CZ20013709A3 - Analog interleukinu 5, fragment nukleové kyseliny, vektor, buňka, přípravky a pouľití - Google Patents

Analog interleukinu 5, fragment nukleové kyseliny, vektor, buňka, přípravky a pouľití Download PDF

Info

Publication number
CZ20013709A3
CZ20013709A3 CZ20013709A CZ20013709A CZ20013709A3 CZ 20013709 A3 CZ20013709 A3 CZ 20013709A3 CZ 20013709 A CZ20013709 A CZ 20013709A CZ 20013709 A CZ20013709 A CZ 20013709A CZ 20013709 A3 CZ20013709 A3 CZ 20013709A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
interleukin
epitope
analogue
group
cell
Prior art date
Application number
CZ20013709A
Other languages
English (en)
Inventor
Steen Klysner
Original Assignee
Pharmexa A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmexa A/S filed Critical Pharmexa A/S
Publication of CZ20013709A3 publication Critical patent/CZ20013709A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Analog interleukinu 5 (IL5), který pochází z IL5 polypeptidu zvířete, do kterého je zavedena modifikace, která má za následek, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidu a kde se modifikace týká substituce aúnebo inzerce a/nebo delece aminokyseliny kterékoliv z kliček 1 až 3 nebo C-konce helixu D IL5, kde uvedené kličky a helix D odpovídají těm, které jsou znázorněny na obr. 3 pro lidský a myší IL5. Řešení je využitelné pro zlepšení léčby a prevence chorobných stavů charakterizovaných zvýšenou hladinou eosinofilních leukocytů, tj. chorobných stavů jako je astma a další chronická alergická onemocnění. Je poskytnut způsob downregulace interleukinu 5 (IL5) umožněním produkce protilátek proti 115, a tím snížení stupně aktivity eosinoftlů. řešení také poskytuje způsoby výroby modifikovaného IL5, modifikovaný IL5, fragmenty nukleové kyseliny kódující modifikovaný IL5, vektory obsahující tyto fragmenty a jimi transformované hostitelské buňky a buněčné linie, způsob identifikace IL5 analogů, přípravky obsahující modifikovaný IL5 nebo nukleové kyseliny kódující IL5 analogy.
··
4 · 4 · · · ··
444 4 · · · · ·
Analog interleukinu 5, fragment buňka, přípravky a použití
....... Ww-M
Gfe>
nukleové kyseliny, vektor,
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká zlepšení terapie a prevence chorobných .stavů charakterizovaných zvýšenou hladinou eosinofilních leukocytů, tj . chorobných stavů, jako je například astma a další chronická alergická onemocněni. Konkrétněji předkládaný vynález poskytuje způsob snižování počtu receptorů (down-regulace) interleukinu 5 (IL5) umožněním produkce protilátek proti IL5, a tím snížení stupně aktivity eosinofilů. Vynález také poskytuje způsoby výroby modifikovaného IL5 použitelného v tomto způsobu, a také samotného modifikovaného IL5. Předkládaný vynález se také týká fragmentů ngkleové kyseliny kódující modifikovaný IL5, vektorů obsahujících tyto fragmenty nukleové kyseliny a hostitelských buněk a buněčných linii jimi transformovaných. Vynález také poskytuje způsob identifikace IL5 analogů, které jsou použitelné ve způsobu podle vynálezu, a dále přípravky obsahující modifikovaný IL5 nebo obsahující nukleové kyseliny kódující analogy IL5.
Dosavadní stav techniky
Astma je běžná nemoc dýchacích cest, postihující přibližně 10% populace. Současná léčba je primárně založena na podávání steroidů a představuje cenu na trhu přesahující dobře miliardu dolarů. Zatím z neznámých důvodů se v průběhu posledních dvou dekád na celém světě zvýšila incidence a morbidita astmatiků. V současnosti poskytuje zlepšené
porozumění imunologickým mechanismům zapojeným do astmatických stavů spojené s bouřlivým rozvojem biotechnologie novou základnu pro rozvoj alternativních a snad lepších léčebných strategií.
Bylo prokázáno, že obecným charakteristickým rysem patogeneze astmatu a dalších chronických alergických onemocnění je zvýšený počet eosinofilů, obzvláště v bronchiál.ní sliznici plic. Po aktivaci eosinofily sekretují velký počet mediátorů, které jsou aktivně zapojeny do zánětlivé reakce dýchacích cest. V aktivaci eosinofilů má důležitou úlohu interleukin 5 (IL5).
IL5 je cytokin zjištěný u mnoha druhů savců a mezi jinými byly klonovány jak humánní tak myší gen pro IL5 (Tanabe et al., 1987, Campbell et al., 1988). humánní gen se skládá ze čtyř exonů s třemi introny umístěnými na chromozomu 5 a kóduje prekurzor s 134 aminokyselinovými zbytky, včetně 19 aminokyselin N-koncové vedoucí sekvence, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 62. Posttranslační štěpení dává vznik zralému proteinu se 115 aminokyselinovými zbytky (sekv. id. č. 1) . myší gen IL5 (mIL5) podobně kóduje prekurzor se 133 aminokyselinovými zbytky s vedoucí sekvencí s 20 aminokyselinami, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 64. Opracovaný zralý mIL5 je tedy dlouhý 113 aminokyselinových zbytků (sekv. id. č. 12), postrádá dva N-koncové aminokyselinové zbytky v porovnání s humánním IL5. aminokyselinové sekvence hIL5 a mTL5 jsou ze 70 % totožné ve srovnání se 77 % identity na úrovni nukleotidů kódujících úseků (Azuma et,l., 1986). Větší podobnost byla publikována mezi humánními primáty, 99% identita byla publikována pro kódující úseky humánní nukleotidové sekvence a nukleotidové sekvence opice Rhesus (Villinger et al., 1995).
·· ··· • · • · · · • · ·· • · · · * a ·
Humánní aminokyselinová sekvence má dvě potenciální místa N-glykosylace a myší sekvence tři. Bylo prokázáno, že humánní IL5 je jak N-glykosylovaný, tak také O-glykosylovaný, a to v pozici Thr 3. Studie hIL5 prokázaly, že glykosylace není pro biologickou aktivitu nezbytná dokonce i když se zdá, že je stabilita ovlivněna deglykosylací (Tominaga et al., 1990, Kodama et al., 1993).
Struktura IL5
Aktivní IL5 je homodimer a rentgenovou krystalografií byla zjištěna trojrozměrná struktura rekombinantního hIL5 (Milburn et al., 1993). 2 monomery jsou organizovány antiparalelně a kovalentně vázány dvěma meziřetězcovými disulfidovými můstky (44-87' a 87-44'), zapojují tedy všechny 4 cysteiny 2 monomerů.
Sekundární struktura monomerů se skládá ze 4 a-helixů (A-D) přerušených 3 spojovacími úseky (kličky) včetně dvou krátkých úseků se strukturou β-listů. Tento svazek 4a helixů je znám jako společný sklad cytokinů , který byl také publikován pro IL-2, IL-4, GM-CSF a M-CSF. Ale ty všechny jsou monomery a struktura homodimeru, kde D-helíx doplňuje motiv 4a helixů protilehlého monomeru je unikátní pro IL5.
Bylo prokázáno, že nativní monomery samotné jsou biologicky inaktivní (přehledy viz Callard & Gearing, 1994, Takutsu et al., 1997). Nicméně je možné vytvořit modifikovaný rekombinantní biologicky aktivní monomer zavedením dalších 8 aminokyselinových zbytků do kličky 3, spojujících helixy C a D. To umožní, že helix D doplní strukturu 4 helixů v jednom polypeptidovém řetězci, a tedy umožní, že monomer interaguje se svým receptorem (Dickason & Huston, 1996, Dickason et al., 1996).
♦ · ···· • · • · · · • · ·
Receptor IL5 se primárně vyskytuje na eosinofilech a je složen z α-řetězce a β-řetězce. α-řetězec receptorů je specifický pro IL5 a β-řetězec, který zajišťuje vysokou afinitu vazby a signální transdukci, je sdílen s heterodimerovými receptory pro IL-3 a GM-CSF. Sdílení receptorové složky by mohlo být důvodem pro zkříženou kompetici pozorovanou mezi IL5. IL-3 a GM-CSF (přehled viz Lopez et al., 1992). Ale nedávno bylo prokázáno, že regulace IL5R je odlišná od regulace IL-3R a GM-CSFR, což dále ukazuje vysoce specializovanou úlohu IL5 v regulaci eosinofilní reakce (Wang et al., 1998).
Zdá se, že C-koncová část IL5 je důležitá jak pro vazbu k IL5R, tak pro biologickou aktivitu, protože odstranění více než dvou C-koncových aminokyselinových zbytků má za následek pokles jak afinity vazby k IL5R, tak biologické aktivity v biologických testech pro IL5 (Proudfoot et al., 1996). Bylo zjištěno, že pro vazbu k receptorů jsou důležité také další zbytky, jako je například Glul2, který je zapojen do vazby k β-řetězci, zatímco zbytky Arg90 a Glul09 jsou zapojen do vazby k α-řetězci receptorů. Obecně se zdá, že vazba k IL5R nastává v úsecích překrývajících se helixů A a D, kde helix D je primárně odpovědný za vazbu ke specifickému α-řetšzci IL5R (Graber et al., 1995, Takastsu et al., 1997).
Homologie IL5's s jinými proteiny
Tyto dva motivy 4-helixové domény pozorované v homodimeru mají nápadně podobnou sekundární a terciární strukturu ve srovnání k cytokinovým skladem nalezeným u GMCSF a M-CSF, IL-2, IL-4 a humánní a prasečím růstovým hormonem (Milburn et al., 1993). Ale i když je nápadná podobnost také pozorována v organizaci intronů a exonů a • · poloze cysteinů (Tanabe et al., 1987, Cambell et al., 1988), což svědčí pro fylogenetický vztah s IL-2, IL-4 a GM-CSF, nebyla pozorována významná homologie s žádným z těchto cytokinů nebo dalšími cytokiny z aminokyselinové sekvence.
Biologická aktivita IL5
IL5 je hlavně sekretován plně diferencovanými buňkami Th2, žírnými buňkami a eosinofily (Cousins et al., 1994, Takutsu et al., 1997). Bylo prokázáno, že působí na eosinofily, basofily, cytotoxické T lymfocyty a na myší B lymfocyty (Callard & Gearing, 1994, Takutsu et al., 1997). účinky IL5 na humánní B lymfocyty jsou ještě předmětem polemiky. Bylo prokázáno zvýšení syntézy imunoglobulinů za určitých okolností a vazba celé řadě humánních B buněčných linií. Dokonce i když byla v humánních B lymfocytech zjištěna mRNA pro hIL5R, skutečná přítomnost receptoru na těchto buňkách ještě musí být ověřena (Baumann & Paul, 1997, Huston et al., 1996).
Účinky IL5 na eosinofily zahrnují chemotaxi, zvýšenou adhezi k endotelovým buňkám, aktivaci a konečnou diferenciaci buněk. Dále bylo prokázáno, že IL5 předchází apoptóze zralých eosinofilů (Yamaguchi et al., 1991). Tato zjištění přispěla k současné představě, že IL5 je nejdůležitější cytokin pro diferenciaci eosinofilů (Corrigan & Kay, 1996, Karlen et al., 1998).
Fyziologicky se uvažuje, že IL5 a s ním spojená aktivace eosinofilů slouží ochranné úloze proti hlístovým infekcím a možná proti určitým nádorům, protože tato onemocnění jsou typicky doprovázena eosinofilií periferní krve (Takutsu et al., 1997, Sanderson et al., 1992). Je to ale poněkud spekulativní, protože ve dvou studiích tito autoři • · · • · · · · · • · · · · · » · ·
I · · · · ι · l · <
9 9 9 9
99
9 · • · 9 9
9 9
9 9999 neprokázali žádný účinek kromě snížení počtu receptorů eosinofilů po podávání protilátky proti IL5 na imunitu (např. hladiny IgE) proti Nippostrongylus braziliensis nebo Schistosoma mansoni u myší infikovaných těmito parazity (Sher et al., 1990, Coffman et al., 1989).
IL5 transgenní zvířata a „knock-out zvířata
Studie na transgenních myších exprimujících IL5 nebo „knock-out myších bez genu pro IL5 podaly další znalosti o fyziologické úloze IL5.
Bylo publikováno několik IL5 transgenních myší:
Bylo publikováno, že transgenní myši exprimující gen IL5 v T iymfocytech měly zvýšený počet bílých krvinek charakterizovaný expanzí B220+ B lymfocytů a významnou eosinofilií. To bylo doprovázeno masivním buněčným exsudátem do břišní dutiny, kde z buněk převládaly eosinofily a infiltrací eosinofilů v téměř všech orgánových systémech (Lee et al., 1997a).
Pro další transgenní myši exprimující gen IL5 pod kontrolou metalothioninového promotoru bylo charakteristické zvýšení sérových hladin IgM a IgA, masivní eosinofilie v periferní krvi a mnoha dalších orgánech doprovázená expanzí zřetelné CD5+ B lymfocytové populace, která tvořila autoprotilátky (Tominaga et al., 1991).
Třetí studie se týkala transgenních myší konstitutivně exprimujících IL5 v plicích. U těchto zvířat se vyvinuly patofyziologické změny podobné změnám u humánního astmatu, včetně eosinofilní invaze peribronchiálních prostorů, hypertrofie epitelu a zvýšené produkce hlenu. Kromě toho byl pozorován rozvoj nadměrné vnímavosti dýchacích cest v nepřítomnosti antigenů (Lee et al., 1997b).
··**
Byly také studovány myši s nefunkčním IL5 (tzv. „knockout myši). Tyto myši (C57BL/6) nemají žádné zjevné příznaky nemoci a jsou fertilní. Hladiny imunoglobulinů a specifické protilátkové reakce na DNP-OVA byly normální. Jsou vytvářeny bazální hladiny eosinofilů, ale jsou 2-3 krát nižší než u kontrolních zvířat, což ukazuje, že eosinofily mohou být vytvářeny při úplné absenci IL5. Když byly tyto myši infikovány Mesocestoides corti, normálně pozorovaná eosinofilie byla odstraněna, a tato absence eosinofilie nepůsobila na infekci červy tvořenou tímto parazitem (Kopf et al., 1996).
Ve studii autorů Foster et al. (1996) byl zkoumán účinek IL5 „knock-out na běžný model atopického zánětu dýchacích cest. Senzitizace a aerosolový podnět myší ovalbuminem má normálně za následek eosinofilii v dýchacích cestách, hyperreaktivitu dýchacích cest na β-methacholin a rozsáhlé poškození plic, což je analogické změnám pozorovaným u astmatu. U myší s deficitem IL5 eosinofilie, hyperreaktivita dýchacích cest a poškození plic nenastaly. Když byla exprese IL5 u těchto myší obnovena, byla aero-alergenem indukovaná eosinofilie a dysfunkce dýchacích cest znovu navrácena.
Patofyziologická úloha IL5
Astma postihuje přibližně 10 % populace na celém světě a z doposud neznámých důvodů se v posledních dvou dekádách incidence a morbidita zvyšují (Ortega & Busse, 1997). Je to chronické onemocnění dýchacích cest charakterizované opakující se a obvykle reverzibilní obstrukcí proudění vzduchu, zánětem a nadměrnou vnímavostí (Moxam a Costello, 1990). To tvoří symptomy sípání a dušnosti, které mohou být ve vážných případech fatální.
• Φ ♦ φ φφφφ «· ·· • « · ♦ « φ · • φ φ • φ · •· φφφφ
Pokusy se zvířaty uvedené výše používající transgenní myši konstitutivně exprimující IL5 v plicích (Lee et al., 1997a) a knock-out myši s deficitem IL5 (Foster et al., 1996) výrazně podporují úlohu IL5 v patogeneze astmatu. Další důkazy toto podporující mohou být odvozeny z několika studií s astmatiky. Eosinofilie byla identifikována v tekutině bronchoalveolární laváže (BAL) a v biopsiích bronchiální sliznice pacientů s astmatem a koreluje se závažností nemoci, u pacientů s astmatem bylo v tekutině BAL identifikováno několik produktů eosinofilů a počty eosinofilů v periferní krvi korelují se závažností astmatu (Ortega & Busse 1997) .
Bylo zjištěno, že sérová koncentrace IL5 byla zvýšena (střední hodnota koncentrace 150 pg/ml) u 15 z 29 pacientů s chronickým vážným astmatem ve srovnání s kontrolními osobami (Alexander et al., 1994).
V další studii zahrnující jak neatopické, tak atopické astmatiky, bylo zjištěno, že zvýšená produkce IL5 pomocnými T lymfocyty způsobovala eosinofilní zánět u atopického i neatopického astmatu (Moři et al., 1997).
Další výsledky také ukazují, že IL5 má nespornou úlohu u dalších atopických onemocnění. Nedávno bylo prokázáno, že alergenem indukované systémové epizody u osob s alergickou rýmou korelují spíše s alergenem indukovanou syntézou IL5 než IgE (Ohashi et al., 1998). Korelace atopických reakcí byla také prokázána ve studii autorů Barata et al. (1998), kde byla prokázána významná exprese IL5 T lymfocyty v pozdní fázi kožní reakce.
Tyto a další výsledky vedly několik autorů, jako
Corrigan & Kay (1996), Danzig & Cuss (1997) k identifikaci a doporučení IL5 jako primárního cíle v rozvoji lepší léčby astmatu a atopických onemocnění zahrnujících eosinofilní zánět. Chronická hypereosinofilie poškozující tkáň indukovaná ·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · ·· · · parazitární infekcí, topická plicní eosinofilie a hypereosinofilní syndrom jsou příklady dalších patogenních chorobných stavů, které by mohly být ovlivněny snížením počtu receptorů IL5.
Demonstrace úlohy IL5 in vivo
V několika studiích s modely astmatu u hlodavců bylo ukázáno, že léčení monoklonálními protilátkami proti IL5 (anti-IL5 mAb) mělo za následek inhibici eosinofilie závislou na dávce ve srovnání s neošetřenými kontrolami (Nagai et al., 1993a & b, Chand et al., 1992, Coeffier et al., 1994, Kung et al., 1995, Underwood et al., 1996). Ve studii autorů Nagai et al. (1993a) byl také pozorován účinek léčby senzibilizovaných Balb/c myší rozpustným a receptorem IL5.
V jedné studii s myšmi Balb/c (Hamelmann et al., 1997) a čtyřmi studiemi s morčaty bylo dále ukázáno, že anti-IL5 mAb inhibují hyperreaktivitu dýchacích cest vyvolanou různými látkami u zvířat senzibilizovaných antigenem (Mauser et al., 1993, Akutsu et al., 1995, van Oosterhout et al., 1995 & 1993). V některých studiích byly také prospěšné účinky (srovnej tabulku 1) léčby ant.i-IL5 mAb pozorovány mikroskopicky (Mauser et al., 1993, Akutsu et al., 1995, Kung et al., 1995). Což je důležité, ve studii autorů Kung et al. (1995) byla pozorována redukce plicního zánětu u B6D2F1 myší, když byla podávána anti-IL5 mAb hodiny před antigenním podnětem, a také když byla podávána až pět dnů po antigenním podnětu, což ukazuje, že účinek anti-IL5 mAb může být u zánětu dýchacích cest jak profylaktický, tak terapeutický. Ale tento účinek nebyl pozorován autory Underwood et al·., když byla anti-IL5 mAb podávána morčatům dvě hodiny po antigenním podnětu (Underwood et al., 1996).
• · · · · ···· «· ·· ···
Ve studii používající model astmatu u opic publikovali autoři Mauser et al. (1995) inhibici hyperreaktivity dýchacích cest po antigenním podnětu, když potkaní anti-myšíIL5 mAb byla podávána 1 hodinu před antigenním podnětem. Kromě toho bylo 75% snížení počtu eosinofilů v brorichoalveolární laváži (BAL) u zvířat ošetřených protilátkou ve srovnání s neošetřenými kontrolami. Vliv na eosinofilii a nadměrná vnímavost na anti-IL5 mAb byla pozorována až tři měsíce po léčení (Mauser et al., 1995). Co se týče alergické nadměrné vnímavosti, výsledky ze studie autorů Nagai et al. (1993a a 1993b) nedokazují žádnou redukci nadměrné vnímavosti ve spojení se snížením počtu eosinofilů v BAL.
Všechny anti-IL5 mAb pokusy in vivo doposud zmíněné byly prováděny s potkaními-anti-myšími monoklonálními protilátkami. Egan et al. (1995) publikovali pokusy s použitím humanizovaných potkaních-anti-humánních IL5 monoklonálních protilátek, nazvaných Sch 55700. Tyto mAbs inhibovaly eosinofilii v plicní laváži o 75 % v dávce 0,3 mg/kg, když byly podávány senzibilizovaným opicím. Když byla podávána Sch 55700 v dávce 1 mg/kg alergickým myším, byla také pozorována inhibice eosinofilie dýchacích cest.
Léčení astmatu v současnosti a v budoucnu
Současná léčba astmatu je prováděna, jak bylo uvedeno, kortikosteroidy, které jsou díky svému protizánětlivému účinku jedny z nejsilnějších léků. Kromě nich se prokázaly u pacientů s astmatem nejprospěšnějšími β2 agonisté a methylxantinové deriváty, které všechny způsobují bronchodilaci a kromoglykan sodný, který „stabilizuje žírné ··
9
9 • 9 9
9
999 ·
9 9 9
9 9
9999 99
9 9 9 9
999 9· 9999 buňky, a tím zabraňuje uvolňování mediátoru (Ortega & Busse 1997).
Budoucí léčba astmatu může obsahovat anti-IL5 mAbs, jak bylo diskutováno výše. Firma Celltech ve spolupráci s firmou Schering Plough mají anti-IL5 mAb ve fázi I klinických astmatu. Ale léčba monoklonálními Především rozvoj a humanizovanou mAb) zkoušek pro léčení protilátkami s sebou nese řadu nedostatků, produkční náklady pro bezpečnou mAb (např.
jsou velmi vysoké, což má za následek drahý terapeutický produkt pro konečného uživatele. Za druhé mAbs mají z hlediska pacienta nevýhodnou vlastnost, jsou podávány v relativně krátkých intervalech. Za třetí mAbs projevují přirozenou úzkou specifičnost proti jednomu epitopu antigenu. A, konečně, mAbs (dokonce i humanizované) jsou imunogenní, vedou ke stále rychlejší inaktivaci podávaných protilátek, jak léčení časem pokračuje.
Bylo také navrhováno použití antisense IL5 oligonukleotidů pro antisense terapii firmou Hybridon pro léčení astmatu, alergií a zánětů. Ale antisense technologie se prokázala technicky obtížná a ve skutečnosti ještě nebyl podán konečný důkaz uskutečnitelnosti antisense terapie u lidí.
Konečně WO 97/45498 (Bresagen Limited/Medvet Science) navrhuje použití modifikovaných a různých forem IL5 molekul schopných antagonizovat aktivitu IL5 při zmírnění, zeslabení nebo jiném snížení aberantních účinků vyvolaných nativními nebo mutantními formami IL5. Bylo publikováno, že antagonizující účinek je výsledkem různých forem IL5 vazby k a řetězci IL5R o nízké afinitě, ale ne k receptorům o vysoké afinitě, tímto způsobem varianty kompetují s IL5 o vazbu k jeho receptorům bez projevů fyziologických účinků 1L5.
44 »4 4
4 4
4 4 4
4 4
4444
44
4 4 4
4 4
4 4 4 · ·
4 4 4 4 4
444 4
4 4
4 444
4 4
4 4
4 444
Další atopicka onemocnění zahrnující eosinofilní zánět jsou léčena buď symptomatickými léky uvedenými u léčba astmatu nebo imunitní terapií (IT) s použitím hyposensitizace s alergenovými extrakty. Je známo, že tento typ léčení je účinný u alergií na jeden nebo několik antigenů, zatímco není vhodný pro léčení mnohonásobné alergie. Kromě toho u obvyklé IT je časové období pro dosažení klinického zlepšení u pacientů reagujících na léčbu velmi dlouhé.
Tedy navzdory existujícím a možným budoucím léčbám chronických alergických onemocnění, jako je například astma, existuje nesporná potřeba alternativních způsobů léčby a zmírňování těchto a dalších chronických alergických onemocnění.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout novou léčbu chronických alergických stavů (jako je například astma) charakterizovaných eosinofilií. Dalším předmětem je vývoj autovakcíny proti IL5, aby se dosáhlo nové léčby astmatu a dalších patologických stavů zahrnujících chronický zánět dýchacích cest.
Cytokin IL5 pocházející z T lymfocytů má, jak bylo uvedeno výše, hlavní úlohu v řízení eosinofilní reakce, ovlivňuje jak produkci, tak i lokalizaci a aktivaci eosinofilů. Protože nebylo publikováno, že IL5 má jinou centrální úlohu v rozvoji protektivní imunitní reakce, je tento konkrétní cytokin dle mínění původců atraktivní terapeutický cíl pro léčbu astmatu.
Obecným cílem předkládaného vynálezu je snížení patogenních hladin eosinofilů v dýchacích cestách pacienta «· ♦ • · • ·
4
4444 • 4
44 • 4 4 • ·
4 • 4 ·
4444 44
444 4 * ·
444 4 4 « 4 s astmatem down-regulací hladin IL5. protože eosinofily závisí na IL5. co se týče atrakce a aktivace. Výsledkem sníženého počtu eosinofilů ve sliznici dýchacích cest by bylo současné snížení zánětu v dýchacích cestách odpovídající klinickému zlepšení pacienta s astmatem.
Potenciální účinek tohoto přístupu již byl prokázán ve studiích s použitím anti-IL5 monoklonálních protilátek ve zvířecích modelech zánětu dýchacích cest (srovnej úvod k příkladům).
Předkládaný vynález ale dotahuje výsledky získané pasivní imunizací o jeden krok dále s použitím vyvolání aktivní imunitní reakce způsobem autovakcinace. Dle nej lepší znalosti původce, tento přístup ještě nebyl doposud navržen.
Výhodou léčby astmatiků IL5 autovakcínou ve srovnání se současnou léčbou kortikosteroidy apod., je redukce a/nebo eliminace vedlejších účinků a nejpravděpodobněji lepší účinek, co se týče trvání. Ve srovnání s anti-IL5 mAbs se očekává, že účinek indukované polyklonální Ab reakce je lepší než pasivně injikované monoklonální imunoglobuliny, protože polyklonální reakce je specifičtější. očekává se také zlepšení, co se týče aplikačního režimu (protože účinné autovakcíny popsané v tomto textu typicky vyžadují maximálně 2-6 podávání ročně).
Ve srovnání s hyposenzibilizací poskytuje předkládaný vynález lákavý aspekt, protože je nespecifický, což je obzvláště relevantní při jednání s mnohanásobně alergickými pacienty.
Tudíž ve svém nejširším a nejobecnějším rozsahu se předkládaný vynález týká způsobu in vivo down-regulace aktivity interleukinu 5 (IL5) u zvířete i člověka, tento
4· • ♦ · 4 · • · • ·
4·· *· ·*« 4 • · · • 4 4·· • · · • · * • 4 ·4· • 4 ·· « · · • · * · · · ·
4· ···· způsob obsahuje prezentaci imunitnímu systému zvířete imunologicky účinného množství
- alespoň jednoho IL5 polypeptidů nebo jeho subsekvence, který byl formulován tak, ze imunizace zvířete IL5 polypeptidm nebo jeho subsekvencí indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidů, a/nebo
- alespoň jednoho IL5 analogu, do kterého je zavedena alespoň jedna modifikace v IL5 aminokyselinové sekvenci, což má za následek, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidů.
Nejpřitažlivější aspekt tohoto přístupu je to, že např. astma může být kontrolováno periodickou, ale nepříliš častou imunizací, na rozdíl od terapeutického postupu, který vyžaduje podávání anti-IL5 nebo molekul majících s nimi analogickou vazebnou afinitu k IL5. Očekává se, že 1 až 4 roční injekce imunogenního přípravku podle vynálezu budou postačující pro vznik požadovaného účinku, zatímco podávání jiných inhibitorů IL5 aktivity vyžaduje aplikaci denně nebo alespoň týdně.
Vynález se také týká analogů IL5, a také fragmentů nukleové kyseliny kódujících jejich podskupinu. Součástí vynálezu jsou také imunogenní přípravky obsahující analogy nebo fragmenty nukleové kyseliny.
Vynález se také týká způsobu identifikace analogů IL5 a také způsobu výroby přípravku obsahujícího analogy IL5.
·« ·»♦· • · ·
9 9 •999 99 • · 9 9 9 9 9
9 999 9 9 · • 9 9 · 9 · · • · 9 9 9 9
999 99 9999
Popis obrázků
Obr. 1: aminokyselinová sekvence zralého humánního IL5 (sekv. íd. č. 1) . Je zahrnuta porovnaná myší sekvence (sekv. íd. č. 12), ale jsou zobrazeny pouze pozice, které se liší od humánní sekvence. Dvě označují chybějící N-koncové zbytky myšího IL5. Pozice N-glykosylace jsou označeny dvojitým podtržením, O-glykosylované threoniny humánního IL5 jsou uvedeny kurzívou a cysteiny tučně.
Obr. 2: dimerní a monomerní struktury humánního IL5.
A: dimerní struktura hIL5. Struktura byla získána pouze pro zbytky 5-112, což znamená, že místo O-glykosylace v Thr3 není zahrnuto.
B: stejná struktura jako v A, s přiřazením helixů (A-D a A’-D').
C: monomer hIL5 s aminokyselinovými zbytky odlišnými od mIL5 ukázanými světle šedě.
Obr. 3: porovnané aminokyselinové sekvence (sekv. id. č. 1 a 12) zralého humánního IL5 (hIL5) a myšího IL5 (mIL5) s označením úseků vhodnými pro substituci. 4 α-helixy A-D jsou obklopeny rámečky s plnou čarou, β-listy jsou dvojitě podtrženy a pozice dvou cysteinů jsou označeny Identické zbytky v těchto dvou sekvencích jsou označeny a neidentické zbytky jsou označeny Klička 1 se překlenuje mezi helixy A a B, klička 2 se překlenuje mezi helixy B a C a klička 3 se překlenuje mezi kličkami C a D. Aminokyselinové sekvence pro substituci peptidy obsahujícími cizorodý TH epitop jsou označeny tučně: jedna taková sekvence je
94 «9 9
4 9 · 9 ·
9 9 •«•9 9·
4*4*
9* · 9 ··
9 9 • · 9
499
9« *4
4 4 9
9 ·
4 9 ·
9 9
9994 obklopena rámečkem z tečkované čáry díky zbytkům překrývajícím se se zbytky substituovanými v odlišném konstruktu. Aminokyselinové sekvence 10 konstruktů (5 pochází z humánního a 5 pochází z myšího IL5) jsou uvedeny v sekv. id. č. 2 až 11 a 13 až 22.
Obr. 4: výsledky testu ELISA imunizace DNA testováním dvou mIL5 autovakcín DNA.
Myši byly DNA očkovány s nahou plazmidovou DNA kódující buď ovalbumin, mIL5wt, mIL5.1 nebo mIL5.5. Séra získaná 77. den byla testována na reaktivitu proti ovalbuminu a myšímu IL5. Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy ovalbuminem (1 pg/jamka, Sigma) nebo purifikovaným rekombinantním myším IL5 (0,1 pg/jamka, E1320). Reaktivita naředěných sér přidávaných do jamek byla vizualizována s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky. Odečty odběrů krve před testem v OD490 byly subtrahovány od odečtů testovaných vzorků v OD490 a výsledné hodnoty byly prezentovány pro každou jednotlivou myš jako sloupce. Odečty odběrů krve před testem v OD490 (ředění 1:25) byly v rozmezí od 0,025 do 0,034. Křížky označují mrtvá zvířata.
Obr. 5: Schematické znázornění konstruktů autovakcín na základě myšího IL5.
Horní obrázek představuje myší monomer IL5 divokého typu s helixy A-C, kličkami 1 až 3 a pohyblivým C-koncovým úsekem. Ostatní obrázky představují odlišné konstrukty autovakcín mající vnitřní substituce epitopů P2 a P30 tetanového toxoidu v různých pozicích. Specifické konstrukty jsou detailně uvedeny v příkladech.
• 1 • A A···
A · ·
9 9
9911 11 ·· ♦»»· • · • ···
1· 911
Definice
V následujícím textu je definována a detailně vysvětlena řada termínů použitých v přítomném popisu a patentových nárocích, aby se objasnily cíle a souvislosti vynálezu.
Termíny T lymfocyt a T buňka jsou používány zaměnitelně pro lymfocyty pocházející z thymu, které jsou zodpovědné za různé imunitní reakce zprostředkované buňkami a také za pomocnou aktivitu v humorální imunitní reakci. Podobně jsou použity termíny B lymfocyt a B buňka zaměnitelně pro lymfocyty produkující protilátky.
Termín IL5 polypeptid v tomto textu označuje polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci výše diskutovaných IL5 proteinů pocházejících z člověka a myši (nebo jejich zkrácených variant, které sdílí podstatné množství epitopu B lymfocyt s intaktním IL5), ale tímto termínem jsou také obsaženy polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci totožnou s xeno-analogy těchto dvou proteinů izolovanými z dalších živočišných druhů. V mezích termínu jsou také zahrnuty neglykosylované formy IL5. které jsou připravovány v prokaryotickém systému, jako jsou formy mající různý charakter glykosylace díky použití např. Kvasinek nebo dalších jiných než savčích eukaryotických expresních systémů. Je ale nutné poznamenat, že používáním termínu IL5 polypeptid je zamýšleno, že uvažovaný polypeptid je normálně neimunogenní, když je prezentován léčenému zvířeti. Jinými slovy IL5 polypeptid je autoprotein nebo je to xenoanalog takového autoproteinu, který nedává normálně vzniknout imunitní reakci proti IL5 u zkoumaného zvířete.
Termín IL5 analog označuje IL5 polypeptid, ve kterém byly provedeny změny primární struktury. Tato změna může být např. ve formě fúze IL5 polypeptidu ke vhodnému fúznímu »· φ φ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφφφ
φφ φφφ
S φ
φ φφφφ partnerovi (tj. změna primární struktury zahrnující výlučně C-koncové a/nebo N-koncové přidání aminokyselinových zbytků) a/nebo může být ve formě inzercí a/nebo delecí a/nebo substitucí v IL5 polypeptidové aminokyselinové sekvenci. Termín také zahrnuje jsou derivované IL5 molekuly, srovnej diskusi níže o modifikacích IL5.
Je nutné poznamenat, že použití u člověka např. psího analogu humánního IL5 jako vakcíny může být chápáno tak, že se vytvoří požadovaná imunita proti IL5. Takové použití xenoanalogu pro imunizaci je také považováno za IL5 analog tak, jak je definován výše.
Používání zkratky IL5 v tomto textu se týká aminokyselinové sekvence zralého IL5 divokého typu (v tomto textu také označován IL5m a IL5wt). Zralý humánní IL5 je označován hIL5, hIL5m nebo hIL5wt a myší zralý IL5 je označován mIL5, mIL5m nebo mIL5wt. V případech, kdy DNA konstrukt obsahuje informaci kódující vedoucí sekvenci nebo
jinou látku, to je Je zamýšleno normálně jasné z kontextu.
, že termín polypeptid v přítomném
kontextu znamená oba krátké peptidy o 2 až 10
aminokyselinových zbytcích, oligopeptidy o 11 až 100
aminokyselinových zbytcích a polypeptidy o více než 100
aminokyselinových zbytcích. Kromě toho je také zamýšleno, že
tento termín obsahuje proteiny, tj. Funkční biomolekuly obsahující alespoň jeden polypeptid, když obsahuje alespoň dva polypeptidy, tyto mohou tvořit komplexy, mohou být kovalentně spojeny nebo mohou být spojeny nekovalentně. Polypeptid(y) v proteinu mohou být glykosylovány a/nebo lipidovány a/nebo obsahují prostetické skupiny.
Termín subsekvence znamená jakýkoliv nepřetržitý úsek alespoň 3 aminokyselin nebo případně alespoň 3 nukleotidů, pocházející přímo z přirozeně se vyskytující IL5 ·· «· « · · ·
• · · « 4 aminokyselinové sekvence nebo sekvence nukleové kyseliny, v daném pořadí.
Je zamýšleno, že termín zvíře v daném kontextu obecně označuje druhy živočichů (výhodně savců), jako je například Homo sapiens, Canis domesticus, apod. a ne jenom jedno jediné zvíře. Ale termín také označuje populaci takového živočišného druhu, protože je důležité, že všichni jedinci imunizovaní podle způsobu vynálezu obsahují v podstatě stejný IL5. což umožňuje imunizaci zvířat stejným imunogenem(imunogeny). Jestliže například v různých lidských populacích existují genetické varianty IL5. může být nutné použít v těchto různých populacích odlišné imunogeny, aby bylo možné uniknout autotoleranci na IL5 v každé populaci. Odborníkovi je jasné, že zvíře v daném kontextu je živoucí bytost, která má imunitní systém. Je výhodné, když zvíře je obratlovec, jako je například savec.
Termínem down-regulace IL5 aktivity in vivo je v tomto textu míněno snížení počtu interakcí mezi IL5 a jeho receptory v živém organizmu (nebo mezi IL5 a jinými možnými biologicky důležitými vazebnými partnery této molekuly). Down-regulace může být dosažena několika mechanismy: z nich je nej jednodušší jednoduchá interference s vazbou protiiátKy v aktivním místě IL5. Ale v rozsahu předkládaného vynálezu je také to, že vazba protilátky má za následek odstranění IL5 buňkami se scavengerovými („uklízecími) receptory (jako jsou například makrofágy a další fagocytující buňky).
Výraz prezentuje... imunitnímu systému označuje to, že imunitní systém zvířete je vystaven řízenému imunogennímu podnětu. Jak bude jasné z popisu uvedeného níže, toto podněcování imunitního systému může být prováděno celou řadou způsobů, z nichž je nejdůležitější vakcinace polypeptidem obsahujícím farmakologické vakcíny (tj . Vakcínu, která je • 4 4 • · • 4
4 • 444 • 4 •
4 •
• 4
4« ··*«4 4 · • 4 · ·4
4 4 4
4 4 • 4 ·
4 «4
4·
4444 podáván pro léčbu nebo zmírnění stále pokračující nemoci) nebo očkování farmakologickou vakcínou nukleovou kyselinou. Dosaženým důležitým výsledkem je, že imunokompetentní buňky zvířete jsou konfrontovány s antigenem imunologicky účinně, zatímco přesný způsob, jak tento výsledek dosáhnout, je pro vynálezeckou myšlenku předkládaného vynálezu méně důležitý.
Termín imunogenně účinné množství ma svug význam v oboru, tj indukovat imunitní patogenními agens, imunogenem.
označuje množství imunogenu reakci, která se významně které sdílí imunologické obvyklý schopné zabývá rysy s
Používání výrazu, že IL5 byl modifikován, se v tomto textu míní chemická modifikace polypeptidu, který vytváří hlavní řetězec IL5. Takovou modifikací může např. být derivatizace (např. alkylace, acylace, esterifikace apod.) určitých aminokyselinových zbytků v IL5 sekvenci, ale jak vyplyne z popisu níže, výhodné modifikace zahrnují změny (nebo přidávání k) primární struktury IL5 aminokyselinové sekvence.
Pojmem autotolerance k IL5 se rozumí, že i když IL5 je autoprotein v populaci, která má být očkována, normální jedinci v populaci nevyvíjejí imunitní reakci proti IL5. ačkoliv nemůže být vyloučeno, že příležitostní jedinci ve zvířecí populaci by mohli být schopni tvořit protilátky proti nativnímu IL5. např. jako část autoimunitní poruchy. Kdykoliv bude zvíře normálně autotolerantní pouze ke svému vlastnímu IL5. ale nemůže být vyloučeno, že analogy IL5 pocházející z jiných druhů zvířat nebo z populace mající odlišný IL5 fenotyp by také mohly být tolerovány uvedeným zvířetem.
Termíny cizorodý epitop T lymfocytů (nebo: cizorodý T lymfocytární epitop) je peptid, který je schopný vázat MHC molekulu a který stimuluje T lymfocyty v živočišných druzích.
·· »· • · · · £ · · • · ·
• · · · · • · · · ···· «·
Výhodné cizorodé epitopy T lymfocytu podle vynálezu jsou všeobecné (nebo tzv. „promiskuitní) epitopy, t j. epitopy které vážou podstatnou část konkrétní třídy MHC molekul v živočišných druzích nebo populaci. Je znám pouze velmi omezený počet těchto všeobecných epitopů T lymfocytu a budou diskutovány detailně níže. Je nutné poznamenat, že aby imunogeny, které jsou použity podle předkládaného vynálezu, byly účinné co největší frakce populace zvířat, jak je jen možné, může být nezbytné 1) vložit několik cizorodých epitopů T lymfocytu do stejného IL5 analogu nebo 2) připravit několik analogů IL5. kde každý analog má vložen odlišný všeobecný epitop. Je také nutné poznamenat, že pojem cizorodých epitopů T lymfocytu také obsahuje použití kryptických epitopů T lymfocytu, tj. Epitopů, které pocházejí z autoproteinu a které projevují imunogenní chování pouze tehdy, když existují v izolované formě bez toho, aby byli částí zkoumaného autoproteinu.
Termín cizorodý epitop pomocného T lymfocytu (cizorodý TH epitop) je cizorodý epitop T lymfocytu, který se váže na molekulu MHC třídy II a může být předložen na povrchu buňky prezentující antigen (APC) navázané k molekule MHC třídy II.
Termín funkční část (bio)molekuly v daném kontextu znamená část molekuly, která je zodpovědná za alespoň jeden biochemický nebo fyziologický účinek projevovaný molekulou. V oboru je známo, že mnoho enzymů a jiných efektorových molekul mají aktivní místo, které je zodpovědné za účinky projevované zkoumanou molekulou. další části molekuly mohou sloužit účelům stabilizace nebo zvýšeni rozpustnosti a mohou tudíž být vynechány, jestliže tento účel není relevantní pro určité provedení předkládaného vynálezu, například je možné použít určité další cytokiny jako modifikující skupinu v IL5 • · • · ·« (srovnej detailní diskusi níže) a v takovém případě může být otázka stability irelevantní, protože kondenzace k IL5 poskytuje nezbytnou stabilitu.
Termín adjuvans má svůj obvyklý význam v oboru vakcinační technologie, tj. Znamená předmětnou látku nebo přípravek, který 1) není sám o sobě schopný vyvolat specifickou imunitní reakci proti imunogenuu vakcíny, ale který je 2) nicméně schopný zesílit imunitní reakci proti imunogenuu. Nebo jinými slovy, vakcinace adjuvans samotným neposkytuje imunitní reakci proti imunogenu, vakcinace imunogenem může nebo nemusí vyvolat imunitní reakci proti imunogenu, ale kombinace vakcinace imunogenem a adjuvans indukuje imunitní reakci proti imunogenu, která je silnější, než reakce indukovaná imunogenem samotným.
Termínem cílení molekuly je v daném kontextu označována situace, kdy se molekula po zavedení do zvířete objeví přednostně v určité tkáni(tkáních) nebo je přednostně sdružována s určitými buňkami nebo buněčnými typy. účinek může být uskutečněn řadou způsobů včetně formulace molekuly do přípravku usnadňujícího cílení nebo zavedením skupiny usnadňující cílení do molekuly. Tyto otázky budou diskutovány detailně níže.
Termín stimulace imunitního systému znamená, že předmětná látka nebo přípravek projevují obecný, nespecifický imunostimulační účinek. Počet adjuvancií a předpokládaných adjuvancií (jako jsou například určité cytokiny) sdílejí schopnost stimulovat imunitní systém. Výsledkem použití imunostimulačního agens je zvýšená pohotovost imunitního systému znamenající, že simultánní nebo následná imunizace imunogenem indukuje významně účinnější imunitní reakci ve srovnání s použitím izolovaného imunogenu.
·· · · · ·
Výhodná provedení down-regulace IL5 aktivity
Je výhodné, když IL5 polypeptid použitý jako imunogen ve způsobu podle vynálezu je modifikovaná molekula, kde je v IL5 aminokyselinové sekvenci přítomná alespoň jeden změna, protože šance na získání důležitého úniku autotoleranci na IL5 je tímto způsobem výrazně usnadněna. Je nutné poznamenat, že to nevylučuje možnost použití takto modifikovaného IL5 ve formulacích, které dále usnadňují únik autotoleranci na IL5, např. formulace obsahující určitá adjuvancia diskutovaná detailně níže.
Bylo prokázáno (v Dalum I et al., 1996, J. Imunol. 157, 4796-4804), že potenciálně autoreaktivní B lymfocyty rozpoznávající autoproteiny jsou u normálních jedinců fyziologicky přítomné. Ale aby v těchto B lymfocytech byla indukována skutečná tvorba protilátek reagujících s relevantními autoproteiny, je potřebné přispění T pomocných lymfocytů produkujících cytokiny (TH buňky nebo TH lymfocyty). Normálně tato pomoc není poskytnuta, protože T lymfocyty obecně nerozpoznávají epitopy T lymfocytů pocházející z autoproteinů, když jsou předkládány buňkami prezentujícími antigen (APC). Ale po zajištění prvku cizorodosti autoproteinu (tj. Zavedení imunologicky významné modifikace) T lymfocyty rozpoznávající cizorodý prvek jsou aktivovány po rozpoznáváni cizorodého epitopu na APC (jako je například původně mononukleární buňka). Polyklonální B lymfocyty (které jsou také specializované APC) schopné rozpoznání autoepitopů na modifikovaném autoproteinu také internalizuji antigen a pak prezentují jeho cizorodý epitop(y) T lymfocytů a aktivované T lymfocyty pak poskytují cytokinovou pomoc těmto autoreaktivním polyklonálním B lymfocytům. Protože protilátky vytvořené těmito polyklonálními B lymfocyty jsou reaktivní s odlišnými epitopy modifikovaného polypeptidů, včetně těch, • 4 • · · · 4 · 4 · • · · · 4444 4 • 4 444 4 444
4 · · · 4 4 • 444 44 44 444 které jsou také přítomné na nativním polypeptidu, je indukována protilátka zkříženě reagující s nemodifikovaným autoproteinem. Závěrem, T lymfocyty mohou být vedeny k tomu, že jednají tak, jako kdyby populace polyklonálních B lymfocytů rozpoznávala úplně cizorodý antigen, zatímco ve skutečnosti je pro hostitele cizorodý pouze vložený epitop(epitopy). Tímto způsobem jsou indukovány ' protilátky schopné zkřížené reakce s nemodifikovanými autoantigeny.
V oboru je známo několik způsobů, jak modifikovat peptidový autoantigen, aby se dosáhlo úniku autotoleranci. Tudíž podle vynálezu modifikace může zahrnovat, že
- je zaveden alespoň jeden cizorodý epitop T lymfocytů a/nebo
- je zavedena alespoň jedna první skupina, která provádí cílení modifikované molekuly k buňce prezentující antigen (APC), a/nebo
- je zavedena alespoň jedna druhá skupina, která stimuluje imunitní systém a/nebo
- je zavedena alespoň jedna třetí skupina, která optimalizuje prezentaci modifikovaného IL5 polypeptidu imunitnímu systému.
Ale všechny tyto modifikace by měly být prováděny při udržování podstatné frakce původních epitopů B lymfocytů na IL5. protože je takto zesíleno rozpoznávání nativní molekuly B lymfocytem.
V jednom výhodném provedení jsou kovalentně nebo nekovalentně zavedeny postranní skupiny (ve formě cizorodých epitopů T lymfocytů nebo výše uvedené první, druhé a třetí skupiny). To znamená, že úseky aminokyselinových zbytků pocházející z IL5 jsou derivovány beze změny primární aminokyselinové sekvence nebo alespoň bez zavedení změn v peptidových vazbách mezi jednotlivými aminokyselinami v řetězci.
• · · · · · · • · · · · · · · • · · ···· · • · · · · · • · ··· ·· ··· ·
Alternativní a výhodné provedení používá substituci a/nebo deleci a/nebo inzerci a/nebo adice aminokyselin (což může být prováděno rekombinantními technikami nebo peptidovou syntézou, modifikace, které se týkají delších úseků aminokyselin mohou dát vznik fúzním polypeptidům). Jedna obzvláště výhodná verze tohoto provedení je technika popsaná ve WO 95/05849, která popisuje způsob down-regulace autoproteinů imunizací analogy autoproteinů, kde byl velký počet aminokyselinových sekvencí substituován odpovídajícím počtem aminokyselinových sekvencí, z nichž každá obsahovala cizorodý imunodominantní epitop T lymfocytů, zatímco byla současné udržena obecná terciární struktura autoproteinů v analogu. Pro účely předkládaného vynálezu je ale postačující, jestliže modifikace (ať už to je inzerce, adice, delece nebo substituce aminokyseliny) založila cizorodý epitop T lymfocytů a současně uchovala podstatný počet epitopů B lymfocytů v IL5. Ale aby bylo dosaženo maximální účinnosti indukované imunitní reakce, je výhodné, že je udržována v modifikované molekule obecná terciární struktura IL5.
Následující vzorec popisuje IL5 konstrukty obecně spadající do rozsahu vynálezu:
(MODJs! (IL5el)ni (MOD2)s2 (IL5e2)n2.. (MODX) sx (IL5ex)nx (I) kde IL5ei“IL5ex je x epitopů B lymfocytů obsahujících subsekvence IL5. které jsou nezávisle identické nebo neidentické a které mohou obsahovat nebo neobsahují cizorodé postranní skupiny, x je celé číslo ú 3, nl-nx jsou x celá čísla 0 (alespoň jedno je ú 1), MODi~MODx jsou x modifikace zavedené mezi zachované epitopy B lymfocytů a Si~sx jsou x celá čísla 0 (alespoň jedno je ú 1, jestliže v IL5e • · • · ···· ·· ·· • · * · · · · • · ··· · · ♦ • · · · · · ♦ • · · · · · • · ·«· ·· ···· sekvenci nejsou zavedeny žádné postranní skupiny). Tedy za daných obecných funkčních omezení imunogenicity konstruktů, vynález umožňuje všechny druhy permutací původní IL5 sekvence a všechny druhy modifikací. Tedy ve vynálezu jsou zahrnuty modifikované IL5 získané části IL5 sekvence, která např. Projevuje vedlejší účinky in vivo nebo vynecháním části, která by mohla založit nežádoucí imunologické reakce.
Udržování podstatné frakce epitopů B lymfocytu nebo dokonce obecné terciární struktury proteinu, který je podroben modifikaci tak, jak bylo v tomto textu popsáno, může být dosaženo několika způsoby. Jedním z nich je jednoduše připravit polyklonální antisérum namířené proti IL5 (např. antisérum připraven v králíkovi) a poté použití tohoto antiséra jako testované reagencie (např. V kompetitivním testu ELISA) proti modifikovaným proteinům, které jsou vytvářeny. Modifikované verze (analogy), které reagují do stejné míry s antisérem jako IL5, musejí mít stejnou obecnou terciární strukturu jako IL5, zatímco analogy projevující omezenou (ale ještě významnou a specifickou) reaktivitu s tímto antisérem si zachovávají podstatnou část původních epitopů B lymfocytu.
Alternativně může být připravena a použita jako testovací panel selekce monoklonálních protilátek reagujících s rozdílnými epitopy IL5. Tento postup výhodně umožní 1) mapování epitopů IL5 a 2) mapování epitopů, které jsou udržovány v připravených analozích.
Ovšem třetím přístupem by bylo rozložit trojrozměrnou strukturu IL5 nebo jeho biologicky aktivní zkrácené varianty (srovnej výše) a srovnat ji s rozloženou trojrozměrnou strukturou připravených analogů. Trojrozměrná struktura může být rozložena prostřednictvím studií rentgenové difrakce a NMR spektroskopií. Další informace týkající se terciární struktury mohou být do určité míry získány ze studií cirkulárního dichroismu, které mají výhodu, že vyžadují polypeptid pouze v čisté formě (zatímco rentgenová difrakce vyžaduje obstarání krystalizovaného polypeptidu a NMR vyžaduje obstarání isotopových variant polypeptidu), aby byla poskytnuta použitelná informace o terciární struktuře dané molekuly. Ale nakonec rentgenová difrakce a/nebo NMR jsou nezbytné pro zisk směrodatných dat, protože cirkulární dichroismus může poskytnout pouze nepřímý důkaz správné trojrozměrné struktury prostřednictvím informace sekundárních strukturních prvků.
Jedno výhodné provedení vynálezu používá mnohonásobné prezentace epitopů B lymfocytu IL5 (tj. Vzorec I, kde alespoň jeden epitop B lymfocytu je přítomný ve dvou pozicích). Tohoto účinku může být dosaženo různými způsoby, např. jednoduchou přípravou fúzních polypeptidů obsahujících strukturu (IL5)m, kde m je celé číslo 2, a pak zavedením modifikací diskutovaných v tomto textu do alespoň jedné IL5 sekvence nebo alternativně vložením mezi alespoň dvě IL5 aminokyselinové sekvence. Je výhodné, že zavedené modifikace zahrnují alespoň jeden duplikát epitopu B lymfocytu a/nebo zavedení haptenu.
Jak bylo uvedeno výše, zavedení cizorodého epitopu T lymfocytu může být uskutečněno zavedením inzerce, adice, delece nebo substituce alespoň jedné aminokyseliny. Ovšem normální bude zavedení více než jedné změny do aminokyselinové sekvence (např. Inzerce nebo substituce kompletního epitopu T lymfocytu), ale je důležité dosáhnout, aby IL5 analog, když je zpracováván buňkou prezentující antigen (APC), založil takový cizorodý imunodominantní epitop T lymfocytu, který bude předložen molekule MHC třídy II na povrchu APC. Tedy, jestliže IL5 aminokyselinová sekvence ve ···· • · · vhodných pozicích obsahuje množství aminokyselinových zbytků, které mohou být také zjištěny v cizorodém TH epitopu, pak zavedení cizorodého TH epitopu může být uskutečněno poskytnutím zbylých aminokyselin cizorodého epitopu pomocí inzerce, adice, delece a substituce aminokyseliny. Jinými slovy, není nutné zavést inzercí nebo substitucí kompletní TH epitop.
Je výhodné, když je počet aminokyselinových inzercí, delecí, substitucí nebo adicí alespoň 2, například 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25 inzercí, substitucí, adicí nebo delecí. Dále je výhodné, když počet aminokyselinových inzercí, substitucí, adicí nebo delecí nepřesahuje 150, je například nejvíce 100, nejvíce 90, nejvíce 80 a nejvíce 70. Je obzvláště výhodné, když počet substitucí, inzercí, delecí nebo adicí nepřesáhne 60 a konkrétně by počet neměl přesáhnout 50 nebo dokonce 40. Nej výhodnější je počet ne více než 30. Co se týče adicí aminokyselin, je nutné poznamenat, že počet adicí, když je výsledný konstrukt ve formě fúzního polypeptidu, je často značně vyšší než 150.
Výhodná provedení vynálezu zahrnují modifikace zavedením alespoň jednoho cizorodého imunodominantního TK epitopu. Je nutné porozumět, že otázka imunitní dominance TH epitopu závisí na zkoumaném živočišném druhu. Termín imunodominance používaný v tomto textu se jednoduše týká epitopů, které u očkovaného jedince vyvolají významnou imunitní reakci, ale je známým faktem, že TH epitop, který je imunodominantní u jednoho jedince, není nutně imunodominantní u dalšího jedince stejného živočišného druhu, dokonce i když může být schopný vazby MHC-II molekuly u posledně uvedeného jedince.
Dalším důležitým bodem je otázka MHC restrikce TH epitopů. Obecně přirozeně se vyskytující TH epitopy jsou MHC • · · · · · * · ·· «·· · ·· •» 99 9 9 omezeny, t j. určitý peptid tvořící TH epitop se účinně váže pouze k podskupině molekul MHC třídy II. To má dále ten účinek, že ve většině případů použití jednoho specifického TH epitopu má za následek složku vakcíny, která je účinná pouze ve frakci populace a v závislosti na velikosti této frakce, může být nezbytné zahrnout více TH epitopů do stejné molekuly nebo alternativně připravit vakcínu s mnoha složkami, kde složky jsou IL5 varianty, které se od sebe liší povahou zavedeného TH epitopu.
Jestliže MHC restrikce použitých T lymfocytů je zcela neznámá (například v situaci, kdy má očkované zvíře nedostatečně definovaný MHC přípravek), frakce populace zvířat pokrytá specifickým vakcinačním přípravkem může být určena pomocí následujícího vzorce:
populace
kde pi je četnost jedinců v populaci reagujících na i-tý cizorodý epitop T lymfocytů přítomný ve vakcinačním přípraveku a n je celkový počet cizorodých epitopů T lymfocytů ve vakcinačním přípravku. Tudíž vakcinační přípravek obsahující 3 cizorodé epitopy T lymfocytů mající četnosti reakce v populaci 0,8, 0,7 a 0,6, v daném pořadí, by dal
- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976 tj . u 97,6 % populace se statisticky vyvine MHC-II zprostředkovaná reakce na vakcínu.
Výše uvedený vzorec nelze použít v situacích, kdy je více nebo méně přesně znám typ MHC restrikce použitých peptidů. Jestliže se například určitý peptid váže pouze na humánní molekuly MHC-II kódované HLA-DR alelami DR1, DR3, DR5 a DR7, pak použití tohoto peptidů spolu s dalšími peptidy, které se vážou na zbylé molekuly MHC-II kódované HLA-DR alelami dovrší 100% pokrytí ve zkoumané populaci. Podobně, jestliže se druhý peptid váže pouze na DR3 a DR5, přidání tohoto peptidu nezvýší pokrytí všech. Jestliže je kalkulace reakce populace založena pouze na MHC restrikci epitopů T lymfocytu ve vakcíně, frakce populace pokryté specifickým vakcinačním přípravkem může být určena pomocí následujícího vzorce:
f.popude (III) /-I kde <f>j je suma frekvencí alelických haplotypů v populaci, které kódují MHC molekuly, které vážou jakýkoliv epitop T lymfocytu ve vakcíně a které patří k j-tému ze 3 známých HLA lokusů (DP, DR a DQ), v praxi je nejdříve určeno, které MHC molekuly rozpoznají každý epitop T lymfocytu ve vakcíně a proto jsou tyto MHC molekuly uvedeny typem (DP, DR a DQ) pak jsou jednotlivé frekvence odlišných uvedených alelických haplotypů pro každý typ sumarizovány, a tím poskytují (/>lr Φ2 a Φ3·
Může nastat situace, kdy hodnota p± ve vzorci II překročí odpovídající teoretickou hodnotu ^Ι-ΠΟ-ν,)2 (IV) /«i kde Vj je suma frekvencí alelických haplotypů v populaci, které kódují MHC molekuly, které vážou í-tý epitop T lymfocytu ve vakcíně a které patří k j-tému ze 3 známých HLA lokusů (DP, DR a DQ) . To znamená, že v 1-7Tí, populace je četnost reagujících osob freziduáiní-i = (Ρί~^ϊ) / (1-^i) · Tudíž, vzorec III může být upraven tak, že vzniká vzorec V:
• ♦ Μ» · • * · • · * · ·
-ι-Πο-ρ/Μι-ΐίο
·· ··*· (V) kde termín 1-frezíduáiní-i se rovná nule, jestliže je negativní. Je nutné poznamenat, že vzorec V vyžaduje, aby všechny epitopy byly haplotypy mapované proti identickým sadám haplotypů.
Tudíž při selekci epitopů T lymfocytu, které mají být zavedeny do IL5 analogu, je důležité obsáhnout znalost všech epitopů, které jsou k dispozici: 1) četnost osob v populaci odpovídajících na každý epitop, 2) MHC restrikční data a 3) frekvenci relevantních haplotypů v populaci.
Existuje velký počet přirozeně se vyskytujících všeobecných epitopů T lymfocytu, které jsou aktivní u velké části jedinců živočišného druhu nebo populace zvířat a ty jsou výhodně zavedeny do vakcíny, a tím snižují potřebu velmi vysokého počtu odlišných analogů IL5 v téže vakcíně.
Všeobecný epitop může být podle vynálezu přirozeně se vyskytující humánní epitop T lymfocytu, jako jsou například epitopy tetanického toxoidu (např. Epitopy P2 a P30), epitop difterického toxoidu, hemaglutinin viru chřipky (HA) a CS antigen P. Falciparum.
V průběhu let byl identifikován velký počet dalších všeobecných epitopů T lymfocytu. Byly identifikovány zejména peptidy schopné vázat velký podíl HLA-DR molekul kódovaných odlišnými HLA-DR alelami a všechny z nich jsou možné epitopy T lymfocytu pro zavedení do analogů IL5 použitých podle předkládaného vynálezu. (Srovnej také epitopy diskutované v následujících odkazech, které jsou tímto všechny zahrnuty do odkazů v tomto textu: WO 98/23635 (Frazer IH et al., přidělená University Queensland), Southwood S et. al., 1998, J. Imunol., 160, 3363-3373, Sinigaglia F et al., 1988, • · «•«4 ·· ·· • · · 4
4 «
4·44
4 4
Nátuře, 336, 778-780, Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med., 178, 27-47, Hammer J et al., 1993, Cell, 74, 197-203 a Falk K et al., 1994, Immunogenetics, 39, 230-242). Poslední odkaz se také zabývá HLA-DQ a -DP ligandy. Všechny epitopy uvedené v těchto 5 odkazech jsou relevantní jako uvažované přírodní epitopy pro použití v předkládaném vynálezu, jakož i epitopy, které s nimi sdílejí společné motivy.
Alternativně epitopem může být každý syntetický epitop T lymfocytu, který je schopný vázat velkou část molekul MHC třídy II. V tomto kontextu „panpeptidy DR epitopu (PADRE) popsané ve WO 95/07707 a v odpovídajícím článku Alexander J et al., 1994, Immunity, 1, 751-761 (oba popisy jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu) jsou zajímavé uvažované epitopy pro použití podle předkládaného vynálezu. Je nutné poznamenat, že nejúčinnější peptidy PADRE popsané v těchto článcích nesou D-aminokyseliny na C-a N-koncích, aby se zlepšila stabilita při podávání. Ale předkládaný vynález primárně usiluje o zavedení relevantních epitopů jako části modifikovaného IL5. které by pak následně byly rozloženy enzymaticky v lyzozomech APC, aby se umožnila následná prezentace molekule MHC-II, a tudíž není prospěšné zavést D-aminokyseliny do epitopů použitých v předkládaném vynálezu.
Jeden obzvláště výhodný PADRE peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci AKFVAAWTLKAAA (sekv. id. č. 65) nebo jeho imunologicky účinnou subsekvenci. Tento a další epitopy, kterým chybí stejná MHC restrikce, jsou výhodné epitopy T lymfocytu, které by měly být přítomny v analozích IL5 použitých ve vynálezeckém způsobu. Tyto super-všeobecné epitopy by umožnily nejjednodušší provedení vynálezu, kde pouze jeden jediný modifikovaný IL5 je předložen imunitnímu systému očkovaného zvířete.
• 4 44 44 44·· • · 4 4 4 4 ·
4 4 4 4 44· • 9 · 4 4 • 4 4 4 44 ·· *·· • 4 44 • 4 4 4
4 4 • ·4 • 44 •4 4444
Jak bylo uvedeno výše, modifikace IL5 může také zahrnout zavedení první skupiny, která cílí modifikovaný IL5 k APC nebo B lymfocytů. Například, první skupina může být specifický vazebný partner pro specifický povrchový antigen B lymfocytů nebo pro specifický povrchový antigen APC. V oboru je známo mnoho takových specifických povrchových antigenů. Například, skupina může být sacharid, pro který je receptor na B lymfocytů nebo na APC (např. mannan nebo mannóza) . Alternativně, druhá skupina může být hapten. Jako první skupina může být také použit protilátkový fragment, který specificky rozpoznává povrchovou molekulu na APC nebo lymfocytech (povrchové molekuly mohou např. Být FCy receptor makrofágů a monocytů, jako je například FCyRI nebo alternativně každý další specifický povrchový markér, jako je například CD40 nebo CTLA-4). Je nutné poznamenat, že všechny tyto příklady cílících molekul mohou být také použity jako část adjuvans, srovnej níže.
Jako alternativa nebo doplněk cílení modifikovaného IL5 polypeptidu k určitému buněčnému typu, aby se dosáhlo zesílené imunitní reakce, je možné zvýšit stupeň odpovídavosti imunitního systému zahrnutím výše uvedené druhé skupiny, která stimuluje imunitní systém. Typické příklady takových druhých skupin jsou cytokiny a proteiny tepelného šoku nebo molekulární chaperony, a také jejich účinné části.
Vhodné cytokiny pro použití podle vynálezu jsou ty, které normálně také působí jako adjuvancia ve vakcinačním přípravku, t j. například interferon y (IFN-y), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin . 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13) , interleukin 15 (IL-15). a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), alternativně, funkční část molekuly cytokinu může dostačovat > ··
A · A
A A
A A ···· • A
AAAA ·* ·Α » · A · · • · · A • A A A A · 4 • AAAA 1
BAAA AA AA AAA
A* AAAA jako druhá skupina. Co se týče použití těchto cytokinů jako adjuvancií, srovnej diskusi níže. Je nutné poznamenat, že použití obou IL-4 a IL-13 by mělo být prováděno velmi opatrně, jestli vůbec, protože obě molekuly jsou známy jako klíčové efektorové molekuly v patofyziologii atopie a astmatu.
Podle vynálezu mohou být vhodnými proteiny tepelného šoku nebo molekulární chaperony použitými jako druhá skupina HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (také známý jako gp96, srovnej Wearsch PA et al. 1998, Biochemistry, 37, 5709-19) a CRT (kalretikulin).
Alternativně může být druhá skupina toxin, jako je například listeriolycin (LLO), lipid A a tepelně labilní enterotoxin. Zajímavou možností je také celá řada mykobakteriálních derivátů, jako je například MDP (muramyldipeptid) a diestery trehalózy TDM a TDE.
Také možnost zavedení třetí skupiny, která zesiluje prezentaci modifikovaného IL5 imunitnímu systému, je důležité provedení vynálezu. V oboru bylo ukázáno několik příkladů tohoto principu. Například je známo, že palmitoylová lipidační kotva v proteinu OspA Borrelia burgdorferi může být použita tak, že poskytne autoadjuvační polypeptidy (srovnej např. WO 96/40718). Zdá se, že lipidované proteiny vytvářejí struktury podobné micelám s jádrem, které tvoří lipidační části kotvy polypeptidů a zbylé části molekuly z nich vyčnívají, což má za následek mnohonásobnou prezentaci antigenních determinant. Tudíž použití tohoto a příbuzných postupů s použitím různých lipidačních kotev (např. myristylové skupiny, farnesylové skupin, geranyl-geranylové skupiny, GPI-kotvy a N-acylové skupiny diglyceridu) jsou výhodná provedení vynálezu, obzvláště proto že poskytnutí této lipidační kotvy v rekombinantně vytvořeném proteinu je • 4 ··*♦
4 • · · · • 4 4 ·
4 · • 4 ·
4 4 •44· ·« ·· ·4· • 9 44 ♦ 4 4 4 • 4 4 · ·
4 9
4* ·494 zcela jasné a vyžaduje pouze použití např. Přirozeně se vyskytující signální sekvence jako fúzního partnera pro modifikovaný IL5 polypeptid. Další možností je použití C3d fragmentu faktoru komplementu C3 nebo samotného C3 (srovnej Dempsey et al., 1996, Science, 271, 348-350 a Lou & Kohler,
1998, Nátuře Biotechnologi, 16, 458-462).
za
2) je
Alternativní provedení vynálezu, které má také následek výhodnou prezentaci mnohočetných (např. alespoň kopií důležitých epitopových úseků IL5 imunitnímu systému, kovalentní nebo nekovalentní vazba IL5. jeho subsekvence nebo variant k molekulám určitých nosičů. mohou být použity například polymery, např. Sacharidy, jako je například dextran (srovnej např. Lees A et al., 1994, Vaccine, 12, 1160-1166, Lees A et al., 1990, J Imunol., 145, 3594-3600), ale použitelné alternativy jsou také mannóza a mannan. Úplné membránové proteiny např. Z E. coli a dalších bakterií jsou také použitelní konjugační partneři. Tradiční nosičské molekuly, jako je například hemokyanin z mořské přílipky (KLH) , tetanický toxoid, difterický toxoid a albumin bovinního séra (BSA) jsou také výhodní a použitelní konjugační partneři.
Má se za to, že určité oblasti nativního IL5 jsou obzvláště vhodné pro tvoření modifikací. Předpovídá se, že modifikace v alespoň jedné kličce 1 až 3 nebo v aminokyselinových zbytcích C-koncové části helixů D (uvedené kličky a uvedený helix D odpovídají těm ukázaným na obr. 3 pro humánní a myší IL5) budou s největší pravděpodobností vytvářet požadované konstrukty a vakcinační výsledky. Důvody pro tyto vybrané úseky jsou a) konzervace známých a predikovaných epitopů B lymfocytu, b) konzervace terciární a kvartérní struktury apod., srovnej také diskusi v úvodu k příkladům. V každém případě, jak je diskutováno výše, je • 9 ·· ♦ · ♦ * « ♦ * * · * • · · «· ··*· ·» «» ·♦ ·»»· » · » » » · · • « · · · ··· »» ··· · ·» • » » « · · ·«·· ·· ·· ··· zcela snadné provádět screening a nastavení modifikovaných IL5 molekul, které byly všechny podrobeny zavedení epitopů T lymfocytu v různých polohách.
Protože nej výhodnější provedení předkládaného vynálezu se týkají down-regulace humánního IL5. je proto výhodné, že IL5 polypeptid diskutovaný výše je humánní IL5 polypeptid. V tomto provedení, je obzvláště výhodné, že humánní IL5 polypeptid byl modifikován substitucí alespoň jedné aminokyselinové sekvence v sekv. id. č. 1 alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí stejné nebo odlišné délky a obsahující cizorodý TH epitop, kde substituované aminokyselinové zbytky jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří zbytky 87 až 90, zbytky 32 až 43, zbytky 59 až 64, zbytky 86 až 91 a zbytky 110 až 113. Zdůvodnění těchto konstruktů je detailně diskutováno v příkladech.
Formulace IL5 a modifikovaných IL5 polypeptidů
Při prezentaci IL5 polypeptidu nebo modifikovaného IL5 polypeptidu imunitnímu systému zvířete jeho podáváním zvířeti, formulace polypeptidu sleduje principy v oboru obecně přijímané.
Přípravě vakcín, které obsahují peptidové sekvence jako účinné složky, se v oboru obecně dobře rozumí, jak doloženo příklady z patentů Spojených Států č. 4 608 251, 4 601 903, 4 599 231, 4 599 230, 4 596 792 a 4 578 770, všechny zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Typicky jsou takové vakcíny připraveny jako injikovatelné, buď jako tekuté roztoky nebo suspenze, mohou také být připraveny pevné formy vhodné pro vytvoření roztoku nebo suspenze v tekutině před injekcí. Přípravek může být také emulgován. Aktivní imunogenní složka je často smíchána s excipienty, které jsou farmaceuticky
·« ·· ♦ © © © © © · «© ··©· přijatelné a kompatibilní s účinnou složkou. Vhodnými excipienty jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol apod. a jejich kombinace. Kromě toho, je-li žádoucí, vakcína může obsahovat menší množství pomocných látek, jako jsou například smáčedla nebo emulgátory, pH pufry nebo adjuvancia, která zesilují účinnost vakcín, srovnej detailní diskusi o adjuvanciích níže.
Vakcíny jsou obvykle podávány parenterálně injekcí, například buď subkutánně, intrakutánně, intradermálně, subdermálně nebo intramuskulárně. Další formulace, které jsou vhodné pro další způsoby podávání obsahují čípky a v některých případech formulace pro perorální, bukální, sublingvální, intraperitoneální, intravaginální, anální, epidurální, spinální a intrakraniální podávání. Co se týče čípků, mohou obsahovat tradiční pojivá a nosiče například polyalkalenglykoly nebo triglyceridy, takové čípky mohou být vytvořeny ze směsí obsahujících účinnou složku v rozmezí 0,5 % až 10 %, výhodně 1 až 2 %. Perorální formulace obsahují normálně používané excipienty, jako jsou například mannit, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sacharin sodný, celulóza, uhličitan hořečnatý apod. Farmaceutického stupně čistoty. Tyto přípravky mají formy, jako jsou roztoky, suspenze, tablety, pilulky, tobolky, formulace nebo prášky s prodlouženým uvolňováním a obsahují 10 až 95 % účinné složky, výhodně 25 až 70 %. Co se týče perorálních formulací, toxin cholery je zajímavý formulační partner (a také možný konjugační partner).
Polypeptidy mohou být formulovány do vakcíny jako neutrální formy nebo soli. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují kyselé adiční soli (vytvořené s volnými aminoskupinami peptidů) a které jsou tvořeny s anorganickými kyselinami, jako je například chlorovodíková nebo fosforečná • 4 ·« 4
4 4 • 4
9999 99 ·999 •
4 4 4 4 • 4 4
4 4
49·
4 • 4 • « ·
► 4444 kyselina, nebo takovými organickými kyselinami, jako je octová, oxalová, vinná, s volnými karboxylovými mandlová apod. skupinami mohou z anorganických baží, jako je například sodík, amonium, vápník nebo hydroxid železitý, a
Soli vytvořené také pocházet draslík, takových organických baží, jako je isopropylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain apod.
trimethylamin,
Vakcíny jsou podávány způsobem kompatibilním s lékovou formulací a v takovém množství, jaké je terapeuticky účinné a imunogenní. Podávané množství závisí na léčeném pacientovi, včetně např. Kapacity imunitního systému jednotlivce vyvinout imunitní reakci a stupni požadované protekce. Vhodné rozmezí dávka je řádově několik set mikrogramů účinné složky na vakcinaci s výhodným rozmezím přibližně od 0,1 pg do 2000 pg (třebaže vyšší množství v rozmezí 1 až 10 mg jsou také předpokládána), jako je například v rozmezí přibližně od 0,5 pg k 1000 pg, výhodně v rozmezí od 1 pg do 500 pg a obzvláště v rozmezí přibližně od 10 pg do 100 pg. Vhodné režimy pro počáteční podávání a upomínací dávky jsou také variabilní, ale je pro ně typické počáteční podávání následované dodatečnými inokulacemi nebo dalším podáváním.
Způsob aplikace se může široce odlišovat. Je použitelná každá obvyklá metoda pro podávání vakcíny. Tyto metody zahrnují perorální aplikaci na pevné fyziologicky přijatelné bázi nebo ve fyziologicky přijatelné disperzi parenterálně, injekcí nebo podobně. Dávka vakcíny závisí na způsobu podávání a mění se podle věku očkované osoby a formulace antigenu.
Některé polypeptidy vakcíny jsou dostatečně imunogenní ve vakcíně, ale pro jiné další bude imunitní reakce zesílena, jestliže vakcína dále obsahuje adjuvans.
φ φ * φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ φ
φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφφ φφ
Φ· φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ
φ φ
φφφφ
Jsou známy různé metody, jak pro vakcínu dosáhnout adjuvantní účinek. Obecné principy a metody jsou detailně uvedeny v The Theory and Practical Application of Adjuvants, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (vyd.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, a také v Vaccines: New Generation Imunological Adjuvants, 1995, Gregoriadis G et al. (vyd.), Plenům Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, obě publikace jsou tímto zahrnuty formou odkazu v tomto textu.
Je obzvláště výhodné použít adjuvans, u kterého může být prokázáno, že usnadňuje únik autotoleranci k autoantigenům, to je ve skutečnosti esenciální v případech, kdy je použit jako účinná složka autovakcíny nemodifikovaný IL5. Neomezující příklady vhodných adjuvancií jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří imunitně cílící adjuvans, imunitně modulující adjuvans, jako je například toxin, cytokin a mykobakteriální derivát, olejový přípravek, polymer, adjuvans tvořící micely, saponin, imunostimulační komplexní matrix (ISCOM matrix), částice, DDA, hlinitá adjuvancia, DNA adjuvancia, y-inulin a opouzdřovací adjuvans. Obecně je nutné poznamenat, že výše uvedené popisy, které se týkají sloučenin a přípravků použitelných jako první, druhá a třetí skupina v analozích, se také týkají mutatis mutandis jejich použití v adjuvans vakcíny podle vynálezu.
Aplikace adjuvancií zahrnuje použití činidel, jako je například hydroxid nebo fosfát hlinitý (alum), obecně používaných jako 0,05 až 0,1 procentní roztok v pufrovaném fyziologickém roztoku, směs se syntetickými polymery sacharidů (např. Carbopol®) používanou jako 0,25 procentní roztok, agregaci proteinu ve vakcíně zahříváním při teplotách v rozmezí od 70 °C do 101°C po dobu 30 sekund až 2 minuty, v daném pořadí, a je také možná agregace prostřednictvím zkříženě vázajících činidel. Může také být použita agregace ·· ·· ·♦ ··*♦ ·· ·· ···· · · · · · 0 · • · · · * ··· · · · · · « · · · · · *»»· »« 99 «9· 99 9999 reaktivací s pepsinem ošetřenými protilátkami (Fab fragmenty) k albuminu, směsí bakteriálních buněk, jako je například C. Parvum nebo endotoxiny nebo lipopolysaccharidovými složkami gramnegativních bakterií, emulzí ve fyziologicky přijatelném oleji vehikula, jako je například mono-oleát manitu. (Aracel A) nebo emulze s 20 procentním roztokem perfluorovaných uhlovodíků (Fluosol-DA) použitým jako bloková substituce. Je také výhodná směs s oleji, jako je například skvalen a IFA.
Podle vynálezu DDA (dimethyldioktadecylamoniumbromid) je zajímavý kandidát adjuvans, jako je DNA a γ-inulin, ale také Freundovo kompletní a nekompletní adjuvans, a také saponiny z quillaja, jako je například QuilA a QS21, jsou zajímavá, jako je RIBI. Další možností jsou monofosforyllipid A (MPL), výše uvedené C3 a C3d a muramyldipeptid (MDP).
Je také známo, že lipozomové formulace mohou propůjčit adjuvantní účinky, a tudíž podle vynálezu jsou výhodná lipozomová adjuvancia.
Také adjuvancia typu imunostimulační komplexní matrix (ISCOM® matrix) jsou výhodným výběrem podle vynálezu, obzvláště protože bylo ukázáno, že tento typ adjuvans je schopen up-regulace (zvýšení počtu receptorů) exprese APC MHC třídy II. matrix ISCOM© se skládá z (volitelně
frakcionovaných) saponinů (triterpenoidů) z Quillaja
saponaría, cholesterolu a fosfolipidu. Když je přimíšen
imunogenní protein, výsledná částicová formulace je to, co je
známo jako ISCOM částice, kde saponin tvoří 60 až 70 %
(hmotnostních), cholesterol a fosfolipid 10 až 15 % (hmotnostních) a protein 10 až 15 % (hmotnostních). Detaily týkající se přípravku a použití imunostimulačních komplexů mohou být zjištěny např. Ve výše uvedených příručkách zabývajících se adjuvancii, ale také práci Morein B et al., 1995, Clin. Imunother., 3, 461-475, a také Barr IG a Mitchell ·>· · Φ • *
ΦΦΦ «« 44 • 4 φ 4 • · 4 • 4 4 • · ·
4·· · »4 ♦ · Φ
4· ΦΦΦ
44 • Φ · Φ • 4 Φ
Φ 4 4 4 • 44
44Φ4
GF, 1996, Imunol. and Cell Biol., 74, 8-25 (oba zahrnuty formou odkazu v tomto textu) poskytují použitelné instrukce pro přípravu kompletních imunostimulačních komplexů.
Další vysoce zajímavá (a tedy výhodná) možnost dosažení adjuvantního účinku je použití techniky popsané v práci Gosselin et al., 1992 (která je tímto zahrnuta formou odkazu v tomto textu). Stručně, prezentace relevantního antigenu, jako je například antigen podle předkládaného vynálezu, může být zesílena konjugací antigenu k protilátkám (nebo fragmentům vázajícím antigen) proti Fcy monocytech/makrofázích. Bylo prokázáno, že protilátkovým receptorům na zejména konjugáty mezi antigenem a anti-Fcyf imunogeničnost pro účely očkování.
zesiiuii
Další možnosti se týkají použití cílících a imunomodulačních látek (i.a. cytokinů) uvedených výše jako uvažovaných látek pro první a druhé skupiny v modifikovaných verzích IL5. V tomto spojení jsou možností také syntetické induktory cytokinů, jako jsou póly I:C.
Vhodné mykobakteriální deriváty jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří muramyldipeptid, kompletní Freundovo adjuvans, RIBI a diester trehalózy, jako je například TDM a TDE.
Vhodná imunitně cílící adjuvancia jsou vybrána ze skupiny, kterou tvoří CD40 ligand a CD40 protilátky nebo její specifické vazebné fragmenty (srovnej diskusi výše), mannóza, Fab fragment a CTLA-4.
Vhodný polymerová adjuvancia jsou vybrána ze skupiny, kterou tvoří sacharid, jako je například dextran, PEG, škrob, mannan a mannóza, plastický polymer jako takový a latex jako jsou například latexové perličky.
Ještě další zajímavý způsob modulace imunitní reakce je zahrnutí IL5 imunogenu (volitelně dohromady s adjuvancii a *« ·· 99 ·«»«»· ·« »· • · » · 9 9 9 9 9 9 9 • ♦ » · · · ·· 9 · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 9999 farmaceutickypřijatelnými nosiči a vehikuly) do virtuální lymfatické uzliny (VLN) (patentované léčebné zařízení vyvinuté firmou ImunoTherapy, lne., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tenké tubulární zařízení) napodobuje strukturu a funkci lymfatické uzliny. Vložení VLN do kůže vytvoří místo sterilního zánětu s náhlým vzestupem koncentrace cytokinů a chemokinů. T a B lymfocyty, jakož i APC rychle odpovídají na signalizaci nebezpečí, míří do zánětlivého místa a akumulují se v porézní matrix VLN. Bylo ukázáno, že dávka antigenu nutná pro vyvolání imunitní reakce na antigen je redukována při použití VLN a že imunitní protekce získaná vakcinací s použitím VLN předčí obvyklou imunizaci s použitím Ribi jako adjuvans. Technologie je i.a. Stručně popsána v práci Gelber C et al., 1998, Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Smáli Amounts of Immunogens Using A Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node, v: From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 12.-15. říjen 1998, Seascape Resort, Aptos, California.
Očekává se, že vakcína by byla podávána alespoň jednou, jako je například alespoň 1, 2, 3, 4, 5, 6a 12 krát ročně. Konkrétněji se očekává podávání jedinci, který to potřebuje, 1 až 12 krát ročně, jako je například 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 nebo 12 krát ročně. Již dříve bylo ukázáno, že paměťová imunita indukovaná použitím výhodných autovakcín podle vynálezu není permanentní a proto imunitní systém potřebuje být periodicky podněcován analogy.
Díky genetickým odchylkám mohou různí jedinci reagovat imunitními reakcemi odlišné síly na stejný polypeptid. Tedy vakcína podle vynálezu může obsahovat několik odlišných polypeptidů, aby se zvýšila imunitní reakce, srovnej také diskusi výše týkající se výběru cizorodého epitopu T
44
4 4 4 4 · 4 4
4* 4*4« • · • ··♦
44
4 4 4
4 4 »44
444 44 4444 lymfocytů pro zavedení. Vakcína může obsahovat dva nebo více polypeptidy, přičemž všechny polypeptidy jsou, jak je definováno výše.
Vakcína může dále obsahovat 3 až 20 odlišných modifikovaných nebo nemodifikovaných polypeptidů, jako například 3 až 10 odlišných polypeptidů. Ale normálně hledaný počet polypeptidů bude udržován na minimu, jako například 1 nebo 2 polypeptidy.
Očkování nukleovou kyselinou
Jako alternativa ke klasickému podávání vakcíny založené na peptidů nabízí technologie vakcinace nukleovou kyselinou (také známa jako imunizace nukleovou kyselinou, genetická imunizace a genová imunizace) velký počet přitažlivých vlastností.
Za prvé, na rozdíl od postupu s tradiční vakcínou, vakcinace nukleovou kyselinou nevyžaduje zdroje spotřebovávající produkci imunogenního agens ve velkém měřítku (např. Ve formě průmyslové fermentace mikroorganizmů produkujících modifikovaný IL5). Kromě toho není zapotřebí přístrojová purifikace a schémata skládání (refolding) imunogenu. A nakonec, protože vakcinace nukleovou kyselinou spoléhá na biochemický aparát očkovaného jedince pro vytváření expresního produktu zavedené nukleové kyseliny, očekává se, že nastane optimální posttranslační zpracování expresního produktu, což je v případě autovakcinace obzvláště důležité, protože, jak bylo uvedeno výše, může být zachována významná frakce původních IL5 epitopů B lymfocytů v modifikované molekule, a protože epitopy B principu mohou být tvořeny částí kterékoliv (např. Sacharid, lipid, protein apod.) lymfocytů v (bio)molekuly Tudíž, nativní ·· *· ···♦ ·· • · · · · · · · · · · • · · · · ·«· 9 · · ·«**·· 9 9 « · · « · · * 9 9 9 9 9
9999 99 »· ··· 99 9999 glykosylace a typy lipidace imunogenu mohou být velmi dobře důležité pro celkovou imunogeničnost, a očekává se, že je to zajištěno tím, že imunogen je produkován hostitelem.
Proto výhodné provedení vynálezu obsahuje prezentaci modifikovaného IL5 imunitnímu systému zavedením nukleové kyseliny(kyselin) kódující modifikovaný IL5 do buněk zvířete, a tím získání in vivo exprese zavedené nukleové kyseliny(kyselin) buňkami.
V tomto provedení je zavedená nukleová kyselina výhodně DNA, která může být ve formě nahé DNA, DNA formulované s nabitými nebo nenabitými lipidy, DNA formulované v lipozomech, DNA obsažené ve virovém vektoru, DNA formulované s proteinem nebo polypeptidem usnadňujícím transfekci, DNA formulované s cílícím proteinem nebo polypeptidem, DNA formulované s vápníkovými precipitačními činidly, DNA kondenzované k molekule inertního nosiče, DNA opouzdřené v polymeru, např. V PLGA (srovnej mikroopouzdřovací technologii popsanou ve WO 98/31398) nebo v chitinu či chitosanu a DNA formulované s adjuvans. V tomto kontextu je nutné poznamenat, že prakticky všechny důvody týkající se použití adjuvancií v tradiční vakcinační formulaci lze aplikovat pro formulace DNA vakcín. Proto tedy všechny popisy v tomto textu, které se týkají použití adjuvancií v kontextu vakcín založených na polypeptidech lze aplikovat mutatis mutandis na jejich použití v technologii vakcinace nukleovou kyselinou.
Co se týče způsobů podávání a aplikačních schémat vakcín založených na polypeptidech, které byly detailně popsány výše, jsou také použitelné pro vakcíny s nukleovou kyselinou podle vynálezu a všech diskuse uvedené výše týkající se způsobů podávání a aplikačních schémat pro polypeptidy lze aplikovat mutatis mutandis na nukleové kyseliny. Mělo by být
ΦΦΦ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ · · «φφφ φ φφφ φφ φ φφφ • ΦΦΦ Φ· φφ φφφ φφ φφφφ přidáno, že vakcíny s nukleovou kyselinou mohou být vhodně podávány intravenózně a intraarteriálně. Kromě toho je v oboru známo, že vakcíny s nukleovou kyselinou mohou být podávány s použitím takzvané „genové pistole (biobalistické metody), a tudíž také tento a ekvivalentní způsoby podávání j sou považovány za část předkládaného vynálezu. Konečně bylo také publikováno použití VLN pro podávání nukleových kyselin za vzniku dobrých výsledků, a proto je tento konkrétní způsob podávání zejména výhodný.
Kromě toho nukleová kyselina(kyseliny) použitá jako imunizační agens může obsahovat úseky kódující první, druhou a/nebo třetí skupinu, např. Ve formě imunomodulační látky popsané výše, jako jsou například cytokiny diskutované jako použitelná adjuvancia. Výhodná verze tohoto provedení zahrnuje kódující úsek analogu a kódující úsek imunomodulátoru v odlišných čtecích rámcích nebo alespoň pod kontrolou různých promotorů. Tímto se zabrání tomu, že analog nebo epitop je vytvořen jako fúzní partner k imunomodulátoru. Alternativně, mohou být použity dva rozdílné nukleotidové fragmenty, ale to je méně výhodné oproti výhodě zajištěné koexprese, když jsou oba kódující úseky zahrnuty v téže molekule.
V souladu s tím se vynález také týká přípravku pro indukci produkce protilátek proti IL5. Přípravek obsahuje fragment nukleové kyseliny nebo vektor podle vynálezu (srovnej diskusi o vektorech níže) a
- farmaceuticky a imunologicky přijatelné vehikulum a/nebo nosič a/nebo adjuvans, jak bylo diskutováno výše.
Za normálních okolností je nukleová kyselina kódující
IL5 variantu zavedena ve formě vektoru, přičemž exprese je pod kontrolou virového promotoru. Pro detailnější diskusi o • · · · · · • · · · · · · vektorech a DNA fragmentech podle vynálezu srovnej diskusi níže. Jsou také k dispozici detailní popisy týkající se formulace a použití vakcín s nukleovou kyselinou, srovnej Donnelly JJ et al, 1997, Annu. Rev. Imunol., 15, 617-648 a
Donnelly JJ et al., 1997, Life Sciences, 60, 163-172. Oba tyto odkazy jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu.
Živé vakcíny
Třetí alternativa pro prezentaci modifikovaného IL5 imunitnímu systému je použití technologie živé vakcíny. Při živém očkování je prezentace imunitnímu systému je prováděna podáváním zvířeti nepatogenních mikroorganizmů, které byly transformovány fragmentem nukleové kyseliny kódujícím modifikovaný IL5 nebo vektorem zavádějícím tento fragment nukleové kyseliny. Nepatogenní mikroorganizmus může být kterýkoliv vhodný oslabený bakteriální kmen (oslabbený pasáží nebo pomocí odstranění patogenních expresních produktů technologií rekombínantní DNA), např. Mycobakterie bovis BCG, nepatogenní Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, apod. Přehledy týkající se přípravy živých vakcín podle současného stavu techniky lze nalézt např. v publikacích Saliou P, 1995, Rev. Prát., 45, 1492-1496 a Walker PD, 1992, Vaccine, 10, 977-990, oba zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Pro detaily o fragmentech nukleové kyseliny a vektorech použitých v těchto živých vakcínách srovnej diskusi níže.
Jako alternativa živých bakteriálních vakcín, fragment nukleové kyseliny podle vynálezu diskutovaný níže může být zaveden do nevirulentního virového vakcinačního vektoru, jako je například kmen vakcinie nebo kterýkoliv další vhodný virus neštovic.
• · • · ···· · · · · ··· · · · · · · · · ··· ·· · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····
Normálně je nepatogenní mikroorganizmus nebo virus podáván zvířeti pouze jednou, ale v určitých případech může být nutné podávat v průběhu života mikroorganizmus více než jednou, aby byla udržována protektivní imunita. Dokonce se předpokládá, že imunizační schémata, jako jsou ta uvedena detailně výše pro vakcinaci polypeptidem, budou použitelná při použití živé nebo virové vakcíny.
Alternativně, živá nebo virová vakcinace je spojena s předešlou nebo následnou vakcinací polypeptidem a/nebo nukleovou kyselinou. Například je možné provádět primární imunizaci živou nebo virovou vakcínou, po které následuje posilovači imunizace s použitím postupu s polypeptidem nebo nukleovou kyselinou.
Mikroorganizmus nebo virus může být transformován nukleovou kyselinou(kyselinami) obsahující úseky kódující první, druhou a/nebo třetí skupinu, např. Ve formě imunomodulační látky popsané výše, jako jsou například cytokiny diskutované jako použitelná adjuvancia. Výhodná verze tohoto provedení zahrnuje kódující úsek analogu a kódující úsek imunomodulátoru v odlišných čtecích rámcích nebo alespoň pod kontrolou různých promotorů. Tímto se zabrání tomu, že analog nebo epitopy jsou vytvořeny jako fúzní partnery k imunomodulátoru. Alternativně, mohou být použity dva rozdílné nukleotidové fragmenty jako transformační přípravky. Ovšem když je první a/nebo druhá a/nebo třetí skupina ve stejném čtecím rámci, mohou poskytnout expresní produkt, analog podle vynálezu, a takové provedení je obzvláště výhodné podle předkládaného vynálezu.
Použití způsobu podle vynálezu při léčení nemocí
Jak je zřejmé z diskusí uvedených výše, způsobu podle vynálezu umožňuje kontrolu charakterizovaných eosinofilií. V tomto kontextu je klíčovým cílem vynálezeckého způsobu astma, ale také další chronické alergické stavy, jako například mnohočetná alergie a alergická rhinitis, jsou vhodný cíle pro léčení/zmírnění příznaků. Proto důležité provedení způsobu podle vynálezu down-regulace IL5 aktivity obsahuje léčbu a/nebo prevenci a/nebo zmírnění příznaků astmatu nebo dalších chronických alergických stavů charakterizovaných eosinofilií, tento způsob obsahuje down-regulaci IL5 aktivity podle způsobu podle vynálezu do takové míry, že počet významně redukován.
poskytnutí onemocnění eosinofilů je
V daném kontextu je taková významná redukce počtu eosinofilů alespoň 20% srovnání s počtem eosinofilů před léčením, ale předpokládají se vyšší procenta, jako je například alespoň 30 %, alespoň 40 60 %, alespoň 70 %, alespoň 80 %
Redukce může být systémová nebo častěji lokální, V plicích.
%, alespoň 50 %, alespoň a dokonce alespoň 90 %.
nap ř.
Počty eosinofilů jsou zjišťovány metodami v oboru známými, typicky s použitím mikroskopického vyšetření vhodného vzorku (jako je například tekutina z BAL) a počítání počtu eosinofilů manuálně v mikroskopu. Alternativně může být počet eosinofilů počítán s použitím metody průtokové cytometrie nebo jakékoliv jiné vhodné cytometrické metody schopné odlišit eosinofily.
• 4 ·· ·· ···· ·· 44 • 4 4 4 444 4444
4 4 4444 4 4 4
444 44 4 444 ·44· 44 44 4·4 4· 4444
Peptidy, polypeptidy a přípravky podle vynálezu
Jak je zjevné z výše uvedeného, předkládaný vynález je založen na myšlence imunizace jedinců proti IL5 antigenu, aby se nepřímo dosáhlo redukce počtu eosinofilů. Výhodný způsob, jak dosáhnout této imunizace je použití modifikovaných verzí IL5. a takto poskytnout molekuly, které doposud nebyly v oboru popsány.
Má se za to, že modifikované IL5 molekuly diskutované v tomto textu jsou hlavním předmětem vynálezu, a tudíž důležitá část vynálezu se týká IL5 analogu, který pochází ze zvířecího IL5. přičemž je zavedena modifikace, která má za následek to, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek zkříženě reagujících s nemodifikovaným IL5 polypeptidem. Výhodně je povaha modifikace přizpůsobena typům modifikací popsaných výše při diskusi o různých provedeních způsobu podle vynálezu při použitím modifikovaného IL5. Proto každý popis předložený v tomto textu týkající se modifikované IL5 molekuly je relevantní pro účel popsání analogů IL5 podle vynálezu a každý takový popis lze aplikovat mutatis mutandis pro popis těchto analogů.
Je nutné poznamenat, že výhodné modifikované IL5 molekuly obsahují modifikace, které mají za následek polypeptid mající sekvence identické alespoň ze 70 % s IL5 nebo s jeho subsekvencí dlouhou alespoň 10 aminokyselin. Jsou výhodné sekvence více identické, např. alespoň ze 75 % nebo dokonce alespoň z 80 % nebo z 85 %. Identita sekvencí pro proteiny a nukleové kyseliny může být vypočtena jako (Nref Ndifl * 100/Nrefr kde Ndif je celkový počet neidentických zbytků ve dvou sekvencích při porovnávání a kde Nref je počet zbytků v jedné sekvenci. Proto DNA sekvence AGTCAGTC má sekvenci identickou ze 75 % se sekvence AATCAATC (Ndif -2 a Nref = 8) .
• ·· · • · • · · ·
Vynález se také týká přípravků použitelných při provádění způsobu podle vynálezu. Proto se vynález také týká imunogenního přípravku obsahujícího imunogenně účinné množství IL5 polypeptidu, který je autoprotein pro zvíře, uvedený IL5 polypeptid je formulován společně s imunologicky přijatelným adjuvans tak, aby se dosáhlo úniku autotoleranci zvířete na IL5 polypeptid, přípravek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelné vehikulum a/nebo nosič. Jinými slovy, tato část vynálezu se týká formulace přirozeně se vyskytujících IL5 polypeptidů, které byly popsány ve spojení s provedeními způsobu podle vynálezu.
Vynález se také týká imunogenního přípravku obsahujícího imunologicky účinné množství IL5 analogu definovaného výše, uvedený přípravek dále obsahující farmaceuticky a imunologicky přijatelné ředidlo a/nebo vehikulem a/nebo nosič a/nebo excipient a volitelně adjuvans. Jinými slovy, tato část vynálezu se týká formulace modifikovaného IL5 v podstatě tak, jak bylo popsáno v tomto textu výše. Výběr adjuvancií, nosičů a vehikul je v souladu s tím, co bylo diskutováno výše při odkazech na formulace modifikovaného a nemodifikovaného IL5 pro použití ve vynálezeckém způsobu down-regulace IL5.
Polypeptidy jsou připraven podle metod v oboru známých. Delší polypeptidy jsou normálně připravovány pomocí rekombinantní genové technologie včetně zavedení sekvence nukleové kyseliny kódující IL5 analog do vhodného vektoru, transformace vhodné hostitelské buňky vektorem, exprese sekvence nukleové kyseliny, opětného získání expresního produktu z hostitelských buněk nebo jejich tkáňového supernatantu a následné purifikace a volitelné další modifikace, např. opětného skládání nebo derivatizace.
Kratší peptidy jsou výhodně připraveny pomocí známých technik syntézy peptidu na pevné nebo tekuté fázi. Ale • · ·· ···· nedávné pokroky této technologie poskytly možnost produkce kompletních polypeptidů a proteinů těmito prostředky, a tudíž je také v rozsahu předkládaného vynálezu připravit dlouhé konstrukty syntetickými prostředky.
Fragmenty nukleove kyseliny a vektory podle vynálezu
Z výše uvedeného popisu se uznává, že modifikované IL5 polypeptidy mohou být. připraveny prostředky rekombinantní genové technologie, ale také prostředky chemické syntézy nebo semisyntézy: tyto dvě druhé uvedené možnosti jsou obzvláště spočívá v kondenzaci například KLH, difterický a neproteinovým molekulám, polymery a ovšem také, když postranních řetězců nebo řetězci pocházejícímu z IL5 relevantní, když modifikace k proteinovým nosičům (jako je toxoid, tetanický toxoid a BSA) jako jsou například sacharidové modifikace zahrnuje adici postranních skupin k peptidovému polypeptidu.
Pro účely rekombinantní genové technologie a ovšem také pro účely imunizace nukleovou kyselinou jsou fragmenty nukleové kyseliny kódující modifikovaný IL5 důležité chemické produkty. Proto se důležitá část vynálezu týká fragmentu nukleové kyseliny, který kóduje IL5 analog, t j . Polypeptid pocházející z IL5. který obsahuje buď přírodní IL5 sekvenci, ke které byl přidán nebo vložen fúzní partner nebo výhodně polypeptid pocházející z IL5. do kterého byl zaveden cizorodý epitop T lymfocytu pomocí inzerce a/nebo adice, výhodně pomocí substituce a/nebo delece. Fragmenty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou buď DNA nebo RNA fragmenty.
Fragmenty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou normálně vloženy do vhodných vektorů za vzniku klonovacích nebo expresních vektorů nesoucích fragmenty nukleové kyseliny ·· ·· ·· ···· 44 44 • 4 4 · 444 « · · 4
4 4 4 · 4 4 « 4 4
444 44 4 444
4444 44 44 444 «4 4444 podle vynálezu, tyto nové vektory jsou také částí vynálezu. Detaily týkající se konstrukce těchto vektorů podle vynálezu budou diskutovány v kontextu transformovaných buněk a mikroorganizmů níže. Vektory mohou být, v závislosti na účelu a typu aplikace, ve formě plazmidů, fágů, kosmidů, minichromozomů nebo viru, ale také nahá DNA, která je exprimována pouze přechodně v určitých buňkách, je důležitý vektor. Výhodné klonovací a expresní vektory podle vynálezu jsou schopné autonomní replikace, a tím umožní vysoké počty kopií pro účely vysokého stupně exprese nebo vysokého stupně replikace pro následné klonování.
Obecný profil vektoru podle vynálezu obsahuje následující charakteristické rysy ve směru 5'- 3' a v operativní vazbě: promotor pro řízení exprese fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu, volitelně sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid umožňující sekreci (do extracelulárního prostoru nebo, kde použitelné, do periplazmy) nebo integraci polypeptidového fragmentu do membrány, fragment nukleové kyseliny podle vynálezu a volitelně sekvenci nukleové kyseliny kódující terminátor. Při zacházení s expresními vektory v producentských kmenech nebo buněčných liniích je pro účely genetické stability transformované buňky výhodné, když je vektor po zavedení do hostitelské buňky integrován do genomu hostitelské buňky. Na rozdíl od toho při zacházení s vektory, které budou použity pro provádění in vivo exprese ve zvířeti (tj. Při použití vektoru pro DNA očkování) je z bezpečnostních důvodů výhodné, když vektor není schopen integrace do genomu hostitelské buňky, typicky jsou použity nahá DNA nebo neintegrující virové vektory, jejichž výběr je odborníkovi znám.
Vektory podle vynálezu jsou použity pro transformaci hostitelských buněk, aby tvořily modifikovaný IL5 polypeptid ·· ·· φφ ···· ·· φφ φφφφ φφφ φφφφ • ΦΦ · ♦ ··· φφ φ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφ Φ·Φ ·Φ φφφφ podle vynálezu. Tyto transformované buňky, které jsou také částí vynálezu, mohou být pěstované buňky nebo buněčné linie použité pro propagaci fragmentů nukleové kyseliny a vektorů podle vynálezu nebo použité pro rekombinantní produkci modifikovaných IL5 polypeptidů podle vynálezu. Alternativně transformované buňky mohou být vhodné kmeny pro živou vakcínu, kam fragmenty nukleové kyseliny (jedna jediná nebo mnohočetné kopie) byly vložen tak, aby se provedla sekrece nebo integrace do bakteriální membrány nebo buněčné stěny modifikovaného IL5.
Výhodné transformované buňky podle vynálezu jsou mikroorganizmy, jako jsou například bakterie (jako je například druh Escherichia [např. E. coli], Bacillus [např. Bacillus subtilis], Salmonella nebo Mycobakterie [výhodně nepatogenní, např. M. Bovis BCG]), kvasinky (jako je například Saccharomyces cerevisiae} a protozoa. Alternativně transformované buňky pocházejí z mnohobuněčných organizmů, jako jsou například houby, hmyzí buňky, rostlinné buňky nebo savčí buňky. Nejvýhodnější jsou buňky pocházející z člověka, srovnej diskusi o buněčných liniích a vektorech níže. Bylo ukázáno, že nedávné výsledky jsou slibné, co se týče použití komerčně dostupné buněčné linie Drosophila melanogaster (Schneider 2 (S2)buněčná linie a vektorový systém k dispozici od firmy Invitrogen) pro rekombinantní produkci analogů IL5 podle vynálezu, a tudíž tento expresní systém je obzvláště výhodný.
Pro účely klonování a/nebo optimalizované exprese je výhodné, že transformovaná buňka je schopna replikace fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu. Buňky exprimující nukleový fragment jsou výhodná použitelná provedení vynálezu, mohou být použity pro přípravu modifikovaného IL5 v malém • 4 44 44 4444 44 44
4*44 4«· 4444
4 4 4 4 4 4 4 4 4
444 44 4 444
4444 44 44 444 ·4 4444 nebo větším měřítku nebo, v případě nepatogenních bakterií, jako součásti vakcíny v živé vakcíně.
Při produkci modifikovaného IL5 podle vynálezu pomocí transformovaných buněk je pohodlné, ačkoliv není nutné, když je buď expresní produkt exportován do kultivačního média nebo nesen na povrch transformované buňky.
Když byla identifikována účinná producentská buňka, je výhodné na jejím základě založit stabilní buněčnou linii, která nese vektor podle vynálezu a která exprimuje fragment nukleové kyseliny kódující modifikovaný IL5. Výhodně, tato stabilní buněčná linie sekretuje nebo nese IL5 analog podle vynálezu, a tím usnadňuje jeho purifikaci.
Obecně, plazmidové vektory obsahující replikon a kontrolní sekvence, které pocházejí z živočišných druhů kompatibilních s hostitelskou buňkou, jsou použity ve spojení s hostiteli. Vektor obyčejně nese místo replikace, a také markerové sekvence, které jsou schopné poskytnout fenotypovou selekci v transformovaných buňkách. Například E. coli je typicky transformovaná s použitím pBR322, plazmidu pocházejícího z druhu E. coli (viz např. Bolivar et al., 1977). Plazmid pBR322 obsahuje geny pro rezistenci na ampicilin a tetracyklin, a tedy poskytuje snadný prostředek pro identifikaci transformovaných buněk. Plazmid pBR nebo jiný mikrobiální plazmid nebo fág musí také obsahovat nebo být modifikován tak, aby obsahoval, promotory, které mohou být použity prokaryotickým mikroorganizmem pro expresi.
Promotory nejčastěji používané v prokaryotických rekombinantních DNA konstruktech obsahují B laktamázu (penicilinázu) a laktózové promotorové systémy (Chang et al., 1978, Itakura et al., 1977, Goeddel et al., 1979) a tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel et al. , 1979,
EP-A-0 036 776) . I když tyto jsou nejčastěji používané, byly
44 ·· 4444 ·· ·· • 444 444 4444 • · 4 4 ·*·· · « φ
444 4 4 · · · 4 •444 44 44 444 «4 4444 objeveny a používány další mikrobiální promotory a byly publikovány detaily týkající se jejich nukleotidové sekvence, což umožňuje zkušeným odborníkům ligovat je funkčně s plazmidovými vektory (Siebwenlist et al., 1980). Určité geny z prokaryot mohou být exprimovány účinně v E. coli z jejich vlastních promotorových sekvencí, což vylučuje potřebu přidávání dalšího promotoru umělými prostředky.
Kromě prokaryot mohou také být použity eukaryotické mikroby, jako jsou například kvasinkové kultury a zde by měl být promotor schopen řízení exprese. Nej častěji používaný eukaryotický mikroorganizmus je Saccharomyces cerevisiase nebo běžné pekařské droždí, ačkoliv obecně je k dispozici velký počet dalších kmenů. Pro expresi v Saccharomyces je obecně používán například plazmid YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Kingsman et al., 1979, Tschemper et al., 1980). Tento plazmid již obsahuje trpí gen, který poskytuje selekční markér pro mutantní kmen kvasinek, který nemá schopnost růstu v tryptofanu, například kmen ATCC č. 44076 nebo PEP4-1 (Jones, 1977). Přítomnost trpí léze jako charakteristiky kvasinkového genomu hostitelské buňky pak poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace růstem v nepřítomnosti tryptofanu.
Vhodné promotorové sekvence v kvasinkových vektorech obsahují promotory pro 3-fosfoglycerátkinázu (Hitzman et al., 1980) nebo další glykolytické enzymy (Hess et al., 1968, Holland et al·., 1978), jako je například enoláza, giyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza, pyruvátdekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfátisomeráza, 3-fosfoglycerátmutáza, pyruvátkináza, triosefosfátisomeráza, fosfoglukózoisomeráza a glukokináza. Při konstrukci vhodných expresních plazmidů jsou terminační sekvence spojené s těmito geny také ligovány do expresního vektoru ve směru 3' od • · Β· ·· · · 9 · ·Β ·· • · · · Β · · Β · Β · • · « · ···· · Β · • · · · * Β Β fc Β ···· ·· ·· ··· ·Β ···« sekvence, kterou je žádoucí exprimovat, aby byla zajištěna polyadenylace mRNA a terminace.
Jiné promotory, které mají další výhodu transkripce řízené růstovými podmínkami, jsou úsek promotoru pro alkoholdehydrogenázu 2, izocytochrom C, kyselou fosfatázu, degradační enzymy spojené s dusíkovým metabolizmem a výše uvedená glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza a enzymy zodpovědné pro využití maltózy a galaktózy. Je vhodný každý plazmidový vektor obsahující promotor kompatibilní s kvasinkami, počátek replikace a terminační sekvence.
Kromě mikroorganizmů mohou být také použity jako příjemci kultury buněk pocházejících z mnohobuněčných organizmů. V principu je zpracovatelná každá taková buněčná kultura, ať už z tkáňové kultury od obratlovce nebo bezobratlého živočicha. Ale největší zájem je o buňky obratlovců a propagace buněk obratlovců v kultuře (tkáňová kultura) se v současnosti stala rutinním postupem (Tissue Culture, 1973). Příklady těchto použitelných hostitelských buněčných linií jsou buňky VĚRO a HeLa, buněčné linie z vaječníků čínského křečka (CHO) a buňky W138, BHK, COS293, Spodoptera frugiperda (SF) (komerčně dostupné jako kompletní expresní systémy od i.a. Firmy Protein Sciences, 1000 Reseach Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. a od firmy Invitrogen) a buněčné linie MDCK. V předkládaném vynálezu je obzvláště výhodná buněčná linie S2 k dispozici od firmy Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandsko.
Expresní vektory pro tyto buňky obyčejně obsahují (je-li nutné) počátek replikace, promotor lokalizovaný před exprimovaným genem, spolu s kterýmkoliv nezbytným ribozomálním vazebným místem, místy sestřihu RNA, polyadenylačním místem a sekvencí terminátoru transkripce.
*· ·« ·♦ »· «·«· · · * Α 4 « « • · Α ··*>·· ·1 ϊ * · ··· · ··· · · • · · ·· · · · « ···· ·· ·· ·«» «« «·«·
Pro použití v savčích buňkách jsou kontrolní funkce expresních vektorů často poskytnuty virovým materiálem. Například obecně používané promotory pocházejí z polyoma, adenovirus 2 a nejčastěji z opičího viru 40 (SV40). Časné a pozdní promotory SV40 viru jsou obzvláště užitečné, protože oba lze snadno získat z viru jako fragment, který také obsahuje počátek replikace SV40 viru (Fiers et al., 1978). Mohou být také použity menší nebo větší SV40 fragmenty za předpokladu, že je zahrnuta sekvence o velikosti přibližně 250 bp šířící se z místa HindlII k místu BglI lokalizovanému ve virovém počátku replikace. Dále je také možné a často žádoucí, použít promotorové nebo kontrolní sekvence normálně sdružené s požadovanou genovou sekvencí, za předpokladu, že tyto kontrolní sekvence jsou kompatibilní s hostitelskými buněčnými systémy.
Počátek replikace může být zajištěn buď konstrukcí vektoru obsahujícího exogenní počátek, jako například může pocházet z SV40 nebo jiných virů (např. Polyoma, adeno, VSV, BPV) nebo může být zajištěn chromozomálním mechanismem replikace hostitelské buňky. Jestliže je vektor integrován do chromozomu hostitelské buňky, je tento často postačující.
Identifikace použitelných analogů IL5
Odborníkovi je jasné, že ne všechny varianty nebo modifikace nativního IL5 budou mít schopnost vyvolat tvorbu protilátek u zvířete, které zkříženě reagují s nativní formou. Není ale obtížné sestavit účinný standardní screening modifikovaných IL5 molekul, které splní minimální požadavky na imunologickou reaktivitu diskutovanou v tomto textu. Proto se další část vynálezu týká způsobu identifikace modifikovaného IL5 polypeptidu, který je schopen indukovat protilátky proti nemodifikovanému IL5 u živočišného druhu, * · 9
9» 1* ** 9 * · ♦ · ♦ »9 • 9 9 9 · ··# 9 9 9
999 9 999 9 9
99 99 9 999
9999 99 99 999 99 9999 kde je nemodifikovaný IL5 polypeptid autoprotein, tento způsob obsahuje
- přípravu peptidovou syntézou nebo prostředky molekulární biologie sady vzájemně rozdílných modifikovaných IL5 polypeptidu, kde aminokyseliny byly přidány, vloženy, odstraněny nebo substituovány v aminokyselinové sekvenci IL5 polypeptidu živočišného druhu, a tím založit aminokyselinové sekvence v sadě, které obsahují epitopy T lymfocytu, které jsou cizorodé pro živočišný druh nebo přípravu sady fragmentů nukleové kyseliny kódující sadu vzájemné rozdílných modifikovaných IL5 polypeptidů,
- testování členů sady na jejich schopnost indukovat produkci protilátek proti nemodifikovanému IL5 živočišným druhem, a
- identifikaci a volitelně izolaci člena(členů) sady, který významně indukuje produkci protilátek proti nemodifikovanému IL5 v živočišném druhu nebo identifikaci a volitelně izolaci polypeptidových expresních produktů kódovaných členy sady fragmentů nukleové kyseliny, které významně indukují produkci protilátek proti nemodifikovanému IL5 polypeptidu v živočišném druhu.
V tomto kontextu sada modifikovaných IL5 polypeptidů je modifikovaných IL5 polypeptidů, které byly vybrány např. na základě kritérií diskutovaných výše (např. V kombinace se studiemi cirkulárního dichroismu, NMR spekter a/nebo typu rentgenové difrakce). Sada se může skládat z pouze několika členů, ale předpokládá se, sada může obsahovat několik set členů. Podobně sada fragmentů nukleové kyseliny je kolekce neidentických fragmentů nukleové kyseliny, každý fragment kóduje modifikovaný IL5 polypeptid vybraný stejným způsobem.
vzájemně rozdílných kolekce neidentických ·· ·· ·· ···· ·· ·· ···· ··· · · · · • · · · · · · · · · · • · · ·· · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····
Test členů sady může být nakonec prováděn in vivo, ale může být použit velký počet in vitro testů, které zúží počet modifikovaných molekul, které budou sloužit účelu vynálezu.
Protože cílem zavedení cizorodých epitopů T lymfocytů je podporovat reakci B lymfocytů pomocí T lymfocytů, je bezpodmínečně nutné, aby byla modifikovaným IL5 indukována proliferace T lymfocytů. Proliferace T lymfocytů může být testována standardizovanými proliferačními testy in vitro. Stručně, od pacienta je získán vzorek bohatý na T lymfocyty a je pak udržován v kultuře. Pěstované T lymfocyty jsou uvedeny do kontaktu s APC pacienta, které již dříve nabraly modifikovanou molekulu a zpracovaly ji pro prezentaci epitopům T lymfocytů. Proliferace T lymfocytů je monitorována a srovnána s vhodnou kontrolou (např. S T lymfocyty v kultuře v kontaktu s APC, které zpracovaly intaktní nativní IL5). Alternativně, proliferace může být hodnocena na základě určování koncentrace relevantních cytokinů uvolňovaných T lymfocyty jako reakce na jejich rozpoznávání cizorodých T lymfocytů.
Je-li vysoce pravděpodobné, alespoň jeden modifikovaný IL5 ze sady je schopen indukovat produkci protilátky proti IL5. je možné připravit imunogenní přípravek obsahující alespoň jeden modifikovaný IL5 polypeptid, který je schopen indukovat protilátky proti nemodifikovanému IL5 u živočišného druhu, kde nemodifikovaný IL5 polypeptid je autoprotein, způsob obsahuje smíchání člena(členů) sady, který významně indukuje produkci protilátek v živočišném druhu, který reaguje s IL5. s farmaceuticky a imunologicky přijatelným nosičem a/nebo vehikulem a/nebo ředidlem a/nebo excipientem, volitelně v kombinaci s alespoň jedním farmaceuticky a imunologicky přijatelným adjuvans.
··· · · · · · · · · • · · ····· ·· · • · · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ····
Podobně je také možné připravit imunogenní přípravek, který jako imunogen obsahuje fragment nukleové kyseliny kódující imunogenní IL5 analog, srovnej diskusi o vakcinaci nukleovou kyselinou výše.
Výše uvedené aspekty vynálezu jsou obyčejně prováděny výchozí přípravou velkého počtu vzájemně rozdílných sekvencí nukleové kyseliny nebo vektorů podle vynálezu, jejich zavedení do vhodných expresních vektorů, transformace vhodných hostitelských buněk vektory a exprese sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu. Tyto kroky pak mohou být následovány izolací expresních produktů. Je výhodné, když jsou sekvence nukleové kyseliny a/nebo vektory připraveny metodami používajícími techniku molekulární amplifikace, jako je například PCR, nebo syntézou nukleových kyselin.
Příklady provedení vynálezu
Návrh vakcíny
Uvažované příklady IL5 autovakcíny jsou konstruovány podle koncepce AutoVac™ (popsáno detailně ve WO 95/05849) substitucí známých všeobecných epitopů T lymfocytů proteinu humánního IL5 divokého typu. Substituce jsou peptidové substituce, kde vložený peptid může být stejně nebo rozdílně dlouhý, než odstraněný peptid v sekvenci divokého typu.
Pro počáteční průkaz koncepce in vivo testováním a screeningem bylo rozhodnuto připravit konstrukty myší IL5 sekvence. Jako příklad jsou použity jako substituující peptidy epitopy tetanického toxoidu P2 (sekv. id. č. 23) a P30 (sekv. id. č. 24), ale podle předkládaného vynálezu by mohl být použit každý další vhodný peptid obsahující nebo vytvářející všeobecný TH epitop.
• 4 « · •« ·· ···· ·· • · · · · · » φ
4 4 4444 4 4 ·
4444 44 44 444 4· 4444
Je nutné zdůraznit, že velikost molekuly (115 zbytků) ve srovnání s velikostí substitucí (15 nebo 21 zbytků pro P2 a P30, v daném pořadí) silně omezuje možná místa strukturních nedestruktivních inzercí. Protože disulfidové můstky jsou pro dimerizaci důležité, ale ne nutné, jsou některé varianty vytvořeny v párech +/- eliminace cysteinů.
V konstrukci uvažovaných molekul byly brány do úvahy dva základní parametry. Zaprvé, zkoušela se zachovat maximální část trojrozměrné struktury divokého typu hIL5. a tím uchovat nativní repertoár epitopů B lymfocytu. To je podporováno autory Dickason et al., (1994), kteří prokázali, že IL5 epitopy B lymfocytu známé jako neutralizační jsou konformační. Uchování terciární struktury je dosaženo zavedením modifikací v strukturně neutrálních místech, jako jsou například kličky nebo oddělené segmenty. Fakt, že Nkoncový helix A spolu s helixy B a C jsou schopny se skládat do kvartérní struktury s druhou molekulou, ukazuje, že tyto 3 helixy vytvářejí stabilně sestavenou strukturní kostru.
Zadruhé byla brána do úvahy biologická aktivita ve vztahu ke koncepci vakcíny. Obecně je výhodný inaktivní konstrukt se zřetelem ke snížení předpokládaných toxických účinků molekul a obecně pro vyhodnocení imunitní reakce. Na druhé straně, optimální neutralizační protilátky by teoreticky měly projevit specifičnost pro část IL5. která interaguje s IL5R. To se nejpravděpodobněji dosáhne imunizací aktivní variantou. Konečně, není nemožné, že biologický účinek IL5 na imunitní systém může působit jako zesilovač imunitní reakce, tedy zlepšuje obecný účinek. Ale na základě předešlých zkušeností původce s dalšími molekulami lze očekávat, že většina teoreticky možných aktivních konstruktů bude mít nízkou nebo žádnou aktivitu.
Tedy, všechny navrhované varianty jsou potenciálně aktivní ale mohou být, je-li to žádoucí, relativně snadno inaktivovány zabráněním vytvoření aktivního dimeru nebo alteracemi v úsecích A- a D-helixů, které jsou zapojeny do receptorové vazby/aktivace.
Souhrnem, výše uvedené úvahy o zachování struktury a biologické aktivitě definují jako cílové úseky kteroukoliv z kliček 1 až 3, a také C-koncovou flexibilní oblast.
Klička 3 je vybrána jako primární cílová oblast, protože je strukturně oddělena od předpokládané trojšroubovicové kostry. Protože je dále možné vytvořit biologicky aktivní monomer, elongací kličky 3 (Dickason, 1996), obsahuje tato oblast možnosti pro vytvoření všech typů variant: monomer/dimer a aktivní/inaktivní.
Klička 1 je druhá oblast obsahující nešroubovicový úsek délky vhodné pro substituce. Varianty z tohoto úseku jsou teoreticky aktivní pouze tehdy, když jsou schopné dimerizace, ale protože délka kličky divokého typu ji činí spíše flexibilní, je racionální očekávat správné složení proteinu po substituci.
Varianty obsahující substituce v oblasti kličky 2 budou také aktivní pouze jako dimery. Oblast, která může být substituována, je krátká ve srovnání s inzerty a má centrální polohu v předpokládané strukturní kostře, což jsou dvě charakteristické vlastnosti kličky 2, které by mohly zabránit správnému složení proteinu po substituci. Ne druhé straně, klička 2 je situována naproti k oblasti interagující s IL5R, což má za následek očekávanou optimální prezentaci neutralizačních epitopů divokého typu, jestliže je modifikovaný protein správně složen.
• ·
Nakonec, jsou navrhovány inzerty v C-koncovém flexibilním úseku po helixu D. Z hlediska proteinové struktury tato koncepce vypadá docela bezpečně, ale je pravděpodobné, že modifikace v dimerizaci, tak biologickou modifikovaný protein dimerizován) protože C-koncová část je lokalizována v oblasti jak vazby receptorů, tak ve styčné tomto úseku ovlivní aktivitu (jestliže jak je ploše dimeru.
Aminokyselinové sekvence 10 variant původně konstruovaných podle výše uvedených úvah jsou uvedeny jako sekv. id. č. 2 až 11 a 13 až 22. Další varianty konstruované později jsou uvedeny v sekv. id. č. 27 až 59 (včetně DNA sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí).
Je nutné poznamenat, že všechny inzerty kromě těch podle příkladu 2 jsou připraveny tak, aby obsahovaly hraniční aminokyselinové zbytky, které jsou zachovány z hIL5 do mIL5. aby podporovaly proces úspěšného přenosu pozitivních konstruktů z myší na člověka.
V následujících příkladech jsou pozice pro substituce označované podle čísel aminokyselinových zbytků v myší sekvenci, odpovídající humánní pozice jsou dány v závorkách.
Příklad 1
Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 3 při zachování Cys84 (86)
Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 3 při zabránění eliminaci Cys89(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 2 a 28 (humánní), kde aminokyseliny 87-90 nebo 88-91 jsou substituovány, a sekv. id. č. 13 a 46 (myší), kde aminokyseliny 85-88 nebo 86-89 jsou substituovány) jsou ·· ·· ·· ···· ·· ·· • · ♦ a · » · ···· • · · · · · · · · · · • · ··· · · · · · · ··· ·· · · · · ·>·· ·· 99 999 99 9999 potenciálně aktivní jako monomery (díky elongaci kličky 3) a jako dimery. Sekv. id. č. 28 a 46 jsou také označeny hIL5.1 a mIL5.1, v daném pořadí.
Příklad 2
Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 1 při zachování Cys42 (44)
Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 1 při zabránění eliminaci Cys42(44). Tyto varianty (sekv. id. č. 3 a 36 (humánní), kde aminokyseliny 32-43 nebo 33-43 jsou substituovány, a sekv. id. č. 14 a 56 (myší) , kde aminokyseliny 30-41 nebo 31-41 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery. Sekv. id. č. 36 a 56 jsou také označeny hIL5.5 a mIL5.5, v daném pořadí.
Příklad 3
Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 2
Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 2. Tyto varianty (sekv. id. č. 4 a 34 (humánní) , kde aminokyseliny 59-64 jsou substituovány, a sekv. id. č.15 a 50 (myší), kde aminokyseliny 57-62 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery. Sekv. id. č. 34 a 50 jsou také označeny hIL5.4 a mIL5.4, v daném pořadí.
Příklad 4
Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 3 při eliminaci
Cys84 (86)
4 4 4 ·· 4 · 4 · ·· 4 4
4 4 4 4·· 4*4*
4 4 4444 4 4 4
444 44 4 444
4444 44 44 4·4 44 4444
Epitop Ρ2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 3 při eliminaci Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 5 a 38 (humánní), kde aminokyseliny 86-91 jsou substituovány, a sekv. id. č. 16 a 54 (myší), kde aminokyseliny 84-89 jsou substituovány) jsou v principu podobné jako varianty typu č.
(sekv. id. č. 2 a 28 a 13 a 46), ale vytvoření monomerních produktů bylo usnadněno inhibicí tvorby disulfidových můstků a upravením délky kličky 3. Sekv. id. č. 38 a 54 jsou také označeny hIL5.6 a mIL5.6, v daném pořadí.
Příklad 5
Varianty s P2 substituujícím pozice 108-111 (110-113) v
C-koncové oblasti
Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v C-koncové oblasti následující po helixu D. Tyto varianty (sekv. id. č. 6 a 17) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimer.
Příklad 6
Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 3 při zachování Cys84 (36)
Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 3 při zabránění eliminaci Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 7 a 40 (humánní), kde aminokyseliny 88-91 nebo 87-90 jsou substituovány, a sekv. id. č. 18 a 58 (myší) , kde aminokyseliny 85-88 nebo 86-89 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní jako monomery (díky elongaci kličky 3) a jako dimery. Sekv. id. č. 40 a 58 jsou také označeny hIL5.7 a mIL5.7, v daném pořadí.
·· ·· • · ·
·· ····
Příklad 7
Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 1 při zachování Cys42 (44)
Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 1, při zabránění eliminaci Cys42(44). Tyto varianty (sekv. id. č. 8 a 30 (humánní), kde aminokyseliny 32-43 jsou substituovány, a sekv. id. č. 19 a 48 (myší) , kde aminokyseliny 30-41 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery. Sekv. id. č. 30 a 48 jsou také označeny hIL5.2 a mIL5.2, v daném pořadí.
Příklad 8
Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 2
Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 2. Tyto varianty (sekv. id. č. 9 a 20, kde aminokyseliny 59-64 a 57-62 jsou substituovány, v daném pořadí) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery.
Příklad 9
Varianty s P30 substituujícím pozice v C-koncové oblasti
Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v C-koncové oblasti následující po helixu D. Tyto varianty (sekv. id. č. 10 a 21, kde aminokyseliny 110-113 a 108-111 jsou substituovány, v daném pořadí) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery.
·· 44 44 ···· 44 44 • 444 4 4 4 4 4 4 4 ·· · · 4 · · · 4 4 ·
444 44 4 444 • 444 44 44 4·· 44 4444
Příklad 10
Varianty s P2 substituujícím pozice 84-89 (86-91) a P30 substituujícím pozice 110-113
Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 3 při eliminaci Cys84(86) a epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v C-koncové oblasti následující po helixu D. Pouze tyto varianty (sekv. id. č. 11 a 22) jsou spolu s variantami typu č. 12 jediné obsahující oba epitopy a jsou potenciálně aktivní monomery.
Příklad 11
Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 3 při eliminaci Cys84 (86)
Epitop P2 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 3 při eliminaci Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 42 (humánní), kde aminokyseliny 86-91 jsou substituovány, a sekv. id. č. 58 (myší), kde aminokyseliny 84-89 jsou substituovány) jsou v principu podobné jako varianty typu č. 6, ale vytvoření monomerních produktů bylo usnadněno inhibici tvorby disulfidového můstku a upravením délky kličky 3. Sekv.
id. č. 42 a 58 pořadí. j sou také označeny hIL5.12 a mIL5.12, v daném
Příklad 12
Varianty s P2 a P30 substituuj ícími pozice v kličce 3
P2 (sekv. id. č. 23) a P30 (sekv. id . č. 24) epitopy
jsou substituovány v kličce 3 při zachování Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 44 a 60, kde aminokyseliny 88-91 a 8699 99 • 9 9 9
9· 9
9 9
9999 »· ·· • · · · • · · ·· »0··
9999 99 jsou substituovány, v daném pořadí) obsahují oba epitopy a jsou potenciálně aktivní monomery. Sekv. Id. č. 44 a 60 jsou také označeny hIL5.13 a mIL5.13, v daném pořadí.
Příklad 13
Výběr expresního systému
Rekombinantní IL5 byl exprimován v celé řadě odlišných expresních systémů včetně kvasinek, hmyzích buněk a buněk CHO (Tavernier et al., 1989).
Podle předkládaného vynálezu je jedním vhodným expresním systémem E. coli, na základě předešlých studií publikujících použití tohoto hostitele pro produkci hIL5 (Proudfoot et al., 1990, Graber et al., 1993). Rekombinantní protein je exprimován jako inkluzní tělíska, která jsou konvertována na biologicky aktivní dimer po purifikací a opětném složení (např. S použitím obecně použitelné metody opětného složení popsané v patentu Spojených Států č. 5 739 281). Rychlost a jednoduchost exprese v E. coli umožňuje okamžitý počátek produkce proteinu, když jsou hotové genetické konstrukty, a tedy usnadnění rychlé tvorby materiálu pro stanovení in vivo důkazu koncepce IL5 autovakcíny.
Jestliže je z některého důvodu zjištěno, že proveditelnost je příliš špatná (např. příliš nízký výtěžek opětného složení, nestabilita produktů nebo zlepšené farmakokinetické parametry ve vztahu ke glykosylaci apod.), může být v dalším rozvoji uvažováno o produkci autovakcíny v kvasinkách.
Nedávno byly získány slibné výsledky s použitím expresního systému Drosophila melanogaster s použitím S2 buněk (k dispozici od firmy Invitrogen) a v současnosti íl »· ·« »*»« ·* 44 • · · · 4 · 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4444 4 4 4
444 44 4 444
4444 44 44 ·»· 44 4444 provedení pro expresi produkována buňkami S2 IL5 konstrukty. Bylo buněk a pořadí. Sondergaarda představuje tento systém výhodné analogů IL5 podle vynálezu.
IL5 varianta proteinu byla Orosophila trvale exprimujícími testováno několik různých transfekčních metod a byly vybrány Ca2PO4 a Lipofectin. Byly použity dva odlišné subklony S2 byly transfekovány Ca2PO4 a Lipofectinem, v daném Tyto dva klony byly získány z ATCC a Larse z Univerzity v Kodani, v daném pořadí.
S použitím obou metod byly vybrány vhodné stabilní linie exprimující mIL5 a mIL5.1 proteiny v rozmezí 2-10 mg/1. Materiál a metody
S2 buňky byly pěstovány a udržovány v Schneiderově médiu (Sigma) obsahujícím 5 až 10 % fetálního telecího séra (FCS), 0,1 Pluronic F68 (Sigma), penicilin/streptomycin (Life Technologies), pěstovány v třepacích baňkách v 25°C a 120 rpm.
Transfekce Lipofectinem byly prováděny ve 250 ml nebo 1 1 třepacích baňkách. S2 buňky byly rozděleny po 2,5-3 x 106/ml do 50 ml Excell 420 (JRH Biosciences) bez antibiotik a pěstovány přes noc ve 250 ml třepacích baňkách. Příští ráno byly připraveny reagencie Lipofectinu: zkumavka 1) 300-1200 μg plazmidové DNA obsahující zkoumaný gen, plus 15-60 μg pCoHYGRO hygromycinového selekčního plazmidů (20:1 poměr plazmidů) v 15-45 ml séra a médiu bez doplňku, zkumavka 2) 1 ml Lipofectinu v 5 ml séra a médiu bez doplňku. Po 1 hodině při teplotě místnosti byly zkumavky 1 a 2 smíchány a ponechány po dobu 15 minut při teplotě místnosti před pozvolným přidáním k S2 buňkám. Po pěstování buněk přes noc bylo přidáno nové plně doplněné médium plus 150-300 μg/ml Hygromycinu.
ΊΟ «© 99 >©
4 9 9 4 9 9 9 9 9 9
9 4 * » · 99 4 4 4
9 4 4 4 4 4 4 4 4 4
4 4 9 4 4 4 4 4
4444 49 94 444 44 4444
Linie s tranzientní a trvalou expresí byly indukovány buď s 500 μΜ síranu měďnatého nebo 10 μΜ chloridu kademnatého po dobu 48-72 hodin v médiu Ex-cell 420 bez séra (JRH Biosciences).
Výsledky
Pomocí Ca2PO4 bylo vytvořeno 33 stabilních linií a pomocí Lipofectinu 23. Výtěžky exprese kolísaly od nedetekovatelných až do 11 mg/1. Následující tabulka shrnuje několik linií použitých pro produkci proteinu.
Shrnutí výsledků exprese mIL5 z nej lepších S2 buněčných transfekcí
Plazmid Konstrukt S2 buňky Metoda transfekce Výtěžek
p612 IL5/Hisl5/mIL5wt ATCC Ca2PO4 3,5 mg/1
p767 Bip/Hisl5/mIL5wt LS Lipofectin 11 mg/1
p613 IL5/Hisl5/mIL5.1 ATCC Ca2PO4 2,6 mg/1
p768 Bip/Hisl5/mIL5.1 ATCC Ca2PO4 0*
p619 IL5/Hisl5/mIL5.5 LS Lipofectin 0*
* expresní plazmid obsahoval mutace sekvence.
S2 buňky mohou být tedy transfekovány buď precipitací s fosforečnanem vápenatým nebo Lipofectinem. Díky rozdílu ve stupni exprese mezi plazmidy p612 a p767 se zdá, že signální peptid Bip je účinnější vedoucí sekvence než endogenní mIL5 vedoucí sekvence v S2 buňkách.
Příklad 14
Screening a selekce modifikovaných molekul
Po expresi je rekombinantní protein purifikován a posouzen. Charakterizace uvažovaných autovakcín zahrnuje • · • · • · ··· · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ···· analytickou chromatografií, izoelektrické zaostření (IEF), SDS-PAGE, analýz kompozice aminokyselin, N-koncovou sekvenační analýzu, hmotnostní spektrometrii, analýzu rozptylu laserového záření pod nízkým úhlem, standardní spektroskopii a cirkulární dichroismus do takové míry, že přesně dokumentují relevantní parametry definující zamýšlený proteinový produkt.
Proteiny značené His byly až donedávna purifikovány s použitím dvoustupňového postupu. Ale výtěžek a čistota po konečném kroku s chelátem nebyly tak vysoké, jak bylo očekáváno. Nový jednostupňový postup purifikace zNázevnal 3 hlavní dosažené výhody: vyšší výtěžek, vyšší výkonnost a vyšší čistotu konečného produktu. Byly také stanoveny podmínky štěpení pro odstranění značky His.
Dvoustupňový purifikační postup pro IL5:
Exprese proteinu byla indukována přidáním kovových iontů k médiu. Tyto kovové ionty musely být odstraněny před aplikací protein na chelátovou kolonu. Tak bylo přidáno celkem 20 mM EDTA ke komplexu kovových iontů a supernatant byl pak filtrován nad kolonou SP-sepharose pro zachycení proteinu. Po promytí, aby se odstranil nenavázaný protein, byl vázaný protein eluován stupňovým gradientem NaCI. Tento krok slouží dvěma účelům: jako koncentrační krok redukující objem faktorem 30 a výměna pufru.
Relevantní frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE) jsou sloučeny a dále purifikovány na koloně s cheláty kovu.
Protein byl nanese na Ni2+-nabitou chelátovou kolonu a nenavázaný protein byl odmyt. Vázáný protein pak byl eluován s použitím imidazolového gradientu. Všechny frakce, kolonou proteklé pufry a proteklý roztok EDTA, pak byly zkontrolovány pomocí SDS-PAGE a metodou bodového přenosu („dot-blot).
Relevantní frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE a „dot-blot) jsou sloučeny a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9.
Po filtraci byla dialyzovaná látka koncentrována dokud nebylo dosaženo vhodné koncentrace (výhodně 1 mg/ml). Nakonec byl protein rozdělen do alikvotů a uložen v -20°C.
Byl použit následující specifický protokol:
1) získaný supernatant byl stočen v 2500 x g po dobu 15 minut (jestliže se objevila infekce, byla zapotřebí centrifugace ve 22000 x g po dobu 30 minut. Supernatant pak byl filtrován s použitím 0,45 μιη filtru, pak následovalo použití 0,22 μη filtru (někdy bylo nezbytné filtrovat nejdříve přes 5 μιη filtr) . Supernatant pak byl smíchán v poměru 1:1 s pufrem A (viz krok 2) obsahující 4 0mM EDTA, což mělo za následek konečné složení pufru 0,2M NaH2PO4, 10% glycerol, 20mM EDTA, pH 6,0.
2) filtrovaný supernatant pak byl nanesen na SPSepharose kolonu ekvilibrovanou pufrem A. Na 80 ml kolonu může být naneseno celkem 1-2 1 (v závislosti na koncentraci proteinu, výše uvedené platí pro 1-10 mg IL5/1). Průtok během aplikace: 1-2 ml/min (obvykle přes noc), proteklý pufr byl sbírán a uložen pro pozdější analýzu. Po aplikaci byla kolona promyta 2-3 objemy kolony (CV) pufru A, dokud nebylo dosaženo stabilní bazální hodnoty. Vázáný protein byl eluován s použitím stupňového gradientu: 0-100-500-1000mM NaCl, byly sbírány frakce po 10 ml, průtok byl 10 ml/min. Purifikace byla prováděna v 5°C.
Kolona byla čištěna 2 CV IM NaOH, průtokem 5 ml/min po každém běhu a opět ekvilibrována pufrem A.
Pufr A: 0,2M NaH2PO4, 10% glycerol, pH 6,0
Pufr B: 0,2M NaH2PO4, 1M NaCl, 40mM imidazol, 10% glycerol, pH 6, 0.
Pro divoký typ i varianty byl použit stejný postup.
Všechny frakce, výchozí látka a proteklý pufr byly testovány metodou „dot-blot a SDS-PAGE. Frakce obsahující IL5 byly sloučeny a dále purifikovány s použitím chelátové kolony.
Jednostupňový purifikační postup pro IL5:
Supernatant byl nanesen přímo na 70 ml chelátovou kolonu nabitou ZnCl2. Po odstranění nenavázané látky promytím byl navázaný protein (IL5 a kontaminující složky) eluován s použitím gradientu imidazolu. Tato metoda má plně výhodu značky His za poskytnutí jednostupňového purifikačního postupu s konečným produktem o vysokém stupni čistoty (>95%). Relevantní frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE a dotblot) jsou sloučeny a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9 a koncentrace NaCl upravena na 400 mM.
Po filtraci byla dialyzovaná látka koncentrována dokud nebylo dosaženo vhodné koncentrace (výhodně 1 mg/ml). Nakonec byl protein rozdělen do alikvotů a uložen v -20°C.
Specifický protokol obsahoval tyto kroky:
1) supernatant byl filtrován přes 0,45 pm filtr, aby se odstranily nečistoty, a byl naředěn v poměru 1:1 pufrem A.
Chelátová kolona Fast Flow o objemu 70 ml byla promyta 5 CV vody, a pak nabita 10 CV lOmM ZnCl2, pH 7. Po ekvilibraci 5 CV pufru A, byl nanesen vzorek s použitím pumpy (průtok 10 ml/minutu) . Proteklý pufr byl sbírán a uložen pro pozdější analýzu. Vázaný protein byl eluován s použitím imidazolového gradientu od 0 do 250mM imidazolu více než 30 CV. Nakonec byla kolona opláchnuta 5 CV pufru C.
·· ·· ·* ···· ·· ·· • · · · · · · ···· • · · · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····
Byly sbírány frakce 10 ml. Pufry:
A: 20mM NaH2PO4, 0,5M NaCl, 10% glycerol, pH 7.
B: 20mM NaH2PO4, 0,5M NaCl, 10% glycerol, pH 7, 0,25M imidazol
C: 2 0mM NaH2PO4, 0,5M NaCl, 0, IM I EDTA, pH 7,0.
Všechny frakce, proteklé pufry a výchozí látka byly
testovány SDS-PAGE.
2) nejčistší frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE) obsahující IL5 byly sloučeny (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější analýzu) a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9, v 6°C, MW 12-14 kD. Dialyzát byl filtrován přes 0,22 μιη filtr (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější analýzu) a byla měřena A280 s použitím dialyzačního pufru (filtrován přes 0,45 μιη) jako referenční hodnoty. Byl měřen objem před a po dialýze a vzorky byly uloženy pro pozdější analýzu SDS-PAGE (po kroku 3).
3) NaCl byl přidán k dialyzovanému proteinu, dokud nebylo dosaženo celkové koncentrace 400 mM a byl pak koncentrován s použitím buď přístroje Amicon (pro objemy větší něž 50 ml) nebo koncentračního zařízení Vivaspin (pro 10 až 50 ml). V obou případech byla membrána saturována 10 ml pufru PBS před tím, než byl nanesen vzorek. Vzorek by měl být koncentrován dokud nebylo dosaženo výhodné koncentrace 1 mg/ml (jak měřeno A28q) . Dialyzovaný koncentrovaný vzorek byl filtrován přes 0,22 μιη filtr a značen s E-nr. A28o byla měřena s použitím proteklého pufru jako referenční hodnoty.
Všechny vzorky z dialýzy a koncentračního kroku byly analyzovány SDS-PAGE a obarveny modří Coomassie. Purifikovaný protein byl uložen zmražený v alikvotech a byl vyplněn list papíru popisující vzorek a vložen do pořadače IL5-protein.
4 ♦ 4
Výše popsaný postup poskytl protein o čistotě přibližně 90 až 95 %, ještě obsahující značku His.
Při sekvencování měl IL5wt a varianta IL5.1 očekávanou N-koncovou sekvenci zahrnující značku His.
Purifikační postup zmíněný výše byl realizován v následujícím specifickém nastavení:
1) sloučené frakce z kolona SP-sepharose byly filtrovány přes 0,45 μιη filtr, aby se odstranily nečistoty.
Chelátová kolona 5 ml HiTrap (nutné použít pouze určené kolony) byla promyta 15 ml vody (s použitím injekční stříkačky), a pak nabita 15 ml O,1M NiSO4 a promyta 15 ml vody. Kolona byla připojena k systému Akta ekvilibrovanému 23 CV pufru A. Vzorek byl nanesen s použitím buď kličky nebo pumpy - v závislosti na objemu (průtok 4 ml/min), proteklý pufr byl sbírán a uložen pro pozdější analýzu. Navázaný protein byl eluován s použitím imidazolového gradientu od 0 do 500 mM imidazolu více než 20 CV. Frakce 5 ml byly sbírány. Nakonec byla kolona opláchnuta s použitím 5 CV pufru B2.
Pufr A: 0,2M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 10% glycerol, pH 5,0 pufr Bl: 0,2M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 0,5M imidazol, 10% glycerol, pH 5,0
Pufr B2: 50mM acetát sodný, 0,5M NaCI, 0,lM EDTA, 10% glycerol, pH 4,5
Všechny frakce, proteklý pufr a výchozí látka byly testovány dot-blot, všechny relevantní frakce byly testovány SDS-PAGE.
2) nejčistší frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE) obsahující IL5 byly sloučeny (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější analýzu) a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9, v 6°C, MW 12-14 kD. Dialyzát byl filtrován přes 0,22 μιη filtr (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější ·· 4 4 4 4 ···· ·· ·· • 44« 444 · 4 4 ♦
4 · 4 4 4 4 4 4 4
444 44 4 444
4444 44 44 444 44 4444 analýzu) a byla měřena A28o s použitím dialyzačního pufru jako referenční hodnoty. Byl měřen objem před a po díalýze a vzorky byly uloženy pro pozdější analýzu SDS-PAGE (po kroku
3) .
3) po přidání dodatečné NaCl až do konečné koncentrace 400 mM, byl dialyzovaný protein koncentrován s použitím buď přístroje Amicon (pro objemy větší něž 50 ml) nebo koncentračního zařízení Vivaspin (pro 10 až 50 ml) . V obou případech byla membrána saturována 10 ml pufru PBS před tím, než byl nanesen vzorek. Vzorek by měl být koncentrován dokud nebylo dosaženo výhodné koncentrace 1 mg/ml (jak měřeno A2so) · Dialyzovaný koncentrovaný vzorek byl filtrován přes 0,22 gm filtr a značen s E-nr.
Všechny vzorky z dialýzy a koncentračního kroku byly analyzovány SDS-PAGE a obarveny modří Coomassie. Purifikovaný protein byl uložen zmražený v alikvotech.
Další purifikační postupy, které byly hodnoceny:
Purifikace s chelátem Zn2+: Eluce proteinu s použitím stoupajícího imidazolového gradientu se ukázala být velmi účinnou, protože se protein wt váže silně na kolonu. Drosophila supernatant může být nanesen přímo a po promytí může být IL5wt eluován imidazolem. Kolona byla nabita 10 CV 10 mM ZnCl2 a promyta vodou. pH vazby a eluční pufry musí mít pH vyšší než 6,5, protože jinak ZnCl2 precipituje.
Con A afinitní chromatografie je ve výzkumu. Možnost použití glykosylace vyskytující se na IL5 jako afinitní značky a eluce s použitím monosacharidového analogu by byla zajímavá, protože by mohla být použita také pro konstrukty neznačené His.
*· 99 99 9999 »» 99
9 9 9 9 9 · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 9999
Odstranění značky His:
Odstranění 15 aa značky His (sekv. id. č. 25) bylo prováděno podle instrukcí dodavatele (Unizyme):
Purifikovaný a dialyzovaný/koncentrovaný IL5 značený His byl zbaven značení His postupným přidáním dvou enzymů, DAP1 a glutamincyklotransferázy. DAP1 odstranil dvě aminokyseliny z volného N-konce.
Enzym potřebuje být nejdříve aktivován:
μΐ HT-DAP1 (10 U/ml) bylo smícháno s 9 μΐ 20mM cysteamin-HCl. Po 5 minutách inkubace při teplotě místnosti bylo přidáno celkem 108 μΐ HP-GCT (100 U/ml) a 54 μΐ pufru TAGZyme. Tato směs musí být použita během 15 minut.
Tato dávka naštěpí 1 mg proteinu značeného His.
Protein značený His byl smíchán se 150 μΐ aktivovaného enzymu a inkubován ve 37°C po dobu 120 minut. Vzorky byly odebírány pro analýzu SDS-PAGE (10 μΐ) po 0, 10, 30, 60 a 120 minutách. Vzorky byly položeny do ledu, aby se zastavilo štěpení.
Pufry:
1. pufr TAGZyme: 20mM NaPO4 pufr, pH 7,5, 150mM NaCl
2. 20mM cysteamin-HCl
Naštěpený protein (jak bylo určeno z analýzy SDS-PAGE nebo N-koncovým sekvencováním) byl nanesen na 1 ml Nichelátovou kolonu ekvilibrovanou PBS. Bylo sbíráno vše.
Proteklý pufr z aplikace byl uložen pro pozdější analýzu. Kolona byla eluována přidáním 3 CV PBS, byly sbírány frakce 0,5 ml. Kolona byl opláchnuta promytím 2 CV 0,5M imidazolu a frakce byly uloženy pro analýzu.
Všechny frakce byly testovány SDS-PAGE a frakce obsahující IL5 byly sloučeny a A2go byla měřena s použitím PBS jako referenční hodnoty. Nakonec byl protein koncentrován • · ·· ·· ··♦· ·· ··
9 9 9 9 9 9 · « · · ·· 9 · 9 9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 9999 dvěma enzymy, najednou dvě s použitím koncentračního zařízení Vivaspin dokud nebylo dosaženo koncentrace 1 mg/ml.
Odstranění značky His bylo prováděno v pokusech v malém měřítku (0,1-1 mg) a měřítko nebylo zvětšováno. Je nutné pozNázevnat, že odstranění značky vyžaduje odblokovaný a nemodifikovaný N-konec.
Protein značený His byl inkubován s dipeptidylaminopeptidázou, která odstranila aminokyseliny a cyklotransferázou glutamové kyseliny, která katalýzuje konverzi glutamové kyseliny na pyroglutamovou kyselinu. Tato konverze dále blokuje degradaci dipeptidylaminopeptidázy. Štěpená směs pak byla filtrována přes chelátovou kolonu, která by měla zadržet enzymy (které jsou značeny Hisged), kontaminující proteiny vazbou ke koloně a nedegradovaný nebo částečně degradovaný protein. Protein zbavený značení prochází kolonou a byl sbírán v proteklém pufru. Po druhém štěpení s enzymem, který odstranil pyroglutamovou kyselinu, byl protein opět filtrován přes chelátovou kolonu, aby se odstranil druhý enzym. Očekává se, že v tomto konečném stadiu je nutné protein opět koncentrovat.
Obecná zjištění:
pí UniHis-IL5wt bylo 9,5 a optimální hodnota pH pro protein byla 6,5 až 7,0 (nebylo důkladně zkoumáno). Koncentrace NaCl 400 mM stabilizuje protein během koncentrace.
Příklad 15
In vitro screening
Primární in vitro screening je ve formě enzymatického imunotestu (ELISA): kompetitivní ELISA pro divoký typ IL5 • · relevantních epitopů B konstruktech před jejich poskytuje zjištění přítomnosti lymfocytů v modifikovaných IL5 zavedením do zvířat.
Pro měření titrů autoprotilátek v séru očkovaných zvířat může být použit obvyklý test ELISA. Protilátky (jak monospecifické, tak monoklonální) proti humánnímu, a také proti myšímu IL5 jsou komerčně dostupné od firmy R&D Systems, 614 McKinley Plače NE, Minneapolis, MN 55413, USA.
Biologická aktivita produktu a/nebo neutralizační kapacita indukovaných autoprotilátek může být testována v IL5 biologickém testu. Dříve publikované příklady takových biologických testů jsou: vyhodnocení IL5 indukované proliferace TFl buněk (pro humánní IL5) a vyhodnocení IL5 indukované proliferace BCL1 buněk nebo B13 B lymfocytů (pro myší IL5) (Callard & Gearing 1994, Dickason et al., 1994).
Účinek autovakcíny na vnímavost dýchacích cest může být také testován v in vitro testu, kdy byly očkovaným myším odstraněny trachey a umístěny na háček v kyvetě pro orgány. Byla měřena tenze trachey po histaminovém podnětu (van Oosterhout et al., 1995).
Proto, aby bylo možno zjistit biologickou aktivitu vzorků rekombinantního mIL5 (a mIL5 AutoVac) proteinu, byl zaveden buněčný test biologické aktivity pro myší IL5. Test je založen na schopnosti lymfomové linie BCL1 pocházející z lymfocytů B proliferovat v reakci na mIL5 přidaný do kultivačního média. Dva odlišné BCL1 klony byly získány z ATCC, BCL1 klon 5Blb (ATCC CRL-1669) a BCLl klon CW13.20.3B3 (ATCC TIB-197).
V typickém experimentu BCLl proliferace byly buňky naneseny na misky do kompletního RPMI média doplněného fetálním telecím sérem (FCS) na mikrotitrační destičky a inkubovány se sériovým ředěním myšího IL5. Proliferace BCLl buněk byla měřena inkorporací thymidinu značeného tritiem.
44 ·4 4 44· 44 4 4
4 4 * 444 4 4 4 4
444 44 444 44 4
44 44 4 444
4444 44 44 4·4 ·» 4444
Několik optimalizačních experimentů bylo prováděno s použitím sériového ředění zakoupeného rekombinantního mIL5 (R&D Systems) pro stimulaci. Variabilní parametry zahrnují: inkubační intervaly, 3H-thymidin pulzní intervaly, počet buněk nanesených na misku na jamku, koncentrace fetálního telecího séra (FCS) a koncentrace přidávaného mIL5. Bylo dosaženo na dávce závislé proliferace BCL1 buněk, přičemž maximální proliferace byla přibližně 3 krát vyšší než pozadí (BCL1 buňky bez přidaného mIL5).
Test BCL1 byl použit pro určení biologické aktivity následujících vzorků exprimovaných S2 buňkami Drosophila a purifikových tak, jak bylo popsáno výše: HIS-mIL5wt materiál (E1320) , HIS-mIL5wt materiál (E1422), HIS-mIL5.1 materiál (E1396) a S2 preparát pozadí (E0016). Proliferace v reakci na jeden HIS-mIL5wt (E1320) preparát byla významně vyšší než proliferace v reakci na „S2 preparát pozadí, zatímco varianta mIL5.1 a jeden preparát divokého typu (E1422) byly určeny jako biologicky inaktivní.
Stále pokračující práce zahrnuje inhibici BCL1 proliferace s anti-mIL5 a pro optimalizační studie byla použita anti-mIL5 monoklonální protilátka TRFK5. Cílem . bylo použít tento test pro určení schopnosti anti-mIL5 antiséra z imunizovaných myší inhibovat biologickou aktivitu mIL5.
Příklad 16
In vivo modely
Pro měření účinku autovakcíny in vivo existují známé zvířecí modely astmatu. Normálně je zvíře senzibilizováno sloučeninou (alergen/antigen) a po podnětu sloučeninou ve formě aerosolu je měřena bronchokonstrikce (vodivost ·· BB BB ···♦ ·β ·Β
Β · Β · · Β · · · Β « • · · Β Β Β Β β β · · • · · · Β ΒΒΒ·
ΒΒΒΒ ·· ·· ΒΒΒ «· ·>·· dýchacích cest) s použitím tělesného pletysmografu. Jsou také zjišťovány počty eosinofilů v tekutině BAL.
Několik studií zkoumajících účinek anti-IL5 mAb byly úspěšně prováděny na myších. Proti použití myšího modelu je fakt, že IL5 působí jako růstový faktor pro B lymfocyty, což poskytuje možnost interference s myší protilátkovou reakcí. Ale jak bylo ukázáno ve studii s použitím IL5 knock-out myší, protilátková reakce závislá na T lymfocytech proti ovalbuminu, a také rozvoj cytotoxických T lymfocytů se jevily normální (Kopf et al., 1996). Protože myš je také nejpraktičtější a nejekonomičtější model ve srovnání s morčaty nebo opicemi, bude použit model astmatu/ přecitlivělosti dýchacích cest myší Bal/c senzibilizovaných ovalbuminem, jak byl použit autory Hamelman et al. (1997).
Jestliže se ale účinek IL5 na B lymfocyty v myším modelu ukáže problematickým, budou použity jiné vhodné zvířecí modely v oboru známé.
Příklad 17
Příprava DNA konstruktů kódujících myší IL5 a jeho varianty
Konstrukce varianty v pcDNA3.1+:
Inzerce epitopů P2 a P30 do mIL5 divokého typu byla provedena SOE-PCR s překrývajícími se primery obsahujícími sekvence epitopů. Gen mIL5 divokého typu obsahující vedoucí sekvenci (sekv. id. č. 63), klonovaný do pcDNA3.1+ s kanonickou Kozákovou sekvencí (za získání plazmidu p815), byl použit jako templát pro reakce PCR. Výsledné fragmenty byly štěpeny s Nhel a Notl, purifikovány a klonovány do p815 byly použity jako templát pro PCR.
•4 ····
4
4··
44
4 4 4
4 4
4'4 44
4 4 fl
444« 44 ···
4444
Drosophila
Drosophila
Klonování variant do pMT Drosophila vektoru s BiP vedoucí sekvencí a značkou UNI-His:
mIL5 divokého typu byl klonován do série pMT Drosophila expresních vektorů (Invitrogen) vytvořením PCR fragmentu s mIL5 specifickými primery obsahujícími vhodná restrikční místa a, kromě toho, obsahujícími sekvence kódující sekvenci podobnou Kozákově, následovanou BiP vedoucí sekvencí, následovanou sekvencí kódující značku UNI-His (sekv. id. č. 25) fúzovanou k 5' konci sekvence kódující zralý mIL5. Jako templát byla použita cDNA sekvence mIL5 divokého typu. Výsledný fragment byl štěpen EcoRI a Notl a byl pak klonován do vektoru pMT/V5-HisA (Invitrogen). Výsledný plazmid (p818) byl použit pro klonování variant obsahujících epitop do pMT. Ty byly klonovány štěpením variant vytvořených v pcDNA3.1+ se Sací a Notl a klonováním výsledných fragmentů do p818.
Klonování variant do pAC5:
mIL5 divokého typu a varianty mIL5 byly klonovány do pAC5 konstitutivního Drosophila expresního vektoru štěpením variant v pMT s EcoRI a Notl a klonováním výsledných fragmentů do vektoru pAC5.l/V5-HisA (Invitrogen).
Příklad 18
Příprava DNA konstruktů kódujících humánní IL5 a jeho varianty
Bylo uvažováno pět linií plazmidů obsahujících nemodifikovaný IL5 a všechny nebo některé z devíti IL5 variant. Linie zahrnují: 1) humánní IL5 pro DNA vakcinaci ve vektoru pCI vhodném pro expresi v humánních buňkách, 2) humánní IL5 s BiP vedoucí sekvencí a 15 aa značkou His (sekv.
• 4 ·44 ·
4
4 4 4
44
4 4 4 4
4 4 4
44 • 4 4
4
444 44 4 > 4 4
4444 44 44 #4· ·· 4444 id. č. 25, získaná od firmy UNIZYME v Hcrsholm, Dánsko, značka je v tomto textu nazvána UNI nebo značka UNIHis) ve vektor pMT/V5/HIS pro indukovatelnou expresi v Drosophila, 3) jako v bodu 2, ale bez značky His, 4) jako v bodu 3, ale s myším IL5 a 5) humánní IL5 s DAPI vedoucí sekvencí a 15 aa značka HIS ve vektoru pVL1393 pro expresi v bakulovirovém systému.
Plazmidy pro DNA vakcinaci ve vektoru pCI:
Název Ref. č. Kmen č. Epitop
hIL5 (pCI) p888 MR č. 1237 žádný
hIL5.1 (pCI) p889 MR č. 1238 P2, klička 3
hIL5.2 (pCI) p890 MR č. 1239 P30, klička 1
hIL5.3 (pCI) p891 MR č. 1240 P30, klička 2
hIL5.4 (pCI) p892 MR č. 1241 P2, klička 2
hIL5.5 (pCI) p893 MR č. 1242 P2, klička 1
hIL5.6 (pCI) p894 MR č. 1243 P2, klička 3
hIL5.7 (pCI) p895 MR č. 1244 P30, klička 3
hIL5.12 (pCI) p896 MR č. 1245 P30, klička 3
hIL5.13 (pCI) p897 MR č. 1246 P2 a P30, klička 3
Plazmidy pro expresi humánního IL5 v Drosophila se značkou
UNI-His a BiP vedoucí sekvencí v pMT/V5/HIS
Název Ref. č. Kmen č. Epitop
hIL5m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p899 MR č. 1247 žádný
hIL5.lm-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p900 MR č. 1248 P2, klička 3
hIL5.2m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p901 MR č. 1249 P30, klička 1
hIL5.3m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p929 MR č. 1277 P30, klička 2
·· *« ·♦ ···· ·· *· ···· ··· * · · · • 11 11111 11 1
9 11 9 111
1911 11 19 li· 11 1111
hIL5.4m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p902 MR č. 1250 P2, klička 2
hIL5.5m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p903 MR č. 1251 P2, klička 1
hIL5.6m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p904 MR č. 1252 P2, klička 3
hIL5.7m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p905 MR č. 1253 P30, klička 3
hIL5.12m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p906 MR č. 1254 P30, klička 3
hIL5.13m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA) p907 MR č. 1255 P2 a P30,
klička 3
Plazmidy pro expresi humánního IL5 v Drosophila s BiP vedoucí sekvencí, ale bez značky UNI-His v pMT/V5/HIS:
Název Ref. č. Kmen č. Epitop
hIL5m-BiP (pMT/V5-HisA) p908 MR č. 1256 žádný
hIL5.1m-BiP (pMT/V5-HisA) p909 MR č. 1257 P2, klička 3
hIL5.2m-BiP (pMT/V5-HisA) p921 MR č. 1269 P30, klička 1
hIL5.3m-BiP (pMT/V5-HisA) p922 MR č. 1270 P30, klička 2
hIL5.4m-BiP (pMT/V5-HisA) p923 MR č. 1271 P2, klička 2
hIL5.5m-BiP (pMT/V5-HisA) p924 MR č. 1272 P2, klička 1
hIL5.6m-BiP (pMTlV5-HisA) p925 MR č. 1273 P2, klička 3
hIL5.7m-BiP (pMT/V5-HisA) p926 MR č. 1274 P30, klička 3
hIL5.12m-BiP (pMT/V5-HisA) p927 MR č. 1275 P30, klička 3
hIL5.13m-BiP (pMT/V5-HisA) p928 MR č. 1276 P2 a P30, klička 3
Plazmidy sekvencí, pro expresi myšího IL5 v Drosophila s ale bez 15 aa značky His v pMT/V5/HIS: BiP vedoucí
Název Ref. č. Kmen č. Epitop
mIL5m-BiP (pMT/V5-HisA) p918 MR č. 1266 žádný
mIL5.1m-BiP (pMT/V5-HisA) p919 MR č. 1267 P2, klička 3
00 ·»·· ·· 00 0 0 0 0 «00 · « « 0
0« · · ··« · · « «····· ···· 0 • 0 0 00 0 «0« «·«· 0« 00 000 0« ···· mIL5.2m-BiP (pMT/V5-HisA) p920
MR č. 1268 P30, klička 1
Plazmidy pro expresi humánního IL-5 v bakulovirovém systému se značkou UNI-His a DAP1 vedoucí sekvencí pVL1393 v pVLl393:
Název Ref. č. Kmen č. Epitop hIL5m-UNI-DAPl (pVL1393) p916 MR č. 1264 žádný hIL5.lm-UNI-DAPl (pVL1393) p917 MR č. 1265 P2, klička 3
Příklad 19
DNA imunizační studie
Vytvoření vektorů kódujících mIL5wt, mIL5.1 a mIL5.5 s Kozákovými sekvencemi pro pokusy s DNA vakcinací
DNA fragmenty kódující mIL5wt, mIL5.1 a mIL5.5 zahrnující přírodní vedoucí sekvenci (sekv. id. č. 63) byly vloženy do pcDNA3.1, a tak poskytly nové plazmidy p521, 522 a p523. Aby se zvýšila exprese cDNA v savčích buňkách, byly Kozákovy kanonické sekvence vloženy v protisměru od kódujících sekvencí s použitím technologie PCR. PCR reakce byly prováděny s použitím p521, p522 a p523 jako templátů a přímý primer kódující Kozákovu sekvenci hned v protisměru od mIL5 vedoucího startovacího kodonu. Purifikované PCR produkty byly klonovány do vektoru pcDNA3.1+ s použitím restrikčních endonukleáz BamHI a Notl. Výsledné plazmidy p815, p816 a p817, v daném pořadí, byly ověřeny DNA sekvencováním. Všechny další plazmidy použité pro pokusy s DNA vakcinací byly konstruovány s použitím p521 plazmidu jako výchozí látky.
• φ ♦« ·· Φφφφ φφ ·* • · · · φφφ φφφφ φ φ · φ φφφ* φ · φ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφφ φφ φφφφ
In vitro translace DNA vakcinačních plazmidů s použitím soupravy Promega
Komerční souprava používající králičí retikulocytový extrakt k vytvoření in vitro translatovaného proteinového produktu plazmidové DNA, byl dříve úspěšně používán v laboratoři původců ke sledování proteinové exprese z pcDNA plazmidů kódujícího např. cDNA ovalbuminu. DNA vakcinační plazmidy s myším IL5 byly přidány k reagenciím ze soupravy podle standardního postupu. Ale několik pokusů detekovat exprimovaný mIL5 materiál na autoradiogramech selhalo, i když pozitivní kontroly fungovaly. Výsledky z transfekcí COS buněk a DNA vakcinace ukázaly, že byly exprimovány genové produkty, takže původci tyto technické problémy dále nezkoumali.
Přechodná transfekce COS buněk DNA vakcinačními plazmidy pro určení stupně exprese
Aby bylo možné sledovat účinnost transfekce/exprese plazmidů použitých pro DNA vakcinační pokusy, byl zaveden test přechodné transfekce s použitím COS buněk. COS buňky byly ošetřeny trypsinem a naneseny do DMEM média doplněného 10% FCS v kultivačních lahvích T25. Buňky byly transfekovány 2. den s použitím soupravy Dotap (Roche Diagnostics) a sklízeny 5. den. Tkáňový supernatant, lyzát z celých buněk a preparáty bohaté na membrány byly testovány metodou Western blotování, aby se detekoval anti-mIL5 reaktivní expresní produkt. Anti-mIL5 reaktivní produkt v buněčných preparátech se shodně pohyboval jako 2 až 3 oddělené pásy o velikosti 21 až 28 kD při SDS-PAGE, zatímco molekulová hmotnost (MW) mIL5 monomeru použitého jako standard (exprimovaný v bakuloviru, R&D Systems) je pouze 15 až 18 kD. Při použití nedenaturačních podmínek tvořily látky o velikosti 21 až 28 kD dimery, takže původci mají za to, že látka byla mIL5, ·· ·9 99 9999 9« 49 • 9*9 999 «999
9 9 9··· · 9 4 ··· «9 9 499 •••9 99 99 9*9 9« 9999 možná v několika odlišně glykosylovaných formách. Výsledky DNA vakcinace (viz niže) jasně podporuji tento závěr.
DNA vakcinace myší s použitím myších konstruktů IL5 AutoVac
Byla prováděna DNA vakcinační studie, aby se vyšetřilo, zda protilátkové reakce specifické pro myší IL5 mohou být indukovány imunizací myší nahou plazmidovou DNA kódující 8 odlišných myší IL5 mutant. Protože dříve bylo publikováno, že IL5 má úlohu v diferenciaci B buněk , bylo nezbytné prokázat, že anti-mIL5 autoprotilátky mohou být tvořeny v myších a tolerance B buněk na mIL5 může být porušena.
Obecné dispozice DNA vakcinačních pokusů používají buď myši C3H/Hen (H-2k) nebo myši Balb/cA (H-2d) , 6 až 8 týdnů staré, rozdělené do skupin po 5 myších. Ve dnech 0, 14, 28,
42, 62 a 76 byla myším podána anestezie používající hypnorm/dormicum s.c. a byla jim podána injekce s expresními plazmidy kódujícími ovalbumin (kontroly), mIL5wt (divoký typ) nebo testované mIL5 varianty. DNA materiál byl připraven s použitím souprav bez endonukleáz Endofree GigaPrep (Qiagen) a rozpuštěn v koncentraci 1 pg/ml v 0,15M NaCl nebo 0,15M NaCl obsahující 0,1% roztok přípravku bupivacain. 100 μΐ látky bylo injikováno i.d. každé myši do dolní části hřbetu rozděleno do dvou injekčních míst. Předběžné vzorky krve byly získány minus 2. den a vzorky krve v testu byly získávány v týdnech 3, 5, 8 a 11. Séra byla izolována centrifugaci a uložena v -20°C až do testování metodou ELISA na reaktivitu proti purifikovanému ovalbuminu a proteinům mIL5.
Typický výsledek DNA vakcinačního pokusu je ukázán na obr. 4. Podle obecných dispozic popsaných výše bylo 40 myší Balb/cA imunizováno kontrolním plazmidem s ovalbuminem, plazmidem kódujícím mIL5wt nebo plazmidy kódující mIL5 AutoVac varianty mIL5.1 nebo mIL5.5. V tomto experimentu 9 z 9 myší imunizovaných plazmidem kódujícím ovalbumin vytvořilo • 4 «444
44 • 4 4
4* »444 4
4 4 4
4 4 · 4
4 4 « >444 44 «
4 4 • 444 «
4 4 4
4444 protilátky proti ovalbuminu, zatímco u myší, které dostaly DNA kódující mIL5 divokého typu nebo mIL5 variantu, nebyla indukována žádná reakce proti ovalbuminu. Injekce plazmidů kódujícího mIL5wt nevyvolala anti-mIL5 reakci, zatímco tolerance B buněk na mIL5 byla porušena u 4 z 10 myší imunizovaných plazmidem mIL5.1 a u 7 z 9 myší imunizovaných plazmidovou DNA kódující mIL5.5.
Podstatný výsledek celých sérií DNA vakcinačních pokusů je shrnut v tabulce uvedené níže. Počet reagujících jedinců v imunizační skupině byl odlišný mezi různými konstrukty mIL5 AutoVac a byl závislý na kmenu myší. Konstrukt mIL5.2 AutoVac byl zřetelně lepší než další varianty, byl schopen indukovat anti-mIL5 protilátkovou reakci u obou kmenů myší s penetrancí 100 %. Tento plazmid (p820) také měl nejvyšší stupeň exprese v COS transfekčním testu.
Dalším příkladem ke zdůraznění byla jasná MHC restrikce pozorovaná při použití plazmidové DNA kódující mIL5.4 jako imunogenu. Zatímco pouze 1/10 myší C3H/Hen odpovídá na DNA vakcínu, reagovalo 9 z 10 myší Balb/cA. Opačný jev (i když ne tak zřetelný) byl pozorován u konstruktu mIL5.6. DNA vakcína mIL5.2 se ale zdála být imunogenní všeobecně.
OVAwt-pVax mIL5wt- mIL5.1- pcDNA mIL5.2- pcDNA mIL5.9- pcDNA
pcDNA
Balb/cA 28/28 0/28 4/10 9/10 9/10
C3H/Hen 29/29 0/30 3/10 10/10 1/10
mIL5.5 mIL5.6- mIL5.7- mIL5.12- mIL5.13-
pcDNA pcDNA pcDNA pcDNA pcDNA
Balb/cA 7/9 0/10 2/10 0/10 0/10*
C3H/Hen 5/10 6/10 2/10 2/10 2/10*
*4 «4 • 4 4 * 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 444 4« 89 ť* 44*4 44 44 • · · * 4 4 4 • 4 444 «4 * 44* 44*4 4 4 4 4 4 · · 44 444 44 4444
Souhrn výsledků DNA vakcinace 280 myší. 6 myší zemřelo
v průběhu pokusu z důvodů nesouvisejících s účinky DNA
očkování. Počet reagujících jedinců (s vysokými nebo
středními anti-mIL5 titry) je ukázán ve vztahu k celkovému počtu myší v každé imunizační skupině. *) vzorky krve získány v den 55. Všechny další vzorky krve byly získány v den 77.
Další vlastností stojící za zmínku byla tendence mIL5 variant s cizorodým epitopem pomocného T lymfocytů vloženým do mIL5 kličky 1 k tomu, že byly silnější DNA vakcinační imunogeny, než varianty s epitopem pomocného T lymfocytů vloženým v kličce 3. To by mohlo být způsobeno relativně vysokým stupněm exprese. Jediná testovaná varianta kličky 2, mIL5.4-pcDNA, byl silným imunogenem pouze pro kmen Balb/cA, jak bylo uvedeno výše.
Další charakterizace protilátkových reakcí indukovaných DNA očkováním
Experimenty s testem ELISA byly nastaveny tak, aby se určilo, zda by mohly být protilátky specifické pro vložený epitop pomocného T lymfocytů detekovány u anti-mIL5 pozitivních myší. V každé imunizační skupině byla sloučena séra z anti-mIL5 pozitivních myší a testována na reaktivitu proti P2 nebo P30 peptidům, které byly imobilizovány na AquaBind mikrotitrační destičky. Antiséra indukovaná DNA vakcinací proti mIL5.2 u obou myších kmenů nepochybně obsahovala reaktivitu proti vloženému P30, zatímco žádná další antiséra nebyla s P2 nebo P30 reaktivní. To bylo pravděpodobně spojeno s vyššími protilátkovými titry a penetrancí, což bylo obecně pozorováno u mIL5.2 DNA vakcinačního konstruktu. Je nutné se zmínit, že s použitím tohoto nastavení testu ELISA byli původci schopni detekovat anti-P2 reaktivitu v antiséru indukovanou proti mIL5.1.
• 9
9 9
9
9
9
9999
9 9
9
9
9
999· •
9999 9 9 9 999 9 9
9
999
Pozitivní anti-mIL5 sloučené antisérum z DNA očkovaných myší bylo také testováno v kompetitivním testu ELISA na svou schopnost inhibovat interakci mezi rozpustným nativním myším IL5 a monoklonálními protilátkami TRFK4 nebo TRFKS, což jsou obě neutralizační protilátky. Sériová ředění anti-mIL5 sloučených antisér byla preinkubována s rozpustným nativním mIL5 a vzorek byl přidán k ELISA destičkám potaženým záchytnou protilátkou TRFKS. Navázaný myší IL5 (který nebyl absorbován antiséry) byl dále vizualizován s použitím vrstvy biotinylovaného TRFK4, a pak streptavidinu značeného křenovou peroxidázou. Ne všechna anti-mIL5 pozitivní antiséra indukovaná DNA vakcinaci mohla inhibovat interakci mezi rozpustným mIL5 a TRFK4 nebo TRFK5. Antisérum s nej vyšší TRFK9/5 inhibiční schopností bylo z myší C3H/Hen imunizovaných DNA kódující mIL5.2. Nebylo testováno, zda pozorované rozdíly v inhibici byly přímo úměrné titračním rozdílům nebo byly spojeny s jemnou specifičností různých antisér. Nejpravděpodobněji to byla kombinace těchto dvou faktorů.
Zvířecí model eosinofilie u myší imunizovaných mIL5 AutoVac DNA
DNA očkovaných myší bylo vybráno pro testování ve zvířecím modelu eosinofilie: 10 myší Balb/cA imunizovaných DNA mIL5wt, 10 myší Balb/cA imunizovaných DNA mIL5.2, 10 myší C3H/Hen imunizovaných DNA mIL5wt a 10 myší C3H/Hen každé z těchto myší byl podáván režim s ovalbuminem, aby se byly senzibilizovány imunizovaných DNA mIL5.2 senzibilizačni/podnětový indukovala eosinofilie. subkutánními injekcemi ovalbuminu (OVA)
Myši 50 pg fyziologickém roztoku smíchaném v poměru 1:1 s Adjuphos jednou týdně po tři týdny. Čtyři dny po poslední OVA senzibilizaci byly myši podněcovány intranazálně s 12,5 μς
0,9% • · ·· · · • · ·· • · · • ·
OVA v 0,9% fyziologickém roztoku každý druhý den do celkového počtu 3 podnětů. Tekutina z bronchoalveolární laváže (BALF) byla sbírána jeden den po poslední senzibilizaci kanylací trachey a promytím lumina dýchacích cest s 1 ml PBS.
Přibližně 30 000-60 000 buněk BALF bylo stočeno na podložních sklíčkách v 1500 rpm po dobu 20 minut. Sklíčka byla usušena přes noc a barvena 2,5 minuty s May-Grunwaldovým barvivém (Sigma), promývána 4 minuty ve fyziologickém roztoku pufrovaném trisem, barvena 20-30 minut s Geimsovým barvivém (1:20 s ddHžO, Sigma) a krátce opláchnuta ddH2O. Obarvená sklíčka byla sušena přes noc a typy buněk byly identifikovány s použitím světelného mikroskopu. Na každém sklíčku bylo počítáno přibližně 100 až 200 buněk a pro každou myš byla počítána 3 sklíčka. Počty eosinofilů byly vyjádřeny jako počet eosinofilů na 100 počítaných buněk. U myší C3H/Hen očkovaných DNA mIL5.2 byla indukce plicní eosinofilie významně down-regulována ve srovnání se skupinou očkovanou DNA mIL5wt divokého typu (mIL5.2 DNA: 14,6 ± 8,9 eosinofilů na 100 buněk, mIL5wt DNA: 51,1 ± 9,9 eosinofilů na 100 buněk). Ale u kmene Balb/cA nebyl žádný významný rozdíl v počtech eosinofilů mezi imunizačními skupinami (mIL5.2 DNA: 23,3 ± 6,8 eosinofilů na 100 buněk, mIL5wt DNA: 27,7 ± 9,3 eosinofilů na 100 buněk). Možné vysvětlení je, že myši Balb/cA jsou na model pouze slabě citlivé. To bylo podporováno daty z testu anti-ovalbumin ELISA, ukazujícími, že jeden týden před odběrem BALF byly anti-ovalbuminové titry v séru myší Balb/cA nižší než v séru myší C3H/Hen. Bylo publikováno, že podkmen Balb/cJ je citlivý v modelu OVA senzibilizace/podnět.
• · · · · · · ·· · · · · · · • · · · · ·
Příklad 20
Studie vakcinace proteinem
Myši Balb/c J byly imunizovány myším IL5 (mIL5) proteinem a podrobeny modelu s intranazálním podáním ovalbuminu, který indukuje eosinofily v plicích ošetřených myší. Oba UniHis-mIL5 a UniHis-mIL5.1 proteiny indukovaly protilátky, které zkříženě reagovaly s mIL-5 tvořeným v buňkách sf9 od firmy R&D Systems. Model eosinofilie indukoval vysoké počty eosinofilů v OVA kontrolní skupině a UniHis-mIL5.1 skupině, zatímco počty eosinofilů byly redukovány jak v PBS skupině, tak v UniHis-mIL5 skupině. Tento výsledek vedl původce k tomu, že měli za to, že mohly být sloučeny.
Materiál a metody
UniHis-mIL-5 E1320 a E01397
UniHis-mIL-5.1 E01337 a E01396
Imunizace
6-8 týdnů staré samice myší Balb/c J (M&B) byly imunizovány buď s 1) ničím, 2) PBS, 3) UniHis-mIL5 nebo 4) UniHis-mIL5.1 v kompletním Freundově adjuvans (CFA, Sigma) a upomínány 3 krát v intervalech tří týdnů antigenem v nekompletním Freundově adjuvans (IFA, Sigma). Séra byla sbírána a testována testem ELISA 10 dnů po každé upomínací dávce.
Testy ELISA
Ant.i-UniHis-mIL5 ELISA
Séra byly získána 32. den (krevní vzorek 1) a 54. den (krevní vzorek 2) po 2 a 3 imunizacích, v daném pořadí.
Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy purifikovaným HIS-mIL5wt (0,1 gg/jamku, E1320). Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky. Hodnoty odečítání OD490 kontrolních sér z myší imunizovaných PBS ve Freundově adjuvans byly subtrahovány od hodnot odečítání OD490 testovaných vzorků.
Anti-mIL5 ELISA
Séra byla získána 75. den (krevní vzorek 3) . Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy se zakoupeným mIL5 (0,1 gg/jamku, R&D kat. č. 405ML) . Reaktivity 1:1000 naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky. Reaktivita TRFK5 (2 gg/ml) byla vizualizována s použitím králičí anti-potkaní sekundární protilátky.
Kompetitivní ELISA
Ředění antisér byla preinkubována s rozpustným IL5 po dobu 1 hodiny a přidána na polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) , které byly potaženy se záchytnou protilátkou TRFK5. Navázaný mIL5 byl vizualizován s použitím biotinylované TRFK4 a kozí anti-myší sekundární protilátky značené HRP.
Anti-P2 ELISA
Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti P2 peptidů v testu ELISA. Specializované mikrotitrační destičky (AguaBind, M&E Biotech) byly potaženy s 0,5 gg/jamku syntetického P2 peptidů. Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí antimyší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).
Anti-UniHis ELISA
Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti peptidu se značkou HIS (UNIZYME) v testu ELISA. Specializované mikrotitrační destičky (AquaBínd, M&E Biotech) byly potaženy s 0,5 pg/jamku syntetického peptidu se značkou HIS. Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).
Anti-S2 protein pozadí ELISA
Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti preparátu S2 pozadí v testu ELISA. Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy s 0,1 pg/jamku preparátu S2 pozadí. Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí antimyší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).
Anti-BSA ELISA
Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti BSA v testu ELISA. Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy s 10 pg/jamku BSA (Intergen). Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).
Model eosinofilie
Myši Balb/c J byly senzibilizovány subkutánními injekcemi 50 μρ ovalbuminu (OVA) v 0,9% fyziologickém roztoku smíchaném v poměru 1:1 s Adjuphos jako alumovým adjuvanciem.
• · « *
44 4
4« • 444 · · · ···
4 4 4 4444 4 4
OVA imunizace byly opakovány jednou týdně po dobu čtyř týdnů. Jeden týden po poslední OVA senzibilizaci byly myši podněcovány s 12,5 pg OVA v 0,9% fyziologickém roztoku intranazálně každý druhý den do celkového počtu 3 podnětů. Tekutina z bronchoalveolární laváže (BALF) byla sbírána jeden den po poslední senzibilizaci kanylací trachey a promytím lumina dýchacích cest s 1 ml 0,9% fyziologického roztoku nebo PBS.
BAL značení
Přibližně 30 000-60 000 buněk BALF bylo stočeno na podložních sklíčkách v 1500 rpm po dobu 20 minut. Sklíčka byla usušena přes noc a barvena 2,5 minuty s May-Grunwaldovým barvivém (Sigma), promývána 4 minuty v TBS, barvena 20-30 minut s Geimsovým barvivém (1:20 s ddH2O, Sigma) a krátce opláchnuta ddH2O. Obarvená sklíčka byla sušena přes noc a typy buněk byly identifikovány s použitím světelného mikroskopu. Na každém sklíčku bylo počítáno přibližně 100 až 200 buněk a pro každou myš byla počítána 3 sklíčka.
Výsledky
Detekce anti-mIL5 protilátek
Byla prováděna série experimentů ELISA, aby se zkoumalo, zda protilátkové reakce specifické pro myší IL5 byly indukovány u myší imunizovaných s proteiny HIS-mIL5wt a HIS-mIL5.1. Zaprvé bylo zjišťováno, zda protilátky proti HIS-mIL5wt imunizačnímu matriálu byly vyvolány testováním ředění antisér z jednotlivých myší na destičkách ELISA potažených s materiálem HIS-mIL5wt. Bylo zjištěno, že již v prvním krevním vzorku vyvinuly všechny myši protilátkovou reakci s vysokými titry proti HIS-mIL5wt (E1320, exprimován • · • · ··· ·
Drosophila S2 buňkami a purifikován), která byla odhadem přibližně z 95 % čistá.
Tento výsledek není pevným potvrzením toho, že antiséra zkříženě reagují s myším IL5. Při těchto dispozicích mohla být také detekován reaktivita proti nečistotám z Drosophila S2 buněk, S2 médiu (které obsahuje např. BSA z fetálního telecího séra, značku HIS, a také denaturované mIL5 epitopy B lymfocytu). Aby se prokázalo, že indukované protilátky obsahují reaktivity proti nativnímu myšímu IL5, byla séra testována na destičkách ELISA potažených s mIL5 zakoupeným od firmy R&D Systems. Tato látka (R&D kat. č. 405-ML) je biologicky aktivní, neobsahuje žádnou značku HIS, je exprimována v systému bakuloviru Sf21, je také velmi čistá (97 %) a může být zakoupena bez proteinového nosiče (BSA). Sloučená séra z obou imunizačních skupin reagovala s destičkami ELISA potaženými zakoupeným mIL5, zatímco séra z myší imunizovaných PBS nereagovala. To bylo ukázáno při testování sér z krevních vzorků 3 získaných 75. den, 11 dnů po 4. imunizaci, ale také séra z krevního vzorku 1 a 2 reagovala se zakoupeným mIL5 při podobném nastavení testu. Aby se vyloučily signály ze zkřížené reakce s nosičem BSA, byly experimenty opakovány pro krevná vzorky 1 a 2 s použitím verzí bez nosiče zakoupeného mIL5 a pufrů ELISA bez BSA a stále byly pozorovány vysoké reakce anti-mIL5.
Aby se dále potvrdilo, že indukovaná antiséra zkříženě reagují s nativním mIL5, byl sestaven kompetitivní test ELISA. Tento test ELISA testoval schopnost odlišných antisér inhíbovat interakci mezi rozpustným nativním myším IL5 a monoklonálními protilátkami TRFK4 nebo TRFK5, které jsou obě neutralizační protilátky. Sériová ředění sloučených antisér byla preinkubována s rozpustným nativním mIL5 a vzorky byly přidán na destičky ELISA potažené záchytnou protilátkou TRFK5. Navázaný myší IL5 (který nebyl absorbován antiséry) ·· «φ 44 4444 44 ··
4444 4 · · 4444 • 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4 • • 444 4 444 · · ····· ···· ···· ·· ·· ··· ·« ···· byl dále vizualizován s použitím vrstvy biotinylované TRFK4, a pak streptavidinem značeným křenovou peroxidázou. Jako kontroly bylo zahrnuto anti-mIL5 pozitivní a anti-mIL5 negativní antisérum z DNA očkovaných myší. Bylo prokázáno, že antiséra myší imunizovaných jak HIS-mIL5wt, tak HIS-mIL5.1 mohou inhibovat interakci mezi rozpustným mIL5 a TRFK4 nebo TRFK5.
mIL5 myší
Na základě výše uvedeného bylo uzavřeno, že specifické autoprotilátky byly indukovány u imunizovaných buď s HIS-mIL5wt nebo HIS-mIL5.1 proteinovými přípravky (u 100 % testovaných myší). Jinými slovy, tolerance B lymfocytů na mIL5 může být porušena při použití rekombinantních verzí značených HIS jak divokého typu, tak myšího IL5 AutoVac. Pravděpodobné vysvětlení pozorování, že tolerance B lymfocytů je porušena k protein divokého typu je, že značka HIS u těchto myší funguje jako cizorodý imunogenní epitop pomocného T lymfocytů. Dalším vysvětlením by mohlo být, že kompletního Freundova adjuvans ruší toleranci B lymfocytů na mIL5. Tyto hypotézy mohou být testovány s použitím antigenů neznačených HIS a/nebo s alternativním méně silným adjuvans, jako je například AdjuPhos.
Další charakterizace protilátkových reakcí u myší imunizovaných s proteiny mIL5 AutoVac
ELISA experimenty byly nastaveny tak, aby určily, zda protilátky specifické pro vložený epitop pomocného T lymfocytů mohou být detekovány v sérech myší imunizovaných proteinem mIL5. Pro každou imunizační skupinu byla sloučena antiséra (krevní vzorek 2) a testována na reaktivitu proti syntetickému P2 peptidu, který byl imobilizován na mikrotitračních destičkách AquaBind. Antisérum anti-HISmIL5.1 obsahovalo reaktivitu proti vloženému P2 peptidu, • · « · • · · « · ·· · ·
• · · zatímco ani anti-HIS-mIL5wt nebo anti-PBS/CFA s peptidem nereagovalo.
Bylo také testováno, zda antiséra anti-HIS-mlLwt a antiHIS-mIL5.1 obsahovala reaktivitu proti 15-merní značce HIS (UNIZYME značka HIS, sekv. id. č. 25), která byla fúzována k N-koncové části jak divokého typu, tak proteinů mIL5 AutoVac. Peptid byl syntetizován a kovalentně imobilizován na mikrotitrační destičky AquaBind a sloučená antiséra z každé imunizační skupiny (krevní vzorky 1, 2 a 3) byla testována na reaktivitu proti navázanému peptidu. Antiséra ze všech myší imunizovaných proteinem reagovala se syntetickým peptidem se značkou HIS.
Bylo také testováno, zda antiséra anti-HIS-mIL5wt a anti-HIS-mIL5.1 byla reaktivní se složkami S2 Drosophila buněk nebo kultivačního média. Destičky ELISA potažené BSA (hlavní složka média) nebo preparátem S2 pozadí (vytvořeným podrobením kultivačního supernatantu z Her2 exprimujících Drosophila S2 buněk purifikačnímu schématu podobnému mIL5 purifikačnímu postupu). Výsledky těchto analýz prokázaly, že zatímco anti-BSA reakce byly velmi nízké, reakce s materiálem S2 pozadí byly výrazné.
Počty eosinofilů v BALF
Aby se určilo, zda protilátky anti-IL5 u očkovaných myší mohou down-regulovat in vivo aktivitu IL5, indukovali původci eosinofilii závislou na IL5 v plicích očkovaných myší. Eosinofily byly indukovány podněcováním senzibilizovaných myší intranazálně s OVA. Vysoké počty eosinofilů byly indukovány u kontrolních OVA myší a myší očkovaných s UniHismIL5.1, ale ne u myší očkovaných Uni-His-mIL5 nebo PBS. Neshoda počtu eosinofilů mezi kontrolními skupinami (OVA a PBS) a experimentálními skupinami (UniHis-mIL5 a UniHismlLS.l), a pozitivní výsledky od DNA očkovaných myší uvedené • · ·· · · · · ·Β ·· • · · * · « · · • · Β Β ΒΒΒ· · · · • «••·· ···· · ····· ···· «··· ·· ·· ··· ·· ···· výše vedly původce k tomu, že skupiny mohly být zaměněny. Ale žádné pokusy k průkazu záměny nepodpořily tuto interpretaci. Očkování proteiny byly opakovány v identickém nastavení, aby se tato neshoda objasnila.
Diskuse
Schopnost obou proteinů UniHis-mIL5 a UniHis-mIL5.1 indukovat protilátky, které zkříženě reagují s myším IL5 divokého typu byla jasně prokázána. Zdali schopnost proteinu UniHis-mIL5 obejít imunologickou toleranci byla způsobena značkou UniHis nebo z některého dalšího důvodu (např. CFA adjuvans) zbývá ověřit. Je překvapivé pozorovat, že pouze konstrukt UniHis-mIL5 byl schopen down-regulovat endogenní in vivo aktivitu mIL5 v modelu eosinofilie. Tato neschopnost antiséra vytvořeného při vakcinaci proteinem UniHis-mIL5.1 inhibovat eosinofilii a jeho schopnost inhibovat eosinofilii prostřednictvím DNA očkování svědčí pro to, že se v tomto pokuse mohla objevit technická chyba. To by také podporovalo neobvyklé zjištění, že vakcinace PBS inhibovala eosinofilii. Nejpravděpodobnější vysvětlení je, že tyto dvě skupiny (PBS a UniHis-mIL5.1) byly prohozeny.
Seznam literatury
Akutsu I. Et al., 1995, Immunol. Lett., 45, 109-116.
Alexander A. G. Et al., 1994, Thorax, 49(12), 1231-1233.
Azuma C. 9158. Et al. , 1986, Nucleic Acid Res. 1986, 14(22), 9149-
Barata L. 222-230. T. Et al., 1998, J. Alergy and Clin. Immunol, 101,
Baumann M .A. Et al., 1997, Methods, 11, 88-97
44
4 4 4
4 4
4
4 · 44 4 444 ···· · · · · · · · «4 «444
100
Callard R.E. & Gearing A.J.H., ’IL-5’, Cytokine Facts Book
1994, Academie Press.
Campbell H.D. Et al., 1988, Eur. J. Biochem., 174, 345-352. Chand N. Et al., 1992, Eur. J. Immunol., 211, 121-123.
Coeffier E. Et al., 1994, Br. J. Pharmacol., 113(3), 749-56.
Coffman R.L. Et al., 1989, Science, 245, 308-310.
Corrigan C.J. & Kay A.B., 1996, Eur. Resp. J., 9, suppl. 22, 72s-78s.
Cousins D.J. 150, S50-S53. Et al., 1994, Am. J. Resp. Crit. Care. Med
Danzig M. Et al. , 1997 , Aler gy, 52(8), 787 -794.
Dickason R.R. Et al., 1994, Cytokine, 6(6) , 647-656.
Dickason R.R. Et al., 1996a, Nátuře, 379, 652-655,
Dickason R.R. Et al., 1996b, J. Mol. Med., 74(9) , 535-546
Egan R.W. Et al., 1995 , Int. Arch. Alergy Immunol ., 107, 32
322.
Foster P.S. Et al., 1996, J. Exp. Med., 183, 195-201.
Graber P. Et al., 1993, Eur. J. Biochem., 212(3), 751-755.
Graber P. Et al., 1995, J. Biol. Chem., 270(26), 15762-15769.
Hamelmann E. Et al., 1997, Am. J. Crit. Care Med., 155(3), 819-825.
Huston M.M. Et al., 1996, J. Immunol., 156(4), 1392-1401.
Karlen S. Et al., 1998, Int. Rev. Immunol., 16(3-4), 227-247.
Kodama S. Et al., 1993, Eur. J. Biochem., 211(3), 903-908.
Kopf M. Et al., 1996, Immunity, 4, 15-24.
Kung T.T. Et al., 1995, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 13, 360-365.
Lee N.A. Et al·., 1997a, J. Immunol., 158, 1332-1344.
φφ φ φ φ
φ φ
φφφφ φφ • φ φ φ φ
φ φφ φφφφ φ · • · φ φ φφφ
101
Lee J.J. Et al., 1997b, J. Exp. Med. 1997b, 185(12), 21432156.
Lopez A.F. Et al., 1992, Immunology Toden, 13, 495-500.
Mauser P.J. Et al., 1993, Am. Rev. Respir. Dis., 148, 16231627.
Mauser P.J. Et al., 1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152 (2), 467-472.
Milburn M.V. Et al., 1993, Nátuře, 363, 172-176.
Moři A. Et al., 1997, J. Alergy Clin. Immunol., 100(6) Pt 2, S56-64.
Moxham J. & Costello J.F., 'Respirátory diseases', kap. 14, Textbook of Medicine, Churchill Livingstone 1990, Ed. Souhami R.L. and Moxham J.
Nagai H. Et al., 1993a, Ann. N.Y. Acad.Sci., 91-96.
Nagai H. Et al., 1993b, Life Sciences, 53, PL 243-247.
Ohashi Y. Et al., 1998, Scand. J. Immunol, 47, 596-602.
Ortega D. & Busse W.W., 'Asthma, Pathogenesis and treatmenť, kap. 28, Alergy, W.B. Saunders Company 1997, Ed. Kaplan A.P. Proudfoot A.E. Et al., 1990, Biochem J., 270(2), 357-361.
Proudfoot A.E. Et al., 1996, J. Protein Chem., 15(5), 491499.
Rose K. Et al., 1992, Biochem J, 286(Pt 3), 825-828.
Sanderson C.J., 1992, Blood, 79(12), 3101-3109.
Sher A. Et al., 1990, J. Immunol., 145, 3911-3916.
Takatsu K. Et al., Interleukin-5, Growth Factors and Cytokines in Health and Disease 1997, díl 2A, JAI Press lne., vyd. Leroith D. & Bondy C.
Tanabe T. Et al., 1987, J. Biol. Chem., 262, 16580-16584.
Tavernier J. Et al., 1989, DNA, 8(7), 491-501.
4 ·4 * ·
44 • 444 444 4444
4 4 4 4 444 4 4 4
444 4 444 4 4
444 44 4 444
4444 44 44 ·44 44 4444
102
Tominaga A. Et al., 1990, J. Immunol., 144(4), 1345-1352. Tominaga A. Et al., 1991, J. Exp. Med., 173(2), 429-437.
Underwood D.C. 154, 850-857. Et al. ř 1996, Am. J. Resp. Crit. Care Med.,
van Oosterhout 548-552. A.J.M. Et al. , 1993, Am. Rev . Resp. Dis., 147,
van Oosterhout A.J.M. Et al., 1995, Am. J. Respir. Crit. Care
Med., 151, 177-183.
Villinger F. Et al., 1995, J. Immunol., 155, 3946-3954.
Wang P. Et al., 1998, J. Immunol., 160, 4427-4432.
Yamaguchi Y. Et al.
1991, Blood, 78 (10), o r- λ '•vr-z'-» z54z-zo4/.
• 4 « 4 « • · 4 4 «4 4 · 4 4
4· 4 · • 444 *4 44
9 4 44·
9 • ·4·
44
9 9 4 • 4 4 • 44 4
4 4
4444
103
SEZNAM SEKVENCI <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> Disulfid <222> (44) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-86 ze sekv. id. č. : 1 <220>
<221> Disulfid <222> (86) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-44 ze sekv. id.
č. : 1 <400> 1
Ile 1 Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala Asn Glu Thr 30 Leu Arg
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Thr Val 60 Gin Gly Gly Thr
Val 65 Glu Arg Leu phe Lys 70 Asn Leu Ser Leu Ile 75 Lys Lys Tyr Ile Asp 80
Gly Gin Lys Lys Lys 85 Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg 90 Val Asn Gin 95 Phe
Leu Asp Tyr Leu 100 Gin Glu Phe Leu Gly 105 Val Met Asn Thr Glu 110 Trp Ile
Ile Glu Ser 115
<210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu
4
4 4
4
4 • 4
444 4 • 4 • 4 4 4
4 · · 4 · 4
4444 *·
4444
4 · 4
4 444 4
4 4 4 4
4 4 4
4··
104 <220>
<221> Mutagen <222> (32)..(46) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(86) <223> Identická se zbytky 1-86 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (102)..(126) <223> Identická se zbytky 91-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 2
Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile
85 90 95
Gly Ile Thr Glu Leu Arg Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin
100 105 - 110
Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Xlé Glu Ser
115 120 125
<210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (32)..(46) ·· • *« · » ·© © · · • · © « • · ► « · · ©
105 <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1) . . (31) <223> Identická se zbytky 1-31 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (47)..(118) <223> Identická se zbytky 44-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 3
Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Gin
20 25 30
Tyr Ile Lys Ala Asn ► Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Thr
35 40 45
Glu GlU Ile Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin
50 55 60
Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys
65 70 75 80
Tyr Ile Asp Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val
85 90 95
Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr
100 105 110
Glu Trp Ile Ile Glu Ser 115 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (59).. (73) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná • · « · • · · © · · · © « © ·©·· ♦· • « ·♦·· ♦ · · • ♦ ··· © · · « · · « · ·♦ · ·· ·· • © · © © « · • · © • « © ·· ····
106 <222> (1).. (58) <223> Identická se zbytky 1-58 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (74)..(124) <223> Identická se zbytky 65-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 4
Ile 1 Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gin Gly Ile GÍy Thr Leu Glu Ser Gin Gin Tyr Ile Lys Ala Asn
50 55 60
Ser Lys .Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn
65 70 75 80
Leu Ser Leu Ile 4 Lys ► Lys Tyr Ile Asp Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly
85 90 95
Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120
<210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (86)..(100) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(85) <223> Identická se zbytky 1-85 ze sekv. id. č.: 1 <220>
• 4
4444
4·
4« 444«
4444 44
4 · • 4 444
4 4 4
4 9·
444 • 4 • 4 • 4 • 4
107 <221> Podobná <222> (101)..(124) <223> Identická se zbytky 90-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 5
Ile Pro 1 Thr Glu Ile Pro 5 Thr Thr Ser Ala Leu Val Lys 10 Glu Thr Leu Ala
Ser Thr 20 Glu 15
Leu Leu His Arg Leu Leu 25 Ile Ala Asn Thr 30 Leu Arg
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Thr Val 60 Gin Gly Gly Thr
Val 65 Glu Arg Leu Phe Lys 70 Asn Leu Ser Leu Ile 75 Lys Lys Tyr Ile Asp BO
Gly Gin Lys Lys Lys 85 Gin Tyr Ile L-ys Ala 90 Asn Ser T.o« —j — Phe Ile 95 Gly
Ile Thr Glu Leu 100 Arg Val Asn Gin Phe 105 Leu Asp Tyr Leu Gin 110 Glu Phe
Leu Gly Val 115 Met Asn Thr Glu Trp 120 Ile Ile Glu Ser
<210> 6 <211> 126 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (110)..(124) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(109) <223> Identická se zbytky 1-109 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (125)..(126) <223> Identická se zbytky 114-115 ze sekv. id. č.: 1 ·· φφ φφ *♦·· φφ ·«
ΦΦΦΦ Φ Φ Φ » 1 I · φφφ φφφφφ φφ · φφ φφφ φ φφφ φ φ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφφ ·· φφφφ
108 <400> β
Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Sex Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly Glu GlU Arg Arg Arg Val Asn Gin Phe
85 90 95
Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Gin Tyr Ile
100 105 110
Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Glu Ser
115 120 125
<210> 7 <211> 132 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (87)..(107) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(86) <223> Identická se zbytky 1-86 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (108)..(132) <223> Identická se zbytky 91-115 ze sekv. id. č.: 1
9 <400> 7 ·· »· « · · ·
9 9 » *
9 » ···· »· • » ··· • · · • 9 99 9
9 9
9 9
9 · · 9 • ♦ • · ♦ * • ·
9999
109
Ile Pro 1 Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu 10 Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Xle Asp
65 70 75 80
Gly Gin Lys Lys Lys Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
85 90 95
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Arg Val Asn Gin
100 105 110
Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp
115 120 125
Ile Ile Glu Ser 130 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (32) . . (52) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(31) <223> Identická se zbytky 1-31 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (53)..(124) <223> Identická se zbytky 44-115 ze sekv. id. č.: 1 ·· ·· »» ·»»· ·· ·· • · 4 · · * · 9 φ · Φ • · * · · ♦«· · · 3 »··««» ···· · • · · « » · · · · «·«» 09 ·· *90 00 9000 <400> 8
110
Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys 10 Glu Thr Leu 15 Ala
1 5
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Phe
20 25 30
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
35 40 45
Ser His Leu Glu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu
50 55 60
Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn
65 70 75 80
Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly
85 90 95
Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120 <210> 9 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (59)..(79) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(58) <223> Identická se zbytky 1-58 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (80) . . (130) <223> Identická se zbytky 65-115 ze sekv. id. č. : 1 <400> 9 ·« ·« • e · « • · <
• · « • · « ···· ·· ··*·
9 9
9 999
9 9
9 9
999
9 9
9
9999
111
Ile 1 Pro Thr Clu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala Asn Glu Thr 30 Leu Arg
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Phe Asn 60 Asn Phe Thr Val
Ser 63 Phe Trp Leu Arg Val 70 Pro Lys Val Ser Ala 75 Ser His Leu Glu Val 80
Glu Arg Leu Phe Lys 85 Asn Leu Ser Leu Ile 90 Lys Lys Tyr Ile Asp 95 Gly
Gin Lys Lys Lys 100 Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg 105 Val Asn Gin 110 Phe Leu
Asp Tyr Leu 115 Gin Glu Phe Leu Gly 120 Val Met Asn Thr Glu 125 Trp Ile Ile
Glu Ser 130 <210> 10 <211> 132 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (110)..(130) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1).. (129) <223> Identická se zbytky 1-129 ze sekv. id. č.: 1 <220>
<221> Podobná <222> (131) .. (132) <223> Identická se zbytky 114-115 ze sekv. id. č.: 1 • · · <400> 10 ·· ·· » · · • ·
112
Ile 1 Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Iie Ala Asn Glu Thr 30 Leu Arg
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu cys Thr 45 Glu Glu Ile
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Thr Val 60 Gin Gly Gly Thr
Val 65 Glu Arg Leu Phe Lys 70 Asn Leu Ser Leu Ile 75 Lys Lys Tyr Ile Asp 80
Gly Gin Lys Lys Lys 85 Cys Gly Glu Glu Arg 90 Arg Arg Val Asn Gin 95 Phe
Leu Asp Tyr Leu 100 Gin Glu Phe Leu Gly 105 Val Met Asn Thr Phe 110 Asn Asn
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 'Sex Ala Ser His
115 120 125
Leu Glu Glu Ser 130 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopy P2 a P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (86)..(100) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Mutagen <222> (119)..(139) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(85) <223> Identická se zbytky 1-85 ze sekv. id. č.: 1 <220>
• · • · · · · ·
113 ·* ·· • · · · • · · • · · · • · · • · · · · ·
<221> Podobná
<222> (101)..(118)
<223> Identická se zbytky 92-109 ze sekv. id. č.: 1
<220>
<221> Podobná
<222> (140).. (141)
<223> Identická se zbytky 114-115 ze sekv. id. č.:
<400> 11
Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu GlU Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
Gly Gin Lys Lys Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
85 90 95
Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
Leu Gly Val Met Asn Thr Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
115 120 125
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Glu Ser
130 135 140
<210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221> Disulfid <222> (42) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-84 ze sekv. id. č. : 12 <220>
<221> Disulfid <222> (84) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-42 ze sekv. id.
č. : 12 <400> 12
114
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Ala Leu 15 Leu
Ser Ala His Arg 20 Ála Leu Leu Thr Ser 25 Asn Glu Thr Met Arg 30 Leu Pro
Val Pro Thr 35 His Lys Asn His Gin 40 Leu Cys Ile Gly Glu 45 Ile Phe Gin
Gly Leu 50 Asp Ile Leu Lys Asp 55 Gin Thr Val Arg Gly 60 Gly Thr Val Met
Arg 65 Leu Phe Gin Asn Leu 70 Ser Leu Ile Lys Lys 75 Tyr Ile Asp Arg Gin 80
Glu Lys Lys Cys Gly 85 Glu Glu Arg Arg Arg 90 Thr Arg Gin Phe Leu 95 Asp
Tyr Leu Gin Glu 100 Phe Leu Gly Ser Met 105 Asn Thr Ala Ala Ile 110 Ile Glu
Gly <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myši IL5 modifikovaný substituci s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (85)..(99) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(84) <223> Identická se zbytky 1-84 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (100) .. (124) <223> Identická se zbytky 89-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 13 • ·· · ······ · · · · · ··· · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····
115
Met Glu Xle Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
50 55 60
Arg Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
Glu Lys Lys Cys Gin Tyr ILe Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
85 90 95
Thr Glu Leu Arg Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
Leu Gly Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
115 120
<210> 14 <211> 116 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (30) .. (44) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(29) <223> Identická se zbytky 1-29 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (45)..(116) <223> Identická se zbytky 42-113 ze sekv. id. č. : 12 <400> 14
116
Met 1 Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu
5 10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Gin Tyr Ile
20 25 30
Lys Ala Asn 35 Ser Lys Phe Ile Gly 40 Ile Thr Glu Leu Cys 45 Ile Gly Glu
Ile Phe 50 Gin Gly Leu Asp Ile 55 Leu Lys Asp Gin Thr 60 Val Arg Gly Gly
Thr 65 Val Met Arg Leu Phe 70 Gin Asn Leu Ser Leu 75 Ile Lys Lys Tyr Ile 8C
Asp Arg Gin Glu Lys 85 Lys Cys Gly Glu Glu 90 Arg Arg Arg Thr Arg 95 Gin
Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Ala Ala
100 105 no
Ile Ile Glu Gly · 115 <210> 15 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (57)..(71) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1) . . (56) <223> Identická se zbytky 1-56 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (72) .. (122) <223> Identická se zbytky 63-113 ze sekv. id. č.: 12 « · <400> 15
117
Met 1 Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu
5 10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gin Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys
50 55 60
Phe Ile Gly Xle Thr Glu Leu Val Met Arg Leu Phe Gin Asn Leu Ser
65 70 75 80
Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu
85 90 95
Arg Arg Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
115 120
<210> 16 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (84)..(98) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1). . (83) <223> Identická se zbytky 1-83 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (99) .. (122) <223> Identická se zbytky 90-113 ze sekv. id. č. : 12 <400> 16
118
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu
10 15
Ser Ale His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
50 55 60
Arg Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
Glu Lys Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
85 90 95
Glu Leu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
115 120 <210> 17 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (108) .. (122) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(107) <223> Identická se zbytky 1-107 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (123) .. (124) <223> Identická se zbytky 112-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 17
119
Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Ser řla His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
50 55 60
Arg Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp
85 90 95
Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Gin Tyr Ile Lys Ala
100 105 110
Asn Ser Lys Phe Ile Giy Ile Thr Glu Leu Glu Gly
115 120
<210> 18 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (85)..(105) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(84) <223> Identická se zbytky 1-84 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (106)..(130) <223> Identická se zbytky 89-113 ze sekv. id. č.: 12 • 4
120
<400> 18
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Ala Leu 15 Leu
Ser Ala His Arg 20 Ala Leu Leu Thr Ser 25 Asn Glu Thr Met Arg 30 Leu Pro
Val Pro Thr 35 His Lys Asn His Gin 40 Leu Cys Ile Gly Glu 45 Ile Phe Gin
Gly Leu 50 Asp Ile Leu Lys Asp 55 Gin Thr Val Arg Gly 60 Gly Thr Val Met
Arg 65 Leu Phe Gin Asn Leu 70 Ser Leu Ile Lys Lys 75 Tyr Ile Asp Arg Gin 80
Glu Lys Lys Cys Phe 85 Asn Asn Phe Thr Val 90 Ser Phe Trp Leu Arg 95 Val
Pro Lys Val Ser 100 Ala Ser His Leu Glu 105 Arg Arg Thr Arg Gin 110 Phe Leu
Asp Tyr Leu 115 Gin Glu Phe Leu Gly 120 Ser Met Asn Thr Ala 125 Ala Ile Ile
Glu Gly •
130
<210> 19 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (30)..(50) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(29) <223> Identická se zbytky 1-29 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (51)..(122) <223> Identická se zbytky 42-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 19 «!·· *·»* *·«* «·· ·* ····
121
Met Glu 1 Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu 15 Leu
• 5 10
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Phe Asn Asn
20 25 30
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
35 40 45
Leu Glu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp
50 55 60
Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met Arg Leu Phe Gin Asn Leu Ser
65 70 75 80
Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu
85 90 95
Arg Arg Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
115 120
<210> 20 <211> 128 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (57)..(77) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(56) <223> Identická se zbytky 1-56 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (78)..(128) <223> Identická se zbytky 63-113 ze sekv. id. č.: 12 • · ©«©· <400> 20 ♦ * · • · © · · • © · • · © © · · · ·
·©
122
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Ala Leu 15 Leu
Ser ?la His Arg 20 Ala Leu Leu Thr Ser 25 Asn Glu Thr Met Arg 30 Leu Pro
Val Pro Thr 35 His Lys Asn His Gin 40 Leu Cys Ile Gly Glu 45 Ile Phe Gin
Gly Leu 50 Asp Ile Leu Lys Asp 55 Gin Phe Asn Asn Phe 60 Thr Val Ser Phe
Trp 65 Leu Arg Val Pro Lys 70 Val Ser Ala Ser His 75 Leu Glu Val Met Arg 80
Leu Phe Gin Asn Leu 85 Ser Leu Ile Lys Lys 90 Tyr Ile Asp Arg’ Gin 95 Glu
Lys Lys Cys Gly 100 Glu Glu Arg Arg Arg 105 Thr Arg Gin Phe Leu 110 Asp Tyr
Leu Gin GlU 115 Phe Leu Gly Ser Met 120 Asn Thr Ala Ala Ile 125 Ile Glu Gly
<210> 21 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (108)..(128) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(107) <223> Identická se zbytky 1-107 ze sekv. id. č. : 12 <220>
<221> Podobná <222> (129)..(130) <223> Identická se zbytky 112-113 ze sekv. id. č.: 12
φ · φφφφ φ
« • φ ·· φφ ♦ · · φ φ φ · φφφ φ φ · φφφφ φφ φ' φ
φ •
φ • ΦΦΦ
123
<400> 21
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Ala Leu 15 Leu
Ser Ala His Arg 20 Ala Leu Leu Thr Ser 25 Asn Glu Thr Met Arg 30 Leu Pro
Val Pro Thr 35 His Lys Asn His Gin 40 Leu cys Ile Gly Glu 45 Ile Phe Gin
Gly Leu 50 Asp Ile Leu Lys Asp 55 Gin Thr Val Arg Gly 60 Gly Thr Val Met
Arg 65 Leu Phe Gin Asn Leu 70 Ser Leu Ile Lys Lys 75 Tyr Ile Asp Arg Gin 80
Glu Lys Lys Cys Gly 85 Glu Glu Arg Arg Arg 90 Thr Arg Gin Phe Leu 95 Asp
Tyr Leu Gin Glu 100 Phe Leu Gly Ser Met 105 Asn Thr Phe Asn Asn 110 Phe Thr
Val Ser Phe 115 Trp Leu Arg Val Pro 120 Lys Val Ser Ala Ser 125 His Leu Glu
Glu Gly 130 <210> 22 <211> 139 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopy P2 a P30 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutagen <222> (84) .. (98) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>
<221> Mutagen <222> (117) .. (137) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>
<221> Podobná <222> (1)..(83) <223> Identická se zbytky 1-83 ze sekv. id. č.: 12 • 4 »4
4 4 4 4
4 4 4 · »
444 ··
4 4 ·
4 4
4 4
4444
124 <220>
<221> Podobná <222> (99)..(116) <223> Identická se zbytky 90-109 ze sekv. id. č.: 12 <220>
<221> Podobná <222> (138)..(139) <223> Identická se zbytky 112-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 22
Met Glu 1 Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Ala Leu 15 Leu
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
50 55 60
Arg Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
Glu Lys Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
» 85 90 95
Glu Leu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Met Asn Thr Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
115 120 125
Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Glu Gly
130 135
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 23
Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani
© ·· • * ♦
··♦· ·· ···· ©« © © © • · ··© • · · ♦ ♦ · ·
125 <400> 24
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 15 10 15
Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(45) <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA kódující značku His <400> 25
atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa caa
Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin Gin
1 5 10 15
<210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<400> 26
Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin Gin
1 5 10 15
<210> 27 <211> 381 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
126 <221> CDS <222> (1)..(381) <220>
<221> Mutace <222> (262)..(306) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(261) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-87 humánního IL5 <220>
<221> různé <222> (307) . . (378) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 <400> 27
atc ccc aca gaa Thr Glu att Ile 5 ccc Pro aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg Leu 15 gca Ala 48
Ile 1 Pro Thr Ser Ala Leu Val 10 Lys Glu Thr
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg 96
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc 144
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act 192
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat 240
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
ggc caa aaa aaa aag tgt gga cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc 288
Gly Gin Lys Lys Lys cys Gly Gin Tyr Ile Lys Ala Asn ser Lys Phe
Θ5 90 95
atc ggc atc acc gag ctg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag 336
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin
100 105 110
gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga 381
Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120 125
<210> 28 <211> 126 <212> PRT ♦
• · 4 ♦ 4 4« ♦ 4 4 ♦ • · 4 ♦ · 4
4 ·
44*4 »·
4 4
127 <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <400> 28
Ile 1 Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Ly3 Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
85 90 95
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120 125
<210> 29 <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(375) <220>
<221> Mutace <222> (94)..(156) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(93)
99
9 9 9
9 « · ·
9 9
9999 »· ·*
9 · 9
9 9
9 9 9 · 9
9999 99 ·**·
9 9 • · 999
9 9 9
9 9
9 99
128 <223> DNA kódující aminokyseliny 1-31 humánního IL5 <220>
<221> různé <222> (157)..(372) <223> DNA kódující aminokyseliny 44-115 humánního IL5 <400> 29
atc Xle 1 ccc aca gaa att ccc Ile Pro 5 aca agt gca ttg gtg aaa cag acc Glu Thr ttg Leu 15 gca Ala 48
Pro Thr Glu Thr Ser Ala Leu Val 10 Lys
ctg ctt tet aet cat ega aet ctg ctg ata gcc aat gag aet ctc ttc 96
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Phe
20 25 30
aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg ege gtg cct aag gtg agc gcc 144
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
35 40 45
agc cac ctg gag tgc aet gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctc 192
Ser His Leu Glu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu
50 55 60
gag agt caa aet gtg caa ggg ggt aet gtg gaa aga cta ttc aaa aac 240
Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn
65 70 75 80
ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat ggc caa aaa aaa aag tgt gga 288
Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly
85 90 95
gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt 336
Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Lsu Gin Glu Phe
100 105 110
ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga 375
Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120 <210> 30 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • 0 ·
I 0 4
I · 0
I 0 ·
0000
0
00« <400> 30 «0 »»
0 0 0 · 0 0 0 ·
0 * 0 * • 000 0000
129
Ile 1 Pro Thr Glu Ile . 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala Asn Glu
Asn Asn Phe 35 Thr Val Ser Phe Trp 40 Leu Arg Val Pro Lys 45
Ser His 50 Leu Glu cys Thr Glu 55 Glu Ile Phe Gin Gly 60 Ile
Glu 65 Ser Gin Thr Val Gin 70 Gly Gly Thr Val Glu 75 Arg Leu
Leu Ser Leu Ile Lys 85 Lys Tyr Ile Asp Gly 90 Gin Lys Lys
Glu Glu Arg Arg 100 Arg Val Asn Gin Phe 105 Leu Asp Tyr Leu
Leu Gly Val 115 Met Asn Thr Glu Trp 120 Ile Ile Glu Ser
Thr Leu 15 Ala
Thr Leu Phe
30
Val Ser Ala
Gly Thr Leu
Phe Lys Asn
80
Lys Cvs Gly
95
Gin Glu Phe
110
<210> 31 <211> 393 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(393) <220>
<221> Mutace <222> (175)..(237) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(174) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-58 humánního IL5 <220>
<221> různé <222> (238)..(390) • & · 4 * ·
ΦΦ ·
·
4
4 ·»
4* 4
4 4
4 4 · ·
4444 »4 * 4 4
4 4 44
4 4 4
4 4
Φ·4
4 *
Φ
Φ
ΦΦ« 4
130 <223> DNA kódující aminokyseliny 65-115 humánního IL5 <400> 31
atc ccc a ca Thr gaa Glu att Ile c ccc Pro aca Thr agt gca ttg Leu 10 gtg Val aaa gag acc ttg gca 48
Ile 1 Pro Ser Ala Lys Glu Thr Leu i c Ala
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg 96
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala Asn Glu Thr 30 Leu Arg
att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc 144
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa ttc aac aac ttc acc gtg 192
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Phe Asn 60 Asn Phe Thr Val
agc ttc tgg ctg ege gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag gtg 240
Ser 65 Phe Trp Leu Arg Val 70 Pro Lys Val Ser Ala 75 Ser His Leu Glu Val 80
gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta eta aag aaa tac atc gat ggc 288
Glu Arg Leu Phe Lys 65 Asn Leu Ser Leu Ile 90 Lys Lys Tyr Ile Asp 95 Gly
caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta 336
Gin Lys Lys Lys 100 Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg 105 Val Asn Gin 110 Phe Leu
gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac ace gag tgg ata ata 384
Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile
115 120 125 gaa agt tga 393
Glu Ser
130
<210> <211> <212> <213> <223> 32 130 PRT Umělá sekvence Popis umělé sekvence: substitucí s epitopem humánní IL5 tetanického modifikovaný toxoidu
<400> 32
Ile Pro 1 Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
' 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
·» »·»♦ • » ······ ·»·· · ·»«·· ···* »··· »· »· »·« »· ·«»·
131
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Phe Asn 60 Asn Phe Thr Val
Ser 65 Phe Trp Leu Arg Val 70 Pro Lys Val Ser Ala 75 Ser His Leu Glu Val 80
Glu Arg Leu Phe Lys 85 Asn Leu Ser Leu Ile 90 Lys Lys Tyr Ile Asp 95 Gly
Gin Lys Lys Lys 100 cys Gly Glu Glu Arg 105 Arg Arg Val Asn Gin 110 Phe Leu
Asp Tyr Leu 115 Gin G-lu Phe Leu Gly 120 Val Met Asn Thr Glu 125 Trp Ile Ile
Glu Ser 130
<210> 33 <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(375) <220>
<221> Mutace <222> (175)..(219) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(174) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-58 humánního IL5 <220>
<221> různé <222> (220)..(372) <223> DNA kódující aminokyseliny 65-115 humánního IL5 •·4« 44 <400> 33 *· ··»· • 4 · • 4 4 4 4 • 4 4 · • 9 ·
444
• 4
4444
132
atc : ccc ; aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca 48
Ile : Pro ' Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg 96
Leu Leu Sex Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc 144
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa cag tac atc aag gcc aac 192
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Gin Tyr Ile Lys Ala Asn
50 55 60
tcc aag ttc atc ggc atc acc gag ctg gtg gaa aga cta ttc aaa aac 240
Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn
65 70 75 80
ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat ggc caa aaa aaa aag tgt gga 288
Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly
85. 90 95
gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt 336
Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
ctt ggt gta atg Bac acc gag tgg ata ata gaa agt tga 375
Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120
<210> 34 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <400> 34 • 4 4© © 4 « · « • © a
4«
44©· ·© ©· ·»©4 © · « • · 4 * · • 4 4
4 4 ·· 4·© ·· 4· © © © © «4 ©
133
Ile Pro 1 Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Gin Tyr Ile Lys Ala Asn
50 55 60
Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn
65 70 75 80
Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly
65 90 95
Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120
<210> 35 <211> 357 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(357) <220>
<221> Mutace <222> (94) . .(138) <223> Epitop $2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (|)..(93) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-31 humánního IL5 <220>
<221> různé
9··· • 9
999 • ·
9 * 9
9
9« 99
9 9 9
9 9 • 9 9 • 9 ·
9*99 99 •
*9 9
9
999 • ·
9999
134 <222> (139)..(354) <223> DNA kódující aminokyseliny 44-115 humánního IL5 <400> 35
atc Ile 1 ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca 48
Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thx Leu Ala 15
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cag 96
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Gin
20 25 30
tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc atc acc gag ctg tgc act 144
Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Thr
35 40 45
gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa 192
Glu Glu Ile Phe Gin Gly Ile Gly Thx Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin
50 55 60 -
ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa 240
Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys
65 70 75 60
tac atc gat ggc caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta 288
Tyr Ile Asp Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val
85 90 95
aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac acc 336
Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr
100 105 110
gag tgg ata ata gaa agt tga 357
Glu Trp Ile Ile Glu Ser 115 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu ·· ·· ·· ···· • · · • · ··· • · · • 4 *·· • · <400> 36 «< ·· • · · · • · · • · · • · • · • · ·· ····
135
Ile 1 Pro Thr Glu Ile ' 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala. Asn Glu Thr 30 Leu Gin
Tyr Ile Lys 35 Ala Asn Ser Lys Phe 40 Ile Gly Ile Thr Glu 45 Leu Cys Thr
Glu Glu 50 Ile Phe Gin Gly Ile 55 Gly Thr Leu Glu Ser 60 Gin Thr Val Gin
Gly 65 Gly Thr Val Glu Arg 70 Leu Phe Lys Asn Leu 75 Ser Leu Ile Lys Lys 80
Tyr Ile Asp Gly Gin 85 Lys Lys Lys Cys Gly 90 Glu Glu Arg Arg Arg 95 Val
Asn Gin Phe Leu 100 Asp Tyr Leu Gin Glu 105 Phe Leu Gly Val Met 110 Asn Thr
Glu Trp Ile 115 Ile Glu Ser
<210> 3l <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(375) <220>
<221> Mutace <222> (256)..(3^00) <223> Epitop £2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (|)..(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 humánního IL5 <220>
<221> různé <222> (301)..(372) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 • · • · · · • · • · · • · ···
136 <4C0> 3T
atc Ile 1 ccc Pro aca Thr gaa Glu att Ile 5 ccc Pro aca Thr agt Ser gca Ala ttg Leu 10 gtg Val aaa Lys gag Glu acc Thr ttg Leu 15' gca Ala 48
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg 95
Leu Leu Ser Thr His. Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc 144
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act 192
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat 240
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
ggc caa aaa aaa aag cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc 288
Gly Gin Lys Lys Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
85 90 95
atc acc gag ctg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt 336
Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga 375
Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120
<210> 38 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu
<400> 38
Ile 1 Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala Asn Glu Thr 30 Leu Arg
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
• ·
137
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val
50 55 60
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys
.65 70 75
Gly Gin Lys Lys Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser
Θ5 SO
Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gin Phe Leu Asp Tyr
100 105
Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
115 120
Gin Gly Gly Thr
Lys Tyr Ile Asp 80
Lys Phe Ile S5 Gly
Leu Gin 110 Glu Phe
<210> 39 <211> 399 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(399) <220>
<221> Mutace <222> (262).. (i3<) <223> Epitop |30 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (,1) . . (261) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-87 humánního IL5 <220>
<221> různé <222> (325)..(396) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 <400> 39
138
atc ccc aca gaa Glu att Ile 5 ccc aca Pro Thr agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca 48
Ile Pro 1 Thr Ser Ala Leu Val 10 Lys Glu Thr Leu 15 Ala
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg 96
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc 144
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act 192
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat 240
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
ggc caa aaa aaa aag tg t gga ttc sse aac ttc ěCC gtg age tte tgg 288
Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
85 90 95
ctg cgc gtg cct aag gtg age gcc age cac ctg gag aga gta aac caa 336
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gin
100 105 110
ttc cta gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg 384
Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp
115 120 125 ata ata gaa agt tga 399
Ile Ile Glu Ser
130 <210> 40 <211> 132 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • 4 44··
4 • 4·· • 4 4444
139
<400> 40
Ile 1 Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala Asn Glu Thr 30 Leu A.rg
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Thr Val 60 Gin Gly Gly Thr
Val 65 Glu Arg Leu Phe Lys 70 Asn Leu Ser Leu Ile 75 Lys Lys Tyr Ile Asp 80
Gly Gin Lys Lys Lys 85 Cys Gly Phe Asn Asn 90 Phe Thr Val Ser Phe 95 Trp
Leu Arg Val Pro 100 Lys Val Ser Ala Ser 105 His Leu Glu Arg Val 110 Asn Gin
Phe Leu Asp 115 Tyr Leu Gin Glu Phe 120 Leu Gly Val Met Asn 125 Thr Glu Trp
Ile Ile Glu Ser 130 <210> 41 <211> 393 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(393) <220>
<221> Mutace <222> (256) . . (318) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 humánního IL5 <220>
<221> různé • · • · ©
• · ··· © ♦ · © · · · · ··
140 <222> (319)..(390) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5
:400> 41
atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca 48
Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg 96
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc 144
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act 192
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gin Thr Val Gin Gly Glv Thr
50 55 60
gtg gaa aga eta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat 240
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
ggc caa aaa aaa aag ttc aac aac ttc aec gtg age ttc tgg ctg ege 288
Gly Gin Lys Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
85 90 95
gtg cct aag gtg age gcc age cac ctg gag aga gta aac caa ttc eta 336
Val Pro Lys val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gin Phe Leu
100 105 110
gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta ata aac acc gag tgg ata ata 384
Asp Tyr Leu i Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile
115 120 125 gaa agt tga 393
Glu Ser
130 <210> 42 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu ···»
141 <400> 42
Ile 1 Pro Thr Glu Ile Pro 5 Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys
Leu Leu Ser Thr 20 His» Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala ϊι« Λ
Ile Pro Val 35 Pro Val His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys
Phe Gin 50 Gly Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Thr Val 60
Val 65 .Glu Arg Leu Phe Lys 70 Asn Leu Ser Leu Ile 75 Lys
Gly Gin Lys Lys Lys Phe 85 Asn Asn Phe Thr 90 Val Ser
Val Pro lys Val 100 Ser Ala Ser His Leu 105 Glu Arg Val
Asp Tyr Leu 115 Gin Glu Phe Leu Gly 120 Val Met Asn Thr
Glu Ser 130
Glu Thr Leu 15 Ala
Glu Thr 30 Leu Arg
Thr 45 Glu Glu Ile
Gin Gly Gly Thr
Lys Tyr Ile Asp 80
Phe Trp Leu 95 Arg
Asn Gin 110 Phe Leu
Glu Trp Ile Ile
125 <210> 43 <211> 444 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(444) <220>
<221> Mutace <222> (262)..(306) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutace <222> (307)..(369) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
• Φ φφφφ φ φ φφφφ φ φ •· φφφφ
142 <221> různé <222> (1) . . (261) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-87 humánního IL5 <220>
<221> různé <222> (370)..(441) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 <400> 43
atc ccc aca gaa att »ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca Ala 48
Ile 1 Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15
ctg ctt tet act cat ega act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg 96
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc 144
Ile řro Val Pro Val His Lys Asn His Gin Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act 192
Phe Gin Gly Ile Gly Thr Leu Glu Sex Gin Thr Val Gin Gly Gly Thr
50 55 60
gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat 240
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
ggc caa aaa aaa aag tgt gga cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc 288
Gly Gin Lys Lys Lys Cys Gly Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
85 90 95
atc ggc atc acc gag ctg ttc aac aac ttc acc gtg. age ttc tgg ctg 336
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
100 105 110
cgc gtg cct aag gtg age gcc age cac ctg gag aga gta aac caa ttc 384
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gin Phe
115 120 125
cta gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta a tg aac acc gag tgg ata 432
Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile
130 135 140 ata gaa agt tga 444
Ile Glu Ser
145 <210> 44 <211> 147 <212> PRT <213> Umělá sekvence
444«
444
444 4
· * • 4 4··«
143 <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <400> 44
Ile 1 Pro Thr Glu Ile 5 Pro Thr Ser Ala Leu 10 Val Lys Glu Thr Leu 15 Ala
Leu Leu Ser Thr 20 His Arg Thr Leu Leu 25 Ile Ala Asn Glu Thr 30 Leu Arg
Ile Pro Val 35 Pro VÁ1 His Lys Asn 40 His Gin Leu Cys Thr 45 Glu Glu Ile
Phe Gin Gly 50 ' Ile Gly Thr Leu 55 Glu Ser Gin Thr Val 60 Gin Gly Gly Thr
Val 65 Glu Arg Leu Phe 4 Lys 70 Asn Leu Ser Leu Ile 75 Lys Lys Tyr Ile Asp 80
Gly Gin Lys Lys Lys 85 Cys Gly Gin Tyr Ile 90 Lys Ala Asn Ser Lys 95 Phe
Ile Gly Ile Thr 100 Glu Leu Phe Asn Asn 105 Phe Thr Val Ser Phe 110 Trp Leu
Arg Val Pro 115 Lys Val Ser Ala Ser 120 His Leu Glu Arg Val 125 Asn Gin Phe
Leu Asp 130 Tyr Leu Gin Glu Phe 135 Leu Gly Val Met Asn 140 Thr Glu Trp Ile
Ile Glu Sex 145 <210> 45 <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(375) <220>
<221> Mutace <222> (256)..(300) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé ·· ¥»·*
144 <222> (1). .(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 myšího IL5 <220>
<221> různé <222> (301)..(375) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 45
atg gag att Ile ccc atg age aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag Gin 15 ctg Leu 48
Met 1 Glu Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Thr
tcc gct cac ega g=t ctg ttg aca age aat gag acg atg agg ctt cct 96
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
gtc cct aet cat aaa aat cac cag eta tgc att gga gag atc ttt cag 144
Val Pro Thr His Ly? Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
ggg eta gac ata ctg aag aat caa aet gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa 192
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
50 55 60
atg eta ttc caa aac ctg tea tta ata aag aaa tac atc gat aga caa 240
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
aaa gag aag tgt ggc cag tac atc aaa gct aac tec aaa ttc atc ggt 288
Lys Glu Lys Cys Gly Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
85 90 95
atc acc gag etg agg acg agg cag ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc 336
Ile Thr Glu Leu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc taa 375
Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120
<210> 46 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu
4«
4444 44 • ♦
4 44
4« 4444
145
<400> 46
Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu
1 5 10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
50 55 60
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
Lys Glu Lys Cys Gly Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
85 90 95
Ile Thr Glu Leu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe
100 105 110
Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120
<210> 47 <211> 369 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <223> (1)..(369) <220>
<221> Mutace <222> (88)..(150) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1) . . (87) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-29 myšího IL5 <220>
<221> různé <222> (151)..(366) • · ·· · · · · · · ·· ·· • ··· ···· ·· · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · ··· · · * · · · ···· ·· ·· ··· ·· ····
146 <223> DNA kódující aminokyseliny 42-113 myšího IL5 <400> 47
atg Met 1 gag Glu att Ile ccc Pro atg age aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag Gin 15 ctg Leu
Met Ser 5 Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Thr
tcc gct cac ega gct ctg ttg aca age aat gag a cg atg ttc aac aac
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Phe Asn Asn
20 25 30
ttc acc gtg age ttc tgg ctg ege gtg ccc aag gtg age gcc age cac
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
40 45
ctg gag tgc att gga gag atc ttt cag ggg cta gac ata ctg aag aat 192
Leu Glu Cys Ile Gly Glu Ile 55 Phe Gin Gly Leu Asp 60 Ile Leu Lys Asn
50
caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa atg cta ttc caa aac ctg tea 240
Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser
65 70 75 80
tta ata aag aaa tac atc gat aga caa aaa gag aag tgt ggc gag gag 288
Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu
85 90 95
aga cgg agg acg agg cag ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt 336
Arg Arg Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc taa 369
Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120 <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • 4 <400> 48
444 4444
4 4 4444 4 4 4
444 4 444 4 4
147
Met -Glu 1 Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu
5 10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Phe Asn’ Asn
20 25 30
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
35 40 45
Leu Glu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn
50 55 60
Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser
65 70 75 80
Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu
85 90 95
Arg Arg Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120
<210> 49 <211> 387 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(387) <220>
<221> Mutace <222> (169)..(231) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(168) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-56 myšího IL5 <220>
<221> různé <222> (232) .. (384) <223> DNA kódující aminokyseliny 63-113 myšího IL5
44
4 4 4 • · 4 • 4 <400> 49
148
atg Met 1 gag att ccc atg age aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu 46
Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val
10 15
tcc. . gct cac ega gct ctg ttg aca age aat gag acg atg agg ctt cct 96
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag 144
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
ggg cta gac ata ctg aag aat caa ttc aac aac ttc acc gtg age ttc 192
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe
50 55 60
tgg ctg egc gtg ccc aag gtg age gcc age cac ctg gag gtg gaa atg 240
Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Glu Met
65 70 75 80
cta ttc caa aac ctg tea tta ata aag aaa tac atc gat aga caa aaa 288
Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin Lys
85 90 95
gag aag tgt ggc gag gag aga cgg agg acg agg cag ttc ctg gat tat 336
Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr
100 105 110
ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc 3B4
Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120 125
taa 387 <210> 50 <211> 128 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • · • · · · <400> 50
149
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Thr Gin 15 Leu
ser Ala His Arg 20 Ala Leu Leu Thr Ser 25 Asn Glu Thr Met Arg 30 Leu Pro
Val Pro Thr 35 His Lys Asn His Gin 40 Leu Cys Ile Gly Glu 45 Ile Phe Gin
Gly Leu 50 Asp Ile Leu Lys Asn 55 Gin Phe Asn Asn Phe 60 Thr Val Ser Phe
Trp 65 Leu Arg Val Pro ► Lys 70 Val Ser Ala Ser His 75 Leu Glu Val Glu Met 80
Leu Phe Gin Asn Leu 85 Ser Leu Ile Lys Lys 90 Tyr Ile Asp Arg Gin 95 Lys
Glu Lys Cys Gly 100 Glu Glu Arg Arg Arg 105 Thr Arg Gin Phe Leu 110 Asp Tyr
Leu Gin Glu 115 Phe Leu Gly Val Met 120 Ser Thr Glu Trp Ala 125 Met Glu Gly
<210> 51 <211> 351 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(351) <220>
<221> Mutace <222> (88) . . (132) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1) . . (87) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-29 myšího IL5 <220>
<221> různé <222> (133) .. (348) ·
• · · · ·· • 4 4 · · ·
4 4 · 4 4 ·
4 4 4 4 4
4 4 4 4
444 44 4444
150 <223> DNA kódující aminokyseliny 42-113 myšího IL5 <400> 51
atg Met 1 gag att ccc atg age aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag Gin 15 ctg Leu 48
Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Thr
tcc gct cac ega gct ctg ttg aca age aat gag a cg atg cag tac atc S6
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Gin Tyr Ile
20 25 30
aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg tgc att gga gag 144
Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ile Gly Glu
35 40 45
atc ttt cag ggg cta gac a ta ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt 192
Ile Phe Gin Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly
50 55 60
acc gťg gaa atg ct$ ttc caa aac ctg tea tta ata aag aaa tac atc 240
Thr Val Glu Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile
65 70 75 80
gat aga caa aaa gag aag tgt ggc gag gag aga cgg agg a cg agg cag 288
Asp Arg Gin Lys Glu Lys Cys Gly GlU Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gin
85 SO 95
ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg 336
Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp
100 105 110
gca atg gaa ggc taa 351
Ala Met Glu Gly
115 <210> 52 <211> 116 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu ·· · · <400> 52 ·· ·· • » ·
151
Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu
1 5 10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Gin Tyr Ile
20 25 30
Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ile Gly Glu
35 40 45
Xle Phe Gin Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly
50 55 60
Thr Val Glu Met Leu Phe Gin Asn Leu Sex Leu Ile Lys Lys Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Arg Gin Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gin
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp
100 105 110
Ala Met Glu Gly 115 <210> 53 <211> 369 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(369) <220>
<221> Mutace <222> (250)..(294) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(249) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-83 myšího IL5 <220>
<221> různé <222> (295.) . . (366) ♦ · · ·· ·· ·· • · · · · «
99
9 9 9 • 9 9
9 9
9 9
99 9 9
152 <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 53
a tg Met 1 gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aea cag Gin 15 ctg Leu 48
Glu Xle Pro Met Ser 5 Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Thr
tcc gct cac ega gct ctg ttg aca agc aat gag a cg atg agg ctt cct 96
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag 144
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa 192
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
50 55 60
atg cta ttc caa aac ctg tea tta ata aag aaa tac atc gat aga caa 240
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gin
65 70 75 80
aaa gag aag cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc atc acc 288
Lys Glu Lys Gin Tyr 85 Ile Lys Ala Asn Ser 90 Lys Phe Ile Gly Ile 95 Thr
gag ctg agg acg agg cag ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt 336
Glu Leu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc taa 369
Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120
<210> 54 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • * ··· · <400> 54 • · · · ·· ··♦· • ♦ · · 9 9 9 '9
9 9 9 9 9 9 9 · ·· · · · · · · « • 9 9 9 9 9 9
99 9 99 9 9 9 99
153
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu
10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val· Glu
50 55 60
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
Lys Glu Lys Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
85 90 95
Glu Leu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120
<210> 55 <211> 393 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(393) <220>
<221> Mutace <222> (256)..(318) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1) . . (255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 myšího IL5 <220>
<221> různé <222> (319)..(390) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 . ·· •· ·»«« <400> 55 ·· ··
4 4 · · · · · • · 4 4 4 • 4 4 ·
4449 99
4· ·
4 • 4
4 4
4
154
atg gag Met GlU 1 att Ile ccc atg age aca Ser Thr gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag Thr Gin 15 ctg Leu 48
Pro Me£ 5 Val Val Lys 10 Glu Thr Leu
tcc gct cac ega gct ctg ttg aca age aat gag a cg atg agg ctt cct 96
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag 144
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa 192
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
50 55 60
atg cta ttc caa aac ctg tea tta ata aag aaa tac atc gat aga caa 240
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
aaa gag aag tgt ggc ttc aac aac ttc acc gtg age ttc tgg ctg ege 288
Lys Glu Lys Cys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
Θ5 SO 95
gtg ccc aag gtg age gcc age cac Ctg gag agg a cg agg cag ttc ctg 336
Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Leu
100 105 110
gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg 384
Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met
115 120 125 gaa ggc taa 393
Glu Gly
130 <210> 56 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <400> 56 ·· ·· ·Β ···· ·· ·· • · · · · Β · · Β · · • · · · · · · · · Β Β
Β Β · · Β Β · · · Β ·
ΒΒΒ · Β Β · · ·
ΒΒΒΒ ΒΒ ·· ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒΒ
155
Met 1 Glu Ile Pro Met 5· Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu
10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Ajn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
50 55 60
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
Lys Glu. Lys Cys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
• 85 90 95
Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Leu
100 105 110
Asp Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met
115 120 125
Glu Gly 130 <210> 57 <211> 387 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1) .. (387) <220>
<221> Mutace <222> (250)..(312) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
<221> různé <222> (1)..(249) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-83 myšího IL5
9999
99 • · Φ · • · Φ ΦΦΦ
ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ
Φ Φ Φ
Φ Φ Φ
Φ Φ
Φ Φ
ΦΦ Φ
Φ Φ Φ Φ «4 Φ
ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ Φ ·
ΦΦ ΦΦΦΦ
156 <220>
<221> různé <222> (313).. (384) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 57
atg gag att ccc atg age aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag Gin 15 ctg Leu 48
Met Glu 1 Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Thr
tcc gct cac ega gct ctg ttg aca age aat gag acg atg agg ctt cct 96
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag 144
Val Pro Thr His Lys »Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
35 40 45
ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa 192
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
50 55 60
atg cta ttc caa aac ctg tea tta ata aag aaa. tac atc gat aga caa 240
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 - 70 75 80
aaa gag aag ttc aac aac ttc acc gtg age ttc tgg ctg cgc gtg ccc 288
Lys Glu Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
85 90 95
aag gtg age gcc age cac ctg gag agg acg agg cag ttc ctg gat tat 336
Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp Tyr
100 105 110
ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc 384
Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120 125
tas 387 <210> 58 <211> 128 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu •4 *44· • 4
444 <400> 58
44
4 4 4
4 4
4 4 4
4 4
4444 44 •
4 4
4 4
4· 444
4· 44
4 · 4 • 4 4
4 4 4
4 4
4444
157
Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu
1 5 10 15
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
20 25 30
Val Pro Thr His Lys Asn His Gin Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gin
40 45
Gly Leu 50 Asp Ile Leu Lys Asn 55 Gin Thr Val Arg Gly 60 Gly Thr Val Glu
Met 65 Leu Phe Gin Asn Leu 70 Ser Leu Ile Lys Lys 75 Tyr Ile Asp Arg Gin 80
Lys Glu Lys Phe Asn 85 Asn Phe Thr Val Ser 90 Phe Trp Leu Arg Val 95 Pro
Lys Val Ser Ala 100 Ser His Leu Glu Arg 105 Thr Arg Gin Phe Leu 110 Asp Tyr
Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
115 120 125 <210> 59 <211> 438 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <220>
<221> CDS <222> (1)..(438) <220>
<221> Mutace <222> (256)..(300) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>
<221> Mutace <222> (301)..(363) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>
AA AAAA
A A A
A AAAA
A A A
A A A
A A AAA
A Α Α·
A A A A
A A A • A A A
AAA ••♦A AA
AA AA
A A A A
A A A
AAA A AAA
AA AAAA
158 <221> různé <222> (1)..(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 myšího IL5 <220>
<221> různé <222> (364)..(435) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 59
atg gag att ccc Pro atg Met 5 age Ser aca Thr gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag Gin 15 ctg Leu
Met 1 Glu Ile Val Val Lys Glu 10 Thr Leu Thr
tcc gct cac ega gct ctg ttg aca age aat gag acg atg agg ctt cct
Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
25 30
gtc cct act Thr 35 cat His aaa Lys aat Asn cac cag eta Leu tgc att gga gag atc ttt cag Gin 144
Val Pro His Gin 40 Cys Ile Gly Glu 45 Ile Phe
ggg eta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa 192
Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gin Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
50 55 60
atg eta ttc caa aac ctg tea tta ata aag aaa tac atc gat aga caa 240
Met Leu Phe Gin Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gin
65 70 75 80
aaa gag aag tgt ggc cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc 288
Lys Glu Lys Cys Gly Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
85 90 95
atc acc gag ctg ttc aac aac ttc acc gtg age ttc tgg ctg ege gtg 336
Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
100 105 110
ccc aag gtg age * gcc age cac ctg gag agg acg agg cag ttc ctg gat 384
Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp
115 120 125
tat ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa 432
Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu
130 135 140
ggc taa 438
Gly
145 <210> 60 <211> 145 <212> PRT <213> Umělá sekvence ·« ·»©· ·© © © • ·· · ©· • · © · • © • · • · © · • ©4 ·© ·© © < · · • · * • · © « • © · ·© ··©·
159 <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <400> 60
Met 1 Glu Ile Pro Met 5 Ser Thr Val Val Lys 10 Glu Thr Leu Thr Gin 15 Leu
Ser Ala His Arg 20 Ala Leu Leu Thr Ser 25 Asn Glu Thr Met Arg 30 Leu Pro
Val Pro Thr 35 His Lys Asn His Gin 40 Leu Cys Ile Gly Glu 45 Ile Phe Gin
Gly Leu 50 Asp Ile Leu Lys Asn 55 Gin Thr Val Arg Gly 60 Gly Thr Val Glu
Met 65 Leu Phe Gin Asn Leu 70 Ser Leu Ile Lys Lys 75 Tyr Ile Asp Arg Gin 80
Lys Glu Lys Cys Gly 85 Gin Tyr Ile Lys Ala 90 Asn Ser Lys Phe Ile 95 Gly
Ile Thr Glu Leu 100 Phe Asn Asn Phe Thr 105 Val Ser Phe Trp Leu 110 Arg Val
Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp
115 120 125
Tyr Leu Gin Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu
130 135 140
Gly
145 <210> 61 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(57) <223> DNA kódující přírodní vedoucí sekvenci humánního IL5 «
*♦ • f *
<400> 61
··
9 ·
160
atg agg atg ctt Leu ctg cat ttg Leu agt Ser ttg Leu ctg gct ctt Leu Ala Leu 10 gga qct Gly Ala gcc Ala 15 tac Tyr 48
Met Arg 1 Met Leu 5 His
gtg tat gcc 57
Val Tyr Ála
<210> 62 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62
Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr 15 10 15
Val Tyr Ala <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Mus musculus <220>
<221> CDS <222> (1)..(60) <223> DNA kódující přírodní vedoucí sekvenci myšího IL5 <400> 63
atg aga agg atg ctt ctg cac ttg agt Ser gtt Val 10 ctg act ctc age tgt gtc Val 48
Met 1 Arg Arg Met Leu 5 Leu His Leu Leu Thr Leu Ser Cys 15
tgg gcc act gcc 60
Trp Ala Thr Ala
<210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus
4* ·*» · · 4 • · · «4 · · • · 4
4444 • 4 4·44 • · · • 4 444
4 · «4 4
4« 44«
94 · · ·
4 4 • 4 4 4
4 4 •4 9449
161 <400> 64
Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val 15 10 15
Trp Ala Thr Ala 20 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Všeobecný epitop pomocného T lymfocytu <400> 65
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1-5 10 • ·
162 £(οΘ
PATENTOVÉ ·· » ·

Claims (20)

  1. » · • · ·
    NÁROKY
    1. Analog interleukinu 5 (IL5), který pochází z IL5 polypeptidu zvířete, do kterého je zavedena modifikace, která má za následek, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidů a kde se modifikace týká substituce a/nebo inzerce a/nebo delece aminokyseliny kterékoliv z kliček 1 až 3 nebo C-konce helixu D IL5, kde uvedené kličky a helix D odpovídají těm, které jsou znázorněny na obr. 3 pro lidský a myší IL5.
  2. 2. Analog interleukinu 5podle nároku 1, v němž modifikace má za následek, že je zachována podstatná frakce IL5 epitopů B buněk a že
    - je zaveden alespoň jeden cizorodý epitop pomocného T lymfocytu (TH epitop) a/nebo
    - je zavedena alespoň jedna první skupina, která provádí cílení modifikované molekuly k buňce prezentující antigen (APC) nebo B lymfocytu a/nebo
    - je zavedena alespoň jedna druhá skupina, která stimuluje imunitní systém a/nebo
    - je zavedena alespoň jedna třetí skupina, která optimalizuje prezentaci modifikovaného IL5 polypeptidů imunitnímu systému.
  3. 3. Analog interleukinu 5 podle nároku 2, v němž modifikace zahrnuje zavedení cizorodého TH epitopu a/nebo první a/nebo druhé a/nebo třetí skupiny jako postranní skupiny navázáním kovalentní nebo nekovalentní vazbou k vhodným chemickým skupinám v IL5 nebo jeho subsekvenci.
    • ·
    163 • · · • · · ··· · · • · • · · · • · · ··
  4. 4. Analog interleukinu 5 podle nároku 3, v němž modifikace zahrnuje substituci a/nebo deleci a/nebo inzerci a/nebo adici aminokyseliny.
  5. 5. Analog interleukinu 5 podle nároku 3 nebo 4, v němž modifikace má za následek poskytnutí fúzního polypeptidu.
  6. 6. Analog interleukinu 5 podle nároku 4 nebo 5, v němž zavedení substituce a/nebo delece a/nebo inzerce a/nebo adice aminokyseliny má za následek podstatnou konzervaci celkové terciární struktury IL5.
  7. 7. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v němž modifikace zahrnuje duplikaci alespoň jednoho IL5 epitopu B buňky a/nebo zavedení haptenu.
  8. 8. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, v němž cizorodý TH epitop je u zvířete imunodominantní.
  9. 9. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až 8, v němž cizorodý TH epitop je promiskuitní.
  10. 10. Analog interleukinu 5 podle nároku 9, v němž alespoň jeden cizorodý TH je vybrán ze skupiny, kterou tvoří přírodní promiskuitní TH epitop a syntetická sekvence vazebného peptidu MHC-II.
  11. 11. Analog interleukinu 5 podle nároku 10, v němž přírodní TH epitop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří epitop tetanického toxoidu, jako je P2 nebo P30, epitop difterického toxoidu, epitop hemaglutininu viru chřipky a CS epitop P. falciparum.
    • · • ·· ·· ·· ·· ·» · · · · · · · • · · · · ·· · • ··· · · · · · · · • · ···· · · ·
    164 ...............
  12. 12. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až
    11, v němž první skupina je v podstatě specifický vazebný partner pro specifický povrchový antigen B lymfocytů nebo pro specifický povrchový antigen APC, jako je hapten nebo sacharid, pro který je receptor na B lymfocytů nebo APC.
  13. 13. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až
    12, v němž druhá skupina je vybrána ze skupiny, kterou tvoří cytokin, hormon a protein tepelného šoku.
  14. 14. Analog interleukinu 5 podle nároku 13, v němž cytokin je vybrán ze skupiny, kterou tvoří interferon γ (IFN-γ), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF) nebo jejich účinné části a protein tepelného šoku je vybrán ze skupiny, kterou tvoří HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 a kalretikulin (CRT) nebo jejich účinné části.
  15. 15. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až 14, v němž třetí skupina je lipidové povahy, jako je palmitoylová skupina, myristylová skupina, farnesylová skupina, geranyl-geranylová skupina, GPI kotva a Nacyldiglyceridová skupina.
  16. 16. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z předcházejících nároků,kde modifikace spočívá v tom, že subsekvence IL5 polypeptidu je modifikována v alespoň jedné kličce 1 až 3 nebo v aminokyselinových zbytcích u C-konce helixů D.
    165 z
    IL5 ·· φφ φφ ·· ·· φφφφ φφφ· φ φ φφ φ φ φ φ φφ φφφ φ · φφφφ φφφ φφ φφ φ φ φφφφ
  17. 17. Analog interleukinu předcházejících nároků, kde polypeptid.
    IL5 podle polypeptid kteréhokoliv je humánní
  18. 18. Analog interleukinu 5 podle nároku 17, v němž humánní IL5 polypeptid byl modifikován substitucí alespoň jedné aminokyselinové sekvence v sekv. id. č. 1 alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí stejné nebo odlišné délky, a tím vznikl cizorodý TH epitop, přičemž substituované aminokyselinové zbytky jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří zbytky 87 až 90, zbytky 88 až 91, zbytky 32 až 43, zbytky 33 až 43, zbytky 59 až 64, zbytky 86 až 91 a zbytky 110 až 113.
  19. 19. Imunogenní přípravek vyznačující se tím, že obsahuje imunogenně účinné množství IL5 polypeptidů autologního pro zvíře, přičemž IL5 polypeptid je formulován společně s imunologicky přijatelným adjuvans tak, aby porušil autotoleranci zvířete k IL5 polypeptidů, přičemž přípravek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelný nosič a/nebo vehikulum, imunogenně účinné množství IL5 analogu podle kteréholiv z nároků 1 až 18, přičemž přípravek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelný nosič a/nebo vehikulem a volitelně adjuvans.
  20. 20. Imunogenní přípravek podle nároku 19 vyznačující se tím, že adjuvans je vybráno ze skupiny, kterou tvoří imunitně cílící adjuvans; imunitně modulující adjuvans, jako je toxin, cytokin a mykobakteriální derivát; olejový přípravek; polymer; adjuvans tvořící micely; saponin; imunostimulační komplexní matrice (ISCOM matrice);
    0«
CZ20013709A 1999-04-23 2000-04-19 Analog interleukinu 5, fragment nukleové kyseliny, vektor, buňka, přípravky a pouľití CZ20013709A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA199900552 1999-04-23
US13281199P 1999-05-06 1999-05-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20013709A3 true CZ20013709A3 (cs) 2002-11-13

Family

ID=26064209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013709A CZ20013709A3 (cs) 1999-04-23 2000-04-19 Analog interleukinu 5, fragment nukleové kyseliny, vektor, buňka, přípravky a pouľití

Country Status (19)

Country Link
US (2) US7285273B1 (cs)
EP (1) EP1173573A1 (cs)
JP (1) JP2002543098A (cs)
KR (1) KR20020084841A (cs)
CN (1) CN1355846A (cs)
AU (1) AU777952B2 (cs)
CA (1) CA2370391A1 (cs)
CZ (1) CZ20013709A3 (cs)
EA (1) EA200101125A1 (cs)
EE (1) EE200100552A (cs)
HR (1) HRP20010824A2 (cs)
HU (1) HUP0200958A3 (cs)
IL (1) IL145786A0 (cs)
MX (1) MXPA01010625A (cs)
NO (1) NO20015021L (cs)
PL (1) PL351986A1 (cs)
SK (1) SK14832001A3 (cs)
TR (1) TR200103046T2 (cs)
WO (1) WO2000065058A1 (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9706957D0 (en) 1997-04-05 1997-05-21 Smithkline Beecham Plc Formulation
GB9820525D0 (en) 1998-09-21 1998-11-11 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
US6913749B2 (en) 1998-11-02 2005-07-05 Resistentia Pharmaceuticals Ab Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses
GB0000891D0 (en) 2000-01-14 2000-03-08 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7097837B2 (en) 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
RU2319503C2 (ru) * 2001-11-07 2008-03-20 Цитос Байотекнолоджи Аг Композиция для иммунизации (варианты), способ ее получения и применение для лечения аллергических эозинофильных заболеваний
BR0213950A (pt) * 2001-11-07 2004-08-24 Cytos Biotechnology Ag Arranjos de antìgenos para o tratamento de doenças eosinofólicas alérgicas
EA007810B1 (ru) * 2001-11-16 2007-02-27 Фармекса А/С Иммуногенные миметики мультимерных белков с нерегулярными вставками т-клеточных эпитопов
AU2003260748A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-19 Glaxo Group Limited Il-14 vaccine for the treatment of asthma and atopic disorders
JP2006503017A (ja) * 2002-08-30 2006-01-26 グラクソ　グループ　リミテッド Ｉｌ−１３要素及びｔ細胞エピトープを含む免疫原組成物並びにその治療上の使用
JP2007525436A (ja) * 2003-03-24 2007-09-06 マーシア・ファーマ・インコーポレイテッド 炎症症状を処置および予防するための方法および組成物
CN103091499B (zh) * 2013-01-23 2015-07-08 三峡大学 一种肿瘤标志物钙网蛋白检测试剂盒的制备及应用
RS57963B1 (sr) * 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharma Miševi koji eksprimiraju humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti
WO2014164640A1 (en) * 2013-03-11 2014-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transgenic mice expressing chimeric major histocompatibility complex (mhc) class i molecules
CN113307870B (zh) * 2020-10-30 2022-12-23 上海洛启生物医药技术有限公司 抗il5纳米抗体及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096704A (en) 1988-11-03 1992-03-17 Schering Corporation Method of treating eosinophilia
FR2677654B1 (fr) 1991-06-17 1995-11-17 Pasteur Merieux Serums Vacc Composes a effet immunogene anti-cytokine, a effet immunogene anticytostatique ou a effet vaccinal anti-infection a hiv.
AU4377793A (en) 1992-05-20 1993-12-13 Johns Hopkins University, The Alternative receptor therapy
US5616488A (en) 1992-12-07 1997-04-01 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. IL-5 targeted ribozymes
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
AU698962B2 (en) 1993-09-14 1998-11-12 Epimmune, Inc. Alteration of immune response using pan DR-binding peptides
JPH09510975A (ja) 1994-03-28 1997-11-04 ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド アレルギー治療用合成ペプチドベース免疫原
AUPO005496A0 (en) 1996-05-24 1996-06-13 Bresagen Limited An interleukin-5 antagonist
ATE196297T1 (de) * 1994-05-18 2000-09-15 Synthetic Peptides Inc Heterodimere trägerzusammensetzung von immunogenen polypeptiden und verfahren zu deren verwendung
GB9412230D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
WO1997000321A1 (en) 1995-06-14 1997-01-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Immune response modulators and uses therefor
CA2745736C (en) 1996-10-23 2016-11-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunotherapy and improved vaccines
AUPO390396A0 (en) 1996-11-29 1996-12-19 Csl Limited Novel promiscuous T helper cell epitopes
PT1005374E (pt) 1997-01-22 2007-07-18 Mgi Pharma Biolog Inc Micropartículas para administração de ácido nucleico
WO1998047923A1 (en) 1997-04-18 1998-10-29 Tanox Biosystems, Inc. Il-5r antagonists for treatment of inflammation, asthma and other allergic diseases
ES2222728T3 (es) * 1998-10-05 2005-02-01 Pharmexa A/S Procedimiento de vacunacion terapeutica.

Also Published As

Publication number Publication date
EE200100552A (et) 2002-12-16
SK14832001A3 (sk) 2003-02-04
CN1355846A (zh) 2002-06-26
WO2000065058A1 (en) 2000-11-02
AU4100800A (en) 2000-11-10
US7285273B1 (en) 2007-10-23
HRP20010824A2 (en) 2002-12-31
NO20015021L (no) 2001-12-21
HUP0200958A2 (en) 2002-06-29
AU777952B2 (en) 2004-11-04
PL351986A1 (en) 2003-07-14
EP1173573A1 (en) 2002-01-23
HUP0200958A3 (en) 2004-11-29
NO20015021D0 (no) 2001-10-15
EA200101125A1 (ru) 2002-04-25
KR20020084841A (ko) 2002-11-11
US6746669B1 (en) 2004-06-08
MXPA01010625A (es) 2003-09-04
TR200103046T2 (tr) 2002-06-21
JP2002543098A (ja) 2002-12-17
IL145786A0 (en) 2002-07-25
CA2370391A1 (en) 2000-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100671036B1 (ko) 오스테오프로테게린 리간드 활성을 하향-조절하는 방법
AU2006312847A1 (en) Therapeutic vaccines targeting HMGB1
JP4238031B2 (ja) ワクチン
KR20020026544A (ko) Ｇｄｆ-8 활성을 하향-조절하는 방법
CZ20013709A3 (cs) Analog interleukinu 5, fragment nukleové kyseliny, vektor, buňka, přípravky a pouľití
US20100028353A1 (en) Anti-amyloid immunogenic compositions, methods and uses
US20040156838A1 (en) Method for down-regulating ige
CA2603052A1 (en) Immunogenic egfr peptides comprising foreign t cell stimulating epitope
CA2498739A1 (en) Immunization against autologous ghrelin
ZA200502927B (en) Single chain recombinant T cell receptors.
AU2004235875A1 (en) Immunogenic human TNF alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation
KR20050052499A (ko) 자가 그렐린에 대한 면역화
EP1541587A2 (en) Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity