백질의 제노(xeno)-유사체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 이 용어 속에 포함시킨다. 이 용어를 사용하는 것은 일반적으로 생물학적인 활성형태, 즉 인간에서 109 아미노산의 길이로 존재하는 C-말단의 펩타이드를 의미한다. 또한 원핵생물계로 제조된 GDF-8의 비글리코실화 형태는, 예컨대 효모 또는 그밖의 비-포유류 진핵 세포의 발현계로 인해 변화하는 O-글리코실화 패턴을 갖는 형태로서 이 용어의 범주내에 포함된다. 그러나 "GDF-8 폴리펩타이드"라는 용어를 이용할 때 대상이 되는 폴리펩타이드는 일반적으로 처리되는 동물에 제공시 비-면역성인 것을 의도함을 지적해야 한다. 바꾸어 말해, GDF-8 폴리펩타이드는 대상 동물의 GDF-8에 대하여 일반적으로 면역 반응을 유발시키지 않는 자가-단백질 또는 그러한 자가-단백질의 제노-유사체이다.

"GDF-8 유사체"는 그 일차 구조가 변형된 GDF-8 폴리펩타이드이다. 이러한 변형은, 예컨대 적절한 융합 파트너로 GDF-8 폴리펩타이드가 융합된 형태일 수 있고(즉, 아미노산 잔기의 C- 및/또는 N-말단의 첨가를 배타적으로 수반하는 일차 구조의 변형) 및/또는 GDF-8 폴리펩타이드의 아미노산 서열상 삽입 및/또는 결실 및/또는 치환된 형태일 수 있다. 또한 "GDF-8 유사체"는 유도된 GDF-8 분자를 포함하고, 참고로 아래에서 GDF-8의 변형에 대해 논의한다.

인간에 대한 백신으로서, 예컨대 인간 GDF-8의 개과 유사체를 이용함으로써 GDF-8에 대한 바람직한 면역성을 제공할 수 있으리라 기대된다. 면역화를 위해 이렇게 제노-유사체를 이용하는 것이 또한 상기 정의한대로 "GDF-8 유사체"의 범주로써 고려된다.

본 문맥 중 "폴리펩타이드"는 2 내지 10 아미노산 잔기의 짧은 펩타이드, 11 내지 100 아미노산 잔기의 올리고펩타이드 및 100 아미노산 잔기 이상의 폴리펩타이드 모두를 의미한다. 게다가, 이 용어는 단백질, 즉 한가지 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 기능성 바이오분자를 포함한다; 두개 이상의 폴리펩타이드를 포함할 때, 이들은 공유적으로 결합되거나 비-공유적으로 결합된 복합체를 형성할 것이다. 단백질내 폴리펩타이드(들)는 글리코실화 및/또는 지질화되고 및/또는 보조군을 포함할 수 있다.

"서브서열(subsequence)"은, 적절하게, 각각 천연 발생의 GDF-8 아미노산 서열 또는 핵산 서열로부터 직접 유래된 3 아미노산 이상의 또는 3 뉴클레오타이드 이상의 어떠한 연속적인 스트레치를 의미한다.

본 문맥에서 "동물"은 일반적으로 호모 사피엔스(Homo sapiens), 카니스 도메스티쿠스(Canis domesticus) 등과 같은 동물 종(바람직하게는, 포유류)을 지적하고 단지 하나의 단일한 동물에 국한되지 않는다. 그러나, 또한 본 발명의 방법에 따라 면역화되는 모든 개체가 동일한 면역원(들)을 이용하여 동물을 면역화시킬 수 있는 동일한 GDF-8을 실질적으로 포함한다는 점이 중요하므로, 이 용어는 동물 종과 같은 집단을 의미한다. 예를 들어, GDF-8의 유전적 변종이 별개의 집단에 존재 한다면 각 집단에서 GDF-8에 대한 자가내성을 깨드릴 수 있도록, 이들 별개의 집단에서 별개의 면역원을 이용하는 것이 필수적이다. 본 문맥에서 동물이란 면역계를 갖는 생명체라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이 동물은 포유 동물과 같은 척추 동물인 것이 바람직하다.

여기서 "GDF-8 활성의 생체내 하향-조절"이라는 용어는 살아있는 유기체에서 GDF-8과 그 수용체 간(또는 GDF-8과 이 분자에 대한 생물적으로 중요한 그밖의 가능한 결합 파트너 간) 상호 작용의 수가 감소함을 의미한다. 하향-조절은 여러가지 메카니즘에 의해 실현될 수 있다; 이 중, 항체 결합에 의해 GDF-8의 활성 부위를 단순 간섭하는 것이 가장 간단하다. 그러나, 또한 항체 결합이 청소 세포(예컨대, 대식세포와 다른 포식세포)에 의해 GDF-8의 제거를 야기하는 것이 본 발명의 범위 내에 있다.

"면역계에... 제공을 유발하는"의 표현은 관리된 방법으로 동물의 면역계가 면역원성에 시험감염되는 것이다. 후술하는대로, 면역계의 이러한 시험감염은 수많은 방법으로 이루어질 수 있고, 가장 중요한 것은 "파마신(pharmaccines)"(즉, 진행중인 질병을 치료하거나 증상을 개선하기 위해 투여하는 백신)을 포함하는 폴리펩타이드를 이용한 백신화 또는 핵산 "파마신" 백신화이다. 면역적으로 유효한 방법으로 면역적격 세포가 동물에서 항원과 맞서는 중요한 결과가 달성된 반면, 이 결과를 달성하는 정확한 방법은 기초가 되는 본 발명의 진보성에서 덜 중요하게 고려된다.

"면역적으로 유효한 양"은 당해 분야에서 통용되는 통상의 의미, 즉 면역적 인 특성을 면역원과 공유하는 발병 약제를 상당하게 보증하는 면역 반응을 유발시킬 수 있는 면역원의 양이다.

여기서 "변형된" GDF-8이라는 표현은 GDF-8의 백본을 구성하는 폴리펩타이드의 화학적 변형을 의미한다. 이러한 변형은, 예컨대 GDF-8 서열상에 존재하는 특정 아미노산 잔기의 파생(예컨대, 알킬화, 아실화, 에스테르화 등)일 수 있으나, 후술하는대로 바람직한 변형은 GDF-8 아미노산 서열상 일차 구조의 변경(또는 첨가)이며, 즉, 이 변형으로 일차 아미노산 서열이 변형된 GDF-8 유사체를 제공한다.

"GDF-8을 향한 자가내성"은, 백신화되는 집단에서 GDF-8이 자가-단백질이기 때문에 집단내 표준 개체들은 GDF-8에 대한 면역 반응을 일으키지 않는다는 것으로 이해된다; 그럼에도 불구하고 동물 집단내 임의의 개체들이, 예컨대 자가면역 장애의 일부로써 고유의 GDF-8에 대한 항체를 생산할 수 있다는 사실을 배제할 수 없다. 하여튼, 동물은 자신의 GDF-8에 대해서만 당연히 자가내성을 가지나 다른 동물 종 또는 별개의 GDF-8 페노형(phenotype)을 갖는 집단에서 유래한 GDF-8 유사체로 인해 또한 상기 동물내 내성이 야기될 수 있음을 지적해야 한다.

"외래 T-세포 에피토프"(또는 "외래 T-림프구 에피토프")는 MHC 분자와 결합할 수 있고 동물 종에서 T-세포를 자극하는 펩타이드이다. 본 발명에서 바람직한 외래 T-세포 에피토프는 "난교잡(promiscuous)" 에피토프, 즉 동물 종 또는 집단에서 MHC 분자 중 특정 군의 상당한 부분과 결합하는 에피토프이다. 이러한 난교잡 T-세포 에피토프 중 단지 매우 제한된 수만이 알려져 있고, 이를 자세하게 후술할 것이다. 가능한 동물 집단의 대부분에서 본 발명에 따른 면역원을 유효하게 이용하기 위하여 1)수개의 외래 T-세포 에피토프를 동일한 GDF-8 유사체에 삽입하거나 2)각 유사체에 별개의 난교잡 에피토프를 삽입시킨 수개의 GDF-8 유사체를 제조하는 것이 필수적이다. 또한 외래 T-세포 에피토프의 개념은, 잠재적인 T-세포 에피토프의 이용, 즉 자가-단백질로부터 유래되고 대상이 되는 자가 단백질의 부분으로 존재하지 않으면서 분리된 형태로 존재할 때만 면역원성 작용을 발휘하는 에피토프의 이용을 포함한다.

"외래 T 헬퍼 림프구 에피토프"(외래 T_H 에피토프)는 MHC의 클래스 II 분자와 결합하고 MHC의 클래스 II 분자에 결합한 항원 표시 세포(APC)의 표면위에 표시될 수 있는 외래 T-세포 에피토프이다.

본 문맥에서 (바이오)분자의 "기능성 부분"이란 한가지 이상의 생화학적 또는 생리적 효과를 분자에 의해 발휘할 수 있는 분자의 일부를 의미한다. 많은 효소와 그밖의 작용체 분자가 대상이 되는 분자에 의해 효과를 발휘할 수 있는 활성 부위를 갖는 것이 당해 분야에 잘 알려져 있다. 분자의 다른 부분들은 안정화 또는 용해성을 강화시키는 용도로 소용될 수 있고 따라서 이들 용도가 본 발명의 특정 구체예에서 적절하지 않다면 무시될 수 있다. 예를 들어, 특정 사이토킨을 GDF-8의 변형 부분으로서 사용할 수 있고(자세한 설명은 후술함), 이 경우 GDF-8과의 커플링이 필요한 안정성을 제공하므로 안정성이라는 논점은 무의미하다.

"보조제(adjuvant)"라는 용어는 당해 백신 기술에서 통상적인 의미를 갖는, 즉 1)그 자체로는 백신의 면역원에 대하여 특정한 면역 반응을 유발하지 않으나, 2)그럼에도 불구하고 면역원에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있는 물질 또는 조성물이다. 또는 바꾸어 말해, 보조제 단독의 백신화는 면역원에 대한 면역 반응을 제공하지 않고 면역원에 의한 백신화는 면역원에 대한 면역 반응을 일으키거나 또는 일으키지 않으나, 면역원과 보조제를 혼합하여 이용한 백신화는 면역원 단독에 의해 유발된 것 보다 강하게 면역원에 대한 면역 반응을 유도한다.

본 문맥에서 분자의 "표적화"는 동물에 도입된 분자가 특정 조직(들)에서 우선적으로 출현하고 특정 세포 또는 세포 타입과 우선적으로 결합하게 되는 상태를 지적한다. 표적화를 촉진하는 조성물내에 분자를 배합시키는 수많은 방법 또는 표적화를 촉진하는 작용기의 분자내 도입에 의해 이 효과를 달성할 수 있다. 이 주제는 상세하게 후술할 것이다.

"면역계의 자극"은 대상이 되는 물질 또는 조성물이 일반적이고 비-특이적인 면역 자극 효과를 나타내는 것을 의미한다. 수많은 보조제와 추정의 보조제(예컨대 특정 사이토킨)가 면역계의 자극력을 분담한다. 면역 자극제를 사용한 결과, 면역원과의 동시적인 또는 후속적인 면역화가 분리된 면역원의 사용과 비교하여 현저하게 효과적인 면역 반응을 유발하는, 면역계의 "경계성"이 증가된다.

GDF-8 활성 하향-조절의 바람직한 구체예

본 발명의 방법에서 면역원으로서 사용하는 GDF-8 폴리펩타이드는, 그러한 방식으로 GDF-8에 대한 자가내성의 모든-중요한 깨어짐을 얻는 변화가 상당히 촉진되어지므로 GDF-8 아미노산 서열상 한가지 이상의 변화가 존재하는 변형된 분자인 것이 바람직하다. 추가로 GDF-8에 대한 자가내성의 깨어짐을 촉진하는 배합물, 예 컨대 아래에서 상세히 논의하는 보조제를 포함하는 배합물 중 이렇게 변형된 GDF-8의 사용 가능성을 제외시키는 것이 아님을 주목해야 한다.

자가-단백질을 인식하는 잠재적으로 자가-반응성인 B-림프구가 표준 개체에 생리적으로 존재함을 보여준다(Dalum I 등, 1996, J.Immunol.157:4796-4804). 그러나, 유발된 이들 B-림프구가 실질적으로 적절한 자가-단백질에 반응성인 항체를 생산하기 위하여, T-보조 림프구(T_H-세포 또는 T_H-림프구)를 생산하는 사이토킨의 원조가 필요하다. 당연히 이 원조는, T-림프구가 일반적으로 항원 표시 세포(APCs)에 의해 표시될 때 자가-단백질로부터 유래된 T-세포 에피토프를 인식하지 않으므로 제공되지 않는다. 그러나, 자가-단백질에서 "외래성"의 요소를 제공(즉, 면역적으로 유의한 변형을 도입하여)함으로써, 외래 요소를 인식하는 T-세포가 APC 상 외래 에피토프를 인식하도록 활성화된다(예컨대, 최초로, 단핵세포). 변형된 자가-단백질 상에서 자가-에피토프를 인식할 수 있는 폴리클로날 B-림프구(또한 APCs)는 항원을 흡수하고 이어서 그 외래 T-세포 에피토프(들)를 출현시키며 활성화된 T-림프구는 후속적으로 이 자가-반응성의 폴리클로날 B-림프구에 사이토킨 원조를 제공한다. 이들 폴리클로날 B-림프구에 의해 생산된 항체들은 변형된 폴리펩타이드 상의 다른 에피토프와 반응성을 가지므로, 또한 고유의 폴리펩타이드에 존재하는 것들을 포함하여, 비-변형된 자가-단백질에 교차-반응성인 항체를 유발한다. 결론적으로, T-림프구는 폴리클로날 B-림프구의 집단이 완전히 외래 항원을 인식하는 것처럼 작용시킬 수 있는 반면, 사실상 단지 삽입된 에피토프(들)이 숙주에 외래적이다. 이 러한 방법으로, 비-변형된 자가-항원에 교차-반응할 수 있는 항체들을 유발한다.

자가내성을 깨뜨리기 위하여 펩타이드 자가-항원을 변형시키는 여러가지 방법이 당해 분야에 알려져 있다. 그러므로 본 발명에 따른 변형은

- 한가지 이상의 외래 T-세포 에피토프를 도입, 및/또는

- 항원 표시 세포(APC)에 변형된 분자를 표적화하는 한가지 이상의 첫번째 부분을 도입, 및/또는

- 면역계를 자극하는 한가지 이상의 두번째 부분을 도입, 및/또는

- 면역계에 변형된 GDF-8 폴리펩타이드의 표시를 최적화하는 한가지 이상의 세번째 부분을 도입하는 것을 포함할 수 있다.

그러나, 고유 분자의 B-림프구 인식이 그로 인해 향상되기 때문에 이들 모든 변형은 활성 GDF-8 중 원시 B-림프구 에피토프의 실질적인 부분을 유지하면서 수행되어야 한다.

한 바람직한 구체예에서, 보조 작용기(외래 T-세포 에피토프 또는 상기-언급한 첫번째, 두번째 및 세번째 부분의 형태에서)가 공유적 또는 비-공유적으로 도입된다. 이것은 GDF-8로부터 유래되는 아미노산 잔기의 스트레치가, 일차 아미노산 서열을 바꾸지 않으면서 또는 적어도 사슬상 개개 아미노산 간의 펩타이드 결합에 변화를 유발하지 않으면서 유도화되는 것을 의미한다.

선택적이고 바람직한 구체예는 아미노산의 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 첨가를 이용한다(재조합 방법 또는 펩타이드 합성 방법에 의해 초래될 수 있다; 아미노산의 보다 긴 스트레치를 포함하는 변형이 융합 폴리펩타이드를 발생시킬 수 있다). 이 구체예의 특히 바람직한 한 설명이 WO 95/05849에서 언급한 기술이다. 이것은 자가-단백질의 유사체를 이용하여 면역화시킴으로써 자가-단백질을 하향-조절하는 방법이고, 여기서 유사체상의 자가-단백질의 전체적인 삼차 구조를 유지하는 동시에 수많은 아미노산 서열(들)이 외래의 면역우성인 T-세포 에피토프를 포함하는 각 상응하는 수많은 아미노산 서열(들)로 치환된다. 본 발명의 목적을 위하여, 그러나, 변형(삽입, 첨가, 결실 또는 치환)이 외래 T-세포 에피토프를 발생시키는 동시에 GDF-8에서 B-세포 에피토프의 상당히 다수를 보존한다면 그것으로 충분하다. 그러한 유발된 면역 반응의 최대 효능을 얻기 위하여 변형된 분자에서 GDF-8의 전체적인 삼차 구조가 유지되는 것이 바람직하다.

다음 식은 본 발명의 일반적인 GDF-8 구조를 기술한 것이다:

(MOD₁)_s1(GDF-8_e1)_n1(MOD₂)_s2(GDF-8 _e2)_n2.......(MOD_x)_sx(GDF-8_ex)_nx (I)

- 식 중, GDF-8_e1-GDF-8_ex는 독립적으로 동일하거나 다르며 외래의 보조 작용기를 함유하거나 함유하지 않은 GDF-8의 서브서열을 포함하는 x B-세포 에피토프이고, x는 ≥3의 정수, n1-nx 는 ≥0의 x 정수(적어도 하나가 ≥1), MOD₁-MOD_x는 보존된 B-세포 에피토프간에 도입된 x 변형, 그리고 s₁-s_x는 ≥0의 x 정수(GDF-8_e 서브서열에 보조 작용기가 도입되지 않으면 적어도 하나가 ≥1)이다. 따라서 구조의 면역성에 일반적인 기능성 제한이 가해진다면 본 발명은 모든 종류의 원시 GDF-8 서열의 순열 및 그 모든 종류의 변형을 인정한다. 따라서, 예컨대 생체내에서 역효과를 나타내는 GDF-8 서열의 부분적인 생략 또는 정상적으로 세포간에 존재하여 소망하지 않는 면역 반응을 일으킬 수 있는 부분의 생략에 의해 얻어지는 변형 GDF-8이 본 발명에 포함된다.

B-세포 에피토프의 실질적인 부분과 심지어 여기서 기술한 변형에 따르는 단백질의 전체적인 삼차 구조의 보존이 여러가지 방법으로 달성될 수 있다. 한가지는 단순히 GDF-8에 대한 폴리클로날 항-혈청을 제조하고(예컨대 토끼에서 제조한 항혈청) 이후에 이 혈청을 제공된 변형 단백질에 대한 시험 약제(예컨대 경쟁적인 ELISA에서)로서 사용하는 것이다. GDF-8처럼 항혈청에 동일한 정도로 반응하는 변형물(유사체)은 GDF-8과 동일하며 포괄적인 삼차 구조를 갖는 것으로 간주되어야 하는 반면 그러한 항혈청에 제한된(그러나 여전히 현저하고 특이적인) 반응성을 나타내는 유사체는 원시 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 유지하는 것으로 간주된다.

선택적으로, GDF-8상에서 별개의 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체의 선택이 가능하고 시험 패널로서 이용할 수 있다. 이러한 접근은 1)GDF-8의 에피토프 지도와 2)제조된 유사체에서 보존되는 에피토프의 지도화가 가능하다는 이점을 갖는다.

물론, 세번째 접근에서는 GDF-8 또는 그 생리적으로 활성인 단편의 3-차원 구조(cf. 상술함)를 분석하고 이것을 제조된 유사체의 해석된 3-차원 구조와 비교할 것이다. 3-차원 구조는 X-선 회절 연구와 NMR-분광학을 이용하여 분석할 수 있다. 주어진 분자의 삼차 구조에 대한 유용한 정보를 제공하기 위하여 단지 순수한 형태의 폴리펩타이드를 요구하는(반면 X-선 회절은 결정화 폴리펩타이드를 요구하고 NMR은 폴리펩타이드의 등방성 변종을 요구한다) 이점을 갖는 순환의 이색성 연구로부터 어떠한 한도까지 삼차 구조에 관련된 추가 정보를 얻을 수 있다. 그러나 순환의 이색성 연구는 단지 이차 구조 요소들의 정보를 통해 완전한 3-차원 구조의 간접적인 입증을 제공할 뿐이므로 궁극적으로는 최종적인 자료를 얻기 위해 X-선 회절 및/또는 NMR이 필수적이다.

본 발명의 한 바람직한 구체예는 GDF-8의 B-림프구 에피토프의 다중 표시를 이용한다(즉, 식 I에서 하나 이상의 B-세포 에피토프가 두 위치에 존재한다). 이 효과는 다양한 방법, 예컨대 단순히 구조 (GDF-8)_m(이 때 m은 ≥2의 정수)을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조하고 한가지 이상의 GDF-8 서열에 여기서 논의한 변형을 도입하거나 또는 선택적으로 적어도 두개의 GDF-8 아미노산 서열 사이에 삽입시킴으로써 달성할 수 있다. 도입된 변형이 한번 이상의 B-림프구 에피토프의 중복 및/또는 부착소의 도입을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 기술한대로, 외래 T-세포 에피토프의 도입은 한가지 이상의 아미노산 삽입, 첨가, 결실 또는 치환의 도입에 의해 수행할 수 있다. 물론, 표준 상태는 아미노산 서열상 한가지 이상의 변화를 도입할 것이나 (예컨대, 완전한 T-세포 에피토프에 의한 삽입 또는 치환) 도달하려는 중요한 목적은 항원 표시 세포(APC)에 의해 처리할 때 GDF-8 유사체가 APC 표면상에 MCH 클래스 II 분자의 관계에서 표시되는 그러한 외래의 면역우성인 T-세포 에피토프를 발생시키는 것이다. 따라서 적절한 위치에서 GDF-8 아미노산 서열이 외래의 T_H 에피토프에서 발견될 수 있는 수많은 아미노산 잔기를 포함한다면, 그때에 아미노산 삽입, 첨가, 결실 및 치환에 의해 외래 에피토프의 보존된 아미노산을 제공함으로써 외래의 T_H 에피토프의 도입이 이루어질 수 있다. 바꾸어 말해, 본 발명의 목적을 수행하기 위해 삽입 또는 치환으로 완전한 T_H 에피토프를 반드시 도입할 필요는 없다.

삽입, 결실, 치환 또는 첨가의 아미노산 수는 2 이상, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 25의 삽입, 치환, 첨가 또는 결실인 것이 바람직하다. 더욱이 삽입, 결실, 치환 또는 첨가의 아미노산 수가 150을 초과하지 않고, 예컨대 많아야 100, 90, 80 및 70인 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 치환, 삽입, 결실 또는 첨가의 수가 60을 초과하지 않고, 보다 구체적으로 50 또는 심지어 40을 초과하지 않는 수이어야 한다. 가장 바람직한 것은 30을 넘지 않는 수이다. 아미노산의 첨가에서, 생성된 구조가 융합 폴리펩타이드의 형태일 때 이들이 종종 150보다 상당히 높다는 것을 지적해야 한다.

본 발명의 바람직한 구체예는 한가지 이상의 면역우성인 외래의 T-세포 에피토프를 도입시킨 변형을 포함한다. 논점이 되는 T-세포 에피토프의 면역 우성은 대상이 되는 동물 종에 달려있다. 여기서 이용한 대로, "면역 우성"은 단순히 백신화 개체/집단에서 현저한 면역 반응을 일으키는 에피토프를 언급하나, 하나의 개체/집단에서 면역우성인 T-세포 에피토프가, 비록 후자의 개체에서 MHC-II 분자와 결합하는 것이 가능할지라도, 반드시 동일한 종의 또다른 개체에서도 면역우성이지는 않다는 사실이 잘 알려져 있다.

또 다른 중요한 점은 T_H세포 에피토프의 MHC 제한점에 있다. 일반적으로, 천연 발생의 T-세포 에피토프는 제한된 MHC이고, 즉 T_H 세포 에피토프를 구성하는 특정 펩타이드가 단지 효과적으로 MHC 클래스 II 분자의 서브셋과 결합할 것이다. 바꾸어 말해, 이것은 대부분의 경우 하나의 특이적인 T_H 세포 에피토프의 사용이 단지 집단의 일부에서 유효한 백신 성분을 야기하는 효과를 갖고, 그 일부의 크기에 따라서, 동일 분자에 보다 많은 T_H 세포 에피토프를 포함할 필요가 있으며, 또는 선택적으로 성분들이 도입된 T_H 세포 에피토프의 본질과 서로 구별되는 GDF-8 변종인 다중-성분 백신을 제조할 수 있다.

사용된 T-세포의 MHC 제한이 완전히 알려져 있지 않다면(예를 들어 백신화 동물이 불충분하게 정의된 MHC 조성물을 갖는 상태에서) 특정 백신 조성물이 적용된 개체 부분은 다음 식으로 결정할 수 있다:

(II)

식 중, P_i는 백신 조성물에 존재하는 i번째 외래 T-세포 에피토프에 대한 집단 내 응답자의 빈도이고, n은 백신 조성물 내 외래 T-세포 에피토프의 총 수이다. 따라서, 집단 내 각각 0.8, 0.7 및 0.6의 반응 빈도를 갖는 3 외래 T-세포 에피토프를 함유하는 백신 조성물은

1 - 0.2 × 0.3 × 0.4 = 0.976

으로 주어진다. 즉 통계적으로 집단의 97.6 퍼센트가 백신에 대해 MHC-II 매 개 반응을 유발할 것이다.

상기 식은 이용된 펩타이드의 다소간 정확한 MHC 제한 패턴이 알려진 조건에서는 적용시키지 않는다. 예를 들어 특정 펩타이드가 단지 HLA-DR 대립유전자 DR1, DR3, DR5 및 DR7에 의해 코딩되는 인간의 MHC-II 분자와 결합한다면 이 펩타이드와 함께, HLA-DR 대립유전자에 의해 코딩되는 존속한 MHC-II 분자와 결합하는 또 다른 펩타이드의 이용은 대상이 되는 집단에서 100% 적용을 성취할 것이다. 마찬가지로, 만약 두번째 펩타이드가 단지 DR3 및 DR5와 결합한다면 이 펩타이드의 첨가는 전혀 적용을 증가시키지 않는다. 만약 백신에서 T-세포 에피토프의 MHC 제한에 순수하게 반응하는 집단의 추정을 기초로 한다면, 특정 백신 조성물에 의해 적용되는 집단의 부분을 다음 식에 의해 결정할 수 있다:

(III)

식 중, φ_j는 백신에서 T-세포 에피토프의 어떠한 하나와 결합하고 알려진 3 HLA 위치(DP, DR 및 DQ) 중 j번째에 속하는 MHC 분자를 코딩하는 대립 유전자 단일타입의 집단에서 빈도의 총합이다; 실제, MHC 분자가 백신에서 각 T-세포 에피토프를 인식한 후 이들이 타입(DP, DR 및 DQ)에 따라 나열되는 것을 우선 결정한다 - 그리고 나서, 나열된 대립 유전자 단일타입의 다른 개개 빈도들을 합하여 φ₁, φ₂ 및 φ₃을 얻는다.

식 II에서 수치 P_i가 상응하는 이론상의 수치 Π_i를 초과할 수 있다:

(IV)

식 중, ν_j는 백신에서 i번째 T-세포 에피토프와 결합하고 알려진 3 HLA 위치(DP, DR 및 DQ) 중 j번째에 속하는 MHC 분자를 코딩하는 대립 유전자 단일타입의 집단에서 빈도의 총합이다. 이것은 집단의 1-Π_i에서 f_잔기__i = (p_i-Π_i)/(1-Π_i)의 응답자의 빈도를 의미한다. 따라서 식 III를 보완하여 식 V를 얻을 수 있다:

(V)

식 중, 1-f_잔기__i이 음수라면 0으로 한다. 식 V는, 모든 에피토프가 동일한 세트의 단일타입에 대한 지도화된 단일타입을 요구한다.

따라서, IL5 유사체에 도입되는 T-세포 에피토프를 선택할 때 유효한 에피토프의 모든 정보를 포함하는 것이 중요한다: 1)집단에서 각 에피토프에 대한 응답자의 빈도, 2)MHC 제한 수치, 및 3)집단에서 관련 단일타입의 빈도.

동물 종 또는 동물 집단의 대다수 개체에서 활성인 수많은 천연 발생의 "난교잡" T-세포 에피토프가 존재하고 바람직하게도 이들을 백신에 도입하여 동일 백신에서 다른 GDF-8 유사체의 수많은 요구를 감소시킨다.

난교잡성(promiscuous) 에피토프는 본 발명에 따라서, 예컨대 파상풍 톡소이드(예를 들어 P2와 P30 에피토프), 디프테리아 톡소이드, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 및 피. 팔시파룸(P. falciparum) CS 항원에서 선택된 에피토프와 같이 천연 발생의 인간 T-세포 에피토프일 수 있다. 물론, 인간 이외의 동물을 백신화할 때 대상이 되는 동물내에서 난교잡성인 천연 발생의 T-세포 에피토프를 사용하는데 주의를 기울여야 한다.

수년에 걸쳐서 수많은 다른 난교잡성 T-세포 에피토프가 동정되었다. 특히 다른 HLA-DR 대립 유전자에 의해 코딩되는 대다수의 HLA-DR 분자와 결합할 수 있는 펩타이드가 동정되었고 이들 모두가 본 발명에 따라 이용되는 GDF-8 유사체에 도입되는 T-세포 에피토프일 수 있다. 참고로 또한 다음 참조에서 논의된 에피토프가 모두 여기서 참조로써 관계한다: WO 98/23635 (Frazer IH 등, assigned to The University of Queensland); Southwood S 등, 1998, J.Immunol. 160:3363-3373; Sinigaglia F 등, 1988, Nature 336:778-780; Chicz RM 등, 1993, J.Exp. Med 178:27-47; Hammer J 등, 1993, Cell 74:197-203; 및 Falk K 등, 1994, Immunogenetics 39:230-242. 후반부의 참조는 HLA-DQ와 -DP 리간드를 다룬 것이다. 이들 5개의 참조에 나열된 모든 에피토프는 본 발명에서 이용되는 천연 에피토프의 후보로서, 이들과 공통의 모티프를 공유하는 에피토프로서 적절하다.

선택적으로, 에피토프는 MHC 클래스 II 분자의 대다수와 결합할 수 있는 어떠한 인공 T-세포 에피토프일 수 있다. 이러한 문맥에서 WO 95/07707과 상응하는 논문 Alexander J 등, 1994, Immunity 1:751-761(두 발표가 여기서 참조로써 관계한다)에 기술된 팬(pan) DR 에피토프 펩타이드("파드레(PADRE)")가 본 발명에 따라 이용되는 에피토프의 후보로서 흥미롭다. 이들 논문에서 기술한 가장 효과적인 파드레 펩타이드가 투여 안정성을 향상시키기 위해 C- 및 N-말단에서 D-아미노산을 담지한다. 그러나, 본 발명은 우선 변형된 GDF-8의 일부로써 적절한 에피토프를 병합시키고 이어서 MHC-II 분자와의 관계에서 후속의 표시를 허가하기 위하여 APCs의 리소솜성 구획내에서 효소적으로 변화를 일으키는 것을 목적으로 하므로 본 발명에 따른 에피토프에서 D-아미노산을 병합시키기 위한 방편이 아니다.

특히 바람직한 하나의 파드레 펩타이드는 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA 또는 그 면역적으로 유효한 서열을 갖는 것이다. 이것과, MHC 제한의 동일 결여를 포함하는 다른 에피토프가 본 발명의 방법에 따라 이용된 GDF-8 유사체에 존재해야 하는 바람직한 T-세포 에피토프이다. 그러한 슈퍼-난교잡성 에피토프가 본 발명의 가장 단순한 구현을 가능하게 하고 이 때 단지 하나의 단일 변형 GDF-8이 백신화 동물의 면역계에 나타난다.

상기 기술한대로, GDF-8의 변형은 또한 APC 또는 B-림프구에 변형된 GDF-8을 표적화시키는 첫번째 부분의 도입을 포함한다. 예를 들어, 첫번째 부분은 B-림프구 특이적인 표면 항원 또는 APC 특이적인 표면 항원을 위한 특이적인 결합 파트너일 수 있다. 다수의 그러한 특이적인 표면 항원이 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 이 부분은 B-림프구 또는 APC상에 수용체가 존재하는 탄수화물일 수 있다(예컨대 만난 또는 만노오스). 선택적으로 두번째 부분은 부착소일 수 있다. 또한 특이적으로 APCs 또는 림프구상 표면 분자를 인식하는 항체 단편을 첫번째 부분으로서 이용할 수 있다(표면 분자는, 예컨대 대식세포 및 단구세포, 예컨대 FCyRI의 FCy 수용체일 수 있고, 선택적으로 CD40 또는 CTLA-4와 같은 어떠한 다른 특이적인 표면 마커일 수 있다). 모든 구체적인 표적화 분자를 또한 후술하는 보조제의 일부로써 이용할 수 있다.

향상된 면역 반응을 얻기 위하여 특정 세포 타입에 대해 변형된 GDF-8 폴리펩타이드를 표적화하는 대안 또는 보완책으로서, 면역계를 자극하는 상기의 두번째 부분을 포함시킴으로써 면역계의 반응성 수준을 증가시킬 수 있다. 이러한 두번째 부분의 통상적인 예로는 사이토킨과 열-쇼크 단백질 뿐 아니라 그 유효 부분을 들 수 있다.

본 발명에 이용된 적절한 사이토킨은 또한 백신 조성물에서 보조제로서 기능한다. 즉, 예를 들어 인터페론 γ(IFN-γ), Flt3L, 인터루킨 1(IL-1), 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 13(IL-13), 인터루킨 15(IL-15) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 선택적으로 사이토킨 분자의 기능성 부분이 두번째 부분으로서 충분하다. 보조제 물질로서 그러한 사이토킨을 이용하는 것이 참고로 후술되어 있다.

본 발명에서, 두번째 부분으로서 이용되는 적절한 열-쇼크 단백질은 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94(또한 Wearsch PA 등, 1998, Biochemistry 37:5709-19에서 gp96으로 알려져 있다) 및 CRT(칼레티큘린(calreticulin))이다.

선택적으로, 두번째 부분은 리스테리오라이신(LLO), 지질 A 및 열-불안정성 엔테로톡신과 같은 독소이다. 또한 수많은 미코박테리아성 유도체, 예컨대 MDP(뮤라밀 디펩타이드) 및 트레할로스 디에스테르 TDM과 TDE의 가능성이 흥미롭다.

또한 면역계에 변형된 GDF-8의 제공을 향상시키는 세번째 부분의 도입 가능성이 본 발명에서 중요한 구체예이다. 당해 분야에서 이 원리의 여러가지 구체예를 제시한다. 예를 들어, 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) 단백질 OspA 에서 팔미토일 지질화 유지를 자가-보조적인 폴리펩타이드를 제공하기 위하여 이용할 수 있다(cf. 예컨대 WO 96/40718)는 것이 알려져 있다. 지질화 단백질이 폴리펩타이드의 지질화 유지 부분으로 구성된 코어와 그로부터 나온 분자의 보존 부분과 함께 미셀-과 같은 구조를 형성하고, 그 결과 항원성 결정자의 다중 표시를 야기하는 것으로 보인다. 따라서, 특히 재조합으로 생산된 단백질에서 이러한 지질화 유지의 제공은 명백하게 수월하고 단지 변형된 GDF-8 폴리펩타이드에 대한 융합 파트너로서, 예컨대 천연 발생의 시그날 서열의 이용을 요구하므로, 이러한 이용과 다른 지질화 유지(예컨대, 미리스틸기, 파르네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-유지 및 N-아실 디글리세라이드기)를 이용하는 관련 접근은 본 발명의 바람직한 구체예이다. 또 다른 가능성은 보조 인자 C3의 C3d 단편 또는 C3 자체의 이용이다(cf. Dempsey 등, 1996, Science 271, 348-350 및 Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).

면역계에 대해 GDF-8의 중요한 에피토프 영역의 바람직한 다중(예컨대, 2 이상) 카피 표시를 야기하는 본 발명의 선택적인 구체예는 특정 담체 분자에 대한 GDF-8, 그 서브서열 또는 변종의 공유적인 또는 비-공유적인 커플링이다. 예를 들어, 폴리머, 덱스트란과 같은 탄수화물, cf. 예컨대 Lees A 등, 1994, Vaccine 12:1160-1166; Lees A 등, 1990, J.Immunol. 145:3594-3600을 이용할 수 있으나, 또한 만노오스 및 만난이 유용한 그 대안이 될 수 있다. 예컨대, 이. 콜라이(E. coli)와 다른 박테리아로부터 얻은 필수적인 막 단백질이 또한 유용한 컨쥬게이션 파트너이다. 전통적인 담체 분자, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드 및 소의 혈청 알부민(BSA)이 또한 바람직하고 유용한 컨쥬게이션 파트너이다.

변형을 수행하는데 고유 GDF-8의 특정 영역들이 가장 적절한 것으로 보인다. 한가지 이상의 다음 서브서열의 C-말단 GDF-8에서의 변형이 적절한 면역성 분자를 야기시킬 것으로 예상된다: SEQ ID NO:11 또는 12 중 잔기 18-41, 46-69 또는 79-104, 또는 인간, 소과, 돼지, 닭 또는 칠면조 이외의 다른 기원으로부터 얻은 GDF-8 폴리펩타이드의 상응하는 서브서열. 기본적인 이러한 선택 영역에서 고려할 점은 a)B-세포 에피토프의 보존, b)이차, 삼차 및 사차 구조의 보존 등이다. 하여튼, 상기 논의한대로, 고유 GDF-8에 대하여 발생되는 항체의 면역 반응성을 위하여 변형된 GDF-8 분자(개별적인 위치에 모든 T-세포 에피토프가 도입된)의 세트를 선별하는 것이 매우 용이하다. 아미노산 서열을, 외래 T_H 에피토프를 포함하는 동일하거나 별개의 길이를 갖는 한가지 이상의 아미노산 서열로 치환시킴으로써 변형을 수행하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 구성 이면의 근본적 원리를 구체예에서 상세하게 논의한다. 또한 C-말단 GDF-8 단편의 어떠한 한 루프(loop) 영역 또는 탄력성 말단(잔기 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 및 105-`109)으로 삽입(또는 치환)시키는 것이 바람직하다.

GDF-8과 변형된 GDF-8 폴리펩타이드의 배합

동물에 투여함으로써 동물의 면역계에 GDF-8 폴리펩타이드 또는 변형된 GDF-8 폴리펩타이드를 제공하고자 때, 폴리펩타이드의 배합은 당해 분야에 일반적으로 알려진 원리를 따른다.

활성 성분으로서 펩타이드 서열을 포함하는 백신의 제조는 일반적으로 당해 분야에 잘 알려져 있고, 그 예로 미국 특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 및 4,578,770를 들 수 있으며 이들 모두가 여기서 참조로써 관계한다. 통상적으로, 이러한 백신은 주사 가능한 액체 용액 또는 현탁액; 용액 또는 현탁액내에 이용하기 적절한 고체 형태이며, 또한 주사 이전에 액체로 제조할 수 있는 것들이다. 또한 조제물은 유화될 수 있다. 종종 활성의 면역원성 성분을, 약리적으로 허용되며 활성 성분과 양립할 수 있는 부형제와 혼합시킨다. 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 살린, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그 혼합물이다. 게다가, 소망한다면 백신의 유효성을 향상시키기 위해 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 또는 보조제와 같은 소량의 보조 물질을 포함시킬 수 있다; cf. 상세한 보조제의 논의를 후술한다.

백신은 통상적으로 주사에 의해, 예를 들어 피하적으로, 피내적으로, 진피내로, 피하 또는 근육내로 비경구 투여된다. 다른 투여 방법에 적절한 추가적인 배합물로는 좌약, 그리고 몇몇 경우에 경구, 협측, 설하, 복강내, 질내, 항문, 경막외, 척수 및 두개강내 배합물이 있다. 좌약에서, 전통적인 결합제 및 담체는, 예를 들어 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 있다; 이러한 좌약은 활성 성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1-2% 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 배합물은 일반적으로 적용되는 부형제, 예컨대 약리적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이 트등을 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방성 배합물 또는 분말의 형태이고 10-95%, 바람직하게는 25-70%의 활성 성분을 함유한다. 경구용 배합물에서, 콜레라 독소가 흥미로운 배합 파트너이다(그리고 또한 가능한 컨쥬게이션 파트너이다).

중성 또는 염 형태로서 폴리펩타이드를 백신에 배합시킬 수 있다. 약리적으로 허용되는 염으로 산 첨가염(펩타이드의 자유 아미노기로 형성된)이 있고, 이것은, 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등과 같은 유기산을 이용하여 형성된다. 자유 카르복실기를 이용하여 형성되는 염은 또한, 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 철 히드록사이드와 같은 무기 염기, 그리고 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

백신은 조제 배합물에 적합한 방법으로 투여되고, 그 양은 치료적으로 유효하며 면역원성을 갖는다. 투여되는 양은 치료의 대상에 따라 달라지고, 예컨대 면역 반응을 일으키는 개체의 면역계 용량 및 소망하는 보호 정도에 따라 다르다. 적절한 복용 범위는, 바람직한 범위 약 0.1㎍ 내지 2,000㎍(비록 1-10㎎의 보다 높은 범위량이 고려될 수 있으나), 예컨대 약 0.5㎍ 내지 1,000㎍의 범위, 바람직하게는 1㎍ 내지 500㎍의 범위 그리고 특히 약 10㎍ 내지 100㎍ 범위의 백신화 당 대략 활성 성분 수백 마이크로그램이다. 초기 투여와 두번째 예방 주사의 적절한 관리가 또한 다양하게 이루어질 수 있으나 초기 투여에 이어 후속의 접종 또는 그밖의 투여를 하는 것으로 정형화된다.

투여 방법은 매우 다양하다. 백신 투여를 위한 어떠한 통상적인 방법도 적용 가능하다. 이것은 생리적으로 허용되는 기재상 고체의 경구 적용 또는 생리적으로 허용되는 분산액을 이용한 경구 적용, 주사에 의한 비경구 투여 등을 포함한다. 백신의 복용량은 투여 경로에 따라 달라지고 백신화되는 사람의 연령 및 항원 배합물에 따라 다양할 것이다.

백신의 몇몇 폴리펩타이드는 백신에서 충분히 면역원성을 가지나, 백신이 부가로 보조 물질을 함유한다면 다른 몇몇에 대한 면역 반응이 향상될 것이다.

백신에 대한 보조 효과를 달성하는 다양한 방법이 알려져 있다. 일반적인 원리와 방법이 "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S.Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6 및 "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G 등,(eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 상세하게 기술되어 있고 이들 모두가 여기서 참조로써 관계한다.

자가항원에 대한 자가내성의 파괴를 촉진한다고 입증된 보조제(adjuvant)를 사용하는 것이 특히 바람직하다; 사실상, 이것은 변형되지 않은 GDF-8이 자가백신에서 활성 성분으로서 사용되는 경우에 필수적이다. 적절한 보조제의 비-제한적인 예들이 면역 표적화 보조제를 구성하는 군으로부터 선택된다; 톡신, 사이토킨 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조절 보조제; 오일 배합물; 폴리머; 미셀 형성 보조제; 사포닌; 면역자극 복합 매트릭스(ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 보조제; DNA 보조제; γ-이눌린; 및 캡슐화 보조제. 일반적으로 유사체에서 첫번째, 두번째 및 세번째 부분으로서 유용한 화합물 및 약제에 관련하여 상기 기술한 내용이 또한 필요한 변경을 가하여 본 발명의 백신 보조제에서 그 용도에 귀착됨을 주목해야 한다.

보조제의 적용은, 통상적으로 완충 살린에서 0.05 내지 0.1% 용액으로 이용되는 알루미늄 히드록사이드 또는 포스페이트(alum)와 같은 약제, 0.25% 용액으로 이용되는 당의 합성 폴리머(예컨대, Carbopol

)와의 혼합물을 사용하여 70 내지 101℃ 사이의 온도 범위에서 30초 내지 2분 동안 각각 열처리함으로써 백신내 단백질을 응집시키는 것을 포함하고 또한 가교-결합에 의해 응집시키는 것이 가능하다. 펩신 처리된 항체(Fab 단편)를 이용한 알부민으로의 반응, 씨. 파르붐(C. parvum) 또는 그램-음성 박테리아의 균체내 독소 또는 리포다당류 성분과 같은 박테리아 세포를 이용한 혼합물, 만니드 모노-올레이트(Aracel A)와 같은 생리적으로 허용되는 오일 비히클에서 에멀젼 또는 방해 대용물로서 이용된 퍼플루오로카본(Fluosol-DA)의 20% 용액을 이용한 에멀젼에 의한 응집을 또한 이용할 수 있다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합물이 또한 바람직하다.

본 발명에 따라서, DDA(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)가, DNA 및 γ-이눌린과 같이, 후보가 되는 흥미로운 보조제이나 또한 QuilA과 QS21과 같은 퀼라야피 사포닌 뿐 아니라 프로인즈의 완전 및 불완전 보조제가 RIBI로서 흥미롭다. 추가로 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 상기 언급한 C3과 C3d 및 뮤라밀 디펩타이드(MDP)가 가능하다.

보조 효과를 내기 위한 리포솜 배합무이 또한 알려져 있고, 따라서 리포솜 보조제가 본 발명에서 바람직하다.

또한 면역 자극 복합 매트릭스 타입(ISCOM

매트릭스) 보조제는, 특히 이 타입의 보조제가 APCs에 의한 MHC 클래스 II 발현을 상향-조절할 수 있으므로, 본 발명에서 바람직하다. ISCOM

매트릭스는 퀼라야피 사포나리아(Quillaja saponaria), 콜레스테롤 및 포스포리피드로부터 얻은 사포닌(트리테르페노이드)으로 구성된다(임의 분류). 면역원성 단백질과 혼합할 때, 생성된 미립자 배합물은 사포닌 60-70% w/w, 콜레스테롤과 포스포리피드 10-15% w/w 및 단백질 10-15% w/w로 구성되는 ISCOM 입자로서 알려져 있다. 조성물 및 면역자극 복합물에 관련된 상세한 설명은, 예컨대 보조제를 다룬 상기 언급한 교본에서 찾아볼 수 있고, 또한 Barr IG와 Mitchell GF, 1996, Immunol. 및 Cell Biol. 74:8-25 뿐 아니라 Morein B 등, 1995, Clin. Immunother. 3:461-475 (모두 여기서 참조로써 관계함)에서 완전한 면역자극 복합물의 제조에 관한 유용한 정보를 제공한다.

보조 효과를 달성하는 또 다른 매우 흥미로운(그리고 바람직한) 가능성은 Gosselin 등, 1992의 기술을 적용하는 것이다(여기서 참조로써 관계함). 간단하게, 본 발명의 항원과 같은 적절한 항원의 표시는 단구/대식세포상의 Fcγ 수용체에 대하여 항체(또는 항체 단편과 결합한 항원)에 항원을 컨쥬게이팅함으로써 향상될 수 있다. 특히 항원과 항-FcγRI간 컨쥬게이트는 백신화의 용도를 위한 면역원성을 향상시키는 것이 입증되었다.

그밖의 가능성으로는 GDF-8의 변형 형태에서 첫번째 및 두번째 부분에 대한 후보로서 상기 언급한 표적화 및 면역 조절용 물질(즉, 사이토킨)을 이용하는 것을 들 수 있다. 이러한 관계에서, 또한 폴리 I:C와 같은 사이토킨의 합성 유도 인자가 가능하다.

적절한 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전한 프로인즈 보조제, RIBI 및 TDM과 TDE와 같은 트레할로스의 디에스테르로 구성된 군으로부터 선택된다.

적절한 면역 표적화 보조제는 CD40 리간드와 CD40 항체 또는 특이적으로 결합하는 그 단편(cf.상술함), 만노오스, Fab 단편 및 CTLA-4로 구성된 군으로부터 선택된다.

적절한 폴리머 보조제는 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노오스와 같은 탄수화물; 가소성 폴리머; 및 라텍스 비즈와 같은 라텍스로 구성된 군으로부터 선택된다.

면역 반응을 조절하는 또 다른 흥미로운 방법은 "가상의 림프 노드"(VLN)에 GDF-8 면역원(임의로 보조제 및 약리적으로 허용되는 담체와 비히클을 함께)을 끌어들이는 것이다(ImmunoTherapy, Inc.가 개발한 독점 의학 장치, 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN(얇은 관의 장치)은 림프 노드의 구조와 기능을 모방한 것이다. 피부내 VLN의 삽입은 사이토킨과 케모킨의 출현과 함께 무균의 염증 부위를 생산한다. APCs 뿐 아니라 T- 및 B-세포가 위험 시그날에 급속하게 반응하여 염증 부위를 가라앉히고 VLN의 다공성 매트릭스 내부에 축적된다. VLN을 사용하면 항원에 대한 면역 반응을 일으키는데 요구되는 필수적인 항원량이 감소하고, VLN을 이용한 백신화에 의해 야기된 면역 보호의 경우 보조제로서 RiBi를 이용 하는 통상적인 면역화를 능가하는 것으로 보인다. 본 기술은 "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California"에서 Gelber C 등, 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Samll Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node"에 간단하게 기술되어 있다.

백신의 투여는 연간 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 12회인 것으로 예상된다. 보다 구체적으로, 백신은 그것이 요구되는 개체에 일년에, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12회와 같이, 연간 1-12회 투여된다. 본 발명의 바람직한 자가백신을 이용하여 유발된 기억 면역이 영구적이지 않으므로 면역계가 유사체를 이용한 주기적인 추가 접종을 요구한다는 것은 이미 알려져 있다.

유전적 다양성 때문에, 별개의 개체라면 동일한 폴리펩타이드에 대해서도 다른 강도의 면역 반응으로 반응할 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 면역 반응을 증가시키기 위해 여러가지 다른 폴리펩타이드를 함유할 수 있고, 참고로 외래의 T-세포 에피토프 도입의 선택에 관련하여 상기 논의한 바 있다. 백신은 두가지 이상의 폴리펩타이드를 함유하고, 이 때 폴리펩타이드는 상기 정의된 바와 같다.

결과적으로 백신은 3-20의 별개의 변형된 또는 변형되지 않은 폴리펩타이드, 예컨대 3-10의 별개의 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 그러나, 일반적인 폴리펩타이드의 수는, 예컨대 최소 1 또는 2의 폴리펩타이드로 유지된다.

핵산 백신화

전형적인 펩타이드-기재 백신의 투여에 대한 대안으로서, 핵산 백신화 기술( 또한 "핵산 면역화", "유전적 면역화" 및 "유전자 면역화"로 알려진)이 흥미로운 많은 특징을 제공한다.

첫째로, 전통적인 백신 접근과 대조적으로, 핵산 백신화는 면역원 약제의 대량 생산을 소비하는 공급원을 요구하지 않는다(예컨대, 변형된 GDF-8을 생산하는 미생물의 산업적 규모의 발효 형태에서). 더욱이, 정제 장치 및 면역원을 위한 되접힘 설계가 필요없다. 그리고 마지막으로, 도입된 핵산의 발현 생성물을 제공하기 위하여 핵산 백신화가 백신화 개체의 생화학적인 기관에 의존하기 때문에, 발현 생성물의 번역후 최적의 처리가 발생한다고 예상된다; 이것은 상기 기술한대로 원시 GDF-8 B-세포 에피토프의 상당한 부분이 변형된 분자에서 보존되어야 하고, 대체로 B-세포 에피토프가 어떠한 (바이오)분자(예컨대, 탄수화물, 지질, 단백질 등)의 부분에 의해 구성될 수 있기 때문에 자가백신화의 경우 특히 중요하다. 따라서 면역원의 본래 글리코실화 및 지질화 패턴이 전체적인 면역원성에 매우 중요하고 이것은 면역원을 제공하는 숙주를 가짐으로써 가장 잘 보증된다.

그러므로, 본 발명의 바람직한 구체예는 변형된 GDF-8을 코딩하는 핵산(들)을 동물 세포에 도입시킴으로써 면역계에 변형된 GDF-8을 표시하고, 핵산(들)이 도입된 세포에 의해 생체내 발현을 달성하는 것을 포함한다.

이 구체예에서, 도입된 핵산은 네이키드 DNA, 전하 또는 비전하의 지질과 배합된 DNA, 리포솜상에서 배합된 DNA, 바이러스 벡터에 포함된 DNA, 형질도입-촉진 단백질 또는 폴리펩타이드와 배합된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 배합된 DNA, 칼슘 침전제와 배합된 DNA, 불활성 담체 분자와 결합된 DNA 및 보조제와 배합된 DNA의 형태가 될 수 있는 DNA인 것이 바람직하다. 이러한 관계에서, 전통적인 백신 배합물에 보조제를 사용하는 경우 고려되는 모든 실질적인 사항들이 DNA 백신의 배합에 적용된다. 그러므로 폴리펩타이드를 기재로 하는 백신에서 보조제의 사용과 관련하여 언급한 모든 설명이 필요한 변경을 가하여 핵산 백신화 기술에 그 용도를 적용시킬 수 있다.

상기 기술한 폴리펩타이드 기재 백신의 투여 경로 및 투여 설계에서, 이들을 또한 본 발명의 핵산 백신에 적용시킬 수 있고 폴리펩타이드에 대한 투여 경로 및 투여 설계에 부속하는 상기 모든 기술이 필요한 변경을 가하여 핵산에 적용된다. 핵산 백신이 정맥내 및 동맥내로 적절하게 투여될 수 있슴이 부연되어야 한다. 더욱이, 핵산 백신이 소위 유전자 총을 사용하여 투여 가능하다는 것이 당해 분야에 잘 알려져 있고 따라서 또한 이것과 동등한 투여 방법이 본 발명의 일부로써 간주된다. 마지막으로, 우수한 결과를 얻기 위하여 핵산 투여에 VLN을 사용하며, 이 특정한 투여 방법이 특히 바람직하다.

게다가, 면역화 약제로서 이용된 핵산(들)이, 예컨대 유용한 보조제로서 논의한 사이토킨과 같이 상기 기술한 면역조절 물질의 형태로서 첫번째, 두번째 및/또는 세번째 부분을 코딩하는 영역을 포함한다. 이러한 구체예의 바람직한 형태는 유사체의 코딩 영역과 별개의 해독틀(reading frame)에서 또는 적어도 별개 프로모터의 조절하에 면역조절자의 코딩 영역을 갖도록 초래된다. 따라서 유사체 또는 에피토프가 면역조절자의 융합 파트너로서 제공되는 것을 피할 수 있다. 선택적으로, 별개의 두 뉴클레오타이드 단편을 이용할 수 있으나, 두개 모두의 코딩 영역을 동일한 분자에 포함시킬 때 확보되는 공동-발현의 이점 때문에 이것은 보다 덜 바람직하다.

따라서, 본 발명은 또한 GDF-8에 대한 항체의 생산을 유발하는 조성물에 관한 것이고, 그 조성물은

- 본 발명의 핵산 단편 또는 벡터(cf. 벡터의 논의는 후술함), 및

- 상기 기술한 약리적 그리고 면역적으로 허용되는 비히클 및/또는 담체 및/또는 보조제를 함유한다.

표준 환경에서, GDF-8 변종-코딩의 핵산이 벡터 형태로 도입되고, 이 때 발현은 바이러스 프로모터의 조절하에 있다. 본 발명의 벡터에 대한 보다 상세한 설명은 후술한다. 또한 핵산 백신의 배합 및 용도와 관련한 상세한 설명을 Donnelly JJ 등, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:617-648 및 Donnelly JJ 등, 1997, Life Sciences 60:163-172에서 볼 수 있다. 두 참조 모두 여기서 참조로써 관계한다.

생백신

면역계에 대해 변형된 GDF-8 표시를 초래하는 세번째 대안은 생백신 기술을 사용하는 것이다. 생백신화는, 변형된 GDF-8을 코딩하는 핵산 단편 또는 그러한 핵산 단편과 병합된 백터를 이용하여 형질전환된 비-병원성 미생물을 동물에 투여시킴으로써 면역계에 제공을 유발한다. 비-병원성 미생물은 어떠한 적절한 독성약화 박테리아 균주(계대에 의해 또는 재조합 DNA 기술을 이용한 병원성 발현 생성물의 제거에 의해 독성이 약화된) 일 수 있다. 예컨대, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG., 비-병원성 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.), 이. 콜라이(E. coli), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 시겔라(Shigella) 등이 있다. 최고 기술 수준의 생백신의 제조를 다룬 내용이 Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45:1492-1496 및 Walker PD, 1992, Vaccine 10:977-990에 실려있고, 두가지 모두 여기서 참조로써 관계한다. 이러한 생백신에 이용된 핵산 단편과 벡터에 대한 상세한 설명은 후술한다.

박테리아 생백신의 대안으로서, 후술하는 본 발명의 핵산 단편이 백신화되는 동물에서 전염성인 백시니아 종 또는 어떠한 다른 적절한 폭스 바이러스와 같이 무-독성 바이러스 백신 백터에 병합될 수 있다.

당연히, 비-병원성 미생물 또는 바이러스는 동물에 단지 한번 투여되나, 특정한 경우 보호 면역을 유지하기 위해 일생에 한번 이상 투여하는 것이 필요할 것이다. 심지어 폴리펩타이드 백신화에 대해 상기 설명한 면역화 설계가 생백신 또는 바이러스 백신을 이용할 때 유용할 것으로 고려된다.

선택적으로, 생백신화 또는 바이러스 백신화를 사전 또는 후속의 폴리펩타이드 및/또는 핵산 백신화와 겸할 수 있다. 예를 들어, 생백신 또는 바이러스 백신을 이용하여 우선 면역화시키고 이어서 폴리펩타이드 또는 핵산으로 접근하여 후속의 이차 면역화를 진행하는 것이 가능하다.

미생물 또는 바이러스는, 예컨대 유용한 보조제로서 논의한 사이토킨과 같이 상기 기술한 면역 조절 물질의 형태로, 첫번째, 두번째 및/또는 세번째 부분을 코딩하는 영역을 포함하는 핵산(들)을 이용하여 형질 전환시킬 수 있다. 이러한 구체예의 바람직한 형태는 유사체의 코딩 영역과 별개의 해독틀에서 또는 적어도 별개 프로모터의 조절하에 면역조절자의 코딩 영역을 갖도록 초래된다. 따라서 유사체 또는 에피토프가 면역조절자의 융합 파트너로서 제공되는 것을 피할 수 있다. 선택적으로 별개의 두 뉴클레오타이드 단편을 형질 전환제로서 이용할 수 있다. 물론, 동일한 해독틀에서 첫번째 및/또는 두번째 및/또는 세번째 부분을 갖는 것을 본 발명의 발현 생성물, 유사체로서 제공할 수 있고 그러한 구체예가 본 발명에서 특히 바람직하다.

고기의 생산 및 질병 치료에 본 발명을 이용하는 방법

상기의 논의에서 알 수 있듯이, GDF-8 활성을 하향-조절하는 본 발명의 방법에 따라 동물에서 골격 근육의 질량 증가를 촉진할 수 있다. 그러므로, GDF-8 활성을 하향-조절하는 본 방법의 중요한 구체예는 동물 골격의 근육량을 증가시키는 것을 포함하고, 이 방법은 근육량이 유의적으로 증가하는 (95%의 신뢰 수준) 그러한 한도까지, 표준의 GDF-8 활성을 나타내는 대조 동물과 비교할 때 적어도 5%로, 본 방법에 따라 GDF-8 활성을 하향-조절하는 것이다.

근육량의 증가는, 돌연변이 생쥐와 천연 발생의 GDF-8 결핍 동물에서 관찰된 근육량의 증가를 참조로, 예컨대 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 심지어 45%까지, 보다 높은 것이 바람직하다.

총 근육량 및/또는 상대적인 근육량을 측정하는, 당해 분야에 알려진 모든 편리한 방법에 의해 근육량을 측정할 수 있다.

항-GDF-8 백신은 잠재적으로, 명백히 근육 퇴화 현상을 갖는 암성 악액질과 같은 특정 인체 질병을 치료하는데 유용할 수 있고, 이것은 또한 그밖의 위축성 근 육 질병을 치료/개선시킬 수 있는 수단이 된다. 또한 최근의 보고에서 GDF-8의 억제가 급성 및 만성 심장병 환자에 유리하다는 사실이 제안되었다.

본 발명의 펩타이드, 폴리펩타이드 및 조성물

상기 설명에서 명백하듯이, 본 발명은 근육 성장율의 증가를 얻기 위해 GDF-8 항원에 대하여 개체를 면역시키는 발상에 기초한 것이다. 이러한 면역화를 얻는 바람직한 방법은 변형된 GDF-8 형태를 이용하는 것이고, 이로써 이전에 당해 분야에 밝혀지지 않았던 분자를 제공한다.

여기서 논의한 변형된 GDF-8 분자는 본래 독창적인 것이고, 따라서 본 발명의 주요 부분이 동물의 GDF-8로부터 유래된 GDF-8 유사체에 관한 것이며, 이 때 변형되지 않은 GDF-8 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 항체의 생산을 유발하는 유사체를 이용하여 동물의 면역화를 야기시키는 변형이 도입된다. 변형된 GDF-8을 사용하는 경우에 따른 본 방법의 다양한 구체예를 논의할 때, 바람직하게도 이 변형의 특성은 상기 기술한 변형의 타입과 합치된다. 그러므로, 변형된 GDF-8 분자와 관련하여 여기서 기술한 모든 설명이 본 발명의 GDF-8 유사체에 관한 기술로서 또한 적절하며, 모든 설명들이 필요한 변경을 가하여 이들 유사체의 설명에 적용된다.

변형된 GDF-8 분자는, GDF-8와 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 또는 10 이상의 아미노산 길이의 그 서브서열을 갖는 폴리펩타이드를 야기시키는 변형을 포함하는 것이 바람직하다. 보다 높은 서열 동일성, 예컨대 75% 이상 또는 심지어 80 또는 85% 이상의 서열 동일성이 바람직하다. 단백질과 핵산에 대한 서열 동일성은 (N_ref - N_dif) ·100 / N_ref의 식으로 계산할 수 있고, 식 중 N_dif은 정렬시 두 서열간 동일하지 않은 잔기의 총수이고 N_ref는 한 서열의 잔기 수이다. 그러므로, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75%의 서열 동일성을 갖는다( N_dif=2와 N_ref=8).

또한 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 동물에서 자가-단백질인 GDF-8 폴리펩타이드의 면역적으로 유효한 양을 포함하는 면역성 조성물에 관한 것이고, 상기 GDF-8 폴리펩타이드는 GDF-8 폴리펩타이드에 대한 동물의 자가내성을 깨뜨리기 위해 면역적으로 허용되는 보조제와 함께 배합되며, 조성물은 추가로 약리적 그리고 면역적으로 허용되는 비히클 및/또는 담체를 포함한다. 바꾸어 말해, 본 발명의 한 부분은 본 방법의 구체예와 관련하여 기술한 천연 발생의 GDF-8 폴리펩타이드를 이용한 배합물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 정의한 GDF-8 유사체의 면역적으로 유효한 양을 포함하는 면역적 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 추가로 약리적 그리고 면역적으로 허용되는 희석제 및/또는 비히클 및/또는 담체 및/또는 부형제 그리고 임의로 보조제를 포함한다. 바꾸어 말해, 본 발명의 한 부분은, 필수적으로 상기 기술한대로, 변형된 GDF-8의 배합물에 관한 것이다. 보조제, 담체 및 비히클의 선택은, 따라서 GDF-8을 하향-조절하는 본 발명의 방법을 이용하기 위해 변형된 그리고 변형되지 않은 GDF-8의 배합물을 언급하면서 상기 논의한 바에 따른다.

당해 분야에 잘 알려진 방법에 따라 폴리펩타이드를 제조한다. 보다 긴 폴리펩타이드는 당연히 재조합 유전자 기술에 의해 제조한다. 이 기술은 GDF-8 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 적절한 벡터에 도입하고, 벡터를 이용하여 적절한 숙주 세포를 형질전환시키며, 핵산 서열을 발현시키고, 숙주 세포 또는 그 배양 상등액으로부터 발현 생성물을 회수한 후, 후속의 정제 및 임의의 추가 변형, 예컨대 되접힘 또는 유도화시키는 것을 포함한다.

보다 짧은 펩타이드는 잘 알려진 고체- 또는 액체-상 펩타이드 합성 기술에 의해 제조하는 것이 바람직하다. 그러나, 이들 기술의 최근의 진보로 인해 총-길이의 폴리펩타이드 및 단백질의 생산이 가능하고, 따라서 또한 합성 방법에 의해 길이가 긴 구성물을 제조하는 것이 본 발명의 범위내에 있다.

본 발명의 핵산 단편과 벡터

재조합 유전자 기술, 또한 화학적 합성 또는 반합성에 의해 변형된 GDF-8 폴리펩타이드를 제조할 수 있는 것이 상기 설명에 의해 명백하다; 후자의 두 가능성은, 변형이 단백질 담체(예컨대 KLH, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드 및 BSA) 및 탄수화물 폴리머와 같은 비-단백질성 분자와 커플링할 때, 그리고 또한 변형이 GDF-8 폴리펩타이드-유래 펩타이드 사슬에 측쇄 또는 보조기를 첨가시킬 때 특히 적절하다.

재조합 유전자 기술, 또한 핵산 면역화를 위하여, 변형된 GDF-8을 코딩하는 핵산 단편이 중요한 화학 생성물이다. 그러므로, 본 발명의 중요한 한 부분은 GDF-8 유사체를 코딩하는 핵산 단편, 즉 융합 파트너에 첨가 또는 삽입되는 천연의 GDF-8 서열을 포함하는 GDF-8 유래의 폴리펩타이드, 또는 바람직하게는 삽입 및/또는 첨가, 바람직하게는 치환 및/또는 결실에 의해 외래의 T-세포 에피토프로 도입되는 GDF-8 유래의 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 핵산 단편은 정상적으로 적절한 벡터에 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 담지하는 클로닝 또는 발현 벡터를 형성한다; 이러한 신규한 벡터가 또한 본 발명의 일부이다. 이들 벡터의 구조에 관련된 상세한 설명은 후술하는 형질 전환 세포 및 미생물에서 논의할 것이다. 적용 목적과 타입에 따라서 본 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-크로모솜 또는 바이러스의 형태일 수 있고, 또한 특정 세포에서 단지 일시적으로 발현되는 네이키드 DNA가 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터는 자율적으로 복제할 수 있으므로 후속 클로닝의 높은-수준의 발현 또는 높은-수준의 복제를 위해 높은 카피-수를 부여할 수 있다.

본 벡터의 일반적인 개요는 5'→3' 방향과 조작가능한 결합에서 다음 특징들을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 이끄는 프로모터, 임의로 폴리펩타이드 단편의 분비(세포외 상으로, 또는 적용가능하다면 박테리아의 페리플라즈마로) 또는 폴리펩타이드 단편의 막으로의 융합을 가능하게 하는 선도 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 단편 및 임의로 종료 인자를 코딩하는 핵산 서열. 생산 균주 또는 세포주에서 발현 벡터를 조작할 때, 형질 전환 세포의 유전적 안정성을 얻기 위하여 숙주 세포에 도입되는 벡터가 숙주 세포 게놈에 융합되는 것이 바람직하다. 대조적으로, 동물에서 생체내 발현을 초래하기 위해 이용되는 벡터를 다룰 때(즉, DNA 백신화에 벡터를 이용할 때) 벡터가 숙주 세포 게놈에 융합 불가능한 것이 안전성의 이유로 바람직하다; 통상적으로, 네이키드 DNA 또는 비-융합성 바이러스 벡터를 이용하고, 이것은 당업자에게 잘 알려진 선택이다.

본 발명의 벡터는 숙주 세포를 형질 전환시켜 본 발명의 변형된 GDF-8 폴리펩타이드를 생산하는데 이용된다. 또한 본 발명의 일부인 그러한 형질전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편과 벡터를 증식하기 위한 세포 또는 세포주로 배양될 수 있고, 또는 본 발명의 변형된 GDF-8 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해 이용된다. 선택적으로, 형질 전환된 세포는 생백신 균주에 적절하고 이 때 핵산 단편(하나의 단일 또는 다중 카피)이 변형된 GDF-8의 박테리아 막 또는 세포벽에 융합 또는 분비되기 위해 삽입된다.

본 발명의 형질 전환되는 세포는 박테리아(예컨대, 에스체리치아 종(Escherichia)[예컨대 이. 콜라이(E. coli)], 바실러스(Bacillus)[예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)], 살모넬라(Salmonella), 또는 미코박테리움(Mycobacterium)[바람직하게는 비-병원성, 예컨대 엠. 보비스(M. bovis) BCG])와 같은 미생물, 효모(예컨대 사카로마이세스 세리비제(Saccharomyces cerevisiae) 및 원충류인 것이 바람직하다. 선택적으로, 형질 전환되는 세포가 곰팡이, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유류 세포와 같은 다중 세포의 유기체로부터 유래된다. 최근의 성과로는, 시판되는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)의 이용이 본 발명의 IL-5 생산의 재조합 생성물에 대해 우수한 가망성을 보여주었으므로 이 발현 시스템이 본 발명에 특히 바람직하다.

클로닝 및/또는 최적의 발현을 위하여, 형질 전환된 세포가 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 유용한 구체예에서 핵산 단편을 발현시키는 세포를 취한다; 소규모 또는 대량 규모로 변형된 GDF-8을 제조하기 위해 또는 비-병원성 박테리아의 경우, 생백신에서 백신 성분으로서 이들을 이용할 수 있다.

형질 전환된 세포에 의해 본 발명의 변형된 GDF-8을 생산할 때, 비록 필수적인 것은 아니나, 발현 생성물을 배양 배지로 실어내거나 형질 전환된 세포의 표면위로 담지하는 것이 편리하다.

유효한 생산 세포를 동정할 때, 이것에 기초하여 본 발명의 벡터를 담지하고 변형된 GDF-8을 코딩하는 핵산 단편을 발현시키는 안정한 세포주를 확정하는 것이 바람직하다. 바람직하게도, 이 안정한 세포주는 본 발명의 GDF-8 유사체를 분비 또는 담지하여 그 정제를 촉진한다.

일반적으로, 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유래된 조절 서열과 레플리콘을 함유하는 플라스미드 벡터를 숙주와 연결시켜 사용한다. 대개 벡터는 형질 전환된 세포에서 표현형의 선택을 제공할 수 있는 표지 서열 뿐 아니라 복제 부위를 담지한다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)는 통상적으로 E. coli 종으로부터 유래된 플라스미드 pBR322를 이용하여 형질 전환된다(예컨대 Bolivar 등, 1977). pBR322 플라스미드는 암피실린과 테트라시클린 내성을 위한 유전자를 함유하므로 형질 전환된 세포를 동정하기 위한 용이한 방법을 제공한다. pBR 플라스미드, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파지는 원핵 미생물에서 발현을 위해 이용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형되어야 한다.

재조합 DNA 구조에 가장 일반적으로 사용되는 프로모터는 B-락타마제(페니실리나제) 및 락토오스 프로모터 시스템(Chang 등, 1978; Itakura 등, 1977; Goeddel 등, 1979)과 트립토판(trp) 프로모터 시스템이다(Goeddel 등, 1979; EP-A-0 036 776). 이들을 가장 일반적으로 사용하는 한편, 그 밖의 미생물 프로모터가 발견 및 사용되었으며, 당업자가 그들을 플라스미드 벡터와 기능적으로 결찰시키면서 그들의 뉴클레오타이드 서열에 대한 상세한 설명이 공개되었다(Siebwenlist 등, 1980). 원핵 생물의 특정 유전자가 인위적인 방법에 의해 또 다른 프로모터 첨가의 필요성을 배제시키면서 그 자신의 프로모터 서열로부터 이.콜랑이(E. coli)에서 효과적으로 발현될 수 있다.

원핵 생물에 추가하여, 예컨대 효모 배양균과 같은 진핵 생물을 또한 이용할 수 있고, 여기서 프로모터는 발현을 초래할 수 있어야 한다. 비록 수많은 다른 균주를 일반적으로 사용할 수 있으나, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiase) 또는 흔한 제빵용 효모가 원핵 미생물 중 가장 일반적이다. 사카로마이세스(Saccharomyces)의 발현에서, 통상적으로, 예를 들어 플라스미드 YRp7을 이용한다(Stinchcomb 등, 1979; Kingsman 등, 1979; Tschemper 등, 1980). 이 플라스미드는, 예를 들어 ATCC No.44076 또는 PEP-1과 같이 트립토판에서 성장력이 부족한 효모의 변이 균주에 대하여 선택 표지를 제공하는 trp1 유전자를 이미 포함하고 있다(Jones, 1977). 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 장애의 존재는 트립토판을 부재시켜 성장시킴으로써 형질 전환을 탐지하는 유효한 환경을 제공한다.

효모 벡터에서 적절한 촉진 서열은 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 그 밖의 당분해 효소(Hess 등, 1968; Holland 등, 1978), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복시라제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 아이소머라제, 포스포글루코스 아이소머라제 및 글루코키나아제에 대한 프로모터를 포함한다. 적절한 발현 플라스미드의 구성에서, 이들 유전자와 결합한 종료 서열이 또한 mRNA의 폴리아데닐화 및 종료를 제공하기 위해 발현이 소망되는 서열의 발현 벡터 3'에 결찰된다.

성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가적인 이점을 갖는 다른 프로모터로는 알코올 디하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 결합된 붕괴성 효소 및 전술한 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제에 대한 프로모터 영역 및 말토오스와 칼락토스 이용을 초래하는 효소를 들 수 있다. 효모-양립성의 프로모터, 원시의 복제 및 종료 서열을 포함하는 모든 플라스미드 벡터가 적절하다.

미생물에 추가하여, 다중 세포의 유기체로부터 유래된 세포 배양균을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 원칙적으로, 척추 동물 또는 비척추 동물 배양균에 상관없이, 모든 세포 배양균을 이용할 수 있다. 그러나 척추 동물 세포에 가장 큰 관심이 주목되었고, 척추 동물의 배양(조직 배양) 증식이 최근 관례적인 방법이 되었다(Tissue culture, 1973). 이렇게 유용한 숙주 세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포주 및 W138, BHK, COS-7 293, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(SF) 세포(Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. 및 Invitrogen으로부터 완전한 발현 시스템이 시판됨) 및 MDCK 세포주가 있다. 본 발명에서 특히 바람직한 세포주는 Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands의 S₂와 SF₂₁이다.

보통 그러한 세포의 발현 벡터는 (필요하다면) 복제원, 발현되는 유전자의 앞에 위치하는 프로모터, 필수적인 리보솜 결합 부위와 함께 RNA 접목 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종료 서열을 포함한다.

포유류 세포의 이용에서, 발현 벡터상 조절 기능은 종종 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를 들어, 흔히 이용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2 그리고 가장 빈번하게 시미안 바이러스 40(SV40) 으로부터 유래된다. SV40 바이러스의 프로모터는 바이러스로부터 용이하게 단편으로서 얻을 수 있고 또한 SV40 바이러스의 복제원을 포함하기 때문에 특히 유용하다(Fiers 등, 1978). 바이러스의 복제원에 위치하며 HindIII 부위로부터 Bg1I 부위로 확장되는 약 250 bp 서열을 포함한다면, 보다 작거나 보다 큰 SV40 단편을 또한 이용할 수 있다. 추가로 그러한 조절 서열이 숙주 세포 시스템과 양립할 수 있다면, 프로모터를 이용하거나 소망하는 유전자 서열과 정상적으로 결합된 서열을 조절하는 것이 또한 가능하고, 종종 바람직하다.

복제원은, 예컨대 SV40 또는 다른 바이러스(예컨대, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)로부터 유래된 외생 기원을 포함하는 벡터를 구성함으로써 제공하거나 또는 숙주 세포의 염색체 복제 메카니즘에 의해 제공할 수 있다. 벡터가 숙주 세포의 염색체에 합쳐지면, 후자가 종종 충분하다.

유용한 GDF-8 유사체의 동정

원시 GDF-8의 모든 가능한 변종 또는 변형이 원시 형태와 가교-반응성인 동물에서 항체의 유발력을 갖지 않는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 그러나 여기서 논의한 면역 활성의 최소 요구를 만족시키는 변형된 GDF-8 분자에 대한 유효한 표준 스크린을 수행하는 것은 어렵지 않다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 부분은 동물 종에서 변형되지 않은 GDF-8에 대하여 항체를 유발할 수 있는 변형된 GDF-8 폴리펩타이드를 동정하는 방법에 관한 것이고, 이 때 변형되지 않은 GDF-8 폴리펩타이드는 자가-단백질이며, 이 방법은

- 펩타이드 합성 또는 유전 공학 기술에 의해, 상호 별개의 변형된 GDF-8 폴리펩타이드의 세트를 제조하고, 이 때 동물 종의 GDF-8 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 아미노산을 첨가, 삽입, 결실 또는 치환시키고, 그로 인해 동물 종에 대해 외래성인 T-세포 에피토프를 포함하는 세트로 아미노산 서열을 발생시키고,

- 변형되지 않은 GDF-8에 대한 동물 종에 의해 항체 생산의 유발력에 대한 세트의 요소들을 시험하고

- 동물 종에서 변형되지 않은 GDF-8에 대하여 상당한 항체의 생산을 유발하는 세트의 요소(들)을 동정한다.

문맥에서, "상호 별개의 변형된 GDF-8 폴리펩타이드의 세트"는, 예컨대 상기 기술한 기준을 근거(예컨대, 순환 이색성, NMR 분광법 및/또는 X-선 회절 패턴 연구를 공동으로)로 선택된 동일하지 않은 변형된 GDF-8 폴리펩타이드의 집합이다. 이 세트는 단지 몇개의 요소로 구성되나 수백개의 성분을 포함할 수 있다고 고려된다.

적용가능한 한 시험계에서 요소를 코딩하는 핵산 단편을 제조하고 나서, 발현 생성물이 면역원성인지를 측정하기 위해 여기서 기술한 핵산 면역화중에 이 핵산 단편을 이용하는 한에 있어서는, 본 세트를 생체내에서 "제조할 수" 있다. 따라서, 이 세트의 요소에 대한 실험은 생체내에서 수행되나, 수많은 실험관내 실험이 본 발명의 목적에 적합한 변형된 분자의 수를 좁히는데 적용될 수 있다.

외래의 T-세포 에피토프를 도입하는 목적이 T-세포 보조에 의해 B-세포 반응을 지지하는 것이므로, 변형된 GDF-8에 의해 T-세포 증식이 유발되는 것이 필수적이다. T-세포 증식은 실험관내 표준화 증식 분석에 의해 실험될 수 있다. 요컨대, 대상균과 후속의 배양균 유지로 T-세포가 풍부한 샘플을 얻는다. 배양된 T-세포를 변형된 분자에서 이미 취한 대상균의 APCs와 접촉시키고 그 T-세포 에피토프를 표시하도록 그것을 처리한다. T-세포의 증식을 모니터링하고 적절한 대조군과 비교한다(예컨대, 배양균에서 완전한, 고유 GDF-8로 처리한 APCs와 접촉시킨 T-세포). 선택적으로 외래의 T-세포에 대한 그들의 인식에 반응하여 T-세포에 의해 방출된 관련 사이토킨의 농도를 측정함으로써 증식을 평가할 수 있다.

세트의 타입 중 한가지 이상의 변형된 GDF-8이 GDF-8에 대한 항체의 생산을 유발할 수 있는 가능성을 높이기 위하여, 변형되지 않은 GDF-8 폴리펩타이드가 자가-단백질인 동물 종에서 변형되지 않은 GDF-8에 대한 항체를 유발할 수 있는 한가지 이상의 변형된 GDF-8 펩타이드를 포함하는 면역적 조성물을 제조할 수 있고, 그 방법은, 약리적 및 면역적으로 허용되는 담체 및/또는 비히클 및/또는 희석제 및/또는 부형제, 임의로 약리적 및 면역적으로 허용되는 한가지 이상의 보조제와 함께, 동물 종에서 GDF-8에 반응성인 상당한 항체의 생산을 유발하는 세트의 요소(들)를 혼합하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 상기 양상은, 처음에 본 발명의 수많은 상호 별개의 핵산 서열 또는 벡터를 제조하고, 이들을 적절한 발현 벡터에 삽입하며, 벡터를 이용하여 적절한 숙주 세포를 형질 전환시킨 후 본 발명의 핵산 서열을 발현시키는 것으로 편리하게 수행된다. 이들 단계 이후에 발현 생성물의 분리가 뒤따른다. 핵산 서열 및/또는 벡터는 PCR과 같은 분자의 증폭 기술의 실행을 포함하는 방법 또는 핵산 합성에 의해 제조되는 것이 바람직하다.

도 1: 자가백신 구조로 유래된 GDF-8의 모델. 짙은 회색으로 표시된 스트레치는 각각 P2와 P30을 이용한 치환의 발생이 제안되는 스트레치이다.

A: P2 에피토프가 삽입된 모노머 구조. "1"은 109 aa C-말단의 GDF-8 단편의 아미노산 잔자 18-32에 대한 P2 치환이고, "2"는 109 aa C-말단의 GDF-8 단편의 아미노산 잔자 52-66에 대한 P2 치환이며, "3"은 109 aa C-말단의 GDF-8 단편의 아미노산 잔기 83-97에 대한 P2 치환을 나타낸다.

B: P30 에피토프가 삽입된 모노머 구조, "1"은 109 aa C-말단의 GDF-8 단편의 아미노산 잔자 21-41에 대한 P30 치환이고, "2"는 109 aa C-말단의 GDF-8 단편의 아미노산 잔자 49-69에 대한 P30 치환이며, "3"은 109 aa C-말단의 GDF-8 단편의 아미노산 잔기 79-99 또는 84-104에 대한 P30 치환을 나타낸다.

C: 160 aa C-말단의 GDF-8 단편으로 치환된 P2 및 P30를 갖는 확장 모노머 구조.

D: 109 C-말단 중 GDF-8 단편의 두개 카피 사이에 연속으로 결합된 P2 및 P30 에피토프를 갖는 다이머 구조.

도 2: TGF-β 단백질의 예상되는 3D 구조.

이 모델은 TGF-β 단백질에서 얻은 유사체 도메인(TGJ-1)에 기초한다. β-시트는 화살표로 보여지며 실린더와 같은 나선형의 것이다.

실시예에 대한 서론

이.콜라이(E.coli)에서 N-말단의 His-Tag에 융합된 GDF-8의 109 아미노산 잔기 C-말단 영역의 발현을 얻었고 토끼의 면역화를 위해 정제된 융합 단백질을 이용하였다. CHO 세포에서 총-길이의 GDF-8을 발현시켰고, 각각 처리된 그리고 처리되지 않은 GDF-8의 다이머로서 분비된다(McPherron 등, Nature 387, 83-90, 1997). 따라서 후술하는 GDF-8의 자가백신 구조물을 발현시키는데 아무런 문제가 없으리라 예상된다. GDF-8 자가백신 구조물의 생산을 위해 가장 가능성 있는 발현계는 이.콜라이(E.Coli), 효모 피.파스토리스(P.pastoris) 및 CHO 세포, 그리고 상기 언급한 드로소필라(Drosophila) 세포와 같은 곤충 세포이다.

실시예 1

백신 설계

본 발명의 이론적 근거는 표적 단백질에서 아미노산 잔기의 스트레치 대신에 외래 또는 인공 T-세포 에피토프, 예컨대 난교잡성 파상풍 톡신 T-세포 에피토프 P2 및 P30을 이용하는 것이다. 바람직하게도 이러한 대용은 표적 단백질의 인증된 삼차 구조를 단지 극소하게 방해할 뿐이다.

여기서 표적 단백질은 GDF-8의 109 아미노산 잔기 C-말단의 영역이고, 이 호모다이머는 GDF-8의 생물적 활성 형태로 예상된다. 이 GDF-8 영역의 삼-차원 구조는 알려져 있지 않으나 도 2에 표시한 모노머 GDF-8의 동형 TGF-β 단백질 구조를 기초로 하여 상당히 실제에 근접한 구조를 예상할 수 있다. 야생형 GDF-β(wt)의 모델에서 α-헬릭스는 실린더로서, β-시트는 화살표로 표시된다. 따라서 시스테인-잔기와 디술파이드-결합은 구조내에서 매우 근접하게 위치한다.

GDF-8의 109 아미노산 잔기 C-말단의 영역내에 비교적 많은 수의 시스테인(9)과 디술파이드-결합이 존재하기 때문에 외래의 T-세포 에피토프가 위치할 수 있는 부위가 제한됨을 명심해야 한다.

게다가 치환없이 GDF-8의 109 아미노산 잔기 C-말단 영역을 생성하기 위해 (즉, SEQ ID NOs:1-10의 잔기 267-375), 다음의 GDF-8 자가백신 구조물이 제안된다.

GDF-8 P2-1 (SEQ ID NO:15)는 P2에 의해 치환된 아미노산 잔기 18-32를 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 P2-2 (SEQ ID NO:16)는 P2에 의해 치환된 아미노산 잔기 52-66을 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 P2-3 (SEQ ID NO:17)는 P2에 의해 치환된 아미노산 잔기 83-97을 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 P30-1 (SEQ ID NO:18)는 P30에 의해 치환된 아미노산 잔기 21-41을 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 P30-2 (SEQ ID NO:19)는 P30에 의해 치환된 아미노산 잔기 49-69를 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 P30-3A (SEQ ID NO:20)는 P30에 의해 치환된 아미노산 잔기 79-99를 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 P30-3B (SEQ ID NO:21)는 P30에 의해 치환된 아미노산 잔기 84-104를 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 다이머 (SEQ ID NO:22)는 P2 및 P30 에피토프를 통해 공유적으로 결합된 GDF-8의 109 아미노산 잔기 C-말단 영역의 두 카피이다. 바꾸어 말해 이 분자는 2개의 반(halves)으로 구성된다. 첫번째 반은 그 C-말단에 융합된 P2를 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역인 한편, 두번째 반은 그 N-말단에 융합된 P30을 갖는 GDF-8의 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

GDF-8 ext (SEQ ID NO:23)는 P30에 의해 치환된 잔기 16-36과 P2에 의해 치환된 잔기 37-51을 갖는 GDF-8의 160 아미노산 잔기로 구성된다. 이 구조물은 P2와 P30 에피토프 모두를 포함하는 N-말단 확장을 갖는 109 아미노산 잔기의 C-말단 영역이다.

후자 2를 제외한 모든 예시적인 구조물에서, 디술파이드-결합의 형성을 통한 다이머화를 피할 수 있도록 Cys73이 Ser로 치환된 변종을 생성한다고 여겨진다. GDF-8 ext에서, 상응하는 위치에서 유사한 치환의 수행이 예상된다(즉, Cys124 → Ser124).

실시예 2

시험관내 모델

상술한대로 정제된 GDF-8 변종을 이용하여 생쥐를 초기 면역화시킨다. 그 다음, 예컨대 비-변형된 GDF-8 분자를 항원으로 이용하여 ELISA에서 세개의 면역화 항체를 측정한다. 이렇게 초기 실험을 하는 주된 이유는 항-GDF-8 교차 반응성 자가항체를 생성하는데 AutoVac™ 기술이 적용가능하지를 확인하고, 중요하게 최적의 복용량과 면역화 방법을 확인하기 위해서이다. 그러나 이러한 반응의 기본이 되는 면역 메카니즘이 TNFα에서 이미 관찰된 것과 거의 동일하므로 본 기술의 이용시 GDF-8에 대한 항체가 발생하지 않는다면 그것은 매우 놀라운 일이다, cf. WO 98/46642 및 WO 95/05849.

실시예 3

생체내 모델

실시예 1에서 기술한 다양한 구조물을 이용하여 생쥐군을 면역화시킨다. 백신에 반응하기 위해서는 면역 적격이어야 하므로 생쥐는 약 4주령일 때 면역화된다. 프로인즈의 완전 보조제를 이용하나, 또한 이전에 TNFα 자가백신 구조물을 이용한 혼합중에 성공적으로 이용되었던, Adjuphos™과 같은 알룸(alum) 보조제를 이용하여 실험을 수행할 수 있다. Adjuphos™은 인체용 및 동물용 두가지 모두로 가능하다. 총 면역화 기간 중 대조군 뿐 아니라 면역화된 GDF-8의 총 체중을 규칙적으로 모니터링한다. 생쥐가 약 16주령일 때, 이들을 치사시키고 그 근육량을 정량한다.

생쥐가 면역 적격이긴 하나 완전히 자라지 않은 상태에서의 비교적 짧은 실행 기간으로 인해, 이들 동물 중 항-GDF-8 백신화의 효과를 입증하기란 어려울 것이다. 사실로 판명되면, 선택적으로 래트 또는 보다 큰 동물, 예컨대 돼지, 소 등을 면역화시키는 것을 고려할 수 있다.

임상적인 전개를 위해 동물의 성장율 및/또는 최대 근육 크기를 우세하게 증가시키는 변형된 GDF-8 분자를 선택한다.

SEQUENCE LISTING <110> PHARMEXA A/S <120> Method for down-regulating GDF-8 activity <130> KP-CH-014601/YJB <160> 23 <170> KOPatentIn 1.71 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Meleagris gallopavo <400> 2 Met Gln Ile Leu Val His Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro 1 5 10 15 Thr Glu Asn Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg 20 25 30 Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu 35 40 45 Ser Lys Leu Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile 50 55 60 Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln 65 70 75 80 Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp 85 90 95 Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser 100 105 110 Asp Phe Leu Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys 115 120 125 Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp 130 135 140 Ile Tyr Leu Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile 165 170 175 Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser 180 185 190 Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser 195 200 205 Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu 210 215 220 Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu 225 230 235 240 Glu Val Arg Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly 245 250 255 Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro 260 265 270 Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro 275 280 285 Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe 290 295 300 Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg 305 310 315 320 Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn 325 330 335 Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro 340 345 350 Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 355 360 <210> 3 <211> 375 <212> PRT <213> Gallus sp. <400> 3 Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile 1 5 10 15 Ala Val Asp Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn 20 25 30 Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 4 <211> 376 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Met Gln Lys Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu 20 25 30 Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr 100 105 110 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 115 120 125 Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 130 135 140 Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg 165 170 175 Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser 180 185 190 Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp 195 200 205 Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu 210 215 220 Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val 225 230 235 240 Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val 245 250 255 Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 260 265 270 Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 275 280 285 Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg 290 295 300 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln 305 310 315 320 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser 325 330 335 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu 340 345 350 Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met 355 360 365 Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 5 <211> 375 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 5 Met Gln Lys Leu Gln Ile Ser Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr 35 40 45 Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gln Phe Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Arg Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125 Thr Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Glu Gly Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 6 <211> 375 <212> PRT <213> Ovis sp. <400> 6 Met Gln Lys Leu Gln Ile Phe Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Lys Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Gln Asn Asn 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Val Thr Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125 Ala Glu Val Gln Glu Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln His Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Glu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Leu Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 7 <211> 376 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 7 Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala 20 25 30 Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr 100 105 110 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 115 120 125 Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 130 135 140 Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg 165 170 175 Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser 180 185 190 Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp 195 200 205 Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu 210 215 220 Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val 225 230 235 240 Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val 245 250 255 Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 260 265 270 Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 275 280 285 Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg 290 295 300 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln 305 310 315 320 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser 325 330 335 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu 340 345 350 Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met 355 360 365 Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 8 <211> 375 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 8 Met Gln Lys Leu Gln Ile Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Met Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125 Met Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 9 <211> 374 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 9 Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys 1 5 10 15 Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr 20 25 30 Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His 35 40 45 Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys 50 55 60 Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp 85 90 95 Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu 100 105 110 His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro 115 120 125 Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser 130 135 140 Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His 145 150 155 160 Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg 165 170 175 Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys 180 185 190 Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys 195 200 205 Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile 210 215 220 Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser 225 230 235 240 Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile 245 250 255 Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp 260 265 270 Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 275 280 285 Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys 290 295 300 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr 305 310 315 320 Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly 325 330 335 Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe 340 345 350 Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val 355 360 365 Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 <210> 10 <211> 375 <212> PRT <213> Papio hamadryas <400> 10 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Leu Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(109) <223> Identical to residues 267-375 in SEQ ID NO: 1 <400> 11 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(109) <223> Identical to residues 267-375 in SEQ ID NO: 5 <400> 12 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu Gly Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 13 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 14 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 15 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (18)..(32) <223> Tetanus toxoid P2 epitope (SEQ ID NO: 13) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(17) <223> Identical to residues 267-283 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (33)..(109) <223> Identical to residues 299-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (73) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 15 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 16 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (52)..(66) <223> Tetanus toxoid P2 epitope (SEQ ID NO: 13) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(51) <223> Identical to residues 267-317 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (67)..(109) <223> Identical to residues 333-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (73) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 16 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr 50 55 60 Glu Leu Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (83)..(97) <223> Tetanus toxoid P2 epitope (SEQ ID NO: 13) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(82) <223> Identical to residues 267-348 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (98)..(109) <223> Identical to residues 364-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (73) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 17 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 85 90 95 Leu Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 18 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (21)..(41) <223> Tetanus toxoid P30 epitope (SEQ ID NO: 14) <220> <221> SIMILAR <222> (42)..(109) <223> Identical to residues 307-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (42)..(109) <223> Identical to residues 308-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (73) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 18 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val 20 25 30 Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 19 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (49)..(69) <223> Tetanus toxoid P30 epitope (SEQ ID NO: 14) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(48) <223> Identical to residues 267-314 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (70)..(109) <223> Identical to residues 336-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (73) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 19 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 50 55 60 Ala Ser His Leu Glu Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 20 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (79)..(99) <223> Tetanus toxoid P30 epitope (SEQ ID NO: 14) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(78) <223> Identical to residues 267-345 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (100)..(109) <223> Identical to residues 366-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (73) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 20 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Phe Asn 65 70 75 80 Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser 85 90 95 His Leu Glu Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 21 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (84)..(104) <223> Tetanus toxoid P30 epitope (SEQ ID NO: 14) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(83) <223> Identical to residues 267-349 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (105)..(109) <223> Identical to residues 371-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (73) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 21 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro 85 90 95 Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 22 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> SIMILAR <222> (110)..(124) <223> Tetanus toxoid P2 epitope (SEQ ID NO: 13) <220> <221> SIMILAR <222> (125)..(145) <223> Diptheria toxoid P30 epitope (SEQ ID NO: 14) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(109) <223> 109 C-terminal residues of human and bovine GDF-8 (residues 267-375 in SEQ ID NO: 1) <220> <221> SIMILAR <222> (146)..(254) <223> 109 C-terminal residues of human and bovine GDF-8 (residues 267-375 in SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (90)..(91) <223> Lys Glu or Glu Gly <220> <221> SITE <222> (235)..(236) <223> Identical to (90)..(91) <400> 22 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser Gln Tyr Ile 100 105 110 Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe 115 120 125 Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu 130 135 140 Glu Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys 145 150 155 160 Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp 165 170 175 Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys 180 185 190 Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln 195 200 205 Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met 210 215 220 Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr 225 230 235 240 Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 245 250 <210> 23 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (16)..(36) <223> Tetanus toxoid P30 epitope (SEQ ID NO: 14) <220> <221> MUTAGEN <222> (37)..(51) <223> Tetanus toxoid P2 epitope (SEQ ID NO: 13) <220> <221> SIMILAR <222> (1)..(15) <223> Identical to residues 216-230 of SEQ ID NO: 1 <220> <221> SIMILAR <222> (52)..(160) <223> Identical to residues 267-375 of SEQ ID NO: 1 <220> <221> SITE <222> (124) <223> Cys or Ser <220> <221> SITE <222> (141)..(142) <223> Lys Glu or Glu Gly <400> 23 Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Phe 1 5 10 15 Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala 20 25 30 Ser His Leu Glu Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile 35 40 45 Thr Glu Leu Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser 50 55 60 Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp 65 70 75 80 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly 85 90 95 Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val 100 105 110 His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr 115 120 125 Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 145 150 155 160

Claims

서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 또는 79-104 잔기들로부터 선택된 위치들이 외래 T_H 에피토프로 적어도 두 번 치환되거나;

서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 또는 105-109의 잔기들로부터 선택된 적어도 어느 한 위치에 외래 T_H 에피토프가 삽입된 GDF-8 폴리펩타이드.
제1항의 GDF-8 폴리펩타이드를 면역학적으로 유효한 양으로 포함하는, GDF-8 활성을 생체 내 하향조절하여 동물의 근육량 증강용 면역 조성물로서,

약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체, 베히클 또는 그들의 혼합물, 및 어쥬번트를 더 포함하는 것인 면역 조성물.
제2항에 있어서, 상기 어쥬번트는 면역 표적화 어쥬번트; 톡신, 사이토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조절 어쥬번트; 오일 배합물; 폴리머; 미셀 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; γ-이눌린; 및 캡슐화 어쥬번트로 구성되는 군에서 선택되는 것인 면역 조성물.
서열번호 12의 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 또는 79-104 잔기들로부터 선택된 위치들이 외래 T_H 에피토프로 적어도 두 번 치환되거나;

서열번호 12의 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 또는 105-109의 잔기들로부터 선택된 적어도 어느 한 위치에 외래 T_H 에피토프가 삽입된 GDF-8 폴리펩타이드.
제4항에 있어서, 상기 치환 또는 삽입은 서열번호 12의 18-41 잔기들에서 일어나는 것인 GDF-8 폴리펩타이드.
서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 또는 79-104 잔기들 중의 적어도 한 위치가 외래 T_H 에피토프로의 치환;

서열번호 11 또는 12의 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 또는 105-109 잔기들 중에서 적어도 한 위치에 외래 T_H 에피토프의 삽입;

서열번호 11 또는 12의 GDF-8 폴리펩타이드 내 루프 영역(loop area) 또는 탄력성 말단(flexible terminus)을 외래 T_H 에피토프로의 치환;

서열번호 11 또는 12의 GDF-8 폴리펩타이드 내 루프 영역 또는 탄력성 말단에 외래 T_H 에피토프의 삽입;

중에서 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 삽입이 일어나는 GDF-8 폴리펩타이드로서,

여기에서 아미노산 삽입 및 치환의 수는 60을 초과하지 않는 것인 GDF-8 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 외래 T_H 에피토프는 삽입에 의해 도입되는 것인 GDF-8 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 외래 T_H 에피토프는 치환에 의해 도입되는 것인 GDF-8 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 외래 T_H 에피토프는 난교잡성(promiscuous)인 것인 GDF-8 폴리펩타이드.
제6항의 GDF-8 폴리펩타이드를 면역학적 유효량으로 포함하는, GDF-8 활성을 생체 내 하향조절하여 동물의 근육량 증강용 면역 조성물로서,

약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체, 베히클 또는 그들의 혼합물, 및 어쥬번트를 더 포함하는 것인 면역 조성물.
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