EA007810B1 - Иммуногенные миметики мультимерных белков с нерегулярными вставками т-клеточных эпитопов - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым иммуногенным вариантам мультимерных белков, таким как иммуногенные варианты интерлейкина 5 (IL5) и фактора некроза опухолей альфа (TNF, TNF-альфа). Данные варианты помимо того, что они иммуногенны у аутологичного хозяина, также обладают большим сходством с природной 3D-структурой белков, от которых они происходят. Некоторые варианты являются мономерными имитациями мультимеров, где пептидные линкеры (инертные или содержащие Т-хелперный эпитоп) обеспечивают пространственную организацию мономерных единиц, которая способствует правильному фолдингу. Подмножество вариантов представляет собой мономерные варианты TNF-альфа, которые проявляют высокую способность объединяться в мультимер с высокой степенью структурного сходства с нативным белком. Также описаны способы лечения и продукции данных вариантов, а также фрагменты ДНК, векторы и клетки хозяина.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области терапевтической иммунотерапии и, в частности, к области активной иммунотерапии, направленной на отрицательную регуляцию аутологических («собственных») белков и других слабо иммуногенных антигенов. Изобретение, таким образом, относится к новым и улучшенным иммуногенным вариантам мультимерных белков, а также к необходимым инструментам для получения таких вариантов. Изобретение, кроме того, относится к способам иммунотерапии, а также к композициям, которые могут использоваться с такими способами.

Предпосылки изобретения

Применение активной иммунотерапии («вакцинации») в качестве средства лечения или ослабления заболевания в течение последних 2 десятилетий вызвало растущий интерес.

Примечательно, что применение активной иммунотерапии в качестве средства нарушения толерантности к аутологичным белкам, которые каким-то образом относятся к патологическому (и другим нежелательным) физиологическому состоянию, известно с конца семидесятых годов, когда сообщалось о первых экспериментах по вакцинам против фертильности.

Вакцины против аутологических антигенов традиционно получают путем «иммуногенизации» относящихся к проблеме собственных белков, например, путем химического связывания («конъюгации») с большим чужеродным и иммуногенным белком-носителем (ср. патент США 4161519) или получением конструкций слияния аутологичного белка и чужеродного белка-носителя (ср. \¥О 86/07 383). В таких конструкциях несущая часть иммуногенной молекулы ответственна за предоставление эпитопов для Тхелперных лимфоцитов («Т_н-эпитопов»), что делает возможным нарушение аутотолерантности.

Позднейшие исследования показали, что хотя такие стратегии действительно могут обеспечить нарушение толерантности против аутологичных белков, возникает некоторое количество проблем. Наиболее важным является тот факт, что при иммунном ответе, который индуцируется с течением времени, будут доминировать антитела, направленные против несущей части иммуногена, поскольку реакционная способность против аутологичного белка часто снижен, эффект, который особенно выражен, когда носитель ранее служил в качестве иммуногена: данный феномен известен как подавление носителем (ср., например, Кайуарегита1 е1 а1. 1995., Еиг. 1. 1ттипо1. 25, 3375-3380). Однако при использовании терапевтической вакцинации обычно необходимо повторно иммунизировать несколько раз в год и поддерживать данное лечение в течение нескольких лет, и это также приводит к ситуации, где иммунный ответ против несущей части будет все больше и больше доминировать над вкладом иммунного ответа против аутологичной молекулы.

Дальнейшие проблемы, имеющие место при использовании технологии гаптен-носитель для нарушения аутотолерантности, представляют собой отрицательные стерические эффекты, оказываемые носителем на часть, относящуюся к аутологичному белку, в таких конструкциях: доля доступных Вклеточных эпитопов, которая напоминает конформационные профили, наблюдаемые в нативном аутологичном белке, часто снижена вследствие простого экранирования или маскировки эпитопов или вследствие конформационных изменений, индуцированных в собственной части иммуногена. Наконец, очень часто бывает трудно охарактеризовать молекулу гаптен-носитель достаточно подробно.

В XV О 95/05849 предоставлено усовершенствование указанных выше стратегий гаптен-носитель. Продемонстрировано, что собственные белки, куда встроен, по меньшей мере, один чужеродный Тнэпитоп, способны нарушить толерантность в отношении аутологичного белка. Внимание было сфокусировано на сохранении третичной структуры аутологичного белка, чтобы убедиться, что максимальное количество аутологичных В-клеточных эпитопов будет сохранено в иммуногене, несмотря на введение чужеродного Тн-элемента. Данная стратегия в общем показала себя как исключительно успешная в том, что индуцированные антитела составляли широкий спектр, а также характеризовались высоким сродством, и в том, что иммунный ответ имел раннее начало и более высокий титр по сравнению с тем, что наблюдался при иммунизации традиционной несущей конструкцией.

В \УО 00/20027 предоставлено развитие указанного выше принципа.

Обнаружено, что введение единичных Т_н-эпитопов в кодирующую последовательность собственных белков может индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (СТЬ), которые специфично взаимодействуют с клетками, экспрессирующими собственный белок. Технология по \¥О 00/20027 также предоставляет комбинированное лечение, где индуцируются антитела и СТЬ: в данных осуществлениях еще требуется, чтобы иммуногены сохраняли существенную часть В-клеточных эпитопов.

В \УО 95/05849 и XVО 98/46642 описана вакцинная технология, которая подходит для отрицательной регуляции активности ΤΝΕα: (фактор некроза опухоли α), цитокина, вовлеченного в патологию некоторых заболеваний, таких как диабет I типа, ревматоидный артрит и воспалительные заболевания кишечника. В обоих описаниях раскрыто сохранение третичной структуры мономерного ΊΝΕα при встрече данной молекулы с иммунной системой.

VО 00/65058 относится к отрицательной регуляции интерлейкина 5 (1Ь5), молекулы, участвующей в активации действия эозинофильных гранулоцитов, значимой в патогенезе некоторого количества заболеваний дыхательных путей, таких как хроническая астма. Описано, что отрицательная регуляция может

- 1 007810 осуществляться посредством технологии вакцинации полипептидами, живых вакцин и технологии вакцинации нуклеиновыми кислотами, и, кроме того, описано, что сохранение В-клеточных эпитопов значимо при индукции иммунного ответа против 1Ь5.

Даже несмотря на то, что описанные выше технологии предоставляли весьма многообещающие результаты, имеются некоторые факторы, которые могут вступить в действие при достижении жизнеспособности вакцинного подхода для преодолении заболевания. Одним из данных факторов является уровень экспрессии иммуногенного белка.

Например, для того, чтобы вакцина с нуклеиновой кислотой была функциональной, клетки, трансфицированные ίη νινο конструкцией, кодирующей «иммуногенизированный» аутологичный белок, должны быть способны к экспрессии иммуногена в достаточных количествах для индукции подходящего иммунного ответа. Также основанные на полипептидах вакцины требуют, чтобы иммуногенный белок мог продуцироваться в удовлетворительных количествах по способу промышленной ферментации. Однако часто наблюдается, что даже небольшие изменения аминокислотной последовательности известного белка могут оказывать драматическое действие на количество белка, которое может быть получено.

Далее, стабильность генетически модифицированных белковых последовательностей может также быть меньшей, чем оптимальная (как в плане срока хранения, так и в плане стабильности ίη νινο).

Наконец, когда собственный белок, который требуется подвергнуть отрицательной регуляции, представляет собой гетерополимер или гомополимер, не обязательно происходит так, что вариант мономерной единицы данного белка способен индуцировать антитела, которые достаточно специфичны в отношении нативной конформации полимерного белка.

Цель изобретения

Целью изобретения является предоставление улучшенных иммуногенных аналогов полимерных аутологичных белков, а также предоставление улучшенных способов индукции гуморального иммунитета против таких полимерных аутологичных белков. Дальнейшей целью является предоставление иммуногенных аналогов собственных белков, которые обладают улучшенной стабильностью и проявляют улучшенные характеристики при экспрессии в гетерологичных клетках хозяина. Наконец, целью изобретения также является предоставление способов и мер, которые могут использоваться при получении или использовании улучшенных иммуногенов.

Сущность изобретения

При продукции крупномасштабных количеств рекомбинантного белка в бактериальных клетках хозяина часто требуется, чтобы продукт экспрессии стал доступным в виде телец включения внутри бактерий. Причин этого несколько: например, выходы экспрессии обычно заметно выше, если белок экспрессирован в виде нерастворимых телец включения, и очистка белка также облегчена, поскольку требуемый продукт экспрессии легко и удобно отделяется от растворимого белка из бактериальной ферментации.

При экспрессии рекомбинантного белка в качестве нерастворимых телец включения, часто бывает необходимым подвергать продукт экспрессии различным способам рефолдинга белка для получения его в биологически активной форме, но это обычно приемлемо даже несмотря на то, что такая стадия приводит к некоторой потере общего рекомбинантного белка, который никогда не свертывается в правильную биологически активную форму.

Однако при продукции рекомбинантных иммуногенных вариантов неиммуногенных собственных белков необходимо вводить Т_н-эпитопы и таким образом первичная структура белкового продукта становится измененной по сравнению с нативным собственным белком. Авторами настоящего изобретения выяснено, что даже слабейшие из изменений делают традиционный подход экспрессии в тельцах включения с последующим рефолдингом непрактичным: после рефолдинга выходы белка, который сохранил удовлетворительную долю В-клеточных эпитопов по сравнению с нативным собственным белком, часто очень малы, и данная проблема возрастает со сложностью рассматриваемого белка.

В настоящее время обнаружено, что конструирование и воздействие на экспрессию белковых конструкций, которые продуцируются в бактериях в виде растворимого белка, является лучшим способом получения иммуногенных вариантов собственных белков: даже несмотря на то, что последующие стадии очистки становятся более сложными, поскольку нужно удалить другие растворимые белки, конечный очищенный и верно свернутый продукт получают со значительно более высоким выходом по сравнению с традиционным подходом, указанным выше. И, что очень важно, очищенные белки, полученные экспрессией такого типа, проявляют невиданную до сих пор способность сохранять В-клеточные эпитопы нативного собственного белка, из которого они происходят.

Коротко, по настоящему изобретению экспрессия растворимых вариантов белков является превосходным критерием отбора при начальном отборе иммуногенных вариантов собственного белка, которые подходят для целей вакцинации.

Для достижения цели экспрессии растворимого белка таких иммуногенизированных собственных белков (и других белков, в первичную структуру которых были введены изменения) могут варьироваться несколько параметров: мультимерные белки, которые трудно объединить, могут продуцироваться путем стабилизации их структуры на мономерном уровне и также путем получения мономерных имитаций

- 2 007810 мультимера, и также простые мономерные белки могут стабилизироваться по указанным здесь инструкциям.

Другим важным фактором являются условия ферментации: открытия в лаборатории авторов настоящего изобретения, например, показали, что ферментация бактерий при температурах более низких, чем обычно используемые для получения высокоуровневой экспрессии, заметно способствуют продукции растворимых форм белковых вариантов.

Авторами настоящего изобретения обнаружено, что получение «мономеризованных» форм 1Ь5 и ΤΝΡα может предоставлять иммуногенные молекулы, обладающие высокой стабильностью, отличной иммуногенностью и требуемыми характеристиками продукции. В частности, выход белка является неожиданно высоким при экспрессии рекомбинантных полипептидов, составленных двумя мономерами ЫЬ5, объединенными пептидным линкером, и включающих чужеродные Т-хелперные эпитопы. Полагают, что данное открытие может применяться в общем по отношению к мультимерным белкам, четвертичная структура которых позволяет сшить их мономерные версии.

Полагают, что настоящая технология особенно подходит для получения иммуногенов для нарушения аутотолерантности в отношении аутологичных белков, поскольку введение пептидного линкера может элегантно комбинироваться с предоставлением чужеродных Т-хелперных эпитопов при сохранении в то же время 30-структуры мультимерного белка (например, сохранение обоих элементов из третичной и четвертичной структуры такого белка путем наложения исходной четвертичной структуры на новую третичную структуру в мономерном белке).

Следовательно, в одном широком аспекте изобретение относится к иммуногенному аналогу полимерного белка, где указанный полимерный белок состоит (в природе) по крайней мере из 2 мономерных единиц, которые не объединены посредством пептидной связи, где указанный аналог

a) содержит существенные фрагменты по меньшей мере 2 мономерных единиц указанного полимерного белка, где указанные существенные фрагменты объединены посредством пептидных связей через пептидный линкер,

b) содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, связывающую МНС класс II, которая гетерологична в отношении полимерного белка, и

c) может продуцироваться в виде единственного продукта экспрессии из клетки, несущей экспрессирующий вектор, кодирующий данный аналог.

Авторами настоящего изобретения также обнаружено, что некоторое количество конкретных манипуляций в аминокислотной последовательности мономерного ΤΝΡα приводит к предоставлению мономерных молекул, которые иммуногенны и способны достигать функциональной четвертичной структуры, и это означает, что данные молекулы обладают такой высокой степенью сохранения третичной структуры, что они могут спонтанно образовывать функциональные, связывающие рецептор димеры и триммеры, и также что данные мономеры продуцируются в бактериях как растворимые белки.

Некоторые из данных манипуляций, которые проведены с белком ΤΝΡα, как полагают, могут в общем использоваться для белков, из которых требуется стабилизированная третичная структура по сравнению с нативным белком.

Конкретный аспект изобретения относится к некоторому числу вариаций в структуре мономера ΤΝΡα, которые по существу не деструктивны, так что они позволяют происходить правильному фолдингу мономеров ΤΝΡα, при введении в то же время по крайней мере одной аминокислотной последовательности, связывающей МНС класса II. Например, было обнаружено, что вставка чужеродного Т_нэпитопа может быть сделана в одной конкретной петлевой структуре в нативном ΤΝΡα без отрицательного влияния на характеристики экспрессии белка или на способность мономера образовывать функциональный димер или тример ΤΝΡα.

Следовательно, значимая часть изобретения относится к иммуногенному аналогу человеческого ΤΝΡα, где аналог включает в себя по меньшей мере одну чужеродную аминокислотную последовательность, связывающую МНС класса II, и, кроме того, обладает такими характеристиками, что является мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, куда в гибкую петлю 3 встроена или замещена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, куда введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, который стабилизирует ЗО-структуру мономера ΤΝΡα, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где подвержена делеции любая из аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на Ν-конце, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в петлю 1 в положении интрона, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена как часть области искусственного стебля на Ν-конце человеческого ΤΝΡα,

- 3 007810 и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена так, что она стабилизирует мономерную структуру путем увеличения гидрофобности поверхности взаимодействия тримера, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность, фланкированная остатками глицина, встроена или замещена в аминокислотную последовательность ΤΝΡα, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в Б-Е-петлю, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена между двумя идентичными подпоследовательностями человеческого ΤΝΡα, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где по меньшей мере один солевой мостик в человеческом ΤΝΡα усилен или замещен дисульфидным мостиком, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где растворимость и/или стабильность в плане протеолиза усилена путем введения мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного ΤΝΡα, и/или мономером человеческого ΤΝΡα или мономеризованным аналогом ΤΝΡα по настоящему изобретению, где потенциальная токсичность снижена или отменена путем введения по меньшей мере одной точечной мутации.

В общем, было обнаружено, что все наиболее подходящие иммуногенные аналоги по изобретению представляют собой те, что являются растворимыми белками уже на стадии, на которой их продуцируют и выделяют в растворимой форме из их рекомбинантных клеток хозяина.

По изобретению далее предоставляются фрагменты нуклеиновой кислоты (такие как фрагменты ДНК), кодирующие такие иммуногенные аналоги и также векторы, содержащие такие фрагменты ДНК.

Изобретение также относится к трансформированным клеткам, подходящим для получения данных аналогов.

Изобретение, кроме того, предоставляет иммуногенные композиции, охватывающие аналоги или векторы по изобретению.

Также изобретение относится к способам лечения, где мультимерные белки подлежат отрицательной регуляции, и к лечению конкретных заболеваний, относящихся к конкретным мультимерным белкам.

Описание чертежа

На чертеже представлен экспрессирующий вектор клеток насекомых ρ2ΖΘΡ2Τ

Последовательность вектора установлена в 8ΕΟ ГБ ΝΟ: 60. Вектор содержит участок множественного клонирования (МС8) ниже промотора ОрШ2 и выше поли А-хвоста ОрШ2 (ОрШ2рА).

Маркерный ген устойчивости к зеацину АеоР) находится под контролем второго промотора ОрШ2.

Подробное описание изобретения

Определения

Далее некоторое количество терминов, используемых в настоящей спецификации и формуле изобретения определяются и подробно объясняются для выяснения пределов изобретения.

Термины «Т-лимфоцит» и «Т-клетка» используются взаимозаменяемо для лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за различные клеточно-опосредованные иммунные ответы, а также за хелперную активность при гуморальном иммунном ответе. Сходным образом, термины «Влимфоцит» и «В-клетка» используют взаимозаменяемо для продуцирующих антитело лимфоцитов.

«Полимерный белок» определяется здесь как белок, который содержит по меньшей мере две полипептидные цепи, которые не объединены конец в конец пептидной связью (термин «мультимерный белок» используется с ним взаимозаменяемо). Следовательно, полимерные белки могут являться полимерами, состоящими из нескольких полипептидов, которые собраны вместе в полимерную форму посредством дисульфидных связей и/или нековалентного связывания. Также данный термин охватывает процессированные предбелки и пробелки, которые после процессинга охватывают по меньшей мере два свободных С-конца и по меньшей мере 2 свободных Ν-конца. Наконец, данный термин охватывает временно существующие комплексы по меньшей мере между двумя полипептидами, которые могут образовать нестабильный, но при этом биологически активный молекулярный объект, который характеризуется отличающейся 3-мерной структурной.

«Иммуногенный аналог» (или «иммуногенизированный» аналог или вариант) подразумевается здесь для обозначения единичного полипептида, который охватывает существенные части информации последовательности, находящейся в полном полимерном белке. То есть, данный белковый аналог охватывает одну полипептидную цепь, в то время полимерный белок охватывает по меньшей мере 2 полипептидные цепи. Следует заметить, что аналог может представлять вариацию мономерной субъединичной структуры полимеров, но в таком случае иммуногенный аналог способен образовывать полимерные белковые комплексы, которые напоминают нативный полимер.

- 4 007810 «Мономеризованный» аналог или вариант полимерного белка в настоящем контексте представляет собой единичный полипептид, который содержит в ковалентно связанной форме через пептидную связь по меньшей мере 2 полипептидные цепи, находящиеся в полимерном белке в природе, где данные 2 полипептидные цепи не связаны пептидной связью.

«Существенный фрагмент» или мономерная единица мультимерного белка, как подразумевается, означает часть мономерного полипептида, которая составляет по меньшей мере часть мономерного полипептида, достаточную для образования домена, который свертывается, по существу, в ту же 3Όконформацию, что может иметь место в мультимерном белке.

«Полипептид 1Ь5», как подразумевается здесь, означает полипептиды, характеризующиеся аминокислотной последовательностью белков 1Ь5, происходящих от людей и других млекопитающих. Также в пределы данного термина входят негликозилированные формы 1Ь5, которые получены в прокариотической системе, как и формы, характеризующиеся варьирующими профилями гликозилирования, например, вследствие применения дрожжей и других не относящихся к млекопитающим эукариотических систем экспрессии. Следует, однако, заметить, что при использовании термина «полипептид 1Ь5» подразумевается, что указанный полипептид обычно не является иммуногенным, когда он представляется подлежащему обработке животному. Иными словами, полипептид 1Ь5 представляет собой собственный белок или ксеноаналог такого собственного белка, который обычно не дает начало иммунному ответу против 1Ь5 у указанного животного.

«Полипептид ΤΝΕα». как подразумевается здесь, означает полипептиды, характеризующиеся аминокислотной последовательностью белков ΤΝΤα, происходящих от людей и других млекопитающих. Также в пределы данного термина входят негликозилированные формы ΤΝΤα, которые получены в прокариотической системе, как и формы, характеризующиеся варьирующими профилями гликозилирования, например, вследствие применения дрожжей и других не относящихся к млекопитающим эукариотических систем экспрессии. Следует, однако, заметить, что при использовании термина «полипептид ΤΝΤα» подразумевается, что указанный полипептид обычно не является иммуногенным, когда он представляется подлежащему обработке животному. Иными словами, полипептид ΤΝΤα представляет собой собственный белок или ксеноаналог такого собственного белка, который обычно не дает начало иммунному ответу против ΤΝΤα у указанного животного.

«Аналог 1Ь5» представляет собой полипептид 1Ь5, который был подвергнут изменениям в его первичной структуре и/или ассоциирован с элементами из других видов молекул. Такое изменение может, например, быть в виде слияния полипептида 1Ь5 с подходящим партнером слияния (например, изменение в первичной структуре, задействующее исключительно С- и/или Ν-концевые добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в виде вставок, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности полипептида 1Ь5. Также данный термин охватывает дериватизированные молекулы 1Ь5, ср. с обсуждением модификаций 1Ь5, приведенным ниже.

«Аналог ΤΝΤα» представляет собой полипептид ΤΝΤα, который был подвергнут изменениям в его первичной структуре и/или ассоциирован с элементами из других видов молекул. Такое изменение может, например, быть в виде слияния полипептида ΤΝΤα с подходящим партнером слияния (например, изменение в первичной структуре, задействующее исключительно С- и/или Ν-концевые добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в виде вставок, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности полипептида ΤΝΤα. Также данный термин охватывает дериватизированные молекулы ΤΝΤα, ср. с обсуждением модификаций ΤΝΤα, приведенным ниже.

Следует понимать, что аналоги 1Ь5 и ΤΝΤα также охватывают мономерные варианты, которые содержат существенные части полных мультимерных белков 1Ь5 и ΤΝΤα.

При использовании здесь аббревиатур «1Ь5» и «ΤΝΤα» они предназначены для ссылок на аминокислотные последовательности зрелых 1Ь5 и ΤΝΤα, 1Ь5 и ΤΝΤα дикого типа (также обозначены здесь как «1Ь5т» и «IЬ5Щ», а также «ΤΝΕαιη» и «ΤΝΡανί»), соответственно. Зрелый 1Ь5 человека обозначен как ЫЬ5, ЫЬ5т или ЫЬ5^1, а мышиный зрелый 1Ь5 обозначен т1Ь5, т1Ь5т или т1Ь5^1, и сходный порядок используется для ΤΝΤα. В случаях, где ДНК-конструкция содержит информацию, кодирующую лидерную последовательность или другой материал, это обычно ясно из контекста.

Термин «полипептид» в настоящем контексте, как подразумевается, означает короткие пептиды от 2 до 10 аминокислотных остатков, олигопептиды от 11 до 100 аминокислотных остатков, или полипептиды длиной более 100 аминокислотных остатков. Более того, данный термин также, как подразумевается, охватывает белки, т.е. функциональные биомолекулы, включающие в себя по меньшей мере один полипептид; когда они включают в себя по меньшей мере два полипептида, они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными, или могут не быть ковалентно связанными.

Полипептид(-ы) в белке могут быть гликозилированными и/или липоилированными, и/или могут содержать простетические группы.

Термин «подпоследовательность» означает любой последовательный участок по меньшей мере из 3 аминокислот, или, когда это существенно, по меньшей мере из 3 нуклеотидов, происходящих непосред

- 5 007810 ственно из встречающихся в природе аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновой кислоты 1Ь5, соответственно.

Термин «животное» в настоящем контексте, как подразумевается, означает вид животного (преимущественно, млекопитающего), такой как Ното 8ар1еи8, Сате йотезйсив, и т.д., и не просто одно конкретное животное. Однако данный термин также означает популяцию животных такого вида, поскольку важно, чтобы субъекты, иммунизированные по способу изобретения все несли примерно один и тот же 1Ь5, что позволяет иммунизировать данных животных одним(-и) и тем(-и) же иммуногеном (-ами). Если, например, генетические варианты 1Ь5 или ΤΝΡα существуют в разных популяциях людей, может оказаться необходимым применять различные иммуногены в данных различных популяциях, чтобы смочь преодолеть аутотолерантность в отношении 1Ь5 и ΤΝΕα, соответственно, в каждой популяции. Специалисту ясно, что животное в настоящем контексте представляет собой живое существо, которое имеет иммунную систему. Предпочтительно, что животное является позвоночным, таким как млекопитающее.

Под термином «отрицательная регуляция» здесь понимают снижение биологической активности мультимерного белка (например, путем препятствия взаимодействию между мультимерным белком и биологически значимыми партнерами связывания с данной молекулой). Отрицательная регуляция может достигаться посредством различных механизмов; среди них наиболее простым является простое препятствие для активного участка мультимерного белка за счет связывания антитела. Однако в объем данного изобретения также входит то, что связывание антитела приводит к удалению мультимерного белка клетками захвата (такими как макрофаги или другие фагоцитарные клетки).

Выражение «эффективное представление ... иммунной системе», как подразумевается, означает, что иммунная система животного подвергается иммуногенной стимуляции контролируемым образом.

Как будет указано ниже в описании, такая стимуляция иммунной системы может осуществляться несколькими путями, наиболее значимым из которых являются вакцинация полипептидом, содержащим «фармакцины» (т.е., вакцину, которую вводят для лечения или подавления текущего заболевания) или вакцинация «фармакциной» на основе нуклеиновой кислоты. Важным результатом, которого нужно достигнуть, является контроль иммунокомпетентных клеток антигеном иммунологически эффективным образом, в то время как конкретный способ достижения данного результата менее важен для идеи изобретения, лежащей в основе настоящего изобретения.

Термин «иммунологически эффективное количество» характеризуется значением, обычно принятым в данной области, т.е. это количество иммуногена, способное индуцировать иммунный ответ, который значительно затронет патологические агенты, обладающие иммунологическими характеристиками данного иммуногена.

При использовании выражения, что 1Ь5, ΤΝΕα или другой собственный белок был «модифицирован», здесь подразумевается химическая модификация полипептида, который составляет остов собственного белка. Такая модификация может, например, представлять собой дериватизацию (например, алкилирование, ацилирование, эстерификацию и т.д.) конкретных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, но как понятно из следующего ниже описания, предпочтительные модификации охватывают изменения первичной структуры аминокислотной последовательности (или добавления к ней).

При обсуждении «аутотолерантности в отношении аутологичного белка» понимают, что поскольку относящийся к проблеме мультимерный белок представляет собой собственный белок в подлежащей вакцинации популяции, нормальные субъекты в популяции не развивают иммунного ответа против него; нельзя, однако, исключать, что некоторые редкие субъекты в популяции животных могут продуцировать антитела против нативного мультимера, например, как часть аутоиммунного нарушения. Во всяком случае, вид животного в норме является аутотолерантным только в отношении своего собственного мультимера, но нельзя исключать того, что аналоги, происходящие из других видов животных или из популяции, имеющей отличный фенотип, также будут вызывать толерантность у указанного животного.

«Чужеродный Т-клеточный эпитоп» (или: «чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп») представляет собой пептид, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки у видов животных, поэтому вводят альтернативный термин. Предпочтительные Т-клеточные эпитопы по изобретению являются «общими» эпитопами (или «универсальными» или «широкого интервала действия»), т.е. эпитопами, которые связываются с существенной долей конкретного класса молекул МНС у вида или популяции животных. Известно лишь очень ограниченное число таких «общих» Т-клеточных эпитопов, и они подробно обсуждаются ниже. Следует заметить, что чтобы иммуногены, которые используют по настоящему изобретению, были эффективными как можно в большей доле популяции животных, может быть необходимым 1) встроить несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов в тот же самый аналог или 2) получить несколько аналогов, где каждый аналог имеет встроенный особый общий эпитоп. Также следует отметить, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов также охватывает применение скрытых Т-клеточных эпитопов, т. е. эпитопов, которые происходят из собственного белка и которые проявляют иммуногенные свойства только когда существуют в выделенной форме, не являясь частью указанного собственного белка.

- 6 007810 «Чужеродный Т-хелперный лимфоцитарный эпитоп» (чужеродный Т_н-эпитоп) представляет собой Т-клеточный эпитоп, который связывается с молекулой МНС класса II, и может представляться на поверхности антигенпредставляющей клетки (АРС), связанной с молекулой МНС класса II.

Связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность, которая гетрологична мультимерному белку», таким образом, представляет собой связывающий МНС класса II пептид, который не существует в указанном мультимерном белке. Такой пептид, если он также действительно чужероден в отношении вида животного, несущего мультимерный белок, представляет собой чужеродный Т_н-эпитоп.

«Функциональная часть» (био)молекулы в настоящем контексте, как подразумевается, означает часть молекулы, ответственную по меньшей мере за один из биохимических или физиологических эффектов, проявляемых данной молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы содержат активный участок, ответственный за эффекты, проявляемые указанной молекулой. Другие части данной молекулы могут служить для цели увеличения стабильности или растворимости и поэтому могут оставаться вне внимания, если данные цели не относятся к контексту конкретного осуществления настоящего изобретения. Однако по настоящему изобретению предпочтительно задействовать как можно большую часть полимерной молекулы, поскольку при использовании описанных здесь мономеров фактически демонстрировалась повышенная стабильность.

Термин «адъювант» характеризуется своим обычным значением в области вакцинной технологии, т.е. это вещество или композиция материалов, которая 1) сама по себе не способна вызвать специфический иммунный ответ против иммуногена вакцины, но который 2) тем не менее способен усиливать иммунный ответ против иммуногена. Или, иными словами, вакцинация одним адъювантом не обеспечивает иммунный ответ против иммуногена, вакцинация иммуногеном может дать или не дать начало иммунному ответу против иммуногена, но комбинация вакцинации иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунный ответ против иммуногена, который является более сильным, чем ответ, индуцированный одним иммуногеном.

«Нацеливание молекулы» в настоящем контексте, как подразумевается, обозначает ситуацию, в которой молекула после введения животному преимущественно обнаруживается в конкретной(-ых) ткани(-ях) или предпочтительно ассоциирована с конкретными клетками или клеточными типами. Данный эффект может осуществляться некоторым количеством путей, включая составление молекулы в композицию, облегчающую нацеливание или введение в молекулу групп, которые способствуют нацеливанию. Данные варианты будут обсуждаться подробно ниже.

«Стимуляция иммунной системы» означает, что вещество или композиция материалов проявляет общий, неспецифический иммуностимулирующий эффект. Некоторое количество адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) наделены способностью стимулировать иммунную систему. Результатом применения иммуностимулирующих средств является повышенная «боевая готовность» иммунной системы, и это означает, что одновременная или последовательная иммунизация иммуногеном индуцирует существенно более эффективный иммунный ответ по сравнению с отдельным использованием данного иммуногена.

Характеристика иммуногенных аналогов по изобретению

Полимерные белки, являющиеся мишенями описанных здесь стратегий, могут представлять собой как гомополимеры, так и гетерополимеры. Как будет ясно из примеров, наиболее важной чертой первого аспекта изобретения является то, что интересующий полимерный белок может «мономеризироваться» без введения существенных изменений в трехмерную структуру мультимерного белка. Следовательно, конкретная функция мультимерного белка не важна для сущности настоящего изобретения - только структурные характеристики белка влияют на решение, является ли он подходящим кандидатом для применения настоящего подхода по первому аспекту изобретения. Например, если Ν-конец одного из мономеров в мультимерном белке характеризуется пространственной близостью к С-концу другого мономера в мультимере, связывание данных двух конкретных мономеров через пептидную связь может осуществляться без введения существенных изменений относительно структуры нативного мультимерного белка. Если, с другой стороны, концы далеко разнесены, для воплощения настоящего изобретения требуется, чтобы большая часть по меньшей мере одного из мономеров не имела отношения в плане иммуногенных целей изобретения или чтобы связывание между мономерными субъединицами могло выполняться длинным линкерным пептидом без оказания отрицательного воздействия на иммуногенные характеристики белка.

Во втором аспекте изобретения «иммуногенизацию» мономерной единицы собственного белка проводят таким образом, что полученный в результате вариант мономера еще способен образовывать часть полимерного белка, который обладает четвертичной структурой нативного полимерного собственного белка.

Предпочтительно, если иммуногенный аналог по изобретению экспонирует в существенных фрагментах существенную долю В-клеточных эпитопов, находящихся в соответствующих мономерах, которые являются частью полимерного белка. Существенная доля В-клеточных эпитопов, как подразумевается здесь, означает долю В-клеточных эпитопов, которые антигенно характеризуют мультимерный белок по сравнению с другими белками. Предпочтительно, чтобы существенные фрагменты экспонировали

- 7 007810 по существу все В-клеточные эпитопы, находящиеся в соответствующих мономерах, когда данные фрагменты являются частью полимерного белка; конечно, может быть необходимо введение малых изменений в последовательность мономера. Например, аминокислотная последовательность, происходящая из мономерной единицы может модифицироваться посредством вставки, замены, делеции или добавления так, чтобы снизить токсичность аналога по сравнению с мультимерным белком и/или ввести связывающую МНС класса II последовательность аминокислоты, если нежелательно, чтоб данная последовательность располагалась в линкере.

Особенно предпочтительное осуществление относится к иммуногенному аналогу по изобретению, где каждая из существенных долей содержит по существу полную аминокислотную последовательность каждой мономерной единицы, или в качестве непрерывной последовательности, или в виде последовательности, содержащей вставки. То есть, только несущественные части последовательности мономерных единиц теряются из аналога, например, в случаях, когда последовательность не вносит вклад в третичную структуру мономерной единицы или в четвертичную структуру мультимерного белка. Однако данное осуществление позволяет провести замену или вставку в мономер, покуда сохраняется ЗО-структура мультимерного белка. Следовательно, особенно предпочтительно, если иммуногенный аналог является таким, что в нем представлены аминокислотные последовательности всех мономерных единиц полимерных белков, и особенно предпочтительным является, если аналог охватывает полные аминокислотные последовательности (всех) мономеров, составляющих полимерный белок, будь то неизмененные последовательности или последовательности, содержащие вставки.

Таким образом, как оказывается, предпочтительным является, чтобы 3-мерная структура полного полимерного белка, по существу, сохранялась в аналоге.

Демонстрация сохранения существенной доли В-клеточных эпитопов или даже 3-мерной структуры мультимерного белка, которая подвергается описанной здесь модификации, может достигаться различными путями. Одним из них является простое получение поликлональной антисыворотки, направленной против мультимера (например, антисыворотки, полученной от кролика) и последующее применение данной антисыворотки в качестве тестового реагента (например, в конкурентном ЕЬ1§Л) против продуцированных модифицированных белков. Модифицированные версии (аналоги), которые взаимодействуют с антисывороткой в той же степени, как это делает мультимер, следует считать имеющими ту же 3Όструктуру, что и мультимер, в то время как аналоги, проявляющие ограниченную (но, тем не менее, значимую и специфичную) реакционноспособность с такой сывороткой, как полагают, сохраняют существенную долю изначальных В-клеточных эпитопов.

Альтернативно, может осуществляться отбор моноклональных антител, способных реагировать с различными эпитопами на мультимере, и они могут использоваться в качестве панели для тестирования. Данный подход имеет преимущество в том, что он предоставляет 1) картирование эпитопов мультимера и 2) картирование эпитопов, которые остаются на полученных аналогах.

Конечно, третьим подходом является разрешение 3-мерной структуры мультимера (ср. выше) и ее сравнение с разрешенной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть разрешена с помощью исследований дифракции рентгеновского излучения и ЯМР-спектроскопии. Дальнейшая информация, касающаяся третичной структуры, может до некоторой степени быть получена из исследований кругового дихроизма, которые имеют то преимущество, что полипептид требуется лишь в чистом виде (в то время как дифракция рентгеновского излучения требует предоставления кристаллизованного полипептида, а ЯМР требует предоставления изотопных вариантов полипептида) для получения полезной информации о третичной структуре данной молекулы. Однако для получения решающих данных окончательно необходимы дифракция рентгеновского излучения и ЯМР, поскольку круговой дихроизм может предоставить только непрямые доказательства правильной 3-мерной структуры посредством информации об элементах вторичной структуры.

Иммуногенный аналог по изобретению может содержать пептидный линкер, который вводит или участвует в образовании в аналоге по меньшей мере одной связывающей МНС класса II аминокислотной последовательности, которая гетерологична в отношении мультимерного белка. Это, в частности, может использоваться в тех случаях, когда не требуется изменение аминокислотной последовательности, соответствующей мономерным единицам мультимерного белка. Альтернативно, пептидный линкер может быть лишенным связывающей МНС класса II аминокислотной последовательности и не участвовать в ее образовании в животных вида, из которого происходит мультимерный белок; это обычно может делаться в случаях, когда необходимо использовать очень короткий линкер или где предпочтительным является, например, сделать потенциально токсичный аналог нетоксичным путем введения связывающего МНС класса II элемента в активный участок. Оба данные осуществления могут комбинироваться с введением точечных мутаций, которые детоксицируют молекулу, если это необходимо.

Предпочтительно, чтобы связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность связывала большую часть молекул МНС класса II из видов животных, откуда происходит мультимерный белок, т.е. связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность была универсальной или общей.

- 8 007810

Также, конечно, важно, чтобы данная последовательность служила своей цели как Т-клеточный эпитоп в видах, для которых иммуноген предназначен в качестве составляющего компонента вакцин. Существует некоторое количество встречающихся в природе «общих» Т-клеточных эпитопов, которые активны в большой доле субъектов вида животных или популяции животных, и их предпочтительно вводят в состав вакцины, снижая таким образом необходимость в очень большом количестве различных аналогов той же вакцины. Следовательно по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность предпочтительно выбирают из природных Т-клеточных эпитопов и искусственных связывающих МНС класса II аминокислотных последовательностей. Особенно предпочтительными последовательностями являются природные Т-клеточные эпитопы, выбранные из эпитопов столбнячного анатоксина, таких как Р2 (8ЕО Ю N0: 3) или Р30 (8Е0 Ю N0 : 5), эпитопа дифтерийного анатоксина, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Р. £а1с1рагит.

В течение лет идентифицировано некоторое количество других общих Т-клеточных эпитопов. Особенно пептиды, способные связывать большую часть молекул НЬЛ-ОК, кодируемых различными аллелями НЬЛ-ΌΚ, идентифицировали, и они представляют собой все возможные Т-клеточные эпитопы, подлежащие введению в аналоги, используемые по настоящему изобретению. Ср. также эпитопы, обсуждаемые в следующих ссылках, которые все включены сюда в качестве ссылки: \У0 98/23635 (Егахсг ГН. с1 а1., переуступлено ТНе Ишуегайу о£ ОнеепЧапб); 8ои!йтеооб 8 с1. а1, 1998, 1. Iттиηο1. 160: 3363-3373 81шдад11а Е. е! а1., 1988, №11игс 336: 778-780; С1исх К.М. е! а1., 1993, 1. Ехр. Меб 178: 27-47 ; Наттег 1. е! а1., 1993, Се11 74: 197-203; апб Еа1к К. е! а1., 1994, [ттиподепебсх 39: 230-242. Последняя ссылка также относится к лигандам НЕА-ΌΟ и -ЭР. Все эпитопы, перечисленные в данных 5 ссылках, рассматриваются природные эпитопы-кандидаты, подлежащие применению по настоящему изобретению, как и эпитопы, которые характеризуются общими мотивами с указанными эпитопами.

Альтернативно, эпитоп может представлять собой любой искусственный Т-клеточный эпитоп, который способен связывать большую часть молекул МНС класса II. В данном контексте пептиды-пан-ИК.эпитопы («РАИКЕ») , описанные в \У0 95/07707 и в соответствующей статье А1ехапбег 1 е! а1., 1994, Ептиийу 1: 751-761 (оба описания включены сюда в качестве ссылки), представляют собой интересные кандидаты в эпитопы, подлежащие применению по настоящему изобретению. Следует заметить, что наиболее эффективные пептиды РАИКЕ, описанные в данных работах, несут Ό-аминокислоты на С- и Νконцах для улучшения стабильности при введении. Однако настоящее изобретение первично относится к введению относящихся к проблеме эпитопов в качестве части аналога, который затем должен быть расщеплен ферментативно внутри лизосомального компартмента АРС для обеспечения последующей презентации в контексте молекулы МНС-П, и поэтому нецелесообразно включать Ό-аминокислоты в состав эпитопов, используемых по настоящему изобретению.

Одним из особо предпочтительных пептидов РАОКЕ является тот, что характеризуется аминокислотной последовательностью АКЕУАА^ТЬКААА (8Е0 ΣΌ N0: 7) или ее иммунологически активной подпоследовательностью. Этот и другие эпитопы, обладающие сходным отсутствием рестрикции МНС, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны быть представлены в аналогах, применяемых в способе по изобретению. Такие сверхобщие эпитопы обеспечивают наиболее простые осуществления изобретения, где лишь один модифицированный ГЕ5 представляется иммунной системе вакцинированного животного.

Предпочтительные осуществления изобретения охватывают модификацию путем введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т_н-эпитопа.

Понятно, что проблема иммунодоминантности Т_н-эпитопа зависит от интересующего вида животного. Используемый здесь термин «иммунодоминантность» просто относится к эпитопам, которые вызывают значимый иммунный ответ у вакцинированного субъекта, но хорошо известным фактом является то, что Тн-эпитоп, иммунодоминантный у одного субъекта, не обязательно является иммунодоминантным у другого субъекта того же вида, даже хотя он может связывать молекулы МНС-П у последнего субъекта.

Как указано выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может осуществляться путем введения вставки, добавления, делеции или замены по меньшей мере одной аминокислоты. Конечно, обычной ситуацией является введение более одного изменения аминокислотной последовательности (например, вставка целого Т-клеточного эпитопа или замена на него), но важная цель для достижения состоит в том, чтобы аналог после процессинга антигенпредставляющей клеткой (АРС), вызывал представление такого Т-клеточного эпитопа в связи с молекулой МНС класса II на поверхности АРС. Так, если аминокислотная последовательность мономерной единицы в подходящей позиции содержит некоторое количество аминокислотных остатков, которые также могут находиться в чужеродном Тн-эпитопе, то введение чужеродного Тн-эпитопа может осуществляться путем предоставления оставшихся аминокислот чужеродного эпитопа посредством вставки, добавления, делеции или замены аминокислот. Иными словами, не является необходимым введение полного Т_н-эпитопа путем вставки или замены.

По настоящему изобретению аналог также может образовывать часть более крупной молекулы, с которой он связан по меньшей мере одним функциональным радикалом, наличие которого не имеет отрицательного воздействия в значительной степени на доступность аналога для антитела. По природе та

- 9 007810 кие радикалы (которые могут быть слиты с аналогом) могут предназначаться для нацеливания модифицированной молекулы на антигенпредставляющую клетку (АРС) или В-лимфоцит, для стимуляции иммунной системы и для оптимизации представления иммунной системе данного аналога.

Радикалы нацеливания обычно выбирают из группы, состоящей, по существу, из специфичного связывающего партнера для специфичного поверхностного антигена В-лимфоцита или для специфичного поверхностного антигена АРС, такого как гаптен или углевод, для которых имеется рецептор на Влимфоците или АРС. Иммуностимулирующие радикалы могут быть выбраны из группы, состоящей из цитокина, гормона и белка теплового шока.

Радикал, оптимизирующий представление, может быть выбран из группы, состоящей из группы липида, такого как пальмитоильная группа, миристильная группа, фарнезильная группа, геранилгеранильная группа, СР1-якоря и Ν-ацилдиглицеридной группы.

Подходящий цитокин представляет собой интерферон у (ΙΡΝ-γ), Р113И, интерлейкин 1 (1Ь-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Б-4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (1Ь-12), интерлейкин 13 (1Ь13), интерлейкин 15 (1Ь-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМС8Р) или эффективную часть любого из них.

Предпочтительный белок теплового шока представляет собой Н8Р70, Н8Р90, Н8С70, СКР94 и кальретикулин (СК.Т), или эффективную часть любого из них.

Предпочтительно, чтобы количество вставок, делеций, замен или добавлений аминокислот составляло по меньшей мере, 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 25 вставок, замен, добавлений или делеций.

Более того, предпочтительно, чтобы количество аминокислот вставок, замен, добавлений или делеций не превышало 150, например, максимум 100, максимум 90, максимум 80 и максимум 70. Особенно предпочтительно, чтобы количество аминокислот замен, вставок, делеций или добавлений не превышало 60, и, в частности, чтобы данное количество не превышало 50 или даже 40. Наиболее предпочтительное количество составляет не более 30. Относительно аминокислот добавлений следует заметить, что при том, что полученная в результате конструкция находится в виде полипептида слияния, их количество часто заметно превышает 150.

Предпочтительные осуществления изобретения охватывают модификации путем введения по крайней мере одного чужеродного иммунодоминантного Т_н-эпитопа (= «чужеродной связывающей МНС класса II аминокислотной последовательности»). Следует понимать, что вопрос иммунодоминантности Т_н-эпитопа зависит от интересующего вида животного. Используемый здесь термин «иммунодоминантность» просто относится к эпитопам, которые у вакцинированного субъекта вызывают значимый иммунный ответ, но хорошо известным фактом является то, что Т_н-эпитоп, иммунодоминантный у одного субъекта, не обязательно является иммунодоминантным у другого субъекта того же вида, даже хотя он может связывать молекулы МНС-ΙΙ у последнего субъекта.

Другим значимым моментом является явление рестрикции Т_н-эпитопов по МНС. В общем встречающиеся в природе Т_н-эпитопы рестрицированы по МНС, т.е. конкретный пептид, составляющий Тнэпитоп эффективно связывается лишь с подмножеством молекул МНС класса II. Это, в свою очередь, обладает тем эффектом, что в большинстве случаев применение одного конкретного Т_н-эпитопа приводит к получению вакцинного компонента, эффективного только у части популяции, и в зависимости от размера данной части может быть необходимым вводить больше Т_н-эпитопов в одну и ту же молекулу, или, альтернативно получать многокомпонентную вакцину, где компоненты представляют собой варианты, которые отличаются друг от друга по природе вводимых Т_н-эпитопов.

Если рестрикция используемых Т-клеток по МНС вообще неизвестна (например, в ситуации, в которой вакцинируемое животное характеризуется малоизученным набором МНС), часть популяции животных, покрываемая конкретной вакцинной композицией, может определяться посредством следующей формулы:

п ίоори1Моп 1 1 О Ρί) (II) ί«1 где Ρι представляет собой частоту в популяции особей, отвечающих на ί-тый чужеродный Т-клеточный эпитоп, представленный в вакцинной композиции, и η представляет собой общее число чужеродных Тклеточных эпитопов в вакцинной композиции. Так, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, характеризующихся частотами ответа в популяции, составляющими 0,8, 0,7, и 0,6, соответственно, будет давать 1-0,2x0,3x0,4=0,976 т.е., 97,6% популяции по статистике будут развивать опосредованный МНС-П ответ на данную вакцину.

Указанная выше формула не применима в ситуациях, где для используемых пептидов известен более или менее точный профиль рестрикции по МНС. Если, например, конкретный пептид связывает только с человеческими молекулами МНС-П, кодируемыми аллелями НЬА-ОК ΌΚ.1, ΌΚ.3, ΌΚ.5 и ΌΚ.7, то применение данного пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы МНСII, кодируемые аллелями НЬА-ОК, будет обеспечиваться 100%-ное перекрывание интересующей популяции. Сходным образом, если второй пептид связывается только с ΌΚ.3 и ΌΚ.5, добавление данного пеп

- 10 007810 тида не увеличит покрытия вовсе. Если основывать расчет ответа популяции исключительно на рестрикции МНС Т-клеточных эпитопов в вакцине, часть популяции, покрываемая конкретной вакцинной композицией, может определяться посредством следующей формулы:

з /ρορηίαύοη ~^<Р^² (III) >1 где ф] представляет собой сумму частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые относятся к |-тому из 3 известных локусов НЬЛ (ΌΡ, ΌΚ и ЭО) ; практически, вначале определяют, какие молекулы МНС распознают каждый Т-клеточный эпитоп в вакцине, а после этого данные молекулы МНС перечисляют по типу (ΌΡ, ΌΚ и ОЦ); затем индивидуальные частоты различных перечисленных аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа с получением ф_ь ф₂ и ф₃.

Может произойти так, что значение р; в формуле II превышает соответствующее теоретическое значение щ:

з (IV) >1 где сумма частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связываются с ί-тым Т-клеточным эпитопом вакцины и которые принадлежат к утому из 3 известных локусов НЬЛ (ΌΡ, ΌΚ и ОЦ). Это означает, что 1-щ из популяции представляет собой частоту отвечающих субъектов ГгевНиа1_1 = (Ρί - щ)/(1-щ). Поэтому формула III может быть адаптирована так, что получится формула V:

/рориШ^ = 1 - П (¹ ~ <Р_}У + ~ П 0 - )} ( V) где число 1-£_Ге8Ииа1 ί установлено на ноле, если оно отрицательное. Следует заметить, что формула V требует, чтобы все эпитопы были картированы по гаплотипу против идентичных наборов гаплотипов.

Поэтому при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог по изобретению важно получить всю доступную информацию о данных эпитопах: 1) частота субъектов в популяции, отвечающих на каждый эпитоп, 2) данные рестрикции по МНС, и 3) частота имеющих отношение к проблеме гаплотипов.

Следует заметить, что предпочтительные аналоги по изобретению содержат модификации, результатом которых является полипептид, включающий в себя участки, обладающие идентичностью по последовательности, равной по меньшей мере 70% по отношению к мономерным единицам мультимерного белка или его подпоследовательностям, составляющим в длину по меньшей мере 10 аминокислот. Предпочтительны более высокие значения идентичности, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80% или 85%. Идентичность по последовательности для белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как (Ν^ _- Ντ) · 100/Ν_Γε£, где Ντ представляет собой общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании и где Ν^ представляет собой число остатков в одной из последовательностей. Следовательно, последовательность ДНК АОТСАОТС будет обладать идентичностью по последовательности, равной 75%, в отношении последовательности ААТСААТС Щац=2 и Н-еГ=⁸⁾.

Наконец, для окончательного доказательства того, что аналог по изобретению все-таки является эффективным в качестве иммуногена, могут проводиться различные тесты для предоставления необходимого подтверждения, см. также подробности, указанные в приведенных здесь примерах. В данном контексте также делается ссылка на обсуждение или идентификацию подходящих для применения аналогов ГЕ5 в МО 00/65058: данное описание может использоваться для верификации применимости аналога (происходящего из ГЕ5 или иного) относительно технологии по настоящему изобретению.

Предпочтительными мультимерами, которые могут использоваться по технологии настоящего изобретения, являются ГЕ5 и ΤΝΕα.

Основанные на ГЕ5 конструкции

Для ЫБ5 было обнаружено, что конструкции, имитирующие структуру природного димера ЫЬ5 и в то же время содержащие чужеродные Т_н-элементы, предоставляют превосходные результаты по сравнению с конструкциями, основанными на мономерной структуре, например, по сравнению с конструкциями, описанными МО 00/65058, особенно когда доходит до уровней экспрессии и реакционной способности антисывороток, полученных против данных конструкций.

Предпочтительные конструкции, основанные на ГЕ5, представляют собой те, где аналог выбран из группы, состоящей из

- двух полноразмерных мономеров ГЕ5, соединенных пептидным линкером, который содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, и

- двух полноразмерных мономеров ГЕ5, соединенных инертным пептидным линкером, из которых по меньшей мере один мономер ГЕ5 содержит гетерологичную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность.

- 11 007810

Такой аналог может обладать линейной структурой 1Ь-Ь_т-1Ь или 1Ь_т-Ь₁-1Ь_п, или 1Ь-Ь₁-1Ь_т или 1Ь-Ь₁1Ь_т или 1Ь_т-Ь_т-1Ь_п, где «ГО» представляет собой полную аминокислотную последовательность мономерного зрелого 1Ь5, «ГО_т» и «ГО_п», которые могут быть идентичными или неидентичными, обозначают по существу полную аминокислотную последовательность мономерного зрелого 1Ь5, включающую в себя гетерологичную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, Ь_т представляет собой пептидный линкер, содержащий по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность в аналоге или вносящий в нее вклад, и «Ь₁» представляет собой инертный пептидный линкер, который не содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность в аналоге и не вносит в нее вклад. Особенно предпочтительно, чтобы Ь_т, ГО_т и Т,, содержали эпитопы Р2 и/или Р30 столбнячного анатоксина или содержали ΡΑΌΒΕ, и Ь₁ представлял собой диглициновый линкер. Однако Ь₁ может представлять собой любой неиммуногенный линкерный пептид, который не образует связывающих МНС класса II последовательностей.

Наиболее предпочтительными осуществлениями являются аналоги ЫЬ5, содержащие зрелую аминокислотную последовательность, указанную в любом из 8Еф ГО N0: 9, 11, 13 и 15.

Предпосылки, связанные с ΤΝΡα

Фактор некроза опухолей (ΤΝΡ, ΤΝΤα, кахектин, ΤΝΡ8Ρ2) представляет собой мощный паракринный и эндокринный медиатор воспалительных и иммунных функций. ΤΝΤα цитотоксичен для многих клеток, особенно в комбинации с гамма-интерфероном. ΤΝΤα впервые был идентифицирован в 1975 г. и, как было продемонстрировано, инициировал некроз и регрессию опухолей. Противораковый эффект позднее исследовали подробно, но обработка им в качестве лечения злокачественных опухолей не имела успеха, хотя до сих пор проводятся испытания по лечению злокачественных опухолей с использованием ΤΝΤα. ΤΝΤα позже был открыт как причина кахексии, и было обнаружено, что ΤΝΤ проявляет свою функцию через опосредованный рецептором процесс. Идентифицировали два различных рецептора ΤΝΤα (ΤΝΡΒ55 и ΤΝΡΒ75), которые опосредуют цитотоксический и воспалительный эффекты ΤΝΡα. ΤΝΤα индуцирует и закрепляет воспалительные процессы во время хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (ВЛ) и, как предполагается, играет критическую роль при аллергиях и псориазе. Блокирование сигнала ΤΝΡα растворимыми рецепторами, рецепторспецифичными ингибиторами, отрицательной регуляцией продукции ΤΝΤα или моноклональными антителами против ΤΝΤα представляет собой привлекательные формы лечения с целью противодействия биологическим эффектам положительной регуляции и передачи сигнала ΤΝΤα.

Из результатов, полученных при лечении растворимыми рецепторами ΤΝΤα и моноклональными антителами против ΤΝΤα, очевидно, что лечение, направленное против ΤΝΤα, имеет успех при некоторых заболеваниях, таких как ВА и болезнь Крона. Антилечение, направленное против ΤΝΡα, считается безопасным и эффективным.

К настоящему времени для клинического применения одобрены два антагониста ΤΝΤα, ремикад ЦпШхтаЬ, Ссп1оеог/1о11п5оп & Ιοίιπδοπ) и энбрел (Е1апетсер1, Iттиηеx).

Ремикад представляет собой химерное мышиное-человеческое моноклональное антитело !дС1, направленное против растворимого и ассоциированного с клетками ΤΝΤα. Ремикад блокирует связывание ΤΝΡ с его эндогенным рецептором ΤΝΡα клеточной поверхности. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (ΡΌΑ) одобрило ремикад в октябре 1998 г. для применения при умеренной до тяжелой или характеризующейся свищами болезни Крона, устойчивой к общепринятым способам лечения. Данное показание было расширено до того, что стало включать в себя дополнительное применение с метотрексатом при ревматоидном артрите, устойчивом к лечению одним метотрексатом, и с июля 2002 г. поддерживающую терапию при болезни Крона.

Энбрел представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из внеклеточной части человеческого рецептора ΤΝΡα, слитого с Ρс-частью человеческого ЦСР Энбрел ингибирует активность ΤΝΡα, служа в качестве капкана для рецептора ΤΝΡα. ΡΌΑ одобрило энбрел для применения при ревматоидном артрите в ноябре 1998 г. Более 350000 пациентов обрабатывали данными антагонистами ΤΝΡα. Обзор клинической эффективности и информацию по безопасности данных средств получают непрерывно, и инфекции и другие связанные с иммунитетом неблагоприятные явления остаются основным вопросом для антагонистов ΤΝΡα, последняя оценка безопасности опыта, полученного после маркетинга, осуществленная ΡΌΑ и Комитетом по патентованным медицинским продуктам (СРМР), подтверждает, что способы лечения, направленные против ΤΝΡα, имеют предпочтительный и благоприятный с точки зрения риска баланс, несмотря на то, что требуются маркировочные изменения, включая изменения при серьезных инфекциях.

По сравнению с установленными способами лечения, направленными против ΤΝΡα, предложенная здесь иммунотерапия против ΤΝΡα имеет преимущества, заключающиеся в вакцинациях микрограммовыми количествами и менее частых инъекциях для поддержания высокого титра против ΤΝΡα ш νΐνο по сравнению с обширными инфузиями моноклональных антител. Позитивными следствиями являются меньший риск развития побочных эффектов и менее дорогостоящая терапия. Также полагают, что при

- 12 007810 родный ответ поликлональных антител будет действовать в качестве более эффективного отрицательного регулятора ΤΝΕα. чем другие способы лечения, направленные против ΤΝΕα..

ΤΝΕα. транслируется в виде белка-предшественника длиной 233 аминокислот и секретируется в виде тримерного трансмембранного белка типа II. который расщепляется специфичными металлопротеазами до тримерного растворимого белка. где каждая идентичная мономерная субъединица состоит из 157 аминокислот (ее аминокислотная последовательность указана в 8Еф ΙΌ N0: 17). ΤΝΕα человека не гликозилирован. в то время как ΤΝΕα мыши содержит один участок Ν-гликозилирования. Мономер ΤΝΕα характеризуется молекулярной массой 17 кДа, в то время как тример имеет теоретическую МУ. равную 52 кДа, хотя перекрестно связанный тример обладает подвижностью. соответствующей 43 кДа, в 8Ό8РАСЕ. ΤΝΕα содержит два цистеина. которые стабилизируют структуру. образуя внутримолекулярный дисульфидный мостик. Как Ν-. так и С-конец ΤΝΕα значимы для его активности.

С-конец особо чувствителен. поскольку делеция трех. двух и даже одной аминокислоты решающим образом снижает растворимость и биологическую активность. Значимой аминокислотой является Ьеи157, который образует стабилизирующий солевой мостик между двумя мономерами тримера. С другой стороны, делеция первых восьми аминокислот повышает активность в 1,5-5 раза. тогда как делеция первых девяти аминокислот сохраняет активность полноразмерного белка. ΤΝΕα является хорошо изученным белком. и идентифицированы многие внутри- и межмолекулярные взаимодействия. которые ведут к образованию тримера и связыванию рецептора.

Следовательно. в природе ΤΝΕα человека (8Еф ГО Ν0: 17) существует как димер и тример. но данная молекула в обоих случаях хорошо подходит в качестве мишени-кандидата по настоящему изобретению.

Основанные на ΤΝΕα конструкции

Предпочтительный аналог ΤΝΕα выбран из группы. состоящей из

1) двух или трех полноразмерных мономеров ΤΝΕα, объединенных конец в конец пептидным линкером. где по меньшей мере один пептидный линкер содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность. и 2) двух или трех полноразмерных мономеров ΤΝΕα. соединенных конец в конец инертным пептидным линкером. где по меньшей мере один из мономеров содержит по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность или по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность слита с Ν- или С-концевым мономером. необязательно посредством инертного линкера.

Особый интерес вызывают иммуногенные молекулы ΤΝΕα с высокой стабильностью. поскольку ранее авторами изобретения было обнаружено. что мономерные конструкции на основе ΤΝΕα имеют тенденцию к относительной нестабильности. ср.. например. с дискуссией. приведенной ниже.

Таким образом. данный тип конструкции имеет очень много аналогичного с описанными выше конструкциями на основе ГО5.

Продуцировали ген. кодирующий 3 субъединицы ΤΝΕα, связанные вместе эпитопами и/или инертными пептидными линкерами способом. параллельным тому. который обсуждался в связи с ГО5. Цель состояла в генерирования вариантов молекул ΤΝΕα с конформацией. максимально близкой к таковой для природного триммера ΤΝΕα. Варианты конструировали для эффективного образования нейтрализующих антител против ΤΝΕα дикого типа.

Наиболее подходящие варианты ΤΝΕα представляют собой растворимые и стабильные белки в отсутствие детергентов и других видов добавок. которые могут разрушить конформацию белка.

Путем экспрессии трех мономеров. связанных вместе в виде единственной полипептидной цепи с использованием линкеров и Т_н-эпитопов, планируется получить варианты ΤΝΕα, более стабильные. нежели существующие ранее иммуногенные варианты ΤΝΕα. Это позволит сохранить структуру ΤΝΕα за счет введения необходимых Т_н-эпитопов вне стабилизирующих водородных связей. солевых мостиков или дисульфидных мостиков.

Из рентгеновской кристаллической структуры ΤΝΕα видно. что первые 5 остатков Ν-конца слишком гибки. чтобы позволить определение структуры. С-конец. однако. локализован вблизи середины поверхности взаимодействия мономера и менее гибок. Расстояние между С-альфа-атомами Агд-6 и Ьеи-157 составляет 10 А. что соответствует расстоянию 3-4 аминокислотных остатков. Поэтому представляется возможным связать мономерные субъединицы вместе. но поскольку С-концы локализованы в чувствительном участке. возможно. будет предпочтительным использовать для данной связи гибкие линкеры. например. глициновые линкеры.

К настоящему времени были сконструированы пять вариантов с использованием подхода «мономеризованного триммера».

Контрольный ΤΝΕΤ0 (тример ΤΝΕα номер 0. 8Еф ГО Ν0: 22) состоит из трех мономеров. непосредственно связанных вместе 2 отдельными глициновыми линкерами (С1у С1у С1у). ΤΝΕΤ0 сконструирован так. что он так же стабилен. как тримерный белок дикого типа. Конечно. вместо указанных выше глици

- 13 007810 новых линкеров могут использоваться другие инертные гибкие линкеры, известные в области белковой химии, при этом важной характеристикой является то, что гибкий линкер не окажет неблагоприятного воздействия на способность мономеризованного белка сворачиваться в ЗИ-структуру, сходную с 3Όструктурой физиологически активного \\1ΤΝΕα.

Конструкция ΤΝΕΤ0 экспрессируется в виде растворимого белка в Е. со11, и был использован для получения типовой конструкции ΤΝΕ-Τ4 (8ЕО ΙΌ N0: 57), являющейся вариантом, куда введен связывающий МНС класса II пептид ΡΛΌΚΕ (8Е0 ΙΌ N0: 7). В данной конструкции отношение между мономерными единицами и чужеродными эпитопами составляет 1 эпитоп на 3 мономера, вместо 1 эпитопа на мономер, как в случае ранее предложенных вариантов, которые имели отношение к иммуногенизированным мономерным белкам; тот же случай для 8Е0 ΙΌ N0: 55). Данный факт потенциально оказывает положительное влияние на стабильность тримера. Результатом данного подхода является вариант ΤΝΡ02 (8Е0 ΙΌ N0: 28, ср. ниже), который представляет собой мономер ΤΝΕα с эпитопом ΡΆΌΒΕ в той же позиции, что в ΤΗΡ Т4.

Параллельно, эпитопы столбнячного анатоксина Р2 и Р30 (8Е0 ΙΌ N0: 3 и 5, соответственно) использовали в вариантах ΤΗΕΤ1 и ΤΗΕΤ2 (8Е0 ΙΌ N0: 49 и 51, соответственно), содержащих один эпитоп в каждой линкерной области, и также в ΤΗΕΤ3 (8Е0 ΙΌ N0: 59), который содержит один С-концевой эпитоп и один во второй линкерной области. Белки большей частью сворачиваются от Η-конца к Сконцу. Идея, лежащая в основе ΤΗΡ Τ3 состоит в том, что первые два Η-концевых домена, сворачиваясь будут функционировать в качестве внутренних шаперонов для третьего домена (мономера) , в состав которого будут входит эпитопы.

Обнаружено, что, в дополнение к описанной подробно выше технологии, где полимерные белки «мономеризованы», ΤΗΡα (и возможно, многие другие мультимерные белки) позволяет осуществлять продукцию мономеров, которые 1) содержат по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию и/или 2) содержат по крайней мере одну не происходящую из ΤΗΡα связывающую МНС класса ΙΙ аминокислотную последовательность, где данные мономерные варианты ΤΗΡα способны верно сворачиваться в третичную структуру, которая впоследствии позволит образоваться димерным или тримерным белкам ΤΗΡα, обладающим верной четвертичной структурой (что подтверждается тем, что они имеют активность по связыванию рецептора). Следовательно, в данных конструкциях возможно получать варианты мономерного ΤΗΡα, которые не обязательно необходимо продуцировать в виде мономеризованных тримеров, поскольку изменения, введенные в последовательности мономеров, вносят столь ограниченное нарушение третичной структуры мономера, что может образовываться ди- или тример. В соответствии с идеями, лежащими в основе настоящего изобретения далее было обнаружено, что все такие варианты могут экспрессироваться в виде растворимых белков в бактериальных клетках.

Следовательно, возможно получить иммуногенные варианты ΤΗΡα по следующим стратегиям, которые могут комбинироваться и которые могут далее комбинироваться с уже обсуждавшимся «подходом мономеризации» по изобретению (если данные конкретные модификации все являются по природе не деструктивными).

Стратегия гибкой петли

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что вставка эпитопа РАЭВЕ (8Е0 ΙΌ N0: 7) в петлю 3 в положении С1у108-А1а109 представляет собой многообещающий подход для получения вариантов ΤΗΡα со структурой, сильно напоминающей нативную молекулу ΤΗΡα.

Из кристаллической структуры ΤΗΡα сделан вывод, что Т_н-эпитоп, встроенный непосредственно в данной позиции, не имеет каких-либо соседних аминокислотных остатков в непосредственной близости для взаимодействия с ним. Исследования с ΤNΕ34 (8Е0 ΙΌ N0: 18), первой содержащей РЛЭИЕ конструкцией, полученной по данному подходу, показали, что примерно 5% экспрессированного белка ΤNΕ34 в Е. со11 было растворимым, а 95% ΤNΕ34 экспрессировалось в виде телец включения, когда бактериальные клетки хозяина выращивали при 37°С, но после адаптации процесса ферментации до температуры ферментации, равной 25°С, выходы растворимого белка из ферментации были близки к 100%. Следовательно, оптимизация условий роста увеличила выход растворимого белка.

Было получено некоторое количество других конструкций (1^35-1^39, 8Е0 ΙΌ N0 23, 24, 25, 26 и 27), где все они зависели исключительно от введения 8Е0 ΙΌ N0: 7 в гибкую петлю 3.

Мутации, увеличивающие стабильность

Введение Т_н-эпитопов в гибкую петлю 3 может потенциально дестабилизировать структуру варианта ΤΗΡα. Однако данной потенциальной дестабилизации можно противодействовать путем стабилизации структуры путем введения цистеинов, которые образуют дисульфидный мостик. Цистиновая пара в двух различных позициях пока не была введена в варианты 1^34^ и ΤNΕ34-Β (8Е0 ΙΌ N0: 29 и 30). Также гибкий Η-конец (первые 8 аминокислот), который, как известно, снижает силу взаимодействия с рецептором, одновременно подвергают делеции, в результате чего получают вариант ΤNΕ34-С (8Е0 ΙΌ N0: 31). Дисульфидный мостик вводят в мономер для стабилизации участка вставки эпитопа вместе с имеющимся в природе дисульфидным мостиком (Сук-67 Сук-101). Данная стратегия также стабилизирует и мономер ΤΗΡα как таковой, и мономеризованный ди- или тример.

- 14 007810

Другие конструкции

Некоторые другие стратегии использовали для конструирования вариантов растворимых продуктов экспрессии. ΤΝΡΧ1.1-2 (8ЕР ГО N0: 32 и 33) основаны на вставках 81% ГО N0:7 в первую петлю ΤΝΡα, где участок вставки локализовался в позиции интрона. В ΤΝΡΧ2.1 (8ЕР ГО N0: 34) создана искусственная область «стебля», содержащая вставку 81% ГО N0: 7.

Путем мутаций ΤΗΡα выявлено, что замены объемных гидрофобных аминокислот, находящихся на поверхности взаимодействия тримера, стабилизируют структуру тримера. ΤNΡX3.1 и ΤNΡX3.2 (8ЕР ГО N0: 35 и 36) являются попытками стабилизировать существующий вариант ΤNΡ34.

В ΤNΡX4.1 (8ЕР ГО N0: 37) использованы диглициновые линкеры для снижения структурного препятствия, воздействующего от пептида РАОКЕ на всю структуру ΤΚΡ34. В ΤNΡX5.1 (8ЕР ГО N0: 38) задействована в качестве точки вставки петлевая структура, находящаяся в молекуле представителя семейства ΊΝΓ В1у8. ΤΚΡΧ6.1-2, 1^7.1-2 и ΤNΡX8.1 (8ЕР ГО N0: 39,40, 41, 42 и 43) являются дальнейшими вариантами. ΤNΡX9.1 и ΤNΡX9.2 (ЗЕР ГО N0: 44 и 45) представляют собой варианты ΤΚΡ34, в которых задействованы идентичные перекрывающиеся последовательности 'Τ^α из 4-6 аминокислот перед и после эпитопа. Наконец, два варианта (ЗЕР ГО N0: 46 и 47) содержат собой двойные варианты Р2/Р30 в том же месте, что пептид РЛОКЕ в ΤNΡ34.

Кроме того, по кристаллической структуре ΤΧΡα сделано наблюдение, что внутри мономера 'Τ^α присутствует один стабилизирующий солевой мостик между остатками Ьуз-98 и О1и-116. Солевой мостик по определению представляет собой электростатическое взаимодействие между атомами кислорода боковых цепей Азр или О1и и положительно заряженными атомами азота боковых цепей в Агд, Ьуз или Н18 с межатомным расстоянием менее 7,0 А. Путем мутаций, заключающихся в сайт-специфической замене Ьуз-98 на Агд или Н1з в данной позиции, в сочетании с заменами О1и 116 на Азр, может достигаться усиление стабильности данного солевого мостика и, таким образом, стабильности молекулы тримера. Также возможно заменить данные солевые мостики дисульфидными мостиками в описанной выше манере.

Было сделано наблюдение, что мышиный Τ^α заметно стабильнее, чем человеческий Τ^α в плане растворимости и протеолиза. Улучшение вариантов 'Τ^α охватывает получение сайтспецифических мутантов, так что имитируется кристаллическая структура мышиного Τ^α для получения более стабильного в плане протеолиза продукта Τ^α.

Из рентгеновских структур человеческого и мышиного Τ^α видно, что центр тримера (в середине трех мономеров ΤΝαΐ держится за счет гидрофобных сил, в то время как вершина и дно тримера связаны за счет встречающихся в природе солевых мостиков. Поэтому стабильность тримера ΓΚΡα может быть усилена путем скрининга данных солевых мостиков на предмет более прочных связей.

Наконец, предварительные результаты, полученные с вариантами 'Τ^α по настоящему изобретению, неожиданно продемонстрировали, что данные варианты являются физиологически активными, по меньшей мере, в смысле их связывания с УМР-рецепторами. Однако, поскольку Τ^α является токсичным белком, требуется получить безопасные варианты, которые не вызовут каких-либо побочных эффектов у субъектов, иммунизированных вакциной по изобретению. Поэтому также важным осуществлением изобретения является введение в конструкции детоксицирующих мутаций, если они после тестиро вания на подходящих моделях токсичности продемонстрируют потенциальную опасность для вакцинированных субъектов.

В данной области известно некоторое количество точечных мутаций, призванных детоксицировать ΤNΡα или, по меньшей мере, в большой степени снизить его токсичность. Данные точечные мутации, если это необходимо, вводят в варианты по настоящему изобретению. Особенно предпочтительными мутациями являются замены, соответствующие в зрелом Τ^α заменам Руг-87 на 8ег, Азр-143 на Азп, и А1а-145 на Агд. Далее, все эффективные мутации, указанные Рое1зсйег, Н., ЗШеЬег, О., Ваппег, О., Маскау, Р. апб Ьезз1аиег, Ш. 1993 ГВС 268 (35) 26350-7, также представляют собой интересные осуществления в рамках осуществлений детоксикации по настоящему изобретению.

В заключение, по настоящему изобретению получали следующие конкретные варианты ΤNΡα:

Конструкция Первая Первая

ΤΝΕ а.к до а.к эпитопа после

Аминокислоты, Мутиции подвергнутые делеции за

Общая длина эпитопа счет вставки

ΤΝΓ34	108	109	-	170
ΤΝΓ35	106	107	-	170
ΤΝΓ36	107	108	-	170
ΤΝΕ37	108	110	А	169
ΤΝΕ38	108	112	АЕА	167

- 15 007810

ΤΝΕ39	106	112	ЕСАЕА	165
ΤΝΕ02	170		—	СЗС+добавленный с С-конца ΡΑϋΚΕ	173
ΤΝΕ34-Α	108	109	-	067С, А111С	170
ΤΝΕ34-Β	108	109	-	А96С, 1118С	170
ΤΝΓ34-Ο	108	109		Удалены Νконцевые аминокислты УКЗЗЗКТР	162
ΤΝΕΧ1,1	17	19	А		169
ΤΝΓΧ1,2	17	96	ΑΝΡΩΆ		165
ΤΝΕΧ2,1	0	2	V	Добавленный с N -конца ΡΑϋΚΕ	170
ΤΝΕΧ3,1	108	109	-	Д157Е	170
ΤΝΓΧ3,2	108	109	-	У49Г	170
ΤΝΓΧ4,1	108	109	—	Два глицина до и после ΡΑϋΚΕ	174

ΤΝΕΧ5,1

ΤΝΕΧ6, 1

ΤΝΕΧ6,2

ΤΝΓΧ7,1

ΤΝΓΧ7,2

ΤΝΓΧ8,1

ГПХТТПХ? Α -I 11ΝΓΛ2, 1

132

135

126 α η ιυο

146

146

140

А А ιυο

ΑΫ3

3ΑΕΙΝΚΡ0ΥΣ0ΓΑ ΙΝΚΡΟΥΣΟΕΑ ЕКСОЗСРЗТНУЬЬ ТНУЬЬТНТ13К1А ЕКС6КЬЗАЕ1ЫКР

ΤΝΓΧ9, 2

108

105 ттт____ шесть аминокислот, предшествующих ΡΆΩΚΕ, после эпитопа дуплицированы Четыре аминокислоты, предшествующие ΡΑϋΚΕ, после эпитопа дуплицированы

167

157

160

157

157

157

Ί Π Г ± / Ό

174

ΤΝΓ34-Ρ2-	108	109	-	Р2 и РЗО	194
РЗО
ΤΝΓ34-Ρ30-	108	109	-	РЗО и Р2	194
Р2

Используемые числа от Ν-концевого V в 81% ΙΌ NО: 17 (то есть, от аминокислоты № 2 в 81% ГО NО: 17). Перед Ν-концевым валином в некоторых последовательностях находится метионин, использованный для старта трансляции.

Наиболее предпочтительными белковыми конструкциями по изобретению являются те, что представлены любой из 81% ΙΌ №: 18, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, а также любая аминокислотная последовательность, происходящая от них, которая содержит только консервативные аминокислотные замены или детоксицирующие аминокислотные.

В любом случае значимым осуществлением является то, что все данные варианты ΤΝΡα, обсуждаемые выше, могут экспрессироваться в виде растворимых белков в бактериальных клетках, таких как Е. со11.

Предпочтительным вектором является рЕТ28Ь+, где целью является экспрессия в Е. со11, ρ2Ζορ2Ρ (8ЕР ГО NО: 60) является вектором, используемым для экспрессии в клетках насекомых, и рНР1 (или его коммерчески доступный «близнец» рСГ) представляет собой вектор для экспрессии в клетках млекопи тающих.

Основные способы лечения, предоставляемые по изобретению

Изобретение относится к способам, посредством которых становится возможной отрицательная регуляция конкретного полимерного белка очень предпочтительным образом.

В общем предоставляется способ отрицательной регуляции полимерного белка у аутологичного хозяина, причем данный способ охватывает осуществление представления иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога по изобретению. Предпочтительно, чтобы аутологичный хозяин представлял собой млекопитающее, наиболее предпочтительно, человеческое существо.

- 16 007810

Данный способ может быть воплощен на практике несколькими путями, среди которых одним из способов выбора является введение белковой вакцины, но также большой интерес вызывает стратегия вакцинации нуклеиновой кислотой или стратегия вакцинации живой вакциной.

Вакцинация белком/полипептидом и композиция белка/полипептида

При осуществлении представления аналогов иммунной системе животного посредством их введения животному композиция полипептида следует принципам, в общем признанным в данной области.

Получение вакцин, которые в качестве активных ингредиентов содержат пептидные последовательности, в общем, хорошо известно в данной области, примеры чего указаны в патентах США 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792; и 4578770; все они включены сюда в качестве ссылки. Обычно такие вакцины получают в виде препаратов для инъекций или в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешан с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями, например, являются вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или тому подобное, и их комбинации. Кроме того, если требуется, вакцина может содержать малые количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие средства, буферные средства для поддержания рН или адъюванты, которые усиливают эффективность вакцин; ср. подробное обсуждение адъювантов, приведенное ниже.

Вакцины обычно вводят парентерально, например, путем инъекции, или подкожно, внутрикожно, интрадермально, субдермально или внутримышечно. Дополнительные композиции, которые подходят для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, подъязычные, интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и внутричерепные препараты.

Традиционные для суппозиториев связующие вещества и носители могут включать в себя, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в интервале от 0,5 до 10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно используемые наполнители такие как, например, фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и тому подобного. Данные композиции принимают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов замедленного высвобождения или порошков, и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Для перорального применения интересным партнером в композиции (и также возможным партнером для конъюгации) является холерный токсин.

Полипептиды могут быть составлены в вакцину в нейтральной форме или в форме солей. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами пептида) и те, которые образованы неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная, и тому подобные.

Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут также происходить из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, или таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и тому подобное.

Вакцины вводят способом, совместимым с дозированным препаратом, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Количество, подлежащее введению, зависит от подлежащего лечению субъекта, включая, например, способность иммунной системы субъекта развивать иммунный ответ, и требуемую степень защиты. Подходящие интервалы дозировки составляют порядка нескольких сотен микрограмм активного ингредиента на вакцинацию, с предпочтительным интервалом примерно от 0,1 до 2000 мкг (хотя рассматриваются даже большие количества в интервале 1-10 мг) , например, в интервале примерно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в интервале от 1 до 500 мкг, и особенно в интервале примерно от 10 до 100 мкг.

Подходящие режимы начального введения и поддерживающих введений также варьируют, но типично характеризуются начальным введением с последующими инокуляциями или другими введениями.

Способ применения может сильно варьировать. Могут использоваться любые общепринятые способы введения вакцины. Они включают в себя пероральное введение твердой физиологически приемлемой основы или физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, путем инъекции и тому подобное. Дозировка вакцины зависит от пути введения и варьирует в зависимости от возраста вакцинируемого субъекта и композиции антигена.

Некоторые аналоги вакцины достаточно иммуногены в вакцине, но для некоторых других иммунный ответ усиливают, если вакцина, кроме того, содержит вещество-адъювант.

Известны различные способы достижения эффекта адъюванта в вакцине. Основные принципы и способы подробно описаны в ΤΙιο ΤΗβοτγ апб Ргасйса1 АррЕсайоп о£ АйщуапЩ, 1995, Эипсап Е. 8. 81е\\аП-ΤιιΙΙ (еб. ), 1оНп ^11еу & 8оп§ ЬМ, !8ΒΝ 0-471-95170-6, и также в Уасстек: Νο\ν Сепегайоп Iтти

- 17 007810 по1ощса1 ЛфиуаШз, 1995, Сгедойаб1к С. е1 а1. (ебк.), Р1епит Ргекк, Νο\ν Уогк, Ι8ΒΝ 0-306-45283-9, причем данные источники включены сюда в качестве ссылки.

Особенно предпочтительным является применение адъюванта, который может демонстрировать облегчение нарушения аутотолерантности в отношении аутоантигенов; фактически, это существенно в случаях, где в качестве активного ингредиента аутовакцины применяется немодифицированный 1Ь5.

Неограничивающие примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из направленного на иммунную систему адъюванта; направленного на иммунную систему адъюванта, такого как токсин, цитокин и производное микобактерий; масляного препарата; полимера; мицеллообразующего адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикс (матрикс 18СОМ); частицы; ΌΌΆ; алюминиевых адъювантов; адъювантов, основанных на ДНК; γ-инулина; и инкапсулирующего адъюванта.

В общем следует отметить, что приведенные выше описания, которые относятся к соединениям и средствам, используемым в качестве первого, второго и третьего радикала аналогов, также относятся с внесением необходимых изменений к их применению в адъюванте вакцины по изобретению.

Применение адъювантов охватывает применение средств, таких как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемые в виде 0,05-0,1-процентного раствора в солевом буфере, примеси синтетических полимеров или Сахаров (например, СагЬоро1™) , используемые в виде 0,25-процентного раствора; возможна агрегация белка в вакцине путем обработки нагреванием при температурах, изменяющихся от 70 до 101°С в течение периодов от 30 с до 2 мин, соответственно, и также агрегация посредством перекрестно связывающих агентов. Также может использоваться агрегация путем реактивации обработанными пепсином антителами (ТаЬ-фрагментами) к альбумину, смешивание с бактериальными клетками, такими как С. Рагуит, или эндотоксинами или липополисахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульсия в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как маннидмоноолеат (Агасе1 А) или эмульсия с 20-процентным раствором перфторуглерода (Е1иоко1-ОА), используемого в качестве блокового замещенного. Также предпочтительным является примешивание масел, таких как сквален и ΙΤΑ.

По изобретению интересующим кандидатом на роль адъюванта является ΌΌΑ (диметилдиоктадециламмония бромид), а также ДНК и γ-инулин, но также интересны полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины Ош11а)а. такие как 0ш1А и 0821. также как и Κ1ΒΙ. Дальнейшие возможные варианты представляют собой монофосфориллипид А (МРЬ) , указанные выше С3 и С3б, и мурамилдипептид (МОР).

Также известно, что липосомные препараты обладают адъювантным эффектом, и поэтому липосомные адъюванты являются предпочтительными по изобретению.

Также предпочтительным выбором по изобретению являются адъюванты типа иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикс 18СОМ), особенно потому что было показано, что адъюванты данного типа способны положительно регулировать экспрессию МНС класса II в АРС.

Матрикс 18СОМ® состоит из (необязательно разделенных) сапонинов (тритерпеноидов) из Ош11а)а каропапа, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученный в результате препарат частиц представляет собой препарат, известный под названием частица 18СОМ, где сапонин составляет 60-70% мас./мас., холестерин и фосфолипид составляют 10-15% мас./мас., и белок составляет 10-15% мас./мас.

Подробности, касающиеся композиции и применения иммуностимулирующих комплексов могут, например, быть найдены в указанных выше учебниках, имеющих отношение к адъювантам, но также в Могеш В. е1 а1., 1995, С11п. 1ттипо1йег. 3: 461-475, а также в Вагг 1.С. апб Мйсйе11 С.Р., 1996, 1ттипо1. апб Се11 Вю1. 74: 8-25 (оба источника включены сюда в качестве ссылки) предоставлена полезная информация по получению полных иммуностимулирующих комплексов.

Другой очень интересной (и, таким образом, предпочтительной) возможностью достижения адъювантного эффекта является применение способа, описанного Соккейп е1 а1., 1992 (что включено сюда в качестве ссылки). В кратком изложении, презентация имеющего отношение к проблеме антигена, такого как антиген по настоящему изобретению, может усиливаться за счет конъюгации антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против Ρсγ-рецепторов на моноцитах/макрофагах. В частности, было продемонстрировано, что конъюгаты между антигеном и антителом против ΒογΡΙ усиливают иммуногенность для целей вакцинации.

Другие возможности используют применения направленных и иммуномодулирующих веществ (т. е., цитокинов), указанных в формуле изобретения как радикалы для белковых конструкций. В данной связи также возможно применение синтетических индукторов цитокинов, таких как ро1у 1:С.

Подходящие производные микобактерий выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, Κ1ΒΙ и сложного диэфира трегалозы, такого как ТОМ и ТОЕ.

Подходящие направленные на иммунную систему адъюванты выбраны из группы, состоящей из лиганда СО40 и антител против СО40 или их специфично связывающих фрагментов (ср. обсуждение, приведенное выше), маннозы, ЕаЬ-фрагмента и СТЬА-4.

- 18 007810

Подходящие полимерные адъюванты выбраны из группы, состоящей из такого углевода, как декстран, ΡΕΟ, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера, такого как; и латекса, такого как латексные частицы.

Еще одним интересующим способом модулирования иммунного ответа является введение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и несущими средствами) в «виртуальном лимфоузле» (УБЫ) (патентованном медицинском устройстве, разработанном IттиηоΤйе^ару, Шс., 360 Бехтд1оп Ауепие, №\ν Уогк, ΝΥ 10017-6501). УБИ (тонкое трубковидное устройство) имитирует структуру и функцию лимфоузла. Вставка ΑΕΝ под кожу приводит к образованию участка стерильного воспаления с повышением количества цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АРС быстро отвечают на сигналы опасности, мигрируют в участок воспаления и накапливаются в пористом матриксе УБК Показано, что необходимая доза антигена, требуемая для развития иммунного ответа на антиген, при использовании ΑΕΝ снижена, и что иммунная защита, вызванная вакцинацией с использованием УБ» превосходила общепринятую иммунизацию с использованием в качестве адъюванта РТЫ. Данная технология впервые кратко описана в Се1Ьег С. е! а1., 1998, ЕНсйайоп о£ КоЬик! Се11и1аг апй Нитога1 [ттипе Кекропкек Ю Зта11 АтоиШк о£ [ттиподеш Икшд а Νο\ό1 Мейюа1 Беуюе Бекщпа!ей 1йе У1йиа1 Бутрй Мойе, ш: Егот 111е БаЬога!огу !о 111е СНшс, Воок о£ АЬк1гас1к. Ос!оЬег 12111-15111 1998, Зеаксаре Рекой, Ар!ок, СаШогша .

Ожидается, что вакцина будет вводиться по меньшей мере один раз в год, например по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 12 раз в год. Более конкретно, ожидается введение нуждающемуся в этом субъекту 1-12 раз в год, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 раз в год. Ранее было показано, что иммунологическая память, индуцированная использованием предпочтительных аутовакцин по изобретению, не перманентна, и поэтому иммунная система нуждается в периодической стимуляции аналогами.

Вследствие генетической изменчивости различные субъекты могут реагировать на один и тот же полипептид иммунными ответами разной силы. Поэтому вакцины по изобретению могут содержать несколько различных полипептидов для усиления иммунного ответа, ср. выше также обсуждение, касающееся выбора введений чужеродных Т-клеточных эпитопов. Вакцины могут включать в себя два или более полипептида, где все полипептиды являются теми, что определены.

Вакцина может в результате содержать 3-20 различных аналогов, например, 3-10 аналогов. Однако обычно число аналогов составляет минимум, например, 1 или 2 аналога.

Вакцинация нуклеиновыми кислотами

В качестве очень важной альтернативы классическому введению основанной на пептидах вакцине технология вакцинации нуклеиновой кислотой (также известная как «иммунизация нуклеиновой кислотой», «генетическая иммунизация» и «генная иммунизация») предоставляет некоторое количество привлекательных характеристик.

Во-первых, в отличие от традиционного вакцинного подхода, вакцинация нуклеиновой кислотой не требует ресурса потребления крупномасштабной продукции иммуногенного агента (например, в виде ферментации микроорганизмов, продуцирующих белки, в промышленных масштабах). Более того, не требуется организовывать очистку и схемы рефолдинга иммуногена. И наконец, поскольку вакцинация нуклеиновой кислотой относится к биохимическому аппарату вакцинируемого субъекта, для продукции экспрессированного продукта введенной нуклеиновой кислоты, ожидается, что будет происходить оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, поскольку, как указывалось выше, значимая часть исходных В-клеточных эпитопов полимера в модифицированной молекуле должна сохраняться, и поскольку В-клеточные эпитопы в принципе могут составляться из частей любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Поэтому нативные профили гликозилирования и липоилирования иммуногена могут быть очень важны для иммуногенности в целом, и ожидается, что это гарантируется хозяином, продуцирующим иммуноген.

Следует заметить, что увеличенный уровень экспрессии, наблюдаемый с описанными здесь аналогами, очень значим для эффективности вакцинации ДНК, поскольку уровень экспрессии ш у1уо является одним из определяющих факторов для иммуногенной эффективности ДНК-вакцины. Следовательно, предпочтительное осуществление изобретения относится к эффективному представлению аналога по изобретению иммунной системе путем введения нуклеиновой(-ых) кислоты(-т), кодирующих аналог, в клетки животных и к достижению таким образом экспрессии ш у1уо клетками введенной (-ых) нуклеиновой (-ых) кислоты (-т).

В данном осуществлении введенная нуклеиновая кислота предпочтительно представляет собой ДНК, которая может находиться в виде голой ДНК, ДНК, объединенной в композицию с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, введенной в липосомы, ДНК, встроенной в вирусный вектор, ДНК, объединенной в композицию с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с направленным белком или полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с преципитирующими кальций средствами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в полимер, например, в РБСА (ср. технологию микроинкапсулирования, описанную в АО 98/31398) или в хитин или хитозан, и ДНК, объединенной в композицию с адъювантом. В данном контексте отмечено, что практически все соображения, касающиеся применения адъювантов в традицион

- 19 007810 ном вакцинном препарате, относятся и к препарату ДНК-вакцин. Следовательно, все приведенные здесь описания, которые относятся к применению адъювантов в контексте основанных на полипептиде вакцин, относятся с необходимыми изменениями к применению технологии вакцинации нуклеиновой кислотой.

Пути введения и схемы введения основанных на полипептиде вакцин, подробно описанные выше, также могут применяться для вакцин на основе нуклеиновой кислоты по изобретению, и все приведенные выше обсуждения, касающиеся путей введения и схем введения для полипептидов, прилагаются с соответствующими изменениями к нуклеиновым кислотам. К этому стоит добавить, что вакцины на основе нуклеиновой кислоты могут подходящим образом вводиться внутривенно и внутриартериально. Более того, в данной области хорошо известно, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут вводиться путем применения так называемой генной пушки, и, следовательно, также этот и эквивалентные ему пути введения рассматриваются как часть настоящего изобретения. Наконец, также применение νΈΝ при введении нуклеиновых кислот, как было описано, дает хорошие результаты, и поэтому данный конкретный способ введения является особо предпочтительным.

Далее, нуклеиновая (-ые) кислота(-ы), используемые в качестве средства для иммунизации по настоящему изобретению могут содержать области, кодирующие радикалы, определенные в формуле изобретения, например, имеющие вид описанных выше иммуномодулирующих веществ, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве подходящих адъювантов. Предпочтительный вариант данного осуществления охватывает наличие области, кодирующей аналог, и области, кодирующей иммуномодулятор, в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом избегают того, что аналог или эпитоп будет продуцировать в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут использоваться два различных нуклеотидных фрагмента, но это менее предпочтительно из-за преимущества гарантированной совместной экспрессии при наличии обоих кодирующих областей, включенных в состав одной и той же молекулы.

Соответственно, изобретение также относится к композиции для индукции продукции антител против ГБ5, причем композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению (ср. ниже обсуждение нуклеиновых кислот и векторов) и фармацевтически и иммунологически приемлемое несущее средство, и/или носитель, и/или адъювант, как обсуждается выше.

В обычных обстоятельствах нуклеиновую кислоту вводят в виде вектора, где экспрессия происходит под контролем вирусного промотора. Для более подробного обсуждения векторов и фрагментов ДНК по изобретению, ср. обсуждение ниже. Также доступны подробные описания, относящиеся к композиции и применению вакцин на основе нуклеиновой кислоты, ср. ОоппсИу 1.1. е! а1., 1997, Лили. Неу. ^тииок 15: 617-648 апб ИоииеНу 1.1. е! а1., 1997, ЫГе 8с1еисе8 60: 163-172. Обе эти ссылки включен сюда в качестве ссылки.

Живые вакцины

Третьей альтернативой осуществления представления аналогов по изобретению иммунной системе является применение технологии живых вакцин. При живой вакцинации представление иммунной системе осуществляется путем введения животному непатогенного микроорганизма, который трансформируют фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог по изобретению или вектором, содержащим такой фрагмент нуклеиновой кислоты.

Непатогенный микроорганизм может быть любым подходящим аттенуированным бактериальным штаммом (аттенуированным посредством пересева или посредством удаления патогенных продуктов экспрессии посредством технологии рекомбинантной ДНК), например, ВС6 МусоЬас1егшт όονίδ. непатогенным 81гер1ососси5 §рр., Е. со11, 8а1тоие11а §рр., У1Ьгю сЬо1ега, 8Ыде11а, и т.д. Обзоры, имеющие дело с получением введенных в практику живых вакцин могут, например, обнаруживаться в 8а1юи Р., 1995, Неу. Рга!. 45: 1492-1496 и ЭДа1кег Ρ.Ό., 1992, Уассте 10: 977-990, причем оба источника включены сюда в качестве ссылки. Для подробностей по фрагментам нуклеиновой кислоты и векторов, применяемых в таких живых вакцинах, ср. обсуждение ниже.

В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам обсуждаемые ниже фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть включены в состав невирулентного вирусного вакцинного вектора, такого как штамм коровьей оспы или любого другого подходящего поксвируса.

Обычно непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному только один раз, но в некоторых случаях может быть необходимо вводить микроорганизм более одного раза в течение жизни для поддержания протективного иммунитета. Рассматривается даже, что схемы иммунизации, такие как те, что подробно описаны выше для иммунизации полипептидами, могут использоваться и при использовании живых или вирусных вакцин.

Альтернативно, вакцинация живыми или вирусными вакцинами сочетается с предшествующей или последующей вакцинацией полипептидами и/или вакцинацией нуклеиновыми кислотами. Например, возможно осуществить первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующими загрузочными иммунизациями с использованием подхода полипептидов или нуклеиновой кислоты.

Микроорганизм или вирус может трансформироваться нуклеиновой(-ыми) кислотой(-ами), содержащими области, кодирующие указанные выше радикалы, например, имеющие вид описанных выше иммуномодулирующих веществ, таких как цитокины, обсуждаемые как подходящие адъюванты. Пред

- 20 007810 почтительный вариант данного осуществления охватывает наличие области, кодирующей аналог, и области, кодирующей иммуномодулятор, в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом избегают того, что аналог или эпитоп будет продуцировать в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, в качестве средств трансформации могут использоваться два различных нуклеотидных фрагмента.

Конечно, наличие адъювантных радикалов в одной и той же открытой рамке считывания может предоставить в качестве продукта экспрессии аналог по изобретению, и такое осуществление является особо предпочтительным по настоящему изобретению.

Комбинированное лечение

Одним из особенно предпочтительных способов осуществления изобретения охватывает применение вакцинации нуклеиновой кислотой в качестве первой (первичной) иммунизации, с последующими вторыми (стимулирующими) иммунизациями основанной на полипептиде вакциной или живыми вакцинами, как описано выше.

Применение способа по изобретению при лечении заболевания

Точный выбор режима лечения зависит от выбора мультимерного белка, на который оно направлено. Например, при использовании в качестве мишени ГБ5 к проблеме имеют отношение все состояния, обсуждаемые в \УО 00/65058, а когда мишенью является ΤΝΕα, все имеющие к проблеме заболевания/состояния охватывают ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, спондилартропатии, полимиозит, дерматомиозит, васкулит, псориаз (бляшки) и псориатический артрит, МЬ. болезнь Крона, хроническое обструктивное легочное нарушение, синдром миелодисплазии, увеит при ревматоидном артрите, острую дисфункцию легких, астму, гранулематоз Венегера, болезнь раздраженной толстой кишки, темпоромандибулярное нарушение (болезненное смыкание челюстей), стоматит-остеопороз и кахексию при злокачественных опухолях, а также другие воспалительные заболевания и другие состояния, рассматриваемые в данной области как связанные с неблагоприятными эффектами ΤΝΕα. Поэтому возможно лечение или ослабление симптомов любых из данных заболеваний путем использования способа отрицательной регуляции активности мультимерного белка по изобретению.

Композиции по изобретению

Изобретение также относится к композициям, которые могут использоваться при воплощении способа по изобретению. Следовательно, изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество определенного выше аналога, причем указанная композиция далее содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый растворитель, и/или несущее средство, и/или носитель, и/или наполнитель, и, необязательно, адъювант. Иными словами, данная часть изобретения относится к препаратам аналогов, по существу описанных здесь и выше. Выбор адъювантов, носителей и несущих средств осуществляется в соответствии с обсуждаемым выше, когда это относится к препарату аналогов для вакцинации пептидами.

Аналоги получают по способам, хорошо известным в данной области. Более длинные полипептиды обычно получают посредством рекомбинантной генной технологии, включающей в себя введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог, в подходящий вектор, трансформацию данным вектором подходящего хозяина, экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты (путем культивирования клетки хозяина в подходящих условиях), получение продукта экспрессии из клеток хозяина или их культуральной надосадочной жидкости и последующую очистку и необязательную дальнейшую модификацию, например, рефолдинг или дериватизацию. Подробности, касающиеся необходимых инструментов, находятся ниже под заголовком «Фрагменты нуклеиновой кислоты и векторы по изобретению», но также и в примерах.

Более короткие пептиды предпочтительно получают хорошо известными способами жидко- и твердофазного пептидного синтеза.

Однако последние успехи в данной технологии дали возможность для продукции полноразмерных полипептидов и белков данными средствами, и поэтому также в объеме настоящего изобретения находится получение длинных конструкций синтетическими средствами.

Фрагменты нуклеиновой кислоты и векторы по изобретению

Из указанного выше описания следует понимать, что модифицированные полипептиды могут быть получены посредством рекомбинантной генной технологии, но также посредством химического синтеза или полусинтетически; два последних условия особенно применимы, когда модификация состоит в связывании с белковыми носителями (такими как КЬН, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и В8Л) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры, или охватывает это, и, конечно, также когда модификация охватывает добавление боковых цепей или боковых групп к происходящей из полимера пептидной цепи. Данные осуществления, как понятно из сказанного выше, не являются предпочтительными.

Для целей рекомбинантной генной технологии и, конечно, также для целей иммунизации нуклеиновой кислотой важными химическими продуктами являются фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие аналоги (а также комплементарные им последовательности). Следовательно, важная часть изо

- 21 007810 бретения относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанный здесь аналог, т. е. происходящий из полимера искусственный полимерный полипептид, как описано здесь выше. Фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению представляют собой ДНК- или РНК-фрагменты.

Наиболее предпочтительный ДНК-фрагмент по изобретению охватывает последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из БЕО Ш N0: 8, 10, 12, 14, 17, 48, 50, 52, 54, 56 и 58, или последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную любой из них.

Фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению обычно встраивают в подходящие векторы с образованием клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Подробности, касающиеся конструирования данных векторов по изобретению, обсуждаются ниже в контексте трансформированных клеток и микроорганизмов. Векторы могут в зависимости от цели и типа применения находиться в виде плазмид, фагов, космид, минихромосом, или вируса, но также и голая ДНК, которая экспрессируется лишь транзиторно в конкретных клетках, является значимым вектором (и может использоваться для вакцинации ДНК). Предпочтительные клонирующие и зкспрессирующие векторы по изобретению способны к автономной репликации, что обеспечивает, таким образом, высокую копийность для целей высокоуровневой экспрессии или высокоуровневой репликации для последующего клонирования.

Общий вариант вектора по изобретению содержит следующие черты в 5' З'-направлении и функциональной связи: промотор для направления экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты по изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию (во внеклеточную фазу или, где возможно, в периплазму) или встраивание полипептидного фрагмента в мембрану, фрагмент нуклеиновой кислоты по изобретению, и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах или клеточных линиях-продуцентах для целей генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы вектор при введении в клетку хозяина интегрировался в геном клетки хозяина. При работе с векторами, подлежащими использованию для экспрессии у животных ίη νίνο (т.е., использования вектора при вакцинации ДНК), наоборот, из соображений безопасности предпочтительно, чтобы вектор не был способен интегрироваться в геном клетки хозяина; обычно используют голую ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых хорошо известен специалисту в данной области.

Векторы по изобретению используют для трансформации клеток хозяина для продукции модифицированного полипептида 1Ь5 по изобретению. Такие трансформированные клетки, которые также являются частью изобретения, могут быть культивируемыми клетками или клеточными линиями, используемыми для размножения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов по изобретению или используемыми для рекомбинантной продукции модифицированных полипептидов 1Ь5 по изобретению. Альтернативно, трансформированные клетки могут представлять собой штаммы, подходящие для живых вакцин, где фрагмент нуклеиновой кислоты (единственная или множественные копии) встроены так, что осуществляется секреция или интеграция модифицированного 1Ь5 в бактериальную мембрану или клеточную стенку.

Предпочтительные трансформированные клетки по изобретению представляют собой такие микроорганизмы как бактерии (такие как виды ЕксЕепсЫа [например, Е. со11], ВасШик [например, ВасШик киЬίίΐίδ], Ба1топе11а, или МусоЬас1епит [предпочтительно, непатогенные, например, М. ЬотЬ ВС6] ), дрожжи (такие как БассРаготусек сеге\ак1ае) и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки происходят из многоклеточного организма, такого как гриб, являются клетками насекомых, растительными клетками или клетками млекопитающих. Наиболее предпочтительными являются клетки, происходящие из человеческого существа, ср. ниже обсуждение клеточных линий и векторов. Последние результаты показали, что многообещающим является применение коммерчески доступной клеточной линии ЭгокорР11а те1аподак1ег (клеточная линия и векторная система БсРпе1йег 2 (Б2), доступные от 1птЦгодеп) для рекомбинантной продукции аналогов 1Ь5 по изобретению, и поэтому данная экспрессирующая система является особенно предпочтительной, и поэтому данный тип системы в общем является предпочтительным осуществлением изобретения.

Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка могла реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты по изобретению.

Клетки, экспрессирующие данный нуклеиновый фрагмент, являются предпочтительными используемыми осуществлениями изобретения; они могут использоваться для мелко- и крупномасштабного получения аналога или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинного составляющего живой вакцины.

При продукции аналогов по изобретению посредством трансформированных клеток удобно, хотя и не существенно, чтобы продукт экспрессии экспортировался в культуральную среду или находился на поверхности трансформированной клетки, поскольку оба данных условия облегчают последующую очистку данного продукта экспрессии.

После идентификации эффективной клетки-продуцента предпочтительно на ее основе получить стабильную клеточную линию, которая будет нести вектор по изобретению и которая будет экспресси

- 22 007810 ровать фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный 1Ь5. Предпочтительно данная стабильная клеточная секретирует или несет аналог 1Ь5 по изобретению, облегчая таким образом его очистку.

В общем в связи с конкретными хозяевами используют плазмидные векторы, содержащие репликон и последовательности контроля, которые происходят из видов, совместимых с клеткой хозяина. Обычно вектор содержит участок репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечивать фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Например, Е. сой обычно трансформируют с использованием рВК.322, плазмиды, происходящей из видов Е. сой (см., например, Βοϊίνατ е! а1., 1977). Плазмида рВК.322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, и так обеспечивает простое средство идентификации трансформированных клеток. Плазмида рВВ или другая микробная плазмида или фаг также должна содержать промоторы, которые могут использоваться прокариотическим микроорганизмом для экспрессии, или должна быть модифицирована так, чтобы она содержала данные промоторы.

Те промоторы, что наиболее часто используются в прокариотических конструкциях рекомбинантной ДНК включают в себя промоторные системы β-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (СНапд е! а1., 1978; Пакта е! а1., 1977; Ооеббе1 е! а1., 1979) и триптофановую (!тр) промоторную систему (Ооеббе1 е! а1., 1979; ЕР-А-0 036 776). Хотя эти системы наиболее часто используют, открыты и использованы другие микробные промоторы, и опубликованы подробности, относящиеся к их нуклеотидным последовательностям, что позволяет специалисту функционально лигировать их с плазмидными векторами (З|еЬ\\'епНк! е! а1., 1980). Некоторые гены прокариот могут эффективно экспрессироваться в Е. сой с их собственных промоторных последовательностей, отменяя необходимость добавления другого промотора искусственными средствами.

В дополнение к прокариотам также могут использоваться эукариотические микробы, такие как дрожжевые культуры, и здесь промоторы должны быть способны направлять экспрессию. Среди эукариотических микроорганизмов чаще всего используют ЗассНаготусек се^еν^к^ае, или обыкновенные пекарские дрожжи, хотя обычно доступно некоторое количество других штаммов. Для экспрессии в ЗассНаготусек обычно используют, например, плазмиду УКр7 (ЗйпсйсотЬ е! а1., 1979; Кшдктап е! а1., 1979; ’ГБсЬетрег е! а1., 1980).

Данная плазмида уже содержит ген !гр1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, не способного расти на триптофане, например, АТСС №. 44076 или РЕР4-1 Оопек, 1977). Тогда наличие повреждения !гр1, как характеристика генома дрожжевого хозяина, обеспечивает эффективные условия выявления трансформации по росту в отсутствие триптофана.

Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (Нйхтап е! а1., 1980) или других ферментов гликолиза (Некк е! а1., 1968; Но11аиб е! а1., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. При конструировании подходящих экспрессирующих плазмид последовательности терминации, ассоциированные с данными генами, также лигируют в экспрессирующий вектор в 3'-направлении от последовательности, которую требуется экспрессировать, для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.

Другие промоторы, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, контролируемой условиями роста, включают в себя промоторную область алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, ассоциированных с метаболизмом азота, и указанной выше глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящими являются любые плазмидные векторы, содержащие совместимые с дрожжами промоторы, точку начала репликации и последовательности терминации.

В дополнение к микроорганизмам в качестве хозяев также могут применяться культуры клеток, происходящих из многоклеточных организмов. В принципе любые такие клеточные культуры могут работать, происходят ли они из позвоночных или из беспозвоночных. Однако наиболее интересными являются клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культура ткани) в последние годы стало рутинной процедурой (Пккие Си1!иге, 1973). Примерами таких подходящих клеток линий хозяина являются клетки УЕКО и НеЬа, линии клеток яичников китайского хомячка (СНО) и клетки А138, ВНК, СОЗ-7 293, Зробор!ета Ггнд|регба (ЗЕ) (коммерчески доступные в виде полных экспрессирующих систем, среди прочих, от Рто!ет Заеисек, 1000 Векеатсй Ратк^ау, Мейбеп, СТ 06450, США, и от 1пуЦгодеп) линии клеток МОСК. По настоящему изобретению особенно предпочтительной клеточной линией является клеточная линия насекомых З2, доступная от 1№Йтодеи, РО Вох 2312,9704 СН Отошидеп, Нидерланды.

Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают в себя (если необходимо) точку начала репликации, промотор, локализованный перед подлежащим экспрессии геном вместе с какими-либо необходимыми участками связывания рибосомы, участками сплайсинга РНК, участком полиаденилирования и последовательностями терминации транскрипции.

Для применения в клетках млекопитающих функции контроля экспрессирующих векторов часто предоставляются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы происходят из

- 23 007810 полиомавируса, аденовируса 2. и чаще всего. из обезьяньего вируса 40 (8У40) или цитомегаловируса (СМУ). Ранний и поздний промоторы вируса 8У40 особенно применимы. поскольку оба получены просто из вируса в качестве фрагмента. который также содержит точку начала репликации вируса 8У40 (Είегк е! а1.. 1978). Также могут использоваться меньшие или большие фрагменты 8У40 при обеспечении того. что будет включена последовательность длиной примерно 250 н.п., простирающаяся от участка НшбШ до участка ВдИ. локализованного в точке начала репликации вируса. Кроме того. также возможно. и часто желательно использовать промотор или последовательности контроля. в норме ассоциированные с требуемой генной последовательностью при обеспечении того. что такие последовательности контроля совместимы с системами клетки хозяина.

Точка начала репликации может предоставляться конструированием вектора. чтобы он содержал экзогенную точку начала репликации. такую как происходящая из 8У40 или другого вируса (например. полиомавирус, аденовирус. У8У. ВРУ). или может предоставляться механизмом хромосомной репликации клетки хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клетки хозяина. последнего часто бывает достаточно.

Пример 1. Создание новых 4 конструкций мономера ГЕ5 с двумя эпитопами (Р2+Р30)

ГЕ5 является антипараллельным гомодимером. в котором С концы и Ν концы мономеров расположены в молекуле вплотную друг к другу. Это дает возможность связать два мономера в одну молекулу. весьма подобную четвертичной структуре димера дикого типа.

Авторами изобретения предложен подход. который использует либо эпитопы р2/Р30 в качестве линкера. либо вставку диглицинового линкера как описано ранее у Ь1 е! а1. 1997, ΡΝΑ8 И8А 94 (13): 6694-9.

Использованную во всей исследовательской работе молекулу ДНК. кодирующую природный ЫЬ5. приобретали в К & Ό ууЧепъ (ВВС16). Данная ДНК последовательность не включала в себя лидирующую последовательность ЫЕ5; поэтому добавляли синтетическую последовательность ДНК. кодирующую природный лидирующий пептид. Последовательности. кодирующие эпитопы Т-клеток Р2 и Р30 получали из столбнячного анатоксина. Данные последовательности встраивали в природную последовательность гена. предоставляя. таким образом. иммуногенные варианты ГЕ5. Вставки выполняют. сохраняя рамку считывания в гене ГЕ5.

Стратегия клонирования для получения вариантов основана на удлинении праймера или фрагментов ДНК с перекрыванием последовательности. Сперва два набора праймеров с комплементарными 5' концами. составляющими вставку. удлиняют в двух отдельных реакциях РСК. используя молекулу ДНК Кб те! в качестве матрицы и праймер фланкирующего вектора. После этого данные двойные нитевидные фрагменты. которые также. соответственно. имеют дополнительные 5'-концы, отжигают и удлиняют для того. чтобы включить полную вставку во вторую РСК. В заключение. фрагмент амплифицируют при помощи фланкирующих праймеров. Данные вставки затем расщепляют соответствующими эндонуклеазами. как и вектор. и вектор и вставки лигируют совместно. Данная процедура является модификацией процедуры «соединения посредством перекрывающего продления». описанной Нойои е! а1. 1989 и приведенной в Сштеи! ргоФсок ίη то1еси1аг Ью1оду (рр. 8.5. 7-9) 'ΊηΙΐΌάιιοΙίοη о£ а ροίηΐ ιηιιίαΐίοη Ьу 5ес.|иепЦа1 РСК ЧерУ Аи§аЬе1 е! а1.

Стандартные молекулярно-биологические способы и такие манипуляции с ДНК. как расщепление ферментами рестрикции. электрофорез в агарозном геле. выращивание и хранение клеток Е. со11 проводили с использованием стандартных молекулярно-биологических способов. описанных в лабораторном руководстве 8атЬгоок, ί.. Ег115сЬ. ЕЕ. & Машайк, Τ. 1989 и с использованием стандартных протоколов М & Е.

Пример 2. ЫЬ5.34 и ЫЬ5.35

Для того. чтобы получить эпитопы Т-клеток внутри молекулы. Р2 и Р30 встраивают началом к концу в качестве линкера между двумя мономерами ГЕ5. получая. таким образом. две конструкции ЫЕ5-Р30Р2-ЫЬ5 (ЫЬ5.34, зрелый пептид в 8Еф ГО Ν0: 5 и 6) и ЫЕ5-Р2-Р30-ЫЬ5 (ЫЬ5.35, зрелый пептид в 8Еф ГО Ν0: 7 и 8): обе конструкции ДНК кодируют лидирующую последовательность природного ГО5. приводя в результате к зрелому продукту экспрессии из 266 аминокислот. Продукты трансляции. получающиеся в результате данных конструирований. как подразумевают. сворачиваются в «мономерный димер ^5. то есть мономерную молекулу. которая имеет третичную структуру. которая очень сильно похожа на полную трехмерную структуру димерного ГО5.

Пример 3. ЫЕ5.36 & МЬ5.37

На основе предыдущих успешных поколений биологически активной мономерной «имитации димера ГО5» посредством вставки диглицинового линкера по ί. Ь1 е! а1. были сконструированы похожие. но иммуногенные конструкции с дополнительными эпитопами Т-клеток. Таким образом. вариант ЫЕ5.36 имеет структуру зрелого пептида в 8Еф ГО Ν0: 9 и 10 и вариант ЫЕ5.37 имеет структуру зрелого пептида в 8ЕО ГО Ν0: 11 и 12. Обе данные конструкции кодируются лидирующей последовательностью природного ГО5. за которой следуют первые 4 аминокислоты в Κά. за которыми. в свою очередь. следует первый встроенный эпитоп; другой эпитоп расположен на С-конце.

- 24 007810

Существует 2 основные причины, по которым Ν-концевой эпитоп не располагается на Ν-конце полной последовательности ГБ5 в этих двух конструкциях вместо того, чтобы стремиться сохранить последовательность ЫЬ5. Используя лидирующий пептид природного ЫЬ5 совместно с Ν-концом ЫЬ5, авторы изобретения гарантируют, что лидирующий пептид будет отщепляться правильно. И, поскольку Ν-конец в ГБ5 составляет подвижную область, он не важен для сохранения трехмерной структуры, полученной в результате конструкции.

Продукты трансляции, полученные в результате данных конструирований, по-видимому, сворачиваются в «мономерный димер ГО5», как описано в примере 2.

Пример 4. Уровни экспрессии

Описанные выше аналоги ГБ5 человека встраивали в множественные вектора, используемые для конструкций, вакцинации ДНК и рекомбинантной экспрессии в клетках насекомых, млекопитающих или Е. со11 с использованием стандартных способов для данной области.

Главным образом, используя стандартные экспрессионные системы и протоколы для клеток СО8 (преходящая экспрессия) и для клеток 82, было обнаружено, что уровни экспрессии были даже лучше, чем уровни экспрессии, полученные для конструкций, кодирующих белок ГБ5 дикого типа, и уровни экспрессии также превышали уровни экспрессии, полученные при экспрессии вариантов ЫЬ5, описанных в АО 00/65058.

Пример 5. Индукция перекрестно взаимодействующих антител против ГБ5

Описываемые в данный момент аналоги ГБ5 человека использовали в стандартных протоколах иммунизации мышей. Вкратце, мышей иммунизировали описанными выше вариантами из примеров 2 и 3. Мышиные антитела против ЫЬ5 выделяли посредством иммуноаффинной хроматографии и их активность против ЫЬ5 сравнивали с активностью мышиных антител, полученных против ЫЬ5 дикого типа. Результаты указывают на то, что антитела имели более высокий титр и также более высокую аффинность, чем антитела против аналогов, описанных в АО 00/65058.

Предварительные результаты также показали, что имитации мультимера по настоящему изобретению сохраняли, по крайней мере, некоторую специфическую активность ГБ5.

Пример 6. Получение вариантов ΤΝΕα

Синтетическая последовательность ДНК «8ΜΤΝΕΑΤ3» (8ЕО ГО NО: 16), кодирующая полипептид мономера ΤΝΕα человека дикого типа (8ЕО ГО NО: 17), получали в качестве продукта лигирования в Еп1с1ес1юп СтЬН. Последовательность ДНК человеческого ΙιΤΝΕα оптимизировали для экспрессии в Е. со11 согласно Со4оп Икаде Эа1аЬаке посредством удаления всех кодонов с частотой менее чем 10% для Е. со11. Далее последовательность конструировали так, чтобы включить участок рестрикции для последующих стадий клонирования.

Продукт лигирования 8ΜΤΝΕΑΤ3 вводили в вектор ТОРО В1ип1 рСВ 4, и были трансформированы клетки ΌΗ10Β Е. со11. ДНК плазмиды от 10 получившихся в результате клонов 8ΜΤNΕАΤ3ΤОΡО очищали, и выбирали пять клонов, содержащих необходимый фрагмент (при анализе путем расщепления ферментами рестрикции (ВЕ)).

Фрагменты ДНК КсоЕЕсоШ из пяти потенциально правильных клонов 8ΜΤNΕАΤ3ΤОΡО выделяли и переносили в вектор рЕТ28Ь (+) и определяли их последовательность. Вставки, делеции или замены определяли в четырех клонах, поскольку один клон, по-видимому, являлся правильным. Правильную конструкцию 8ΜΤΝΕΑΤ3ρΕΤ28 впоследствии использовали в качестве матрицы для получения всех единичных вариантов ΤΝΕα.

Пример 7. Конструкция ΤΝΕ34

Аминокислотную последовательность эпитопа РаиЭВ (8Е() ΙΌ ХОк: 7 и 20) вручную «обратно транслировали» в последовательность ДНК (8ЕО ГО NО: 19), оптимизированную для экспрессии в Е. со11, см. ниже, и встраивали в петлю 3 ΤΝΕα посредством 8ОЕ-РСВ.

Полученную в результате конструкцию (последовательность ДНК, кодирующую 8ЕО ГО NО: 18) помещали в вектор рЕТ28Ь+ для того, чтобы получить ΤNΕ34-ρΕΤ28Ь+.

Пример 8. Мономеризованная конструкция тримера

Мономеризованная конструкция тримера основана на 3 областях, кодирующих ΤΝΕα, разделенных или триглициновым линкером и/или областью, кодирующей эпитоп.

Ген ΤΝΕ-α синтезировали как три отдельные части. Три фрагмента собирали посредством 8ОЕРСВ, и собранный ген (8ЕО ГО ЫО: 21) клонировали в рСВ2.1-ТОРО. После подтверждения последовательности выделяли правильный клон. Ген 1ΤΝΕΤ_0 депе (8ЕО ГО ИО: 21, кодирующая ΤΝΕα01γ61γ61γ-ΤΝΕα-61γ61γ01γ-ΤΝΕα, 8ЕО ГО МО : 22, то есть 3 копии 8ЕО ГО МО : 17, разделенные двумя триглициновыми линкерами) затем переносили в рЕТ28Ь+ для того, чтобы получить ЬΤNΕΤ_0-ρΕΤ28Ь+. Выделяли правильный клон, последовательность подтверждали и трансформировали в линии Е. со11 ΒΕ21-8ΤΆΒ, ВЬ21-О0ЕО и НМ8174.

ΗΤNΕΤ_0-ρΕΤ28Ь+ использовали в качестве матрицы для того, чтобы получить следующие четыре мономеризованных варианта тримера: 1ΤΝΕΤ_1, 1ιΤΝΕΤ_2. 1ΤΝΕΤ_3 и 1ιΤΝΕΤ_4 (8ЕО ГО МО: 49, 51, 57 и

- 25 007810

59) посредством 80Е-РСК. Дальнейший вариант (8Еф ГО N0: 53) может быть получен подобным образом.

ΕΤΝΡΤ_1, 1ιΤΝΡΤ_2 и 1ιΤΝΡΤ_3 являются вариантами, включающими в себя эпитопы столбнячного анатоксина Р2 и Р30 (8Еф ГО N0: 3 и 5, соответственно), которые необходимо собирать посредством двух циклов 80Е-РСК. НТ№Т_4 представляет собой вариант со вставкой ΡΑΌΚΕ (8Еф ГО N0 : 7) и может быть собрана посредством одного цикла 8ОЕ РСК. Дальнейший вариант (8Еф ГО N0: 55) может быть получен подобным образом.

ЕТ№Т_4 конструировали посредством описанных выше способов, и в 10 клетках ТОР были обнаружены правильные клоны 11Т№Т_4-рЕТ28Ь+, и конструкцию переносили в клетки ВЬ21-8ТАК и НМ8174.

Для того, чтобы получить МКРТД ЬТ№Т_2 и ЬТ№Т_3 эпитопы встраивали посредством 80ЕРСК в очень маленький фрагмент тримера, который встраивали в ЬТ№Т_0-рЕТ28Ь+ посредством разрезания КЕ и лигирования.

Пример 9. Стабилизация мутантов Т№34

Для дальнейшей стабилизации описанного выше варианта Т№34-рЕТ28Ь+, были сконструированы варианты содержащие включение дополнительного дисульфидного моста, а также мутантную делецию. Были сконструированы 3 различных варианта:

Т№34-А-рЕТ28Ь+, содержащий замены О67С и А111 С, ΤNΡ34-В-рЕТ28Ь+. содержащий А96С и П18С и Т№34-С-рЕТ28Ь+, который содержит делению, в большинстве случаев, 8 ^концевых аминокислот; последовательности аминокислот продуктов экспрессии указаны в 8Еф ГО N0: 20, 30, и 31.

Все 3 конструкции были сделаны при помощи 80Е-РСК и клонированы в ВЕ21-8ТАК, ВЕ21-С0ЕЭ и НМ8174, что сопровождалось подтверждением последовательности.

Пример 10. Варианты гибких петель

Для того, чтобы обнаружить вариант, который мог бы проявлять улучшенные характеристики по сравнению с вариантом Т№34-рЕТ28Ь+, были сделаны конструкции, где вставку РАОКЕ (8Еф ГО N0: 7) перемещали в гибкую петлю 3 молекулы Т№-«.

Все из них: Т№35-рЕТ28Ь+, Т№36-рЕТ28Ь+, Т№37-рЕТ28Ь+, ΤNΡ38-ρЕΤ28Ь+. Т№39-рЕТ28Ь+ и вариант с РАОКЕ, расположенной на С конце молекулы; Т№С2-рЕТ28Ь+ были сделаны при помощи способа 80Е-РСК и были клонированы в ВЬ21-8ТАК, ВЕ21-С0ЕЭ и НМ8174, что сопровождалось подтверждением последовательности. Последовательности аминокислот продуктов экспрессии указанны в 8Е6) ГО N0: 23, 24, 24,26, 27 и 28.

Также для того, чтобы оценить возможность использования клеток насекомых в качестве экспрессионной системы, ТЖ\УТ, Т№34, Т№35, Т№36, Т№37, Т№38, Т№39 и Т№С2 переносили в вектор ρ2Ζορ2ί (ср. фиг. 1) и экспрессировали в клетки насекомых 82.

Пример 11. Другие конструкции

Было приготовлено большое количество дальнейших вариантов Τ№α, все названы Т+Х, ср. выше. ДНК, кодирующую данные варианты, получили при помощи 80Е-РСК и клонировали непосредственно в рЕТ28Ь+.

Правильные клоны Т>.Х трансформировали в ВЬ21-8ТАК и НМ8174 и последовательность впоследствии подтверждали.

Пример 12. Периплазматическая экспрессия

Лидирующую последовательность ЬТВ добавляли в Т№34-рЕТ28Ь+ непосредственно выше 8Еф ГО N0:16 для достижения экспрессии в периплазматическом пространстве.

Пример 13. Экспрессия у млекопитающих

Для того, чтобы проверить экспрессию в клетках млекопитающих, 8Еф ГО N0:16 и ДНК, кодирующую Т№34 переносили в вектор рНР 1, который является вариантом коммерчески доступного вектора ρί.Ί (Рготеда СогрогаНоп). рНР1 включает в себя ген устойчивости к канамицину в качестве маркера вместо гена АтрК в рСТ

Пример 14. Совместная экспрессия СгоЕЬ и СгоЕ8

Экспрессия комплекса шаперонов в Е. со16 СгоЕЬ/Е8, как раннее было описано, увеличивает экспрессию растворимых мутантов ΊΉΡα (1еопд, е! а1 1997, Вю1есйпо1оду 1еиег5, уоС 19, по., 6 р. 579582). Для того, чтобы проверить может ли совместная экспрессия СгоЕЬ/Е8 улучшить экспрессию вариантов Т№г, как описано здесь, использовали плазмиду, содержащую оперон СгоЕЬ/Е8 из Е. сой под контролем его природного промотора. Данную плазмиду совместно трансформировали в НМ8174 вместе с ДНК, кодирующей либо \у1ТЖа, либо Т№34, либо Т№37. Двойные трансформанты отбирали, помещая их на плашки, содержащие как канамицин, так и карбициллин, которые являются двумя подходящими маркерами селекции. Затем двойные трансформанты идентифицировали посредством анализа КЕ, для того, чтобы проверить наличие обеих плазмид в одном и том же самом клоне.

В предварительном эксперименте, клетки выращивали при температуре 37°С до 00600=0,6-1, после чего следовал тепловой шок в течение 30 мин при температуре 42°С. Контрольную фракцию клеток

- 26 007810 не подвергали тепловому шоку, и все клетки разбавляли 5 раз в среде ЙБ, содержащей 1 мМ ΓΡΤΟ, и выращивали при температуре 25°С.

Клетки собирали и оба супернатанта и лизаты анализировали на предмет экспрессии ΤΝΡα. Для того, чтобы оценить экспрессию СгоЕБ/Е8 проводили окрашивание кумасси.

В данном эксперименте никакого улучшения при добавлении шаперонов не наблюдали. Это произошло, главным образом, из-за того, что авторы изобретения получили почти 100% растворимого материала в данном эксперименте, даже в отсутствие шаперонов. Впрочем, авторы изобретения проверят улучшение для других вариантов по изобретению, если они окажутся менее растворимыми вариантами.

Пример 15. Экспрессия Е. сой

Экспрессию растворимых вариантов ΤΝΡα в трех различных штаммах Е. сой проверяли в лабораторных ферментерах, а также в колбах для встряхивания. Использованным оборудованием для ферментации являлась Ыоге йегтеШог 8у81еш с рабочим объемом 1 л. Тремя проверяемыми штаммами Е. сой являлись: НМ8174, БЕ21 8ΤΑΚ и ББ21 СОЙЭ. Среда, использованная для ферментации, представляла собой определенную минимальную среду с глюкозой в качестве единственного источника углерода.

Одна из основных задач заключалась в определении оптимальных параметров процесса ферментации (особенно температуры и концентрации ΣΡΤΟ) с тем, чтобы оптимизировать экспрессию растворимых вариантов ΤΝΡα.

Параметры процесса:

Параметр Устанавливаемое Диапазон Рабочий предел значение

рН	7,0	6,5-7,5	<6,4-7,6
Начальная	37°С	36-38°С	<36->38°С
температура Температура	25°С	24-26°С	<24->26°С
индукции Давление ϋθ2	30%	0-100%	>90% в течение более 4 часов
мешалка	1000 об./мин.	1000-1500	-

Было обнаружено, что одной подходящей схемой являлась следующая схема: концентрация ΓΡΤΟ равнятся 0,5 мМ и температура при индукции снижается до 25°С. Общее время ферментации находится в пределах от 14 до 18 ч, включая сюда размножение, индукцию и продукцию белка. Общее время ферментации зависит от роста культуры. Начальная ΘΌ600 в ферментере находится обычно в пределах между 0,1-0,3 (2-6 в предварительной культуре), как рассчитано из ΘΌ в культуре инокуляции. Индукцию культуры проводили при ΘΌ600=20±1-2 или с девяти до одиннадцати часов после инокуляции. Продукция белка затем происходит в течение от трех до пяти часов.

Альтернативно: экспрессию вариантов ΤΝΡ-α проводят, воспользовавшись низкотемпературной культурой для того, чтобы избежать внутриклеточной преципитации белков вариантов с тельцами включения. Рост культуры до необходимой ΘΌ осуществляют при той же температуре, что и для действительной индукции для того, чтобы избежать «шока» для клеток при изменении температуры от оптимальной температуры для роста (37°С) до более низкой температуры индукции (25°С). Используя данный метод, полагают, что единственным воздействием, применяемым к клеткам, является действительная индукция посредством ΣΡΤΟ; во всяком случае, этот способ недавно обеспечил значительно улучшенный выход растворимого продукта экспрессии. Создавая небольшие культуры в течение ночи и приготавливая более 1 л среды ЙБ заблаговременно за день, образование материала в больших культурах ББ можно провести приблизительно за 9 ч, в то время как период действительной индукции проходит за ночь (через 16-20 ч). Следовательно, предпочтительный способ можно описать как нижеследующий: экспрессию варианта ΤΝΡα проводят в 2x2 л колбах для встряхивания с перегородками, содержащих 1 л среды ББ, каждая с единственной модификацией вышеуказанного способа, заключающейся в том, что клетки (ББ21 8ΤΑΚ) выращивают при температуре 25°С до ΟΌ₄₃₆ 0,7, после чего клетки индуцируют 1 мМ ФБС и позволяют продуцировать белок в течение 20 ч (все еще при температуре 25°С).

Пример 16. Селекционные анализы

Прямой ЕБКА рецептора совместно с поликлональным ЕЙ18А и цитотоксический анализ с клетками ΚΌ-4 и ^ей1 использовали в качестве анализов первой очереди для скрининга и последующей очистки. Антитела, полученные против вариантов ΤΝΡα, использовали для ингибирования связывания νΐΤΝΡα как с рецептором, так и при цитотоксическом анализе, для того, чтобы охарактеризовать качество антитела.

Пример 17. Процедуры очистки

В данном примере подробно описана рекомбинантная продукция и последующая очистка одного из вариантов ΤΝΡα (ΤΝΕ37). Однако процедура очистки является предпочтительной согласно настоящему

- 27 007810 изобретению и будет также применима (с небольшими поправками, соответствующими каждому варианту) для других вариантов ΤΝΡα по настоящему изобретению.

Колонию ΤΝΡ37 штамма ВЬ21 8ΤΑΚ Е. сой из плашки с ЬВ и канамицином (60 мг канамицина/л среды ЬВ, содержащей 1,5% агар) ресуспендируют в 5 мл среды ЬВ (60 мг канамицина/л ЬВ) и выращивают в течение ночи (16 ч) при температуре 37°С, встряхивая с 220 об./мин на шейкере №\ν Вгаигютюк.

2x2 мл данной культуры переносят к 2x1 л ЬВ (60 мг канамицина/л) в колбы для встряхивания с перегородками объемом 2 л и на шейкере №\ν Вгаипотюк при 220 об./мин позволяли клеткам расти до 0Ό43₆=0,6-0,8. Данную стадию выполняли при типовых температурах 37 и 25°С, но температуру можно оптимизировать для каждой культуры.

мл 1М ΓΡΤΟ добавляют в каждую колбу и позволяют клеткам расти в течение 16-20 ч. Перед индукцией температура корректировалась до 25°С, если она уже не являлась температурой ферментации.

Клетки собирают в пробирки для центрифуги (500 мл) посредством центрифугирования при 5000 об./мин. в течение 15 мин, используя насадку 8ЙА-3000 в центрифуге 8огуа11.

Клетки переносят в одну предварительно взвешенную пробирку для центрифуги объемом 500 мл, используя 0,9% №С1, и собирают клетки посредством центрифугирования как и ранее.

Супернатант убирают, и пробирку взвешивают для того, чтобы определить клеточный вес (должно быть 7-11 г).

Добавляют 200 мл 50 мМ №₂ΗΡ0₄, рН=7,0 (если клетки ресуспендируют, их следует использовать сразу же, в ином случае возможно замораживание).

Разрушение клеток, центрифугирование и фильтрация

Механическое разрушение клеток обеспечивает несколько преимуществ над ферментативным разрушением с точки зрения эффективности, надежности и возможности выбора любого буфера, необходимого для последующих стадий очистки. АРУ-1000 содержат холодным во время работы, добавляя ледяную воду в ячейку для образца до использования и пропуская ледяную воду через устройство между двумя пассажами образца. Центрифугирование и фильтрация служат для удаления любых частиц или агрегатов из раствора перед хроматографическим разделением белков. Разрушение клеток и НАхроматографию следует проводить в тот же день, так как это может минимизировать вероятную протеазную активность как следствие отделения их на хроматографической стадии. Процедура разрушения, центрифугирования и фильтрации осуществляется следующим образом:

Тщательно ресуспендированный клеточный материал переносят в устройство для разрушения клеток (АРУ-1000). Суспензию клеток тщательно пропускают 2х через устройство для разрушения клеток (охлаждая на льду после каждого пассажа и пропуская ледяную воду через АРУ-1000 между пассажами), используя 700 бар обратного фильтрационного давления (раствор должен быть чистым на этом этапе).

Разрушенные клетки переносят в пробирки для цетрифугирования объемом 500 мл, и клетки крутят в течение 45 мин при 10000 об./мин на центрифуге 8о1ха11, используя насадку 8ЙА-3000.

Экстракт (приблизительно 225 мл) пропускают через фильтр 0,22 мкм.

Гидроксиапатитная (НА) хроматография

Гидроксиапатитный гель В|о-Се1 ΗΤΡ (ВЮ-КАЛ; № по каталогу 130-0420) является кристаллической формой фосфата кальция, доказавшей себя в качестве уникального средства в разделении таких белков, как моноклональные антитела и других белков, иначе не способных разделиться посредством других способов. Тем не менее, по опыту авторов изобретения реологические свойства материала, до некоторой степени, являются критичными в том смысле, что поток более чем 2 мл/мин увеличивает давление до неприемлемо высокого уровня. Также материал несколько раз разрушался, если совершались попытки восстановления гидроксидом натрия, как рекомендовано производителем.

Буферы и колонка

Маточный раствор для буфера А+В: 1М Ν₂ΗΡ0₄χ2Η₂0, рН=7,0 (рН доводится до 7 при помощи НС1). Буферы А+В приготавливают разбавлением маточного раствора.

Буфер А: 50 мМ №₂ΗΡ0₄χ2Η₂0, ρΗ=7,0

Буфер В: 0,3М №₂ΗΡ0₄χ2Η₂0, ρΗ=7,0

Колонка, заполненная приблизительно до 50-60 мл гидроксиапатитным гелем В|о-Се1 ΗΤΡ (ВЮΚΛΌ; № по каталогу 130-0420) с использованием суспензии в буфере А, и колонка ХК 26/40 (Атегкйат Вю8с1епсе8).

Программа хроматографии

Очистить систему 20 мл при потоке 30 мл/мин.

Уравновешивание: 4 СУ буфера А при потоке 2 мл/мин

Загрузить образец через насос (входной канал Ρ в ВюСаб) (приблизительно 225+5-10 мл, если необходимо заполнение трубок образцом) при потоке 2 мл/мин.

Промыть колонку 1,5 СУ буфера А при потоке 2 мл/мин.

Элюирование: Элюировать белок с градиентом 4 СУ от 0 до 100% буфера В при потоке 2 мл/мин.

Очистить колонку 2 СУ буфера В при потоке 2 мл/мин.

Повторное уравновешивание 4 СУ буфера А при потоке 2 мл/мин.

- 28 007810

Выбрать фракции, объединить и диализировать при температуре 4°С против 15х объем 20 мМ ΤπδНС1, 0,075М №С1, рН 8,0.

Выбор фракций, содержащих ΤΝΡ37, после НА-хроматографии

НА-хроматографический профиль фракции элюирования в основном состоит из «проходящей» фракции и одного элюированного пика, который можно разделить на несколько пиков. Фракцию, содержащую ΤΝΡ37, необходимо выбирать на основе окрашенного кумасси геля полного пика, так как пик, содержащий ΤΝΡ37, прямо не опознается. Тем не менее, как результат последующих стадий очистки, выбор фракций на данном этапе является менее критичным, и возможно удаление загрязняющих веществ позднее по процедуре. Таким образом, менее консервативный выбор фракций обеспечивает максимальный выход варианта.

Первоначально «проходящую» фракцию проверяли при помощи «дот-блота» на наличие какоголибо ΤΝΡ37. Это дало положительный результат, который теоретически следует указывать, что значительная часть варианта не связалась с колонкой. Тем не менее, если подвергнуть «проходящую» фракцию очень эффективной катионобменной хроматографии на 8Р-сефарозе (ср. со следующей стадией), и фракции анализировать при помощи окрашенных кумасси гелей, то они не содержат какого-либо определяемого варианта ΤΝΡ37, указывая на некоторую ложноположительную реакцию в «дот-блоте» или на фракцию варианта, которая связывается совершенно по-другому с 8Р-сефарозой.

Катионобменная хроматография на 8Р-сефарозе

8Р-сефароза является основной катионобменной стадией, выбранной как следствие довольно высокого расчитанного рI 9,4 варианта по сравнению с рI 7,8 для \\1ΤΝΡα. Данное увеличение рI является следствием 2 лизинов, введенных посредсвом эпитопа РЛЭКЕ. Данная хроматография является очень эффективной и быстрой для варианта ΤΝΡ37, и , как ожидают, является пригодной для большого количества других вариантов петель ΤΝΡα.

Наносимый образец должен иметь меньшую проводимость, чем 8 мС/см и рН должно быть по крайней мере 7,7 до возобновления хроматографии на 8Р-сефарозе, поскольку варьирование этого, по опыту авторов изобретения, время от времени делало свойства связывания белка различными.

Буферы и колонка

Маточный раствор для буфера А+В: 1М Τπδ-ΗΟ. рН=8,0.

Буфер А: 20 мМ ΤτΕ-ΗΟ, 0,075М №С1, рН=8,0.

Буфер В: 20 мМ Τήδ-Ηα, 1М №С1, рН=8,0.

Колонка, заполненная приблизительно 60 мл РР 8Р-сефарозой (Лтегайат Вюкшеисек; № по каталогу: 17-0729-01)) с использованием суспензии в буфере А и колонка ХК 26/40 (Лтегайат Вю8с1еисе8) .

Программа хроматографии

Очистить систему 20 мл при потоке 30 мл/мин. Уравновешивание: 4 СУ буфера А при потоке 4 мл/мин. Загрузить образец через насос (входной канал Р в ВюСаб) (образец + 10 мл, если необходимо заполнение трубок образцом) при потоке 4 мл/мин.

Промыть колонку 1,5 СУ буфера А при потоке 4 мл/мин. Элюирование: Элюировать белок с градиентом 4 СУ от 0 до 100% буфера В при потоке 4 мл/мин.

Очистить колонку 2 СУ буфера В при потоке 4 мл/мин. Повторное уравновешивание 4 СУ буфера А при потоке 4 мл/мин.

Выбрать фракции, объединить и диализировать при температуре 4°С против 15х объем 20 мМ ΤπδНС1, 0,075М №С1, рН 8,0.

Выбор фракций, содержащих ΤΝΡ37, после хроматографии на 8Р-сефарозе

Профиль в основном состоит из «проходящей» фракции и нескольких пиков, содержащих белки. Однако два пика содержат варианты с некоторыми загрязняющими веществами. На данном этапе важно не включать слишком много фракций с правой стороны пика два, поскольку он по опыту авторов изобретения включает в себя слишком много загрязняющих веществ, которые не удаляются легко в последующих хроматографических стадиях.

Анионобменная хроматография на О-сефарозе

Анионобменная хроматография на О-сефарозе является основной анионобменной стадией, выбранной для удаления основных загрязняющих белков, которые с высокой воспроизводимостью сопровождают очистку ΤΝΡ37, включая НА-хроматографию и хроматографию на 8Р-сефарозе. Сам вариант ΤΝΡ37 не связывается с колонкой, но основные неизвестные загрязняющие вещества связываются. Тем не менее, возможно выбрать фракции консервативным образом уже на стадии 8Р-сефарозы, избегая таким способом загрязнения. Тем не менее, это ухудшает выход варианта ΤΝΡ37 по сравнению с тем, когда по процедуре используется О-сефароза, и так как другие минорные загрязнения также удаляются на данной стадии, предпочтительно включать его в общую процедуру. В заключение, стадия О-сефарозы важна для очистки варианта 37 и дает даже лучший конечный продукт с высоким выходом.

Буферы и колонка

Маточный раствор для буферов А+В: 1М 'Ггк-НС!. рН=8,0.

Буфер А: 20 мМ ^-НС! 0,075М №С1, рН=8,0.

- 29 007810

Буфер В: 20 мМ 1лз-НС1, 1М №С1, рН=8,0.

Колонка, заполненная приблизительно 50-60 мл ЕЕ Р-сефарозой (Атегзйат Вюзыепсез; № по каталогу: 17-0510-01) с использованием суспензии в буфере А и колонка ХК 26/40 (Атегзйат В1озс1епсез).

Программа хроматографии

Очистить систему 20 мл при потоке 30 мл/мин.

Уравновешивание: 4 СУ буфера А при потоке 4 мл/мин.

Загрузить образец через насос (входной канал Е в ВюСаб) (образец + 10 мл, если необходимо заполнение трубок образцом) при потоке 2 мл/мин.

Промыть колонку 3 СУ буфера А при потоке 4 мл/мин.

Элюирование: Элюировать оставшийся белок 2 СУ 100% буфера В при потоке 4 мл/мин.

Повторное уравновешивание 4 СУ буфера А при потоке 4 мл/мин.

Выбрать фракции, объединить и нанести непрседственно на колонку с 8Р-сефарозой.

Профиль элюции в основном состоит из «проходящей» фракции и нескольких пиков, содержащих белок. Иногда «проходящую» фракцию можно разделить на несколько разрешенных пиков без примесей, все из которых содержат вариант Τ^ΑΊ и, следовательно, все объединяются. Данная гетерогенность 1^^37, вероятно, разрешится, когда разрешится проблема очевидной протеолитической деградации.

Пример 18. Исследования иммунизации

Материалы:

соль (0,9% №1С1 в стерильной воде, Егезепшз КаЫ №где А8, №г\\'ау);

полный адъювант Фрейнда (81дта, Е-5881,39Н8926); неполный адъювант Фрейнда (81дта, Е-5506,60К8937); алгидрогель 2% [10 мг А1/мл] (ВгепШад ВюзесЮг, Ва1с11 96 (3176)); адъюфос [5 мг А1/мл] (ВгепШад ВюзесЮг, Ва1с11 2 (8937));

человеческий ΤNЕ дикого типа Ппуйгодеп номер по каталогу: 10062-024).

КУМ-Ш4: предоставлен А. Меадег (А. Меадег, 1. 1ттипо1. Мебюбз 1991,144 : 141-143).

Клон 13 АЕН1 164: предоставлен Т. Езребк (Τ. Езребк апб 1. №ззеп-Муег, 1. 1ттипо1. Мебюбз 1986,95 : 99-105).

Соль тетразолия (МЕЗ, Се11111ег 96 Ациеоиз опе зо1и!юп; Рготеда, 63581).

Вращающаяся платформа (Ко1ат1х, Не!о, Эептагк)

Вортекс (0ЬЕ Э1СН шзйитеп1такегз Ар8, Эептагк)

Выбор композиции/адъюванта

Очищенные белковые варианты ΤΉΡα (в 20 мМ Ег1з-НС1, 0,075М №С1, рН 8,0) разбавляют до 0,5 мг/мл солью (0,9% №С1), группируют (375 мкг/ампулу) и хранят при температуре -20°С до использования при иммунизации.

Для каждого варианта !’№, иммунизации проводят с двумя адъювантами: 1) полный адъювант Фрейнда (СЕА, для первичной иммунизации) и неполный адъювант Фрейнда (ГЕА, для стимулирующей иммунизации) и 2) алгидрогель или адъюфос (в данной области адъюванты гидроксида алюминия и фосфата алюминия, соответственно): их используют как для первичной, так и для стимулирующей инъекций.

Перед первичной иммунизацией принимается решение о выборе либо алгидрогеля, либо адъюфоса в качестве адъюванта для варианта !’№. Для дальнейшего использования в эксперименте иммунизации выбирают адъювант с наилучшей способностью адсорбировать вариант 1^. Две аликвоты варианта ЮТа смешивают с равным количеством алгидрогеля и адъюфоса в двух ампулах. Содержимое ампулы аккуратно перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин на вращающейся платформе. Затем ампулы центрфугируют при 13000 д в течение 15 мин и супернатант проверяют на наличие растворимого варианта ΉΡ на градиентном (4-12%) δΌδ-геле. Аликвоту адъювант/вариант, содержащую по крайней мере три варианта (то есть, где больше вариантов связалось с алюминиевыми частицами) затем выбирали как наилучший адъювант.

Приготовление эмульгата антиген/адъювант:

Эмульгаты СЕА/ГЕА приготавливают посредством следующей процедуры:

Ампулы с вариантом Τ^α [0,5 мг/мл] размораживают, переносят в стерильную ампулу объемом 10 мл и смешивают с равным объемом СЕА или ГЕА. Содержимое ампулы затем перемешивают далее на вортексе при 3300 об./мин в течение 30 мин при температуре 20°С.

Эмульгаты алгидрогель/адъюфос приготавливают посредством следующей процедуры: алгидрогель/адъюфос разбавляют солью до 1,4 мг А1/мл.

Ампулы с вариантом Τ^α [0,5 мг/мл] размораживают, переносят в стерильную ампулу объемом 10 мл и смешивают с равным объемом алгидрогеля [1,4 мг А1/мл] или адъюфоса [1,4 мг А1/мл]. Ампулу затем мешают далее на вращающейся платформе в течение 30 мин при температуре 20°С.

Выбор модели животных

Самок мышей Ва1Ь/Са в возрасте шесть-восемь недель иммунизировали с повторениями вариантами ЮТи. Образцы крови собирают в разные интервалы, и выделенные сыворотки исследуют на титры

- 30 007810 антител против \\1ΤΝΕα. Мышей заказывают в Тасошс Еагтк, Шс. Лсс.|шге5 М & В А/8, Эептагк. До начала эксперимента мышей содержат в помещении для животных РБагтеха в течение одной недели.

Схема иммунизации и дозировка

Группы 10 + 10 мышей иммунизируют каждым вариантом ΤΝΕα с СЕА/ГЕА и алгидрогелем/адъюфосом, соответственно. 20 + 20 мышей используют для иммунизации ΤΝΕα дикого типа.

При первой иммунизации 50 мкг белка с адъювантом вводят подкожно. Все мыши получают дополнительную стимулирующую иммунизацию подкожно 25 мкг белка с адъювантом через 2, 6 и 10 недель после первой иммунизации.

Образцы крови собирали непосредственно перед первой иммунизацией и через 1 неделю после каждой стимулирующей иммунизации.

Используемые анализы

Биологический анализ цитотоксичности с использованием клеток клона 13 ХУЕШ 164 или клеток КУМ-Ш4: данный анализ используют для того, чтобы определить токсичность вариантов ΤΝΕα по изобретению. Клетки культивируют в течение 48 ч в присутствии титруемых количеств вариантов ΤΝΕα, и гибель клеток определяли посредством добавления соли тетразолия (ΜΤ8), которая биодеградирует в живых клетках с образованием окрашенного продукта формазана. Цитотоксичность вариантов ΤΝΕα сравнивают с цитотоксичностью человеческого ΤΝΕα дикого типа.

Биологический анализ ингибирования цитотоксичности с использованием клеток клона 13 ХУЕШ 164 или клеток КУМ-Ш4: данный анализ используют для того, чтобы исследовать способность антисывороток, полученных у иммунизированных ΤΝΕα мышей, нейтрализовать цитотоксический эффект ΤΝΕα дикого типа. Клетки культивируют в течение 48 ч с титруемыми количествами антисывороток и постоянной концентрацией человеческого ΤΝΕα дикого типа, которая достаточна для индукции клеточной гибели у 50% клеток в отсутствие антисывороток. Клеточную гибель определяли посредством ΜΤ8, как описано выше. Нейтрализующую способность сывороток иммунизированных вариантом ΤΝΕα мышей сравнивают с сыворотками, полученными от мышей, иммунизированных человеческим ΤΝΕα дикого типа ΤΝΕα.

Исследования ίπ νίΙΐΌ

Биологический анализ цитотоксичности с использованием клеток клона 13 ХУЕШ 164 или клеток КУМ-Ш4: биологический анализ ингибирования цитотоксичности с использованием клеток клона 13 ХУЕШ 164 или клеток КУМ-Ш4.

Критерии выбора наилучших иммуногенных конструкций

Варианты ΤΝΕα должны проявлять минимальную цитотоксичность. Иммунизация мышей вариантами ΤΝΕα должна приводить к образованию антисывороток с лучшей или такой же способностью нейтрализовать цитотоксичность, опосредованную человеческим ΤΝΕα дикого типа, в клетках ХУЕШ или КУМ-Ш4, как сыворотки, полученные от мышей, иммунизированных человеческим ΤΝΕα дикого типа

- 31 007810

Список последовательностей <110> РЬагтеха А/3 <120> НОВЫЕ ИММУНОГЕННЫЕ МИМЕТИКИ МУЛЬТИМЕРНЫХ БЕЛКОВ <130> Ρ1013ϋΚ00 <160> 60 , <170> РаЬепЫп νβΓ3Ϊοη 3.1 <210> 1 <211>115 <212> Белок <213> Ьото зархепз <400>1

11е 1

Рго ТЬг

С1и

11е 5

Рго ТЬг

Зег

А1а Ьеи Уа1 10

Ьуз

С1и ТЬг Ьеи 15

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

Нхз

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

11е

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

О А

О с

□ А

V

V

11е

Рго

Уа1

Рго

Уа1

Нхз

Ьуз

Аз η

Η13

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

Не

35

40

45

РЬе

С1п

С1у

11е

С1у

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

С1у

ТЬг

50

55

60

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Аз η

Ьеи

Зег

Ьеи

11е

Ьуз

Ьуз

Туг

11е

Азр

65

70

75

8 θ’

61у

С1П

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

С1п

РЬе

85

90

95

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

61п

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

МеЕ

Азп

ТЬг

С1и

Тгр

Не

100

105

110

Не С1и Зег

115 <210> 2 <211>45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина

- 32 007810 <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(45) <223>

<400>2 сад Рас аЪс ааа дек аас Ьсс ааа ЬЬс акс ддс акс асе даа сЬд45

О1п Туг Не Ьуз А1а Азп Зег Ьуз РЬе 11е С1у 11е ТЬг С1и Ьеи 15 1015 <210>3 <211>15 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <400> 3

С1п Туг 11е Ьуз А1а Азп Зег Ьуз РЬе 11е С1у 11е ТЬг С1и Ьеи

1	5	10
<210>	4
<211>	63
<212>	днк
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Эпитоп РЗО столбнячного	анатоксина
<220>
<221>	СОЗ
<222>	(1)··(63)
<223>
<400>	4

ЪЪс аас РЬе Азп 1

аас Азп

Ьёс асе дЬР

Ьсс ЬЬс Рдд сЬд сде дЬЪ

сса ааа д+Ь Ьсс

48

РЬе

ТЬг 5

Уа1

Зег РЬе Тгр

Ьеи 10

Агд Уа1

Рго

Ьуз

Уа1 Зег 15

дсЬ

Рсс

сас

сЬд

даа

63

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

20

<210> 5 <211> 21 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина <400> 5

- 33 007810

РЬе Азп Азп РЬе ТЬг Уа1 Зег РИе Тгр Ьеи Агд Уа1 Рго Ьуз Уа1 Зег
1	5	10	15
А1а Зег ΗΪ3	Ьеи 20	С1и
<210> 6 <211> 39 <212> ДНК

<213> Искусственная последовательность <220>

<223>	Связывающий	все	типы ΏΒ	пептид	(ΡΑϋΗΕ)
<220>
<221>	СОЗ
<222>	(1).	. (39)
<223>
<400>	6
дсс аад	ί+с	дкд дсс	дек	кдд	асе	скд	аад	дсс дса	дек	39
А1а Ьуз	РЬе	Уа1 А1а	А1а	Тгр	ТИг	Ьеи	Ьуз	А1а А1а	А1а
1		5					10

<210> 7 <211> 13 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Связывающий все типы ΌΚ пептид <400>7

А1а Ьуз РЬе Уа1 А1а А1а Тгр ТНг Ьеи Ьуз А1а А1а А1а 1510 <210> 8 <211>858 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные эпитопами РЗО и Р2 <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(855) <223>

<220>

<221> зрелый пептид <222> (58)..() <223>

- 34 007810 <220>

<221> сигнальный пептид <222> (1)..(57) <223>

<400> ι

В

акд МеЬ

адд Агд

акд Мек

си Ьеи

сЬд Ьеи -15

сак ΗΪ3

Нд Ьеи

адЕ Зег

Нд сЬд Ьеи Ьеи -10

дек А1а

сП Ьеи

дда 61 у

дек А1а

дсс А1а -5

Ьас Туг

48

дЕд

как

дсс

акс

ссс

аса

даа

аП

ссс

аса

адЬ

дса

Нд

дкд

ааа

дад

96

▼ 1 _

61и

УЙХ

±уг

л±а

ххё

гГО

1Ϊ1Ι

1зли

не

ГХ'О

гиг

оег

л±а

ьеи

νβχ

ьуз

-1

1

5

10

асе

ЬЬд

дса

скд

си

ЬсЕ

асЬ

саЪ

еда

аск

скд

сьд

ака

дсс

ааЪ

дад

144

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

11е

А1а

Азп

61и

15

20

25

аск

скд

адд

аЬЬ

ссЕ

дН

ссЕ

дЬа

саЬ

ааа

аак

сас

саа

скд

Еде

асЬ

192

ТЬг

Ьеи

Агд

11е

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

Азп

ΗΪ3

61п

Ьеи

Суз

ТЬг

30

35

40

45

даа

даа

аЬс

ΐζΐζΐζ

сад

дда

ака

ддс

аса

Ид

дад

адЬ

саа

асЬ

дЬд

саа

240

С1и

61и

11е

РЬе

С1п

61у

11е

61у

ТЬг

Ьеи

61и

Зег

61п

ТЬг

Уа1

61п

50

55

60

ддд

ддь

аск

дкд

даа

ада

ска

Нс

ааа

аас

Ид

Ьсс

На

ака

аад

ааа

288

С1у

61у

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

65

70

75

Еас

аЬЪ

дас

ддс

саа

ааа

ааа

аад

ЬдЬ

дда

даа

даа

ада

едд

ада

дка

336

Туг

Не

Азр

61у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

61у

61и

61и

Агд

Агд

Агд

Уа1

80

85

90

аас

саа

ЬЕс

ска

дас

Ьас

сЬд

саа

дад

НЕ

сП

ддь

дка

акд

аас

асе

384

Азп

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

61п

61и

РЬе

Ьеи

61у

Уа1

Мек

Азп

ТЬг

95

100

105

дад

Сдд

аЬа

ака

даа

адЬ

Нс

аас

аас

Нс

асе

дЬд

аде

Нс

кдд

скд

432

С1и

Тгр

11е

11е

61ц

Зег

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

110

115

120

125

сдс

д+д

ссС

аад

д^д

аде

дсс

аде

сас

скд

дад

сад

кас

акс

аад

дсс

480

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

61и

61п

Туг

11е

Ьуз

А1а

130

135

140

аас

Ьсс

аад

ЕЕс

акс

ддс

акс

асе

дад

сЬд

акс

ССС

аса

даа

аН

ССС

528

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

11е

ТЬг

01 и

Ьеи

Не

Рго

ТЬг

61и

11е

Рго

145

150

155

аса

адЬ

дса

Нд

дкд

ааа

дад

асе

Нд

дса

Нд

сП

ЬсЬ

аск

саЬ

еда

576

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

160

165

170

асЪ

сЬд

сЪд

ака

дсс

ааЬ

дад

асЬ

скд

адд

аП

сск

дН

сск

дка

сак

624

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

А1а

Азп

61и

ТЬг

Ьеи

Агд

11е

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

175

180

185

672

ааа ааЬ

сас саа

сЬд Ьдс

асЬ ТЬг

даа С1и

даа С1и

аЬс 11е

РЬе 200

сад дда

а£а 11е

ддс С1у

аса ТЬг 205

Ьуз 190

Азп

ΗΪ3

61п

Ьеи

Суз 195

С1п

С1у

сЬд

дад

а дБ

саа

асЪ

дЪд

саа

ддд

ддБ

асЬ

дЬд

даа

ада

сЬа

ЬЕс

ааа

720

Ьеи С1и Зег С1п ТЬг Уа1 61п С1у С1у ТЬг Уа1 С1и Агд Ьеи РЬе Ьуз 210 215 220 аас ЬЕд Ъсс ЬЬа аЬа аад ааа Бас аЬЬ дас ддс саа ааа ааа аад ЬдЕ Азп Ьеи Зег Ьеи Не Ьуз Ьуз Туг 11е Азр 61у С1п Ьуз Ьуз Ьуз Суз 225 230235

768

дда даа С1у С1и

даа С1и 240

ада Агд

сдд ада дка

аас саа ЬЕс сЬа дас Бас сЬд саа дад

816

Агд

Агд

Уа1

Азп С1п РЬе Ьеи Азр Туг Ьеи

61п

С1и

245

250

сЬЬ

ддЬ

дЪа

аЬд

аас

асе

дад

Ьдд

аЬа

аЬа

даа

адЕ

Ьда

858

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

МеЬ

Азп

ТЬг

С1и

Тгр

11е

11е

С1и

Зег

255 260 265 <210>9 <211>285 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные эпитопами РЗО и Р2 <400> 9

МеЪ

Агд МеЬ

Ьеи

Ьеи ΗΪ3 -15

Ьеи

Зег Ьеи Ьеи А1а Ьеи С1у А1а А1а

Туг

-10

-5

Уа1

Туг

А1а

11е

Рго

ТЬг

С1и

Не

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

-1

1

5

10

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

А1а

Азп

61и

15

20

25

ТЬг

Ьеи

Агд

11е

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

Азп

ΗΪ3

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

30

35

40

45

С1и

С1и

11е

РЬе

С1п

С1у

11е

61у

ТЬг

Ьеи

61и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

50

55

60

С1у С1у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

65

70

75

Туг

11е

Азр

С1у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

80

85

90

Азп

С1п 95

РЬе Ьеи

Азр Туг

Ьеи С1п 100

С1и РЬе Ьеи С1у 105

Уа1 МеЬ

Азп ТЬг

С1и

Тгр

Не

11е

<31и

Зег

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

110

115

120

125

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

61п

Туг

11е

Ьуз

А1а

130

135

140

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

С1у

11е

ТЬг

С1и

Ьеи

11е

Рго

ТЬг

С1и

Не

Рго

145

150

155

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

160

165

170

ТЬг

Ьеи

Ьеи

11е

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

175

180

185

Ьуз

Азп

ΗΪ3

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

Не

РЬе

С1п

(31у

11е

С1у

ТЬг

190

195

200

205

Ьеи

61и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

С1у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

210

215

220

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

11е

Ьуз

Ьуз

Туг

Не

Азр

(31 у

С31п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

225

230

235

С1у

61и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

61п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

С1и

240

245

250

РЬе

Ьеи

61у

Уа1

МеЬ

Азп

ТЬг

61и

Тгр

11е

11е

С1и

Зег

255 260 265 <210>

<211>

<212>

<213>

858

ДНК последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные эпитопами РЗО и Р2 <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(855) <223>

<220>

<221> зрелый пептид

- 37 007810 <222> (58)..() <223>

<220>

<221> сигнальный пептид <222> (1)..(57) <223>

<400> 10

акд адд

акд екк Мек Ьеи

скд сак ккд адк

ккд скд дек Ьеи Ьеи А1а -10

екк дда дек Ьеи С1у А1а

дсс кас

48

Мек

Агд

Ьеи -15

ΗΪ3

Ьеи

Зег

А1а -5

Туг

дЪд

как

дсс

акс

ссс

аса

даа

акк

ссс

аса

адк

дса

ккд

дкд

ааа

дад

96

Уа1

Туг

А1а

Не

Рго

ТЬг

С1и

Не

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

-1

1

5

10

асе

ккд

дса

скд

екк

кек

аск

сак

еда

аск

скд

скд

ака

дсс

аак

дад

14 4

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

А1а

Азп

С1и

15

20

25

аск

скд

адд

акк

сск

дкк

сск

дка

сак

ааа

аак

сас

саа

скд

кде

аск

192

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

Азп

Илз

61п

Ьеи

Суз

ТЬг

30

35

40

45

даа

даа

акс

ккк

сад

дда

ака

ддс

аса

скд

дад

адк

саа

аск

дкд

саа

240

С1и

61и

Не

РЬе

61п

С1у

Не

61у

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

50

55

60

ддд

дд€

аск

дЬд

даа

ада

ска

ккс

ааа

аас

ккд

ксс

кка

ака

аад

ааа

288

С1у

61у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

65

70

75

+- ζ-ч

а + 1-

4-гг4-

«о а

/-4/4/4

апа

/4¼ а

336

υαν

αυ ν

дас

ддс

ииа

ааа

аа^

'-а ·-

дда

у

Туг

Не

Азр

С1у

61п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

80

85

90

аас

саа

ккс

ска

дас

кас

скд

саа

дад

ккк

екк

ддк

дка

акд

аас

асе

384

Азп

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

Мек

Азп

ТЬг

95

100

105

дад

кдд

ака

ака

даа

адк

сад

кас

акс

аад

дсс

аас

ксс

аад

ккс

акс

432

С1и

Тгр

Не

11е

С1и

Зег

61п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

110

115

120

125

ддс

акс

асе

дад

скд

ккс

аас

аас

ккс

асе

дкд

аде

ккс

кдд

скд

сдс

480

С1у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

130

135

140

д€д

сск

аад

дИд

аде

дсс

аде

сас

скд

дад

акс

ссс

аса

даа

акк

ссс

528

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Не

Рго

ТЬг

С1и

Не

Рго

145

150

155

аса

адк

дса

ЬИд

д€д

ааа

дад

асе

ккд

дса

скд

екк

кек

аск

сак

еда

576

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

160 165 170

- 38 007810

асН ТЬг

сНд сНд аНа

дсс ааП

дад 61и 180

асН сНд адд аНН

ссН дНН Рго Уа1 185

ссН Рго

дПа саН Уа1 ΗΪ3

Ьеи 175

Ьеи

Не

А1а

Азп

ТЬг

Ьеи Агд

11е

ааа

ааП

сас

саа

сНд

Идс

асН

даа

даа

аНс

НИН

сад

дда

аНа

ддс

аса

Ьуз

Азп

ΗΪ3

61п

Ьеи

Суз

ТЬг

61и

61и

11е

РЬе

61п

61у

11е

61 у

ТЬг

190

195

200

205

сНд

дад

адН

саа

асН

дНд

саа

ддд

ддН

асН

дНд

даа

ада

сНа

ННс

ааа

Ьеи

61и

Зег

61п

ТЬг

Уа1

61п

61у

61у

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

210

215

220

аас

ННд

Нсс

НПа

аНа

аад

ааа

Нас

аНН

дас

ддс

саа

ааа

ааа

аад

НдН

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

11е

Ьуз

Ьуз

Туг

Не

Азр

61 у

61п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

225

230

235

дда

даа

даа

ада

сдд

ада

дПа

аас

саа

ННс

сНа

дас

Нас

сНд

саа

дад

61у

61и

61и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

61п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

61п

61и

240

245

250

НЕН

сП И

ддН

дПа

аНд

аас

асе

дад

Ндд

аНа

аНа

даа

адН

Ида

РЬе

Ьеи

61у

Уа1

МеН

Азп

ТЬг

61и

Тгр

11е

11е

61и

Зег

255

260

265

<210> 11 <211>285 <212> Белок.

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные эпитопами РЗО и Р2 <400>11

МеН Агд

МеН Ьеи Ьеи -15

ΗΪ3 Ьеи

Зег

Ьеи Ьеи А1а Ьеи 61у А1а А1а

Туг

-10

-5

Уа1

Туг

А1а

11е

Рго

ТЬг

61и

11е

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

61и

-1

1

5

10

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

Η13

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

11е

А1а

Азп

61и

15

20

25

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

Азп

ΗΪ3

61п

Ьеи

Суз

ТЬг

30

35

40

45

61и

61и

Не

РЬе

61п

61у

11е

61у

ТЬг

Ьеи

61и

Зег

61п

ТЬг

Уа1

61п

50

55

60

61у

61у

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

11е

Ьуз

Ьуз

65

70

75

Туг

11е Азр С1у 80

С1п Ьуз Ьуз Ьуз 85

Суз С1у

С1и

С1и Агд Агд 90

Агд Уа1

Азп

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

МеЕ

Азп

ТЬг

95

100

105

С1и

Тгр

Не

Не

С1и

Зег

С1п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

110

115

120

125

61у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

130

135

140

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Не

Рго

ТЬг

б1и

11е

Рго

145

150

155

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

Нхз

Агд

160

165

170

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

А1а

Азп

О1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

175

180

185

Ьуз

Азп

ΗΪ3

б1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

61и

Не

РЬе

С1п

С1у

Не

61у

ТЬг

190

195

200

205

Ьеи 01и Зег С1п

ТЬг Уа1 С1п 01у С1у ТЬг Уа1 С1и Агд Ьеи РЬе

Ьуз

210

215

220

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

Туг

Не

Азр

01 у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

225

230

235

С1у

С1и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

61и

240

245

250

РЬе Ьеи О1у Уа1 МеЪ Азп ТЬг С1и Тгр Не 11е С1и Зег 255 260 265 <210> 12 <211> 864 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные диглициновым линкером и содержащие расположенные на конце эпитопы РЗО и Р2 <220>

<221> СОЗ

- 40 007810 <222> (1)..(861) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (70)..(132) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (817)..(861) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> зрелый пептид <222> (58)..() <223>

<220>

<221> сигнальный пептид <222> (1)..(57) <223>

<400> 12

аРд адд

ард сРР Меб Ьеи

сРд саР РРд адр

РРд срд дсР

сРР Ьеи

дда дсР 61у А1а

дсс А1а -5

Рас Туг

48

Мер

Агд

Ьеи -15

ΗΪ3

Ьеи Зег

Ьеи

Ьеи -10

А1а

дрд

РаР

дсс

аРс

ссс

аса

даа

РРс

аас

аас

РРс

асе

дрд

аде

РРс

Рдд

96

Уа1

Туг

А1а

Не

Рго

ТЬг

61и

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

-1

1

5

10

сРд

сдс

дрд

ссР

аад

дрд

аде

дсс

аде

сас

срд

дад

аРР

ссс

аса

адр

144

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Не

Рго

ТЬг

Зег

15

20

25

дса

РРд

дрд

ааа

дад

асе

РРд

дса

срд

сРР

РсР

асР

саР

еда

асР

сРд

192

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

30

35

40

45

сбд

аба

дсс

ааР

дад

асР

срд

адд

аРР

сер

дРР

ссР

дРа

саР

ааа

ааР

240

Ьеи

Не

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

Азп

50

55

60

сас

саа

срд

Рдс

асР

даа

даа

аРс

РРР

сад

дда

аРа

ддс

аса

сРд

дад

288

Нхз

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

Не

РЬе

С1п

С1у

Не

С1у

ТЬг

Ьеи

С1и

65

70

75

адр

саа

асР

дрд

саа

ддд

ддр

асР

дрд

даа

ада

сРа

РРс

ааа

аас

РРд

336

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

С1у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

80

85

90

Рсс

РРа

ара

аад

ааа

Рас

аРР

дас

ддс

саа

ааа

ааа

аад

РдР

дда

даа

384

Зег

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

Туг

Не

Азр

С1у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

100 105

- 41 007810

даа С1и 110

ада сдд Агд Агд

ада дба

аас саа ббс сба дас бас сбд саа

дад ббб С1и РЬе

ебб Ьеи 125

432

Агд

Уа1

Азп С1п 115

РЬе Ьеи

Азр

Туг Ьеи 120

С1п

ддВ

дба

абд

аас

асе

дад

бдд

аба

аба

даа

адб

ддс

ддб

абс

ссс

аса

480

С1у

Уа1

Меб

Азп

ТЬг

61и

Тгр

11е

11е

61и

Зег

С1у

С1у

11е

Рго

ТЬг

130

135

140

даа

абб

ссс

аса

адб

дса

ббд

дбд

ааа

дад

асе

ббд

дса

сбд

ебб

бсб

528

С1и

11е

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

145

150

155

асб

саб

еда

асб

сбд

сбд

аба

дсс

ааб

дад

асб

сбд

адд

абб

ссб

дбб

576

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

11е

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

160

165

170

ссб

дба

саб

ааа

ааб

сас

саа

сбд

бде

асб

даа

даа

абс

ббб

сад

дда

624

Рго

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

Азп

ΗΪ3

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

11е

РЬе

61п

61у

175

180

185

аба

ддс

аса

сбд

дад

адб

саа

асб

дбд

саа

ддд

ддб

асб

дбд

даа

ада

672

Не

61у

ТЬг

Ьеи

б1и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

С1у

ТЬг

Уа1

61и

Агд

190

195

200

205

сба

ббс

ааа

аас

ббд

бсс

бба

аба

аад

ааа

бас

абб

дас

ддс

саа

ааа

720

Веи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

11е

Ьуз

Ьуз

Туг

11е

Азр

С1у

С1п

Ьуз

210

215

220

ааа

аад

бдб

дда

даа

даа

ада

сдд

ада

дба

аас

саа

ббс

сба

дас

бас

768

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

61и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг.

225

230

235

сбд

саа

дад

ббб

ебб

ддб

дба

абд

аас

асе

дад

бдд

аба

аба

даа

адб

816

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

Меб

Азп

ТЬг

С1и

Тгр

11е

Не

61и

Зег

240

245

250

сад

бас

абс

аад

дсс

аас

бсс

аад

ббс

абс

ддс

абс

асе

дад

сбд

бда

864

С1п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

11е

ТЬг

С1и

Ьеи

255 260 265 <210> 13 <211> 287 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные диглициновым линкером и содержащие расположенные на конце эпитопы РЗО и Р2 <400> 13

Меб

Агд

Меб

Ьеи

Ьеи -15

ΗΪ3

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьеи -10

А1а

Ьеи

С1у А1а

А1а -5

Туг

Уа1

Туг

А1а -1

11е 1

Рго

ТЬг

61и

РЬе 5

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1 Зег 10

РЬе

Тгр

- 42 007810

Ьеи Агд Уа1

Рго Ьуз Уа1

Зег А1а 20

Зег

Нхз

Ьеи С1и 11е 25

Рго ТЬг

Зег

15

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

30

35

40

45

Ьеи

11е

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

Нхз

Ьуз

Азп

50

55

60

Нхз

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

11е

РЬе

С1п

С1у

11е

С1у

ТЬг

Ьеи

С1и

65

70

75

5ег

61п

ТЬг

Уа1

61п

С1у

<31 у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

80

85

90

5ег

Ьеи

11е

Ьуз

Ьуз

Туг

11е

Азр

С1у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

95

100

105

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

61п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

110

115

120

125

01 у

Уа1

Мек

Азп

ТЬг

С1и

Тгр

Не

11е

С1и

Зег

С1у

С1у

Не

Рго

ТЬг

130

135

140

С1и

11е

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

145

150

155

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

11е

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

160

165

170

Рго

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

Азп

Нхз

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

Не

РЬе

С1п

С1у

175

180

185

Не

61у

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

61у

С1у

ТЬг

Уа1

(31и

Агд

190

195

200

205

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

11е

Ьуз

Ьуз

Туг

Не

Азр

С1у

С1п

Ьуз

210

215

220

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

225

230

235

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

61у

Уа1

Мек

Азп

ТЬг

С1и

Тгр

11е

Не

С1и

Зег

240 245 250

- 43 007810

С1п Туг 11е Ьуз А1а Азп Зег Ьуз РЬе 11е С1у 11е ТЬг С1и Ьеи 255 260265 <210>14 <211>864 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные диглициновым линкером и содержащие расположенные на конце эпитопы РЗО и Р2 <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(861) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (70)..(114) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (817)..(861) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <220>

<221> сигнальный пептид <222> (1)..(57) <223>

<220>

<221> зрелый пептид <222> (58)..() <223>

<400> 14

аЪд адд аРд сЬР

сЬд саЬ

ЬЬд ад+ Ьеи Зег

Р±д сРд

дсЬ А1а

с+Ь дда

дсЬ А1а

дсс Рас

48

МеЪ Агд МеЪ

Ьеи

Ьеи -15

Нхз

Ьеи

Ьеи -10

Ьеи

С1у

А1а -5

Туг

дЬд

РаЬ

дсс

аЬс

ссс

аса

даа

сад

Рас

а+с

аад

дсс

аас

Ьсс

аад

Р+с

96

Уа1

Туг

А1а

11е

Рго

ТЬг

С1и

С1п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

-1

1

5

10

аЪс

ддс

аРс

асе

дад

с+д

аРР

ссс

аса

адР

дса

РРд

дрд

ааа

дад

асе

144

Не

С1у

11е

ТЬг

С1и

Ьеи

11е

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

15

20

25

ЪРд

дса

сРд

сЬР

ЪсЬ

асР

саЬ

еда

асЬ

скд

ерд

а+а

дсс

ааЪ

дад

асР

192

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

Η13

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

А1а

Азп

С1и

ТЬг

30

35

40

45

- 44 007810

сБд адд а+

ссБ Рго

дББ Уа1 50

ссБ Рго

дБа Уа1

саБ ааа ааБ Н1з Ьуз Азп 55

сас саа сБд Ηί3 С1п Ьеи

Бдс Суз

асБ даа ТЬг С1и 60

240

Ьеи

Агд 11е

даа

аБс

БББ

сад

дда

аБа

ддс

аса

сБд

дад

адБ

саа

асБ

дБд

саа

ддд

288

С1и

Не

РЬе

61п

С1у

Не

С1у

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

65

70

75

ддБ

асБ

дБд

даа

ада

сБа

ББс

ааа

аас

ББд

Бсс

ББа

аБа

аад

ааа

Бас

336

С1у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

Туг

80

85

90

аББ

дас

ддс

саа

ааа

ааа

аад

БдБ

дда

даа

даа

ада

едд

ада

дБа

аас

384

Не

Азр

С1у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

С1и

Агд

Агд

Агд

νβΐ

Азп

95

100

105

саа

ББс

сБа

дас

Бас

сБд

саа

дад

БББ

сББ

ддк

дБа

аБд

аас

асе

дад

432

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

61и

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

МеБ

Азп

ТЬг

С1и

110

115

120

125

Ъдд

аБа

аБа

даа

адБ

ддс

ддБ

аБс

ссс

аса

даа

аББ

ссс

аса

адБ

дса

480

Тгр

Не

Не

С1и

Зег

С1у

С1у

Не

Рго

ТЬг

С1и

Не

Рго

ТЬг

Зег

А1а

130

135

140

«д

дБд

ааа

дад

асе

ББд

дса

сБд

сББ

БсБ

асБ

саБ

еда

асБ

сБд

сБд

528

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

145

150

155

аБа

дсс

ааБ

дад

асБ

сБд

адд

аББ

ссБ

дББ

ссБ

дБа

саБ

ааа

ааБ

сас

576

Не

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

νβΐ

ΗΪ3

Ьуз

Азп

ΗΪ3

160

165

170

саа

сБд

Бдс

асБ

даа

даа

аБс

БББ

сад

дда

аБа

ддс

аса

сБд

дад

адБ

624

61п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

Не

РЬе

С1п

С1у

Не

С1у

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

175

180

185

саа

асБ

дБд

саа

ддд

ддБ

асБ

дБд

даа

ада

сБа

ББс

ааа

аас

ББд

Бсс

672

61п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

С1у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

190

195

200

205

ББа

аБа

аад

ааа

Бас

аББ

дас

ддс

саа

ааа

ааа

аад

БдБ

дда

даа

даа

720

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

Туг

Не

Азр

61у

61п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

С1и

210

215

220

ада

едд

ада

дБа

аас

саа

ББс

сБа

дас

Бас

сБд

саа

дад

БББ

сББ

ддБ

768

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

225

230

235

дБ а

аБд

аас

асе

дад

Бдд

аБа

аБа

даа

адБ

ББс

аас

аас

ББс

асе

дБд

816

Уа1

МеБ

Азп

ТЬг

С1и

Тгр

Не

Не

С1и

Зег

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

240

245

250

аде

ББс

Бдд

сБд

сдс

дБд

ссБ

аад

дБд

аде

дсс

аде

сас

сБд

дад

Бда

864

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

255 260 265 <210> 15 <211> 287

- 45 007810 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 2 мономера человеческого 1Ь5, соединенные диглициновым линкером и содержащие расположенные на конце эпитопы РЗО и Р2 <400> 15

МеЬ

Агд

МеЬ Ьеи

Ьеи -15

ΗΪ3

Ьеи

Зег Ьеи

Ьеи -10

А1а Ьеи С1у

А1а

А1а -5

Туг

Уа1

Туг

А1а

Не

Рго

ТЬг

61и

С1п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

-1

1

5

10

Не

С1у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

Не

Рго

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

15

20

25

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

5ег

ТЬг

Нхз

Агд

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

А1а

Азп

С1и

ТЬг

30

35

40

45

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

Нхз

Ьуз

Азп

ΗΪ3

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

50

55

60

С1и

Не

РЬе

С1п

С1у

Не

С1у

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

65

70

75

С1у

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьеи

РЬе

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

Туг

80

85

90

Не

Азр

01 у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

61и

С1и

Агд

Агд

Агд

Уа1

Азп

95

100

105

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

Уа1

МеЬ

Азп

ТЬг

С1и

110

115

120

125

Тгр

Не

Не

С1и

Зег

С1у

С1у

11в

Рго

ТЬг

С1и

Не

Рго

ТЬг

Зег

А1а

130

135

140

Т Ω11

Т «ГЛ

ГИ ,,

Фкг·

Т ЛЧ

П 1 -»

Т Л.«

Т ЛЧ

Сл*.

ти

л

гр К*.

Т Л1Ч

Г

ии; и

и У

члх и

X их

XI с ы

пхи

иии

Л XXX

XXX 0

пх у

х их

XIС XX

145

150

155

Не

А1а

Азп

С1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

Рго

Уа1

Рго

Уа1

НЬз

Ьуз

Азп

Нхз

160

165

170

С1п

Ьеи

Суз

ТЬг

С1и

С1и

Не

РЬе

С1п

С1у

Не

С1у

ТЬг

Ьеи

С1и

Зег

175 180 185

- 46 007810

61п ТЬг 190

Уа1 61п С1у

01 у ТЬг 195

Уа1

С1и Агд

Ьеи 200

РЬе Ьуз

Аз η

Ьеи

Зег 205

Ьеи

Не

Ьуз

Ьуз

Туг

11е

Азр

С1у

С1п

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Суз

С1у

С1и

61и

210

215

220

Агд

Агд

Агд

Уа1

Аз η

С1п

РЬе

Ьеи

Азр

Туг

Ьеи

С1п

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

225

230

235

Уа1

МеЕ

Аз η

ТЬг

С1и

Тгр

11е

11е

С1и

Зег

РЬе

Аз η

Аз η

РЬе

ТЬг

Уа1

240

245

250

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

255

260

265

<210> 16 <211> 477 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Человеческий ΤΝΕ дикого типа (КОДОНЫоптимизированы) <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(477) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (4)..(474) <223> Зрелая последовательность ΤΝΓ

<400> аЕд дЕд

16 сдс Еса аде Есд сдс

асд сед ТЬг Рго

адЕ дас ааа

сса дЕа Рго Уа1

дсЕ А1а 15

саЕ ΗΪ3

48

МеЕ 1

Уа1

Агд

Зег

Зег Зег 5

Агд

Зег 10

Азр Ьуз

дЕЕ

дбд

дсс

аас

ссЕ

сад

дед

даа

ддс

сад

сЕс

саа

Едд

ЕЕа

ааЕ

сдЕ

96

Уа1

Уа1

А1а

Аз η

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

сдс

дед

аас

дсс

сЕд

сЕд

дед

аас

ддс

дЕд

даа

сЕд

сдЕ

даЕ

аас

сад

144

Агд

А1а

Аз η

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Аз η

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

сЕд

д£д

дЕс

ссс

аде

дад

ддд

сЕд

ЕаЕ

сЕд

аЕс

ЕаЕ

Еса

сад

дЕд

ЕЕд

192

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

50

55

60

- 47 007810

ίίί: аад ддк

сад ддк С1п С1у

кдк Суз 70

ссд аде асс сас дкк скд скд асд сак асс

240

РЬе 65

Ьуз

С1у

Рго Зег ТЬг

ΗΪ3

Уа1 75

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг 80

акк

кек

едк

акк

дек

дка

кек

как

саа

аск

ааа

дке

аак

кка

екк

кед

288

Не

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дед

акс

ааа

Ссс

ссд

Еде

саа

едк

дад

асс

сск

даа

дда

дед

даа

дсс

336

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

ΘΙη

Агд

61и

ТЬг

Рго

б1и

С1у

А1а

61и

А1а

100

105

110

ааа

сск

Едд

кас

даа

ссд

акс

как

скд

ддд

ддс

дкк

ккк

сад

скс

даа

384

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

ΘΙη

Ьеи

С1и

115

120

125

ааа

ддк

дак

едд

скд

аде

дсс

даа

акк

аак

сдс

ссд

дас

кас

екк

дак

432

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

ккс

дса

дад

ксс

ддк

сад

дке

кас

ккс

ддс

акк

акс

дса

ккд

каа

477

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

ΘΙη

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

А1а

Ьеи

145

150

155

<210> 17 <211> 158 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Человеческий ΤΝΓ дикого типа (кодоныоптимизированы) <400> 17

Мек Уа1 1

Агд Зег Зег 5

Зег

Агд ТЬг Рго Зег 10

Азр Ьуз

Рго Уа1

А1а 15

ΗΪ3

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

ΘΙη

35

40

45

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

50

55

60

РЬе

Ьуз

С1у

ΘΙη

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

65

70

75

80

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

Не Ьуз

Зег 100

Рго Суз С1п

Агд С1и ТЬг Рго С1и С1у А1а 61и

А1а

105

110

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

115

120

125

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

61п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

145

150

155

<210>	18
<211>	170
<212>	Белок
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ΗΤΝΓ с встроеннным ΡΑΌΚ.Ε
<220>
<221>	Мутаген
<222>	(109)..(121)
<223>	Связывающий все типы БК пептид (ΡΑΌΚΕ)

<220>
<221>	разные признаки
<222>	(1)..(108)

<223> Аминокислоты ΗΤΝΕ1-108 <220>

<221> разные признаки <222> (122)..(170) <223> Аминокислоты ΠΤΝΓ109-157 <400> 18

Уа1 Агд Зег Зег Зег

Агд ТЬг

Рго Зег Азр 10

Ьуз

Рго

Уа1 А1а

ΗΪ3 Уа1 15

1

5

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

- 49 007810

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

НЬз

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

61и

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

110

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

115

120

125

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

61у

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

145

150

155

160

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

165 170

<210>	19
<211>	39
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Связывающий	все	типы БК пептид (РАБКЕ)
<220>
<221>	СБЗ
<222>	(1)..(39)
<223>
<400>	19
дед аад	ЬЬс дЬЬ дса	дсЬ	Ьдд асе сЬд аад дсс дсЪ	дса	39
А1а Ьуз	РЬе Уа1 А1а	А1а	Тгр ТЬг Ьеи Ьуз А1а А1а	А1а

10 <210> 20 <211> 13 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Связывающий все типы БК пептид (РАВКЕ) <400> 20

- 50 007810

А1а Ьуз РЬе Уа1 А1а А1а Тгр ТЬг Ьеи Ьуз А1а А1а А1а 15 10 <210> 21 <211> 1437 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> , <223> Мономерная имитация тримерного ΤΝΡ человека <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(1437) <223>

<220>

<221> Мутация <222> (475)..(483) <223> Последовательность, кодирующая триглициновый линкер <220>

<221> Мутация <222> (955)..(963) <223> Последовательность, кодирующая триглициновый линкер <400> 21

аЬд д+д сдс

аде аде аде сдс асе ссс аде дас аад

ссс дрд дсс Рго Уа1 А1а 15

сас Нхз

48

МеЬ 1

Уа1

Агд

Зег

Зег 5

Зег

Агд ТЬг

Рго

Зег 10

Азр Ьуз

дрд

дрд

дсс

аас

ссс

сад

дсс

дад

ддс

саа

сРд

сад

Ьдд

с+д

аас

сдс

96

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

сдс

дсс

аас

дсс

сЪд

сЪд

дса

аас

ддс

д+д

дад

сЬд

сдс

дас

аас

сад

144

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

с£д

дед

д+д

ссс

аде

дад

ддс

с+д

Рас

сЪд

а1:с

Рас

аде

сад

д^д

сЬд

192

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

50

55

60

ЬЬс

аад

ддс

сад

ддс

Ьдс

ссс

аде

асе

сас

дЬд

сЬд

сЪд

асе

сас

асе

240

РЬе

Ьуз

61у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

65

70

75

80

аЬс

аде

сдс

а+с

дсс

д^д

аде

Рас

сад

асе

аад

дрд

аас

сЪд

сЬд

аде

288

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дсс

аРс

аад

аде

ссс

Ьдс

сад

сдс

дад

асе

ссс

дад

ддс

дсс

дад

дсс

336

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

100 105 110

- 51 007810

аад Ьуз

ссс кдд

Бас дад

ссс Рго

акс кас скс ддс ддс дкд ккс сад скд дад

384

Рго

Тгр 115

Туг

61и

Не

Туг 120

Ьеи

61у

С1у

Уа1

РЬе 125

61п

Ьеи

61и

аад

ддс

дас

еде

скд

аде

дсс

дад

акс

аас

еде

ссс

дас

кас

скд

дас

432

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

ккс

дсс

дад

аде

ддс

сад

дкд

кас

ккс

ддс

акс

акс

дсс

скд

ддк

ддс

480

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

61у

61у

145

150

155

160

дда

дБ с

сдд

Есе

кос

ксс

сдд

аса

сса

ксс

дас

ааа

сса

дке

дек

сак

528

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ8

165

170

175

дке

дке

дек

аак

сса

саа

дек

даа

ддк

саа

екк

саа

кдд

екк

аак

сдд

576

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

01и

С1у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

сдд

дек

аак

дек

екк

екк

дек

аак

ддк

дке

даа

екк

сдд

дас

аак

саа

624

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

195

200

205

екк

дке

дБ с

сса

кос

даа

ддк

екк

как

екк

акк

как

ксс

саа

дке

екк

672

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

01и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

210

215

220

ккк

ааа

ддБ

саа

ддк

кдк

сса

ксс

аса

сак

дке

екк

екк

аса

сак

аса

720

РЬе

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Н1з

ТЬг

225

230

235

240

акк

ксс

сдд

акк

дек

дке

ксс

как

саа

аса

ааа

дке

аак

екк

екк

ксс

768

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

дек

акк

ааа

Бес

сса

кдк

саа

сдд

даа

аса

сса

даа

ддк

дек

даа

дек

816

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

61и

С1у

А1а

61и

А1а

260

265

270

ааа

сск

Ъдд

как

даа

сса

акк

как

екк

ддк

ддк

дке

ккк

саа

екк

даа

864

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

61у

61 у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

275

280

285

ааа

ддк

дас

сдд

екк

ксс

дек

даа

акк

аак

сдд

сса

дак

как

екк

дас

912

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290

295

300

ккк

дек

даа

кос

ддк

саа

дке

как

ккк

ддк

акк

акк

дек

скд

ддс

ддк

960

— Г11«

А1а

ОГй

Зег

61у

Сэ1п

”а1

Туг

ТМ__ гпе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

61у

61у

305

310

315

320

ддд

дкк

с дБ

кек

кек

кек

едк

асд

сед

кек

да к

аад

сед

дкк

дед

сас

1008

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Н13

325

330

335

дкБ

дкк

дед

аас

сед

сад

дед

дад

ддд

саа

ккд

сад

кдд

ккд

аак

едк

1056

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

340

345

350

- 52 007810

сдр дед аас

дед А1а

РРд Ьеи

РРд дед ааР ддд

дрр Уа1

даа РРд сдр даР

аас Азп

саа С1п

1104

Агд А1а

Азп 355

Ьеи А1а

Азп 360

61у

С1и

Ьеи

Агд 365

Азр

РРд

дрр

дрр

ссд

РсР

дад

ддд

РРд

Рас

РРд

аРа

РаР

РсР

сад

дрр

РРд

1152

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

370

375

380

РРс

ааа

ддд

саа

ддд

Рдс

ссд

РсР

асд

саР

дрр

РРд

РРд

асд

сас

асд

1200

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

385

390

395

400

аРа

РсР

сдр

аРа

дед

дрр

РсР

Рас

сад

асд

аад

дрр

ааР

РРд

РРд

РсР

1248

11е

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

405

410

415

дед

аРа

ааа

РсР

ссд

РдР

саа

сдр

даа

асд

ссд

даа

ддд

дед

дад

дед

1296

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

420

425

430

аад

ссд

Рдд

РаР

даа

ссд

аРа

Рас

РРд

ддд

ддд

дрр

РРР

сад

РРд

даа

1344

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

435

440

445

ааа

ддд

даР

сдр

РРд

РсР

дед

дад

аРа

аас

сдр

ссд

дас

РаР

РРд

даР

1392

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

450

455

460

РРс

дед

даа

РсР

ддд

саа

дрр

Рас

РРР

ддд

аРа

аРа

дед

сРд

Раа

1437

РЬе

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

465 470 475 <210> 22 <211> 478 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мономерная имитация тримерного ΤΝΓ человека <400> 22

Мер

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

1

5

10

15

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

55 60

- 53 007810

РЬе Ьуз 65

С1у С1п С1у Суз Рго Зег ТЬг ΗΪ3 Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг 80

70

75

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95 !

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

100

105

110

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

115

120

125

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

145

150

155

160

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Η13

165

170

175

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

195

200

205

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

210

215

220

РЬе

Ьуз

01 у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

225

230

235

240

Не

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

61и

А1а

260

265

270

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

275

280

285

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290 295 300

- 54 007810

РЬе А1а С1и Зег С1у 61п Уа1

Туг РЬе С1у

Не 315

11е А1а

Ьеи

61у

С1у 320

305

310

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

325

330

335

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

61у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

340

345

350

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

355

360

365

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

370

375

380

РЬе

Ьуз

61у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

385

390

395

400

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

405

410

415

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

61у

А1а

С1и

А1а

420

425

430

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

435

440

445

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

450

455

4 60

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

465 * 470 475 <210> 23 <211> 170 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

<220> <223>	ΗΤΝΕ с встроеннным РАББЕ
<220> <221> <222> <223>	Мутаген (107)..(119) Связывающий все типы ББ пептид (РАББЕ)

- 55 007810 <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(106) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ1-106 <220>

<221> разные признаки <222> (120)..(170) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ107-157 <400> 23

Уа1 1

Агд

Зег

Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3 15

Уа1

5

10

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

01 и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

'Уа!

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Н13

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

С1и

61у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

115

120

125

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

61у

νβΐ

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

145

150

155

160

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

165

170

- 56 007810 <210> 24 <211> 170 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с встроенным ΡΑΌΚΕ <220>

<221> Мутаген <222> (108)..(120) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (1)..(107) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ1-107 <220>

<221> разные признаки <222> (121)..(170) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ108-157 <400> 24

Уа1 Агд 1

Зег Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго

Уа1 А1а

Нхз 15

Уа1

5

10

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

61п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

100

105

110

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

115

120

125

- 57 007810

61и Рго 11е Туг Ьеи С1у 61у Уа1

130 135

РЬе 61п Ьеи 61и Ьуз 61у Азр Агд

140

Ьеи Зег А1а 61и 11е Азп Агд Рго Азр Туг Ьеи Азр РЬе А1а 145 150 155

61и Зег

160

61у

165

170

<210> <211> <212> <213>	25 169 Белок Искусственная последовательность
<220> <223>	ЬТЫГ с встроенными 12 аминокислотами ΡΑΏΡ.Ε
<220> <221> <222> <223>	Мутаген (109)..(121)

<220> <221> <222> <223>

разные признаки (1)··(109) Аминокислоты ЬТЫЕ1-109

<220>

<221> разные признаки <222> (122)..(169) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ110-157 <400> 25

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

1

5

10

15

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61 у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Ηί3

ТЬг

Не

65

70

75

80

- 58 007810

Бег Агд 11е А1а Уа1

Бег

Туг 61п

ТЬг

Ьуз Уа1 Азп Ьеи Ьеи Бег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Бег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

НО

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

115

120

125

Рго

Не

Туг

Ьеи

61 у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

130

135

140

Бег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Бег

61у

145

150

155

160

61η Уа1 Туг РЬе С1у 11е 11е А1а Ьеи

165 <210> 26 <211> 167 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ΜΝΕ с заменой на РАББЕ <220>

<221> Мутаген <222> (109)..(121) <223> Связывающий все типы ББ пептид(РАББЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(109) <223> Аминокислоты ΜΝΓ1-109 <220>

<221> разные признаки <222> (121)..(167) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ111-157 <400>26

Уа1 Агд Бег Бег Бег Агд ТЬг Рго Бег Азр Ьуз Рго Уа1 А1а Нхз Уа1 15 1015

Уа1 А1а Азп Рго 61п А1а 61и 61у 61п Ьеи С1п Тгр Ьеи Азп Агд Агд

2530

- 59 007810

А1а Азп А1а

Ьеи

Ьеи А1а Азп

С1у Уа1 С1и Ьеи Агд Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

б1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

110

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

115

120

125

Туг

Ьеи

С1у

61у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

130

135

140

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

145

150

155

160

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

165 <210> 27 <211> 165 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с заменой на ΡΑΌΚΕ <220>

<221> Мутаген хЭООх ΗΛΊ) \ XV · / · · \ А Л. } <223> Связывающий все типы ΌΚ пептид (РАБКЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(106) <223> Аминокислоты ΙίΤΝΓΙ-106 <220>

<221> разные признаки

- 60 007810 <222> (119)..(165) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ111-157 <400> 27

Уа1 1

Агд Зег

Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго Уа1 А1а

Нйз Уа1 15

5

10

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

61и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Низ

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

115

120

125

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

130

135

140

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

145

150

155

160

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

165 <210> 28 <211> 173 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с С-концевым линкером и РАБНЕ <220>

- 61 007810 <221> разные признаки <222> (1)..(157) <223> ЬТЫГ <220>

<221> Мутаген <222> (158)..(160) <223> Триглициновый пептид-линкер <220>

<221> Мутаген <222> (161)..(173) <223> Связывающий все типы БК пептид (РАБКЕ) <400> 28

Уа1 Агд 1

Зег Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз Рго Уа1 А1а Нхз

Уа1

5

10

15

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

ΘΙη

Ьеи

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

01и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

61и

А1а

Ьуз

100

105

110

Рго Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

115

120

125

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

130

135

140

А1а

61и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

С1у

С1у

С1у

145

150

155

160

- 62 007810

А1а Ьуз РЬе Уа1 А1а А1а Тгр ТЬг Ьеи Ьуз А1а А1а А1а

165170 <210>29 <211>170 <212> Белок <21.3> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с встроенным ΡΑΏΚΕ и дополнительным дисульфидным мостиком <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(108) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ1-108 <220>

<221> Мутаген <222> (124)..(124) <223> Мутация А1а на Суз <220>

<221> Дисульфидный мостик <222> (67)..(124) <223>

<220>

<221> Мутаген <222> (67)..(67) <223> Мутация Ьеи на Суз <221> Мутаген <222> (109)..(121) <223> Связывающий все типы ΌΒ. пептид (ΡΑΌΚΕ) <220>

<221> разные признаки <222> (122)..(170) <223> Аминокислоты ΜΝΓ109-157 <400> 29

Уа1 1

Агд

Зег

Зег

Зег 5

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр 10

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3 15

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго 20

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п 25

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп 30

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а 35

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у 40

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр 45

Азп

С1п

Ьеи

- 63 007810

Уа1 Уа1

Рго

Зег С1и С1у Ьеи Туг Ьеи 11е Туг Зег С1п Уа1

Ьеи РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Суз

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ5

ТЬг

11е

65.

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

110

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

А1а

С1и

Суз

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

115

120

125

О1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Зег

145

150

155

160

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

165 170 <210> 30 <211> 170 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ΗΤΝΕ : встроенным РАБКЕ и дополнительным дисульфидным мостиком <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(108) <223> Остатки 1-108 ЬТЫЕ с одной мутацией <220>

<221> разные признаки <222> (122)..(170) <223> Остатки 109-157ΗΤΝΓ с одной мутацией <220>

<221> Мутаген <222> (96)..(96) <223> Мутация А1а на Суз

- 64 007810 <220>

<221> Мутаген <222> (131)..(131) <223> Мутация Не на Суз <220>

<221> Дисульфидный мостик <222> (96)..(131) <223>

<220>

<221> Мутаген <222> (109)..(121) <223> Связывающий все типы ϋΚ. пептид (ΡΑΌΡΕ) <400> 30

Уа1 Агд 1

Зег Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз Рго Уа1 А1а Нхз

Уа1

5

10

15

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

Суз

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

110

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

115

120

125

С1и

Рго

Суз

Туг

Ьеи

61у

01у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

б1у

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

145

150

155

160

- 65 007810

165

170

<210> <211> <212> <213>	31 162 Белок Искусственная последовательность
<220> <223>	Усеченный ηΤΝΓ с встроенным РАББЕ

<220> <221> <222> <223>

Мутаген (101)..(113) Связывающий все типы ББ пептид (РАББЕ)

<220> <221> <222>

разные признаки (1) ·. (ЮО)

<223> Аминокислоты ΜΝΕ9-108 <220>

<221> разные признаки <222> (114)..(160) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ109-155 <220>

<221> разные признаки <222> (114)..(162)

>4. Лл
<400>	31
Зег 1	Азр	Ьуз	Рго	Уа1 5	А1а	Нхз	Уа1
С1п	Ьеи	51п	Тгр 20	Ьеи	Азп	Агд	Агд
Уа1	С1и	Ьеи 35	Агд	Азр	Азп	С1п	Ьеи 40
Ьеи	Не 50	Туг	Зег	С1п	Уа1	Ьеи 55	РЬе
Нхз 65	Уа1	Ьеи	Ьеи	ТЬг	Нхз 70	ТЬг	11е

Уа1	А1а 10	Азп	Рго	61п	А1а	С1и 15	61у
А1а 25	Азп	А1а	Ьеи	Ьеи	А1а 30	Азп	С1у
Уа1	Уа1	Рго	Зёг	С1и 45	С1у	Ьеи	Туг
Ьуз	С1у	С1п	С1у 60	Суз	Рго	Зег	ТЬг
Зег	Агд	11е 75	А1а	Уа1	Зег	Туг	С1п 80

- 66 007810

ТЬг Ьуз Уа1 Азп Ьеи

Ьеи

Зег А1а

11е

Ьуз 90

Зег Рго Суз

С1п Агд С1и 95

85

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

100

105

110

А1а

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

115

120

125

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

130

135

140

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С51п

Уа1

1 Туг

РЬе

61у

Не

Не

145

150

155

160

А1а Ьеи <210> 32 <211> 169 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ΜΝΓ с встроенным РАЕВЕ <220>

<221> Мутаген <222> (18)..(30) <223> Связывающий все типы БВ пептид <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(18) <223> Аминокислоты ЬТЫГ1-18 <220>

<221> разные признаки <222> (31)..(169) <223> Аминокислоты ΜΝΕ19-157 <400> 32

Уа1 Агд Зег Зег Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз Рго Уа1 А1а ΗΪ3 Уа1

1	5	10	15
Уа1 А1а Ьуз	РЬе Уа1 А1а А1а Тгр ТЬг	Ьеи Ьуз А1а А1а А1а	Азп Рго
	20 25	30

- 67 007810

С1п А1а С1и

С1у

С1п Ьеи С1п

Тгр Ьеи Азп Агд Агд А1а Азп А1а

Ьеи

35

40

45

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

50

55

60

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

65

70

75

80

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

Не

Зег

Агд

Не

А1а

85

90

95

Уа1

Зег

Туг

<31п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

100

105

110

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

115

120

125

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

(31у

Азр

Агд

Ьеи

130

135

140

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

61у

145

150

155

160

С1п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

165 <210> 33 <211> 165 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> ЬТЫЕ с заменой на ΡΑϋΡΕ <220>

<221> Мутаген <222> (18)..(30) <223> Связывающий все типы ΌΚ пептид (ΡΑΌΚΕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(18) <223> Аминокислоты Ϊ1ΤΝΓ1-18 <220>

<221> разные признаки

- 68 007810 <222> (30)..(165) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ22-157 <400> 33

Уа1 1

Агд

Зег

Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго

Уа1

А1а ΗΪ3 Уа1 15

5

10

Уа1

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

С1и

Б1у

он

о к

ОЛ

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

35

40

45

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

50

55

60

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

65

70

1 к

ап

ι

V V

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

85

90

95

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

100

105

110

ТЬг

Рго

31и

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

5 ч е

1 п Л

ι е

х^и

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

130

135

140

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1 у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

145

150

155

160

61у 11е 11е А1а Ьеи

165 <210> 34 <211> 170 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с добавленной областью стебля и встроенным РАБКЕ <220>

- 69 007810 <221> Мутаген <222> (2)..(14) <223> Связывающий все типы БК пептид (РАБКЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (15)..(170) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ2-157

<400>

34

МеН

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

Агд

Зег

1

5

10

15

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

Уа1

А1а

Азп

20

25

30

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а

35

40

45

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

50

55

60

Зег

61и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

65

70

75

80

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

Зег

Агд

Не

85

90

95

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

Не

Ьуз

Зег

100

105

110

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

115

120

125

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

61у

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

145

150

155

160

С1у

С1П

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

165 170 <210> 35 <211> 170

- 70 007810 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ΗΤΝΕ с встроенным РАБКЕ и одной стабилизирующей мутацией <220>

<221> Мутаген <222> (109)..(121) <223> Связывающий все типы БК пептид (РАБКЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(108) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ1-108 <220>

<221> разные признаки <222> (122)..(170)

<223>

Аминокислоты ΗΤΝΕ 109-

157

С ОДНОЙ

мутацией

<220>

<221>

Мутаген

<222>

(170!

)..(170)

<223> ]

Мутация

Ьеи

на :

РЬе

<400>

35

Уа1 Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

1

5

10

15

Уа1 А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

01 и

С1у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

35

40

45

Уа1 νβΐ

Рго

Зег

С1и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз С1у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

61 у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100 105 110

- 71 007810

А1а

А1а

Тгр ТЬг Ьеи Ьуз А1а А1а А1а А1а С1и А1а Ьуз Рго Тгр

Туг

115

120

125

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

145

150

155

160

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

РЬе

165 170

<210> <211> <212> <213>	36 170 Белок Искусственная последовательность
<220> <223>	ΗΤΝΕ с встроенным РАББЕ и единственной мутацией
<220> <221> <222> <223>	Мутаген (109)..(121) Связывающий все типы БК. пептид (РАБКЕ)

<220> <221> <222> <223>

разные признаки (1)..(108) Аминокислоты ΗΤΝΕ 1-108 с единственной мутацией

<220>

<221> разные признаки <222> (122)..(170) <223> Аминокислоты ΕΤΝΓ 109-157 <220>

<221> Мутаген <222> (49)..(49) <223> Мутация Уа1 на РЬе <400> 36

Уа1 Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

Уа1

1

5

10

15

Уа1 А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

Θΐη

Ьеи С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

25 30

- 72 007810

А1а Азп А1а

Ьеи Ьеи

А1а Азп

61у Уа1 61и Ьеи Агд Азр Азп 61п

Ьеи

35

40

45

РЬе

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

61 у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ5

ТЬг

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

110

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

115

120

125

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

61 у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

61у

Азр

Агд

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Зег

145

150

155

160

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

А1а

Ьеи

165 170 <210> 37 <211> 174 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫГ с встроенным глициноподобным ΡΑϋΡ,Ε <220>

<221> Мутаген <222> (111)..(123) <223^ орязыр·эюпгим зсб типы ОН пзптид (ΡΑΌΙχΕ) <220>

<221> Мутаген <222> (109)..(110) <223> Диглициновый линкер <220>

<221> Мутаген <222> (124)..(125)

- 73 007810 <223> Диглициновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(108) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ1-108 <220>

<221> разные признаки <222> (126)..(174) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ109-157

<400>

37

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

1

5

10

15

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

б1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

С1у

С1у

А1а

Ьуз

100

105

110

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

С1у

61у

А1а

С1и

А1а

115

120

125

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

б1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

130

135

140

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

145

150

155

160

РЬе

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

165 170

- 74 007810 <210> 38 <211> 167 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ΗΤΝΕ с заменой на РАБКЕ <220>

<221> Мутаген <222> (84)..(96) <223> Связывающий все типы БК пептид (РАБКЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(84) <223> Аминокислоты ΜΝΕ1-84 <220>

<221> разные признаки <222> (97)..(167) <223> Аминокислоты ΜΝΕ87-157 <400> 38

Уа1 Агд Зег Зег Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз Рго Уа1 А1а ΗΪ3 Уа1

1

5

10

15

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

85

90

95

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

100

105

110

- 75 007810

Агд

С1и ТЬг 115

Рго

С1и С1у А1а 61и А1а Ьуз Рго Тгр Туг 61и Рго

Не

120

125

Туг

Ьеи

61у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

61и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

130

135

140

61и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Зег

61 у

61п

Уа1

145

150

155

160

Туг РЬе 61у 11е Не А1а Ьеи

165 <210> 39 <211> 157 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с заменой на РАВКЕ <220>

<221> Мутаген <222> (133)..(147) <223> Связывающий все типы ЕН пептид (РАВКЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(132) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ1-132 <220>

<221> разные признаки <222> (148)..(157) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ148-157 <400> 39

Уа1 Агд Зег Зег Зег

Агд ТЬг

Рго Зег Азр Ьуз Рго Уа1 А1а Нхз

Уа1

1

5

10

15

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61 у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

- 76 007810

Ьуз 65

61у

С1п

С1у Суз

Рго 70

Зег

ТЬг

ΗΪ3 Уа1

Ьеи 75

Ьеи ТЬг

НЬз

ТЬг

Не 80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

100

105

110

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

115

120

125

С1у Азр

Агд

Ьеи

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

130

135

140

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

01 у

Не

Не

А1а

Ьеи

145

150

155

<210> 40 <211> 160 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫГ с заменой на ΡΑϋΚΕ <220>

<221> Мутаген <222> (136)..(148) <223> Связывающий все типы ΌΡ пептид (ΡΑΌΕΕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(135) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ1-135 <220>

<221> разные признаки <222> (149)..(160) <223> Аминокислоты 11ΤΝΕ14 6-157 <400>40

Уа1 Агд Зег Зег Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз Рго Уа1 А1а ΗΪ8 Уа1 15 1015

Уа1 А1а Азп Рго С1п А1а С1и С1у С1п Ьеи С1п Тгр Ьеи Азп Агд Агд 20 2530

- 77 007810

А1а Азп А1а Ьеи Ьеи А1а Азп С1у Уа1 61и Ьеи Агд Азр Азп 61п Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

65

70

75

80

5ег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

100

105

110

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

115

120

125

61 у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

130

135

140

Ьуз

А1а

А1а

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

145 150 155 160 <210> 41 <211> 157 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫГ с заменой на РАОК.Е <220>

<221> Мутаген <222> (64)..(76) <223> Связывающий все типы ΌΚ пептид (ΡΑΌΚΕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(63) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ1-63 <220>

<221> разные признаки <222> (77)..(157) <223> Аминокислоты ΜΝΕ77-157

- 78 007810 <400> 41

Уа1 Агд 1

Зег Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр

Ьуз

Рго Уа1 А1а

Η13 15

Уа1

5

10

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61 у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

А1а

50

55

60

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

ТЫ

ΗΪ3

ТЬг

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

100

105

110

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61 у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61 и

Ьуз

115

120

125

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

130

135

140

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

А1а

Ьеи

145

150

155

<210> 42 <211> 157 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с заменой на РАББЕ <220>

<221> Мутаген <222> (72)..(84) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (1)..(71)

- 79 007810 <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ1-71 <220>

<221> разные признаки <222> (85)..(157) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ85-157 <400> 42

Уа1 Агд Зег Зег 1

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго Уа1 А1а

ΗΪ3 Уа1 15

5

10

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

61и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

А1а

А1а

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

100

105

110

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

115

120

125

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

130

135

140

А1а

С1и

Зег С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

145 150 155 <210> 43 <211> 157 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с заменой на РАБНЕ

- 80 007810 <220>

<221> Мутаген <222> (127)..(139) <223> Связывающий все типы БВ. пептид (РАБВЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(126) <223> Аминокислоты ЬТЫГ1-126 <220>

<221> разные признаки <222> (140)..(157) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ140-157 <400> 43

Уа1 Агд 1

Зег Зег

Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а ΗΪ3 Уа1 15

5

10

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

61п

61 у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

100

105

110

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

А1а

Ьуз

115

120

125

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

130

135

140

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

Не

А1а

Ьеи

145

150

155

- 81 007810 <210> 44 <211> 176 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с встроенным пептидом и дупликацией 6 аминокислот <220>

<221> Мутаген <222> (109)..(121) <223> Связывающий все типы ББ пептид (РАББЕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(108) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ1-108 <220>

<221> разные признаки <222> (122)..(176) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ103-157 <400> 44

Уа1 Агд 1

Зег Зег Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго Уа1

А1а

Нхз 15

Уа1

5

10

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

61п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

61у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

110

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

115

120

125

61и

А1а Ьуз Рго Тгр Туг С1и Рго 11е Туг Ьеи С1у С1у Уа1

РЬе 61п

130

135

140

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

145

150

155

160

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

165

170

175

<210> 45 <211> 174 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬТЫЕ с встроенным пептидом и дупликацией 4 аминокислот <220>

<221> Мутаген <222> (109)..(121) <223> Связывающий все типы ΌΚ. пептид (ΡΑΌΗΕ) <220>

<221> разные признаки <222> (1)..(108) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ1-108 <220>

<221> разные признаки <222> (122)..(174) <223> Аминокислоты ΗΤΝΕ105-157 <400> 45

Уа1 Агд Зег Зег Зег

Агд ТЬг

Рго Зег Азр 10

Ьуз

Рго

Уа1 А1а

ΗΪ3 15

Уа1

1

5

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

20

25

30

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

50

55

60

- 83 007810

Ьуз

61у

б1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

85

90

95

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

100

105

110

А1а

А1а

Тгр

ТЫ

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

ТЬг

Рго

61и

С1у

А1а

С1и

А1а

115

120

125

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

130

135

140

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

145

150

155

160

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

61 у

11е

11е

А1а

Ьеи

165 170 <210> 46 <211> 194 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ΗΤΝΓ с встроенными эпитопами Р2 и РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> Мутаген <222> (110)..(124) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина (ЗЕО 1Б N0: 2) <220>

<221> Мутаген <222> (125)..(145) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина (ЗЕО Ю N0: 3) <220>

<221> разные признаки <222> (2)..(109) <223> Аминокислоты ΗΤΝΓ1-108 <220>

<221> разные признаки <222> (146)..(194) <223> Аминокислоты ΜΝΕΊ09-157

- 84 007810 <400> 46

МеЕ 1

Уа1

Агд Зег Зег Зег 5

Агд ТЬг

Рго Зег Азр 10

Ьуз

Рго

Уа1

А1а Н18 15

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

50

55

60

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

65

70

75

80

11е

5ег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

С1п

Туг

11е

100

105

110

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

С1у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

РЬе

Азп

Азп

РЬе

115

120

125

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

130

135

140

С1и

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

145

150

155

160

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

165

170

175

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Зег

С1у

61п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не'

180

185

190

А1а Ьеи <210> 47 <211> 194 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

- 85 007810 <223> ΠΤΝΓ с встроенными эпитопами Р2 и РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> Мутаген <222> (110) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> Мутаген <222> (131)·.(145) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (2)..(109) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ1-108 <220>

<221> разные признаки <222> (146)..(194) <223> Аминокислоты ЬТЫЕ 109-157 <400> 47

МеН 1

Уа1 Агд

Зег

Зег Зег Агд 5

ТЬг Рго Зег Азр Ьуз 10

Рго

Уа1

А1а ΗΪ3 15

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

С1у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

50

55

60

РЬе

Ьуз

61у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

65

70

75

80

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

РЬе

Азп

Азп

100

105

110

- 86 007810

РЬе ТЬг Уа1 Зег РЬе 115

Тгр Ьеи Агд 120

Уа1

Рго Ьуз Уа1 Зег А1а Зег ΗΪ3 125

Ьеи

61и

С1п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

С1у

11е

ТЬг

С1и

130

135

140

Ьеи

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

145

150

155

160

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

61у Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

165

170

175

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

180

185

190

А1а Ьеи <210> 48 <211> 1545 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 последовательности ЬТЫГ, соединенные глициновыми линкерами и эпитопами Р2 и РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (475)..(483) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (4)..(474) <223> ЬТЫГ <220>

<221> разные признаки <222> (1072)..(1542) <223> ΗΤΝΓ <220>

<221> разные признаки <222> (529)..(999) <223> ЬТЫЕ <220>

<221> разные признаки

- 87 007810 <222> (1000)..(1008) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (1009)..(1071) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> СБЗ <222> (1)..(1545) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (484)..(528) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <400> 48

аБд дЬд сдс аде

аде аде Зег Зег 5

сдс асе ссс аде дас аад ссс дБд дсс сас

48

МеБ 1

Уа1 Агд

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег 10

Азр Ьуз

Рго

Уа1 А1а 15

ΗΪ3

дЬд

дЬд

дсс

аас

ссс

сад

дсс

дад

ддс

саа

сБд

сад

Ьдд

сБд

аас

сдс

96

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

61у

С1п

Ьеи

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

сдс

дсс

аас

дсс

сБд

сБд

дса

аас

ддс

дЬд

дад

сБд

сдс

дас

аас

сад

144

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

Сид

дЬд

дид

ссс

аде

дад

ддс

Сид

Бас

сЕд

аы.

иаи

аде

СЗу

дид

Сид

Л П6 X 7 4.

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

50

55

60

ББс

аад

ддс

сад

ддс

Бдс

ссс

аде

асе

сас

дЬд

сБд

сБд

асе

сас

асе

240

РЬе

Ьуз

С1у

ΘΙη

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Н1з

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Н1з

ТЬг

65

70

75

80

аБс

аде

сдс

аБс

дсс

дЬд

аде

Бас

сад

асе

аад

дЬд

аас

сБд

сБд

аде

288

11е

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дсс

аБс

аад

аде

ссс

Бдс

сад

сдс

дад

асе

ссс

дад

ддс

дсс

дад

дсс

336

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

100

105

110

аад

ссс

Ьдд

Бас

дад

ссс

аБс

Бас

сБс

ддс

ддс

дЪд

ББс

сад

сБд

дад

384

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

ΘΙη

Ьеи

С1и

115

120

125

аад

ддс

дас

сдс

сБд

аде

дсс

дад

аБс

аас

сдс

ссс

дас

Бас

сБд

дас

432

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

- 88 007810

иис дсс дад аде ддс сад д£д РЬе А1а С1и Зег 61у 61п Уа1

иас иис ддс Туг РЬе С1у

аис 11е 155

аис Не

дсс сид дди А1а Ьеи С1у

ддс С1у 160

480

145

150

дда

сад

иас

аис

ааа

дси

аас

исс

ааа

иис

аис

ддс

аис

асе

даа

сид

528

61у

С1п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

165

170

175

дис

едд

исс

исс

исс

едд

аса

сса

исс

дас

ааа

сса

дис

дси

саи

дис

576

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

Уа1

180

185

190

дис

дси

ааи

сса

саа

дси

даа

дди

саа

сии

саа

идд

сии

ааи

едд

едд

624

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

195

200

205

дси

ааи

дси

сии

сии

дси

ааи

дди

дис

даа

сии

едд

дас

ааи

саа

сии

672

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

210

215

220

ди с

ди с

сса

исс

даа

дди

сии

иаи

сии

аии

иаи

исс

саа

дис

сии

иии

720

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

225

230

235

240

ааа

дди

саа

дди

иди

сса

исс

аса

саи

дис

сии

сии

аса

саи

аса

аии

768

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

245

250

255

исс

едд

аии

дси

дис

исс

иаи

саа

аса

ааа

дис

ааи

сии

сии

исс

дси

816

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

260

265

270

аии

ааа

исс

сса

иди

саа

едд

даа

аса

сса

даа

дди

дси

даа

дси

ааа

864

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

61и

А1а

Ьуз

275

280

285

сси

идд

иаи

даа

сса

аии

иаи

сии

ддк

дди

дЬс

иии

саа

сии

даа

ааа

912

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

290

295

300

ддЬ

дас

едд

сии

исс

дси

даа

аии

ааи

едд

сса

дай

иаи

сии

дас

иии

960

(31 у Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

305

310

315

320

дси

даа

исс

дди

саа

дис

иаи

иии

дди

аии

аии

дси

сид

ддс

дди

ддд

1008

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

Не

А1а

Ьеи

С1у

61у

61у

325

330

335

иис

аас

аас

иис

асе

дии

исс

иис

идд

сид

сдс

дии

сса

ааа

дии

исс

1056

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

340

345

350

дсЬ

Ьсс

сас

сид

даа

дии

сдЬ

иси

иск

иск

едк

асд

ссд

Ьск

дак

аад

1104

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

355

360

365

ссд

дии

дед

сас

дии

дии

дед

аас

ссд

сад

дед

дад

ддд

саа

иид

сад

1152

Рго

Уа1

А1а

Н1з

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

С1и

61у

С1п

Ьеи

С1п

370 375 380

- 89 007810

Бдд ББд Тгр Ьеи 385

ааБ Азп

сдБ Агд

сдБ дед аас дед

ББд ББд дед ааБ

ддд д^Б С1у Уа1

даа ББд С1и Ьеи 400

1200

Агд

А1а 390

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а 395

Азп

сдБ

даБ

аас

саа

ББд

дББ

дББ

ссд

БсБ

дад

ддд

ББд

Бас

ББд

аБа

БаБ

1248

Агд

Азр

Азп

Б1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

405

410

415

БсБ

сад

дББ

ББд

ББс

ааа

ддд

саа

ддд

Бдс

ссд

БсБ

асд

саБ

дББ

ББд

1296

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

61у

С1п

(31 у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

420

425

430

ББд

асд

сас

асд

аБа

БсБ

сдБ

аБа

дед

дББ

БсБ

Бас

сад

асд

аад

дББ

1344

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

435

440

445

ааБ

ББд

ББд

БсБ

дед

аБа

ааа

БсБ

ссд

БдБ

саа

сдБ

даа

асд

ссд

даа

1392

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

450

455

460

ддд

дед

дад

дед

аад

ссд

Бдд

БаБ

даа

ссд

аБа

Бас

ББд

ддд

ддд

дББ

1440

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

465

470

475

480

БББ

сад

ББд

даа

ааа

ддд

даБ

сдБ

ББд

БсБ

дед

дад

аБа

аас

сдБ

ссд

1488

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

485

490

4 95

дас

БаБ

ББд

даБ

ББс

дед

даа

БсБ

ддд

саа

дББ

Бас

БББ

ддд

аБа

аБа

1536

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

500 505 510 дед сБд Баа1545

А1а Ьеи <210>49 <211>514 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 последовательности ЬТЫЕ, соединенные глициновыми линкерами и эпитопами Р2 и РЗО столбнячного анатоксина <400> 49

МеБ

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Н1з

1

5

10

15

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

- 90 007810

Ьеи Уа1

Уа1

Рго Зег С1и

С1у 55

Ьеи Туг

Ьеи

Не

Туг 60

Зег

С1п

ν3ι

Ьеи

50

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Н1з

ТЬг

65

70

75

80

Не

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

100

105

110

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

115

120

125

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

145

150

155

160

С1у

С1п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

С1у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

165

170

175

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

Уа1

180

185

190

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

195

200

205

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

210

215

220

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

225

230

235

240

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Н13

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Н1з

ТЬг

Не

245

250

255

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

260

265

270

- 91 007810

11е Ьуз Зег Рго 275

Суз С1п Агд С1и ТЬг Рго С1и 280

61у

А1а 285

61и А1а Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

290

295

300

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

305

310

315

320

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

61у

61у

61у

325

330

335

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

340

345

350

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

61и

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

355

360

365

Рго

Уа1

А1а

Н1з

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

370

375

380

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

385

390

395

400

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

405

410

415

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

420

425

430

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

435

440

445

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

450

455

460

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

4 65

470

475

480

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

61у Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

Рго

485

490

4 95

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

500 505 510

- 92 007810

А1а Ьеи <210> 50 <211> 1545 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 мономера ΜΝΕ, соединенные триглициновыми линкерами и эпитопами Р2 и РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> СЦЗ <222> (1)..(1545) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (1072)..(1542) <223> ΗΤΝΕ <220>

<221> разные признаки <222> (547)..(1017) <223> ЬТЫГ <220>

<221> разные признаки <222> (475)..(483) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (484)..(546) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (1018)..(1026) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (1027)..(1071) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (4)..(474) <223> ЬТЫГ

- 93 007810 <400> 50

акд дед Мек Уа1 1

сдс аде

аде аде сдс асе ссс аде дас аад ссс дед дсс сас

48

Агд

Зег

Зег Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго

Уа1

А1а 15

ΗΪ3

5

10

дкд

дед

дсс

аас

ссс

сад

дсс

дад

ддс

саа

сед

сад

едд

сед

аас

сдс

96

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

ΘΙη

А1а

С1и

С1у

ΘΙη

Ьеи

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

сдс

дсс

аас

дсс

сед

сед

дса

аас

ддс

дед

дад

сед

сдс

дас

аас

сад

144

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

б1у

Уа1

б1и

Ьеи

Агч

Азр

Азп

С1п

35

40

45’

сед

дед

дед

ССС

аде

дад

ддс

сед

еас

сед

аес

еас

аде

сад

дед

сед

192

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

50

55

60

еес

аад

ддс

сад

ддс

еде

ссс

аде

асе

сас

дед

сед

сед

асе

сас

асе

240

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

НЬз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

65

70

75

80

аес

аде

сдс

аес

дсс

дед

аде

еас

сад

асе

аад

дед

аас

сед

сед

аде

288

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дсс

аес

аад

аде

ссс

еде

сад

сдс

дад

асе

ссс

дад

ддс

дсс

дад

дсс

336

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

ΘΙη

Агд

С1и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

С1и

А1а

100

105

110

аад

ССС

едд

еас

дад

ссс

аес

еас

се с

ддс

ддс

дед

еес

сад

сед

дад

384

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

б1у

С1у

Уа1

РЬе

ΘΙη

Ьеи

С1и

115

120

125

аад

ддс

дас

сдс

сед

аде

дсс

дад

аес

аас

сдс

ссс

дас

еас

сед

дас

432

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

еес

дсс

дад

аде

ддс

сад

дед

еас

еес

ддс

аес

аес

дсс

сед

дде

ддс

480

РЬе

А1а

61и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

С1у

С1у

145

150

155

160

дда

еес

аас

аас

еес

асе

дее

есс

еес

едд

сед

сдс

дее

сса

ааа

дее

528

С1у

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

165

170

175

есс

дсе

есс

сас

сед

даа

дес

едд

есс

есс

есс

едд

аса

сса

есс

дас

576

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

180

185

190

ааа

сса

дес

дсе

сае

дес

дес

дсе

аае

сса

саа

дсе

даа

дде

саа

сее

624

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

ΘΙη

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

195

200

205

саа

едд

сее

аае

едд

едд

дсе

аае

дсе

сее

сее

дсе

аае

дде

дес

даа

672

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

С1и

210 215 220

екк сдд дас аак

саа екк 61п Ьеи 230

дке дке Уа1 Уа1

сса Рго

ксс Зег

даа 61 и 235

ддк С1у

екк Ьеи

как Туг

екк Ьеи

акк Не 240

720

Ьеи 225

Агд Азр

Азп

как

ксс

саа

дке

екк

ккк

ааа

ддк

саа

ддк

кдк

сса

ксс

аса

сак

дке

768

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

61у

61п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Ηί3

Уа1

245

250

255

екк

екк

аса

сак

аса

акк

ксс

сдд

акк

дек

дке

ксс

как

саа

аса

ааа

816

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

260

265

270

дке

аак

екк

екк

ксс

дек

акк

ааа

ксс

сса

кдк

саа

сдд

даа

аса

сса

864

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

275

280

285

даа

ддк

дек

даа

дек

ааа

сек

кдд

как

даа

сса

акк

как

екк

ддк

ддк

912

61и

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

61у

61у

290

295

300

дке

ккк

саа

екк

даа

ааа

ддк

дас

сдд

екк

ксс

дек

даа

акк

аак

сдд

960

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

61и

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

305

310

315

320

сса

дак

как

екк

дас

ккк

дек

даа

ксс

ддк

саа

дке

как

ккк

ддк

акк

1008

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

325

330

335

акк

дек

скд

ддс

ддк

ддд

сад

кас

акс

ааа

дек

аас

ксс

ааа

ккс

акс

1056

11е

А1а

Ьеи

61у

С1у

61у

61п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

340

345

350

ддс

акс

асе

даа

скд

дкк

едк

кек

кек

кек

едк

асд

сед

кек

дак

аад

1104

61у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

355

360

365

сед

дкк

дед

сас

дкк

дкк

дед

аас

сед

сад

дед

дад

ддд

саа

ккд

сад

1152

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

61у

С1п

Ьеи

61п

370

375

380

кдд

ккд

аак

едк

едк

дед

аас

дед

ккд

ккд

дед

аак

ддд

дкк

даа

ккд

1200

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

385

390

395

400

едк

дак

аас

саа

ккд

дкк

дкк

сед

кек

дад

ддд

ккд

кас

ккд

ака

как

1248

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

405

410

415

кек

сад

дкк

ккд

ккс

ааа

ддд

саа

ддд

кде

сед

кек

асд

сак

дкк

ккд

1296

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

420

425

430

ккд

асд

сас

асд

ака

кек

едк

ака

дед

дкк

кек

кас

сад

асд

аад

дкк

1344

Ьеи

ТЬг

Ηί3

ТЬг

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

435

440

445

аак

ккд

ккд

кек

дед

ака

ааа

кек

сед

кдк

саа

едк

даа

асд

сед

даа

1392

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

450 455 460

ддд дед дад дед аад

ссд бдд баб даа ссд аба бас ббд ддд ддд дбб

1440

С1у А1а С1и 465

А1а

Ьуз

Рго 470

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не Туг Ьеи С1у С1у Уа1

475

480

ббб

сад

ббд

даа

ааа

ддд

даб

едб

ббд

бсб

дед

дад

аба

аас

едб

ссд

1488

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

485

4 90

495

дас

баб

ббд

даб

ббс

дед

даа

бсб

ддд

саа

дбб

бас

ббб

ддд

аба

аба

1536

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

ΘΙη

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

500

505

510

дед ебд баа1545

А1а Ьеи <210>51 <211>514 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 мономера ΜΝΕ¹, соединенные триглициновыми линкерами и эпитопами Р2 и РЗО столбнячного анатоксина <400> 51

Меб Уа1 1

Агд Зег Зег Зег Агд ТЬг Рго Зег Азр Ьуз

Рго

Уа1

А1а 15

Нхз

5

10

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

ΘΙη

А1а

б1и

61у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

ΘΙη

35

40

45

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

50

55

60

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Ηίβ

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нбз

ТЬг

65

70

75

80

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

ΘΙη

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

61и

А1а

100

105

110

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

61и

115

120

125

Ьуз С1у Азр 130

Агд Ьеи

Зег А1а 135

С1и 11е Азп

Агд Рго 140

Азр Туг

Ьеи Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

145

150

155

160

С1у

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

165

170

175

Зег

А1а

Зег

Н1з

Ьеи

С1и

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

180

185

190

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

61у

С1п

Ьеи

195

200

205

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

210

215

220

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

225

230

235

240

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

245

250

255

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

260

265

270

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

275

280

285

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

290

295

300

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

О1и

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

305

310

315

320

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

325

330

335

Не

А1а

Ьеи

61у

С1у

С1у

С1п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

340

345

350

- 97 007810

С1у 11е ТЬг 61и

Ьеи

Уа1

Агд

Зег Зег Зег Агд ТЬг Рго

Зег

Азр

Ьуз

355

360

365

Рго

Уа1

А1а

Нхз

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

370

375

380

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

385

390

395

400

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

405

410

415

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

420

425

430

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

435

440

445

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

450

455

460

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

465

470

475

480

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

61 у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

485

4 90

495

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

500 505 510

А1а Ьеи <210>52 <211>1554 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность' <220>

<223> 3 мономера ΗΤΝΕ,соединенные триглициновыми линкерами и с введенными эпитопами Р2 и РЗО <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(1554) <223>

<220>

- 98 007810 <221> разные признаки <222> (4)..(474) <223> ΗΤΝΓ <220>

<221> разные признаки <222> (475)..(483) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (484)..(954) <223> ЬТЫЕ <220>

<221> разные признаки <222> (955)..(963) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (964)..(1008) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (1009)..(1479) <223> ЬТЫЕ <220>

<221> разные признаки <222> (1480)..(1488) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (1489)..(1551) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина

<400> 52 абд дбд сдс Меб Уа1 Агд 1

аде Зег

аде Зег 5

аде Зег

сдс Агд

асе ТЬг

ссс Рго

аде Зег 10

дас Азр

аад Ьуз

ссс Рго

дбд Уа1

дсс А1а 15

сас Н1з

48

дбд

дбд

дсс

аас

ссс

сад

дсс

дад

ддс

саа

сбд

сад

бдд

сбд

аас

сдс

96

Уа1

57а1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

С1у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

сдс

дсс

аас

дсс

сбд

сбд

дса

аас

ддс

дбд

дад

сбд

сдс

дас

аас

сад

144

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

- 99 007810

скд дкд дкд ссс

аде Зег

дад ддс

скд кас скд акс кас аде сад дкд скд

192

Ьеи Уа1

Уа1

Рго

С1и

С1у 55

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг Зег 60

31п

Уа1

Ьеи

50

ккс

аад

ддс

сад

ддс

кде

ссс

аде

асе

сас

дкд

скд

скд

асе

сас

асе

240

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЫ

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

НЬз

ТЬг

65

70

75

80

а€с

аде

сдс

акс

дсс

дЪд

аде

кас

сад

асе

аад

дкд

аас

скд

скд

аде

288

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дсс

акс

аад

аде

ссс

кде

сад

сдс

дад

асе

ссс

дад

ддс

дсс

дад

дсс

336

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

31и

С1у

А1а

61и

А1а

100

105

110

аад

ссс

Ьдд

Ьас

дад

ссс

акс

кас

скс

ддс

ддс

дкд

кЛс

сад

скд

дад

384

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

115

120

125

аад

ддс

да с

сдс

скд

аде

дсс

дад

акс

аас

сдс

ссс

дас

кас

скд

дас

432

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

ккс

дсс

дад

аде

ддс

сад

дЬд

Ьас

(+с

ддс

акс

акс

дсс

скд

ддк

ддс

480

РЬе

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

61у

145

150

155

160

дда

дЪс

сдд

ксс

ксс

ксс

сдд

аса

сса

ксс

дас

ааа

сса

дке

дек

сак

528

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

165

170

175

дке

дке

дек

аак

сса

саа

дек

даа

ддЪ

саа

екк

саа

кдд

екк

аак

сдд

576

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

сдд

дек

аак

дек

с!1

екк

дек

ааЬ

ддк

дке

даа

екк

сдд

дас

аак

саа

624

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

31и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

195

200

205

скЬ

дке

дке

сса

ксс

даа

ддЬ

сЬк

как

екк

акк

как

ксс

саа

дке

сЪк

672

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

210

215

220

ккк

ааа

ддк

саа

ддк

ЬдЬ

сса

ксс

аса

сак

дке

екк

екк

аса

сак

аса

720

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

225

230

235

240

аСС

Ссс

сдд

а€к

дсЬ

дЪс

ксс

как

саа

аса

ааа

дке

аак.

екк

екк

Ьсс

768

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

дс±

акк

ааа

ксс

сса

Ьдк

саа

сдд

даа

аса

сса

даа

ддк

дек

даа

дек

816

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

31у

А1а

61и

А1а

260 265 270

- 100 007810

ааа ссН Ндд

НаН даа сса аНН

НаН еНН ддН ддН дНе ИНН

саа С1п

еНН даа Ьеи 51и

864

Ьуз Рго

Тгр 275

Туг 61и

Рго 11е

Туг Ьеи 280

С1у С1у Уа1

РЬе 285

ааа

ддН

дас

едд

еНН

Нее

дсН

даа

аНН

ааН

едд

сса

даН

НаН

еНН

дас

912

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290

295

300

НИН

дсН

даа

Нее

ддН

саа

дНе

НаН

ННН

ддН

аНН

аНН

дсН

сНд

ддс

ддН

960

РЬе

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

61у

61у

305

310

315

320

ддд

сад

Нас

аНс

ааа

дсН

аас

Нее

ааа

ННс

аНс

ддс

аНс

асе

даа

сНд

1008

61у

61п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

С1у

Не

ТЬг

61и

Ьеи

325

330

335

дин

едП

И сП

НсН

НсН

едН

асд

сед

НсН

даН

аад

сед

дНН

дед

сас

дНН

1056

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Н1з

Уа1

340

345

350

дни

дед

аас

сед

сад

дед

дад

ддд

саа

ННд

сад

Ндд

ННд

ааН

едН

едН

1104

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

355

360

365

дед

аас

дед

ННд

ННд

дед

ааН

ддд

дНН

даа

ННд

едН

даН

аас

саа

ННд

1152

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

01п

Ьеи

370

375

380

дНН

дНН

сед

НсН

дад

ддд

ННд

Нас

ННд

аНа

НаН

НсН

сад

дНН

ННд

ННс

1200

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

385

390

395

400

ааа

ддд

саа

ддд

Иде

сед

НсН

асд

саН

дНН

ННд

ННд

асд

сас

асд

аНа

1248

Ьуз

61у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Н1з

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

Не

405

410

415

НсН

едП

аНа

дед

дНН

НсН

Нас

сад

асд

аад

дНН

ааН

ННд

ННд

НсН

дед

1296

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

420

425

430

аНа

ааа

И сП

сед

НдН

саа

едН

даа

асд

сед

даа

ддд

дед

дад

дед

аад

1344

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

435

440

445

ссд

Ндд

НаН

даа

сед

аНа

Нас

ННд

ддд

ддд

дНН

ннн

сад

ННд

даа

ааа

1392

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Пе

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

450

455

460

ддд

даН

едН

ННд

НсН

дед

дад

аНа

аас

едН

сед

дас

НаН

ННд

даН

ННс

1440

61у Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

465

470

475

480

дед

даа

НсН

ддд

саа

дНН

Нас

ннн

ддд

аНа

аНа

дед

сНд

ддН

ддс

дда

1488

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

61у

61у

485

490

495

ННс

аас

аас

пне

асе

дНН

Нее

ННс

Ндд

сНд

еде

дНН

сса

ааа

дНН

Нее

1536

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

500 505 510

- 101 007810 дсЕ Есс сас сЕд даа Еаа1554

А1а Зег ΗΪ8 Ьеи 61и

515 <210>53 <211>517 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 мономера ΜΝΕ,соединенные триглициновыми линкерами и

с введенными эпитопами Р2 и РЗО

<400>

53

МеЕ

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

1

5

10

15

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61 у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

35

40

45

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

50

55

60

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

65

70

75

80

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

61 у

А1а

С1и

А1а

100

105

110

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

115

120

125

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

РЬе

А1а

61и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

А1а

Ьеи

61у

61у

145

150

155

160

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

НЬз

165 170 175

- 102 007810

Уа1 Уа1 А1а Азп Рго С1п А1а С1и 61у С1п Ьеи С1п Тгр Ьеи Азп Агд

180

185

190

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

195

200

205

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

210

215

220

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

225

230

235

240

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

260

265

270

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

275

280

285

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290

295

300

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

305

310

315

320

61у

С1п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

61у

11е

ТЬг

С1и

Ьеи

325

330

335

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

340

345

350

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

355

360

365

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

370

375

380

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

385 390 395 400

- 103 007810

Ьуз

С1у С1п

61у

Суз 405

Рго

Зег ТЬг

ΗΪ3

Уа1 Ьеи Ьеи 410

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг 415

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

420

425

430

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

435

440

445

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

61 у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

Ьуз

450

455

460

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

465

470

475

480

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

А1а

Ьеи

61у

61у

61у

485

490

495

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

500

505

510

А1а Зег ΗΪ3 Ьеи С1и

515 <210> 54 <211> 1485 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 ΗΤΝΕ, соединенные триглициновыми линкерами, и с добавленным с С-конца РАОКЕ <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(1485) <223>

<220>

<221> разные признаки η Н ! А X ! Л Ч А X \Ч ) . . I Ч / Ч ) <223> ΗΤΝΓ <220>

<221> разные признаки <222> (484)..(954) <223> ΗΤΝΕ <220>

<221> разные признаки

- 104 007810 <222> (955)..(963) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (964)..(1034) <223> ЬТЫЕ <220>

<221> разные признаки <222> (1035)..(1043) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (1044)..(1482) <223> Связывающий все типы ΏΚ пептид (ΡΑΌΚΕ) <220>

<221> разные признаки <222> (475)..(483) <223> Трициклиновый линкер <400> 54

аБд дБд сдс аде аде аде сдс асе ссс аде дас аад ссс дБд

дсс А1а 15

сас ΗΪ3

48

МеБ Уа1 1

Агд Зег

Зег 5

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег 10

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

ГГ^ГГ

Лг+- ΖΎ

зап

'’СС

гагг

гтг'г*·

ггагт

ГТ ГТ Г»

саа

П+ТТ

Г’ЯГГ

1-гггг

Г^· ГТ

ззс

ГГТГ·

96

дсс

— * ·3

5

'•'и —

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

сдс

дсс

аас

дсс

сБд

сБд

дса

аас

ддс

дБд

дад

сБд

сдс

дас

аас

сад

144

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

35

40

45

сБд

дБд

дБд

ссс

аде

дад

ддс

сБд

Бас

сБд

аБс

Бас

аде

сад

дБд

сБд

192

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

61 у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

50

55

60

ББс

аад

ддс

сад

ддс

Бдс

ссс

аде

асе

сас

дБд

сБд

сБд

асе

сас

асе

240

РЬе

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Η13

ТЬг

65

70

75

80

аБс

аде

сдс

аБс

дсс

дБд

аде

Бас

сад

асе

аад

дБд

аас

сБд

сБд

аде

288

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дсс

аБс

аад

аде

ссс

Бдс

сад

сдс

дад

асе

ссс

дад

ддс

дсс

дад

дсс

336

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

100

105

110

- 105 007810

аад ссс бдд бас дад ссс

абс бас сбс ддс ддс дбд ббс сад сбд дад

384

Ьуз Рго

Тгр Туг 115

61и

Рго

11е

Туг Ьеи 120

61у

61у Уа1 РЬе 125

61п Ьеи

61и

аад

ддс

дас

сдс

сбд

аде

дсс

дад

абс

аас

сдс

ссс

дас

бас

сбд

дас

432

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

ббс

дсс

дад

аде

ддс

сад

дбд

бас

ббс

ддс

абс

абс

дсс

сбд

ддб

ддс

480

РЬе

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

А1а

Ьеи

61у

61у

145

150

155

160

дда

дбс

сдд

бсс

бсс

бсс

сдд

аса

сса

бсс

дас

ааа

сса

дбс

дсб

саб

528

61у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

165

170

175

дбс

дбс

дсб

ааб

сса

саа

дсб

даа

ддб

саа

ебб

саа

бдд

ебб

ааб

сдд

576

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

сдд

дсб

ааб

дсб

ебб

ебб

дсб

ааб

ддб

дбс

даа

ебб

сдд

дас

ааб

саа

624

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

195

200

205

ебб

дбс

дбс

сса

бсс

даа

ддб

ебб

баб

ебб

абб

баб

бсс

саа

дбс

ебб

672

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

210

215

220

ббб

ааа

ддб

саа

ддб

бдб

сса

бсс

аса

саб

дбс

ебб

ебб

аса

саб

аса

720

РЬе

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

225

230

235

240

абб

бсс

сдд

абб

дсб

дбс

бсс

баб

саа

аса

ааа

дбс

ааб

ебб

ебб

бсс

768

Не

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

дсб

абб

ааа

бсс

сса

бдб

саа

сдд

даа

аса

сса

даа

ддб

дсб

даа

дсб

816

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

260

265

270

ааа

ссб

бдд

баб

даа

сса

абб

баб

ебб

ддб

ддб

дбс

ббб

саа

ебб

даа

864

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

61 у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

275

280

285

ааа

ддб

дас

сдд

ебб

бсс

дсб

даа

абб

ааб

сдд

сса

даб

баб

ебб

дас

912

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290

295

300

ббб

дсб

даа

бсс

ддб

саа

дбс

баб

ббб

ддб

абб

абб

дсб

сбд

ддс

ддб

960

РЬе

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61 у

11е

11е

А1а

Ьеи

61у

61у

305

310

315

320

ддд

дбб

едб

бсб

бсб

бсб

едб

асд

ссд

бсб

даб

аад

ссд

дбб

дед

сас

1008

61у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

325

330

335

дбб

дбб

дед

аас

ссд

сад

дед

дад

ддд

саа

ббд

сад

бдд

ббд

ааб

едб

1056

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61 у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

340 345 350

- 106 007810

едк дед аас дед ккд

ккд дед

аак ддд дкк

даа 61и

ккд едк Ьеи Агд 365

дак Азр

аас Азп

саа С1п

1104

Агд

А1а

Азп А1а 355

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп 360

61у Уа1

ккд

дкк

дкк

ссд

кек

дад

ддд

ккд

кас

ккд

ака

как

кек

сад

дкк

ккд

1152

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

370

375

380

ккс

ааа

ддд

саа

ддд

кде

ссд

кек

асд

сак

дкк

ккд

ккд

асд

сас

асд

1200

РЬе

Ьуз

61у

ΘΙη

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

385

390

395

400

ака

кек

едк

ака

дед

дкк

кек

кас

сад

асд

аад

дкк

аак

ккд

ккд

кек

1248

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

405

410

415

дед

ака

ааа

кек

ссд

кдк

саа

едк

даа

асд

ссд

даа

ддд

дед

дад

дед

1296

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

420

425

430

аад

ссд

кдд

как

даа

ссд

ака

кас

ккд

ддд

ддд

дкк

ккк

сад

ккд

даа

1344

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

61у

Уа1

РЬе

ΘΙη

Ьеи

С1и

435

440

445

ааа

ддд

дак

едк

ккд

кек

дед

дад

ака

аас

едк

ссд

дас

как

ккд

дак

1392

Ьуз

С1у Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

450

455

4 60

ккс

дед

даа

кек

ддд

саа

дкк

кас

ккк

ддд

ака

ака

дед

скд

дда

ддд

1440

РЬе

А1а

61и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

С1у

61у

465

470

475

480

ддк

дсс

аад

ккс

дкд

дсс

дек

кдд

асс

скд

аад

дсс

дса

дек

каа

1485

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

485 490 <210> 55 <211> 494 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 ЬТЫЕ, соединенные триглициновыми линкерами, и с добавленным с С-конца РАББЕ <400> 55

Мек Уа1 Агд 1

Зег

Зег 5

Зег Агд ТЬг Рго Зег 10

Азр Ьуз

Рго

Уа1

А1а 15

Нхз

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

35

40

45

- 107 007810

Ьеи Уа1 Уа1 50

Рго

Зег С1и С1у 55

Ьеи Туг Ьеи

Не

Туг 60

Зег С1п

Уа1 Ьеи

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

65

70

75

80

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

<31п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

100

105

но

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

115

120

125

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

145

150

155

160

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

165

170

175

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

61и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

νβΐ

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

195

200

205

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1П

Уа1

Ьеи

210

215

220

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

225

230

235

240

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

(31и

А1а

260

265

270

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

275 280 285

- 108 007810

Ьуз

61у 290

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а С1и Не Азп Агд Рго Азр Туг

Ьеи

Азр

295

300

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

б1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

305

310

315

320

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

325

330

335

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

ΘΙη

Ьеи

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

340

345

350

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

ΘΙη

355

360

365

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

б1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

370

375

380

РЬе

Ьуз

01 у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

385

390

395

400

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

405

410

415

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

61и

С1у

А1а

С1и

А1а

420

425

430

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

435

440

445

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

450

455

4 60

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

61у

465

470

475’

480

С1у

А1а

Ьуз

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

485 490 <210> 56 <211> 1476 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 109 007810 <220>

<223> 3 ЬТЫГ, соединенные триглициновыми линкерами, и с добавленным с С-конца РАВКЕ <220>

<221> СБЗ <222> (1)..(1476) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (475)..(483) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (483)..(954) <223> ΗΤΝΕ <220>

<221> разные признаки <222> (484)..(954) <223> ЬТЫЕ <220>

<221> разные признаки <222> (955)..(963) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки <222> (964)..(1434) <223> ΗΤΝΓ <220>

<221> разные признаки <222> (1435)..(1473) <223> Связывающий все типы БК пептид(РАВРЕ) <220>

<221> разные признаки ζΟΟ'Κ ГЯ\ ΙΛΊΛΧ \ · -я !

<223> ЬТЫЕ <400> 56

аЬд МеЪ 1

дрд сдс аде аде аде

сдс Агд

асе ссс аде дас аад ссс дЬд

дсс сас А1а Ηίβ 15

48

Уа1 Агд Зег

Зег Зег 5

ТЬг

Рго

Зег 10

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

дрд

дрд

дсс

аас

ссс

сад

дсс

дад

ддс

саа

с+д

сад

Ьдд

с£д

аас

сдс

96

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

61п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

- 110 007810

сдс Агд

дсс аас дсс скд скд дса аас ддс дкд дад скд сдс дас аас сад

144

А1а Азп А1а 35

Ьеи

Ьеи А1а Азп 40

С1у

Уа1

С1и

Ьеи Агд Азр Азп 51п 45

скд

дкд

дкд

ссс

аде

дад

ддс

скд

кас

скд

акс

кас

аде

сад

дкд

скд

192

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

50

55

60

ккс

аад

ддс

сад

ддс

кде

ссс

аде

асе

сас

дкд

скд

скд

асе

сас

асе

240

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ8

ТЬг

65

70

75

80

акс

аде

сдс

акс

дсс

дкд

аде

кас

сад

асе

аад

дкд

аас

скд

скд

аде

288

11е

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дсс

акс

аад

аде

ссс

кде

сад

сдс

дад

асе

ссс

дад

ддс

дсс

дад

дсс

336

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

ΘΙη

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

61и

А1а

100

105

110

аад

ссс

кдд

кас

дад

ссс

акс

кас

скс

ддс

ддс

д£д

ккс

сад

скд

дад

384

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

б1у

Уа1

РЬе

ΘΙη

Ьеи

С1и

115

120

125

аад

ддс

дас

сдс

скд

аде

дсс

дад

акс

аас

сдс

ссс

дас

кас

скд

дас

432

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

ккс

дсс

дад

аде

ддс

сад

дкд

кас

ккс

ддс

акс

акс

дсс

скд

ддк

ддс

480

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

145

150

155

160

дда

дкс

сдд

ксс

ксс

ксс

сдд

аса

сса

ксс

дас

ааа

сса

дкс

дек

сак

528

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

165

170

175

дкс

дкс

дек

аак

сса

саа

дек

даа

ддк

саа

екк

саа

кдд

екк

аак

сдд

576

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

ΘΙη

А1а

61и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

сдд

дек

аак

дек

екк

екк

дек

аак

ддк

дкс

даа

екк

сдд

дас

аак

саа

624

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

195

200

205

екк

дкс

дкс

сса

ксс

даа

ддк

екк

как

екк

акк

как

ксс

саа

дкс

екк

672

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

210

215

220

ккк

ааа

ддк

саа

ддк

кдк

сса

ксс

аса

сак

дкс

екк

екк

аса

сак

аса

720

РЬе

Ьуз

С1у

ΘΙη

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

225

230

235

240

акк

ксс

сдд

акк

дек

дкс

ксс

как

саа

аса

ааа

дкс

аак

екк

екк

ксс

768

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245 250 255

- 111 007810

дсе а+ ааа есс

сса еде Рго Суз

саа едд даа аса сса С1п Агд С1и ТЬг Рго 265

даа дде дсе С1и 61у А1а 270

даа дсе С1и А1а

816

А1а

11е

Ьуз Зег 260

ааа

ссе

едд

еае

даа

сса

аее

еае

сее

дде

дде

дес

еее

саа

сее

даа

864

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

61у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

275

280

285

ааа

дде

дас

едд

сее

есс

дсе

даа

аее

аае

едд

сса

дае

еае

сее

дас

912

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290

295

300

еее

дсе

даа

есс

дде

саа

дес

еае

еее

дде

аее

аее

дсе

сед

ддс

дде

960

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

61 у

Не

Не

А1а

Ьеи

С1у

С1у

305

310

315

320

ддд

дее

еде

есе

есе

есе

еде

асд

ссд

есе

дае

аад

ссд

дее

дед

сас

1008

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

325

330

335

дее

дее

дед

аас

ссд

сад

дед

дад

ддд

саа

еед

сад

едд

еед

аае

еде

1056

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

61и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

340

345

350

еде

дед

аас

дед

еед

еед

дед

аае

ддд

дее

даа

еед

еде

дае

аас

саа

1104

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

355

360

365

еед

дее

дее

ссд

есе

дад

ддд

еед

еас

еед

аеа

еае

есе

сад

дее

еед

1152

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

ΘΙη

Уа1

Ьеи

370

375

380

еес

ааа

ддд

саа

ддд

еде

ссд

есе

асд

сае

дее

еед

еед

асд

сас

асд

1200

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

385

390

395

400

аеа

есе

еде

аеа

дед

дее

есе

еас

сад

асд

аад

дее

аае

еед

еед

есе

1248

11е

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

405

410

415

дед

аеа

ааа

есе

ссд

еде

саа

еде

даа

асд

ссд

даа

ддд

дед

дад

дед

1296

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

420

425

430

аад

ссд

едд

еае

даа

ссд

аеа

еас

еед

ддд

ддд

дее

еее

сад

еед

даа

1344

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

435

440

445

ааа

ддд

дае

еде

еед

есе

дед

дад

аеа

аас

еде

ссд

дас

еае

еед

дае

1392

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

450

455

460

еес

дед

даа

есе

ддд

саа

дее

еас

еее

ддд

аеа

аеа

дед

сед

дсс

аад

1440

РЬе

А1а

61и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

А1а

Ьуз

4 65

470

475

480

еес

дед

дсс

дсе

едд

асе

сед

аад

дсс

дса

дсе

еаа

1476

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

485 490

112 007810 <210> 57 <211> 491 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 ЬТЫГ, соединенные триглициновыми линкерами, и с

добавленным с С-конца РАББЕ

<400>

57

МеЕ

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

1

5

10

15

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

61 и

61 у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61 у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

35

40

45

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

50

55

60

РЬе

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

65

70

75

80

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

100

105

но

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61 у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

115

120

125

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

61п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

Не

А1а

Ьеи

61у

61у

145

150

155

160

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

165

170

175

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

С1и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180 185 190

- 113 007810

Агд А1а Азп

А1а Ьеи Ьеи А1а Азп 200

С1у Уа1

С1и

Ьеи Агд Азр 205

Азп

С1п

195

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

210

215

220

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

225

230

235

240

11е

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

А1а

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

01у

А1а

С1и

А1а

260

265

270

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

01 и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

01 и

275

280

285

Ьуз

О1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290

295

300

РЬе

А1а

С1и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

11е

11е

А1а

Ьеи

С1у

С1у

305

310

315

320

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

325

330

335

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1п

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

340

345

350

Агд А1а Азп

А1а

Ьеи Ьеи А1а Азп С1у Уа1 С1и Ьеи Агд Азр Азп

С1п

355

360

365

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

01и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

01п

Уа1

Ьеи

370

375

380

РЬе

Ьуз

О1у

С1п

О1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

НЬз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

385

390

395

400

11е

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

01п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

405

410

415

- 114 007810

А1а 11е Ьуз Зег Рго Суз 61п Агд 61и ТЬг Рго С1и С1у А1а С1и А1а

420

425

430

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

ΘΙη

Ьеи

С1и

435

440

445

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

450

455

460

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

ΘΙη

Уа1

Туг

РЬе

61у

11е

11е

А1а

Ьеи

А1а

Ьуз

465

470

475

480

РЬе

Уа1

А1а

А1а

Тгр

ТЬг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

А1а

485

490

<210> 58 <211> 1545 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 ЬТЫЕ, соединенные глициновыми линкерами, и с введенными Р2 и РЗО <220>

<221> СЬЗ <222> (1)..(1545) <223>

<220>

<221> разные признаки <222> (4)..(474) <223> ΗΤΝΡ

<220> <221> <222> <223>	разные признаки (475)..(483) Трициклиновый линкер
<220>
<221>	разные	признаки
<222>	(484)..	(954)
<223>	ЬТЫЕ

<220>

<221> разные признаки <222> (955)..(963) <223> Трициклиновый линкер <220>

<221> разные признаки

- 115 007810 <222> (964)..(1008) <223> Эпитоп Р2 столбнячного анатоксина <220>

<221> разные признаки <222> (1009)..(1479) <223> ЬТЫГ <220>

<221> разные признаки <222> (1480)..(1542) <223> Эпитоп РЗО столбнячного анатоксина <400> 58

акд дкд сдс аде аде аде Мек Уа1 Агд Зег Зег Зег

сдс Агд

асе ссс

аде дас

аад Ьуз

ссс дкд дсс Рго Уа1 А1а 15

сас Ηϊβ

48

ТЬг

Рго

Зег 10

Азр

1

5

дкд

дкд

дсс

аас

ссс

сад

дсс

дад

ддс

саа

скд

сад

кдд

скд

аас

сдс

96

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

20

25

30

сдс

дсс

аас

дсс

скд

скд

дса

аас

ддс

дкд

дад

скд

сдс

дас

аас

сад

144

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

35

40

45

скд

дкд

дкд

ссс

аде

дад

ддс

скд

кас

скд

акс

кас

аде

сад

дкд

скд

192

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

50

55

60

ккс

аад

ддс

са^

ддс

Еде

ссс

ЗуС

асе

сас

у иу

Си у

асе

сас

асе

240

РЬе

Ьуз

61у

С1п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

65

70

75

80

акс

аде

сдс

акс

дсс

дкд

аде

кас

сад

асе

аад

дкд

аас

скд

скд

аде

288

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

дес

акс

аад

аде

ссс

кде

сад

сдс

дад

асе

ссс

дад

ддс

дсс

дад

дсс

336

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61 у

А1а

61и

А1а

100

105

110

аад

ссс

Ъдд

кас

дад

ссс

акс

кас

скс

ддс

ддс

дкд

ккс

сад

скд

дад

384

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

115

120

125

аад

ддс

да с

сдс

скд

аде

дсс

дад

акс

аас

сдс

ссс

дас

кас

скд

дас

432

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

ккс

дсс

дад

аде

ддс

сад

дкд

кас

ккс

ддс

акс

акс

дсс

скд

ддк

ддс

480

РЬе

А1а

61 и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61 у

Не

Не

А1а

Ьеи

61 у

61у

145 150 155 160

- 116 007810

дда дкс 61у Уа1

сдд Агд

Ьсс Ьсс Ьсс сдд аса

сса Рго

Ьсс Зег 170

дас Азр

ааа Ьуз

сса Рго

дЬс Уа1

дсь А1а 175

саЬ Ηί3

528

Зег

Зег Зег Агд 165

ТЬг

дЬс

дЬс

дек

аак

сса

саа

дек

даа

ддЬ

саа

си

саа

Едд

си

ааЪ

сдд

576

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

С1и

61у

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

сдд

дек

ааЬ

дек

си

си

дсЬ

аак

ддЬ

дке

даа

сП

сдд

дас

аак

саа

624

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

е!у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

195

200

205

си

дке

дЪс

сса

Ьсс

даа

ддк

си

Ьак

сП

аи

как

Ьсс

саа

дке

сП

672

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

210

215

220

т

ааа

ддк

саа

ддь

ЬдЬ

сса

Ьсс

аса

сак

дке

си

си

аса

саЪ

аса

720

РЬе

Ьуз

61у

<31п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

225

230

235

240

аи

Ьсс

сдд

аи

дсЬ

дЬс

Ьсс

как

саа

аса

ааа

дЪс

аак

си

си

Ьсс

768

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

С1п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

дек

аН

ааа

ксс

сса

ЬдЬ

саа

сдд

даа

аса

сса

даа

ддк

дсЬ

даа

дек

816

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

С1и

А1а

260

265

270

ааа

ссЬ

ьдд

как

даа

сса

аи

как

си

ддк

ддк

дке

НЕ

саа

си

даа

864

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

61и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

275

280

285

ааа

ддЬ

дас

сдд

си

Ьсс

дек

даа

аи

ааЬ

сдд

сса

дак

как

си

дас

912

Ьуз

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290

295

300

ЬН

дсЬ

даа

Ьсс

ддь

саа

дке

как

НЬ

ддк

аи

а. И

дек

скд

ддс

ддЬ

960

РЬе

А1а

61и

Зег

61у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

61у

С1у

305

310

315

320

ддд

сад

Ьас

акс

ааа

дек

аас

Ьсс

ааа

Нс

акс

ддс

аЬс

асе

даа

сЬд

1008

С1у

61п

Туг

Не

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

С1у

Не

ТЬг

61и

Ьеи

325

330

335

дП

едк

ЪсЬ

ЬсЬ

ЬсЬ

сдЬ

асд

ссд

ЬсЬ

даЪ

аад

ссд

дН

дед

сас

дН

1056

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

340

345

350

дН

дед

аас

ссд

сад

дед

дад

ддд

саа

Нд

сад

Ьдд

Нд

ааЬ

сдЬ

едк

1104

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

С1п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

355

360

365

дед

аас

дед

Нд

Нд

дед

ааЬ

ддд

дН

даа

Нд

сдЬ

дак

аас

саа

Нд

1152

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

Ьеи

370

375

380

дН

дН

сед

ЬсЬ

дад

ддд

Нд

Ьас

Нд

аЬа

как

Еск

сад

дН

Нд

Нс

1200

Уа1

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

385 390 395 400

- 117 007810

ааа Ьуз

ддд саа

ддд кде ссд

кек Зег

асд сак ТЬг Нхз

дН Уа1 410

Нд Ьеи

ккд асд

сас ΗΪ3

асд ака

1248

61у

б1п

С1у

Суз 405

Рго

Ьеи

ТЬг

ТЬг 415

Не

кек

едк

ака

дед

д+Е

кек

кас

сад

асд

аад

дН

аак

ккд

ккд

кек

дед

1296

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

420

425

430

ака

ааа

кек

ссд

кдЬ

саа

едк

даа

асд

ссд

даа

ддд

дед

дад

дед

аад

1344

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

Ьуз

435

440

445

ссд

кдд

как

даа

ссд

ака

кас

«д

ддд

ддд

дН

сад

ккд

даа

ааа

1392

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

С1и

Ьуз

450

455

460

ддд

дак

едк

ί+д

кек

дед

дад

ака

аас

едк

ссд

дас

как

ккд

дак

ккс

1440

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

465

470

475

480

дед

даа

кек

ддд

саа

дЫ:

кас

ккк

ддд

ака

ака

дед

скд

ккс

аас

аас

1488

А1а

61и

Зег

<31у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

РЬе

Азп

Азп

485

490

495

ккс

асе

9«

ксс

ккс

Ъдд

скд

сдс

дИ

сса

ааа

дН

ксс

дек

ксс

сас

1536

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

Ηί3

500 505 510 скд даа каа1545

Ьеи С1и <210>59 <211>514 <212> Белок.

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> 3 ЬТЫЕ, соединенные глициновыми линкерами, и с введенными

Р2 и РЗО <400> 59

Мек 1

Уа1

Агд

Зег

Зег 5

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег 10

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а 15

ΗΪ3

Уа1

Уа1

А1а

Азп 20

Рго

61п

А1а

61и

61у 25

С1п

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи 30

Азп

Агд

Агд

А1а

Азп 35

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп 40

С1у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд 45

Азр

Азп

С1п

Ьеи

Уа1 50

Уа1

Рго

Зег

С1и

С1у 55

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг 60

Зег

(31п

Уа1

Ьеи

- 118 007810

РЬе Ьуз 61у ΘΙη С1у Суз

Рго Зег ТЬг Нхз

Уа1 Ьеи Ьеи 75

ТЬг

Нхз

ТЬг 80

65

70

Не

5ег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

85

90

95

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

61и

ТЬг

Рго

С1и

С1у

А1а

С1и

А1а

100

105

но

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

11е

Туг

Ьеи

б1у

С1у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61и

115

120

125

Ьуз

01 у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

130

135

140

РЬе

А1а

С1и

Зег

С1у

С1п

Уа1

Туг

РЬе

С1у

Не

Не

А1а

Ьеи

61у

С1у

145

150

155

160

С1у

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

Нхз

165

170

175

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

ΘΙη

А1а

С1и

С1у

С1п

Ьеи

ΘΙη

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

180

185

190

Агд

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61у

Уа1

С1и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

С1п

195

200

205

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

Не

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

210

215

220

РЬе

Ьуз

С1у

С1п

С1у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Нхз

ТЬг

225

230

235

240

Не

Зег

Агд

Не

А1а

Уа1

Зег

Туг

ΘΙη

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

245

250

255

А1а

Не

Ьуз

Зег

Рго

Суз

С1п

Агд

С1и

ТЬг

Рго

б1и

С1у

А1а

С1и

А1а

260

265

270

Ьуз

Рго

Тгр

Туг

С1и

Рго

Не

Туг

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

РЬе

С1п

Ьеи

С1и

275

280

285

Ьуз

С1у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

С1и

Не

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

290 295 300

- 119 007810

РЬе 305

А1а

61и Зег

61 у

61п Уа1 Туг 310

РЬе

61у

11е 11е 315

А1а

Ьеи

61 у

61у 320

61у

61п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

11е

ТЬг

61и

Ьеи

325

330

335

Уа1

Агд

Зег

Зег

Зег

Агд

ТЬг

Рго

Зег

Азр

Ьуз

Рго

Уа1

А1а

ΗΪ3

Уа1

340

345

350

Уа1

А1а

Азп

Рго

61п

А1а

61и

61у

61п

Ьеи

61п

Тгр

Ьеи

Азп

Агд

Агд

355

360

365

А1а

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Азп

61 у

Уа1

61и

Ьеи

Агд

Азр

Азп

61п

Ьеи

370

375

380

Уа1

Уа1

Рго

Зег

61и

61у

Ьеи

Туг

Ьеи

11е

Туг

Зег

61п

Уа1

Ьеи

РЬе

385

390

395

400

Ьуз

61у

61п

61у

Суз

Рго

Зег

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

11е

405

410

415

Зег

Агд

11е

А1а

Уа1

Зег

Туг

61п

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

Ьеи

Ьеи

Зег

А1а

420

425

430

11е

Ьуз

Зег

Рго

Суз

61п

Агд

61и

ТЬг

Рго

61и

61у

А1а

61и

А1а

Ьуз

435

440

445

Рго

Тгр

Туг

61 и

Рго

11е

Туг

Ьеи

61у

61у

Уа1

РЬе

61п

Ьеи

61 и

Ьуз

450

455

460

61у

Азр

Агд

Ьеи

Зег

А1а

61и

11е

Азп

Агд

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Азр

РЬе

4 65

470

475

480

А1а

61и

Зег

61у

61п

Уа1

Туг

РЬе

61у

Не

11е

А1а

Ьеи

РЬе

Азп

Азп

485

490

4 95

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

ΗΪ3

500 505 510

Ьеи 61и <210> 60

- 120 007810 <211> 2773 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Экспрессирующий вектор ρ2Ζορ2Ε для клеток насекомых <220>

<221> разные признаки <222> (561)..(566) <223> Участок ΗϊηάΙΙΙ <220>

<221> разные признаки <222> (573)..(578) <223> Участок Αν3ΐ <220>

<221> разные признаки <222> (586)..(591) <223> Участок ЕсоК!

<220>

<221> разные признаки <222> (593)..(598) <223> Участок ВатН!

<220>

<221> разные признаки <222> (625)..(630) <223> Участок С1а1 <220>

<221> разные признаки <222> (629)..(634) <223> Участок С1а1 <220>

<221> разные признаки <222> (1156)..(1161) <223> Участок АраЫ <220>

<221> разные признаки <222> (2128)..(2133) <223> Участок РзЕ!

<220>

<221> разные признаки <222> (2204)..(2209) <223> Участок Ысо!

- 121 007810 <220>

<221> разные признаки <222> (2284)..(2289) <223> Участок ΑνβΙ <220>

<221> разные признаки <222> (2294)..(2299) <223> Участок Αν3ΐ, Зта1 и Хта1 <220>

<221> разные признаки <222> (2551)..(2556) <223> Участок АраЫ <400> 60

ддаксакдак	дакааасаак	дкакддкдск	аакдкЪдсбк	саасаасаак	кскдккдаас	60
кдкд-Ькккса	кдкккдссаа	саадсасскк	какасЪсддк	ддссксссса	ссассааскк	120
ккккдсаскд	саааааааса	сдсккккдса	сдсдддссса	касакадкас	аааскскасд	180
ккксдкадас	каккккасаЬ	ааакадкска	сассдккдка	касдскссаа	акасаскасс	240
асасаккдаа	сскккккдса	дкдсаааааа	дкасдкдксд	дсадксасдк	аддссддсск	300
каксдддксд	сдксскдкса	сдкасдаакс	асаккаксдд	ассддасдад	кдккдкскка	360
ксдбдасадд	асдссадсЪЪ	сскдкдкбдс	Ъаассдсадс	сддасдсаас	кссккаксдд	420
аасаддасдс	дсскссакак	садссдсдсд	ккаксЪсакд	сдсдкдассд	дасасдаддс	480
дсссдксссд	сккаксдсдс	скакааакас	адсссдсаас	дакскддкаа	асасадккда	540
асадсакскд	кксдааккка	аадсккддка	сссксдадск	садскдаакк	скддаксскс	600
кадассддкс	акакдсддсс	дсддаЬсдак	сдакакскда	скааакскка	дкккдкаккд	660
Ъсакдкккка	акасаакакд	ккакдкккаа	акакдЪккМ:	аакааакккк	акаааакаак	720
ЫгсаасЕЕЕЪ	аЕЬдЪаасаа	саХХдкссаб	ИГасасаскс	скЕЕсаадсд	сдЪдддас£с	780
дакдсгсасг	саааддсддг	аагасддгса	гссасадаак	саддддакаа	сдсаддааад	840
аасакдЪдад	сааааддсса	дсааааддсс	аддаассдка	ааааддссдс	дккдскддсд	900
кккккссака	ддскссдссс	ссскдасдад	саксасаааа	аксдасдскс	аадксададд	960
кддсдааасс	сдасаддасб	акааадакас	саддсдкккс	сссскддаад	сксссксдкд	1020
сдсксксскд	ккссдассск	дссдсккасс	ддакасскдк	ссдсскккск	ссскксддда	1080
адсдкддсдс	кЪРсксааЪд	сксасдскдк	аддбакскса	дкксддкдка	ддксдкксдс	1140

- 122 007810

БссаадсБдд	дсБдБдБдса	сдаасссссс дББсадсссд	ассдсБдсдс	сББаБссддБ	1200
аасБаБсдБс	ББдадБссаа	сссддБаада	сасдасББаБ	сдссасБддс	адсадссасБ	1260
ддБаасадда	ББадсададс	даддБаБдБа	ддсддБдсБа	сададББсББ	даадБддБдд	1320
ссБаасБасд	дсБасасБад	ааддасадБа	БББддБаБсБ	дсдсБсБдсБ	даадссадББ	1380
ассББсддаа	ааададББдд	БадсБсББда	Бссддсааас	ааассассдс	БддБадсддБ	1440
ддБББББББд	БББдсаадса	дсадаББасд	сдсадааааа	ааддаБсБса	адаадаБссБ	1500
ББдаБсББББ	сБасддддБс	БдасдсБсад	Бддаасдааа	асБсасдББа	адддаББББд	1560
дБсаБдаБда	БааасааБдБ	аБддБдсБаа	БдББдсББса	асаасааББс	БдББдаасБд	1620
БдББББсаБд	БББдссааса	адсассБББа	БасБсддБдд	ссБссссасс	ассаасББББ	1680
ББдсасБдса	аааааасасд	сББББдсасд	сдддсссаБа	саБадБасаа	асБсБасдББ	1740
БсдБадасБа	ББББасаБаа	аБадБсБаса	ссдББдБаБа	сдсБссаааБ	асасБассас	1800
асаББдаасс	БББББдсадБ	дсаааааадБ	асдБдБсддс	адБсасдБад	дссддссББа	1860
БсдддБсдсд	БссБдБсасд	БасдааБсас	аББаБсддас	сддасдадБд	ББдБсББаБс	1920
дБдасаддас	дссадсББсс	БдБдББдсБа	ассдсадссд	дасдсаасБс	сББаБсддаа	1980
саддасдсдс	сБссаБаБса	дссдсдсдББ	аБсБсаБдсд	сдБдассдда	сасдаддсдс	2040
ссдБсссдсБ	БаБсдсдссБ	аБаааБасад	сссдсаасда	БсБддБааас	асадББдаас	2100
адсаБсБдББ	сдааББааББ	сддаБсБсБд	садсасдБдБ	БдасааББаа	БсаБсддсаБ	2160
адБаБаБсдд	саБадБаБаа	БасдасБсас	БаБаддаддд	ссассаБддс	саадББдасс	2220
адБдссдББс	сддБдсБсас	сдсдсдсдас	дБсдссддад	сддБсдадББ	сБддассдас	2280
сддсБсдддБ	БсБсссддда	сББсдБддад	дасдасББсд	ссддБдБддБ	ссдддасдас	2340
дБдасссБдБ	БсаБсадсдс	ддБссаддас	саддБддБдс	сддасаасас	ссБддссБдд	2400
дБдБдддБдс	дсддссБдда	сдадсБдБас	дссдадБддБ	сддаддБсдБ	дБссасдаас	2460
ББссдддасд	ссБссдддсс	ддссаБдасс	дадаБсддсд	адсадссдБд	ддддсдддад	2520
ББсдсссБдс	дсдасссддс	сддсаасБдс	дБдсасББсд	Бддссдадда	дсаддасБда	2580
ссдасдссда	ссаасассдс	сддБссдасд	дсддсссасд	ддБсссаддд	дддБсдассБ	2640
сдааасББдБ	ББаББдсадс	ББаБааБддБ	БасаааБааа	дсааБадсаБ	сасаааБББс	2700
асаааБааад	саБББББББс	асБдсаББсБ	адББдБддББ	БдБссааасБ	саБсааБдБа	2760
БсББаБсаБд	БсБ					2773

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (40)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Иммуногенный аналог ΤΝΕα человека, где указанный аналог

   a) содержит существенные фрагменты по меньшей мере 2 мономерные единицы указанного ΤΝΕα человека, где указанные существенные фрагменты соединены пептидными связями через пептидный линкер, указанная мономерная единица ΤΝΕα человека имеет аминокислотную последовательность, представленную остатками 2-158 в 8ЕС) Ш N0: 17,

   b) содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, которая гетерологична в отношении ΤΝΕα человека, и

   c) может продуцироваться в виде единственного продукта экспрессии клеткой, несущей экспрессирующий вектор, кодирующий данный аналог.
2. 2. Иммуногенный аналог по п.1, где каждый из существенных фрагментов экспонирует существенную часть В-клеточных эпитопов, находящихся на соответствующих мономерах, когда они являются частью ΤΝΕα человека.

   - 123 007810
3. 3. Иммуногенный аналог по п.2, где каждый из существенных фрагментов экспонирует, по существу, все В-клеточные эпитопы, находящиеся на соответствующих мономерах, когда они являются частью ΤΝΤα человека.
4. 4. Иммуногенный аналог по п.2 или 3, где аминокислотная последовательность, происходящая из мономерной единицы, модифицирована посредством вставки, замены, делеции или добавления аминокислот, так что снижается токсичность аналога по сравнению с ΤΝΤα человека и/или так что вводится связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность.
5. 5. Иммуногенный аналог по любому из пп.1-4, где каждая из существенных частей содержит, по существу, полную аминокислотную последовательность каждой мономерной единицы в виде непрерывной последовательности или в виде последовательности, содержащей вставки.
6. 6. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где аминокислотные последовательности всех мономерных единиц ΤΝΤα человека представлены в данном аналоге.
7. 7. Иммуногенный аналог по п.6, который содержит полные аминокислотные последовательности мономеров, составляющих ΤΝΤα человека, в виде неизмененных последовательностей или в виде последовательности, содержащей вставки.
8. 8. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где пептидный линкер содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, которая гетерологична в отношении ΤΝΤα человека, или участвует в ее образовании в аналоге.
9. 9. Иммуногенный аналог по любому из пп.1-7, где пептидный линкер не содержит связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность и не участвует в ее образовании у людей.
10. 10. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность связывает большую часть молекул МНС класса II людей.
11. 11. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность выбрана из природного Т-клеточного эпитопа и искусственной связывающей МНС-П последовательности.
12. 12. Иммуногенный аналог по п.10, где природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа столбнячного анатоксина, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного анатоксина, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа СЗ Р. Га1арагит.
13. 13. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где трехмерная структура полного ΤΝΤα человека, по существу, сохранена.
14. 14. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где аналог выбран из группы, состоящей из двух или трех полных мономеров ΤΝΤα, соединенных конец в конец пептидным линкером, где по меньшей мере один пептидный линкер содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, двух или трех полных мономеров ΤΝΤα, соединенных конец в конец инертным пептидным линкером, где по меньшей мере один из мономеров содержит по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, или где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность слита с Ν- или С-концевым мономером, необязательно, через инертный линкер.
15. 15. Иммуногенный аналог ΤΝΤα человека, где данный аналог содержит по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, и далее характеризуется тем, что представляет собой мономер ΤΝΤα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в гибкую петлю 3, и/или мономер ΤΝΤα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, куда введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, который стабилизирует ЛЭ-структуру мономера ΤΝΤα, и/или мономер ΤΝΤα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где любая из аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на Ν-конце подвержена делеции, и/или мономер ΤΝΤα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где встроена или замещена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность в петлю 1 в положении интрона, и/или мономер ΤΝΤα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена как часть области искусственного стебля на Ν-конце ΤΝΤα человека, и/или мономер ΤΝΤα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена так, что она стабилизирует мономерную структуру путем увеличения гидрофобности поверхности взаимодействия тримера, и/или

    - 124 007810 мономер ΤΝΕα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность, фланкированная остатками глицина, встроена или замещена в аминокислотную последовательность ΤΝΕα, и/или мономер ΤΝΕα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в Ό-Ε-петлю, и/или мономер ΤΝΕα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена между двумя идентичными подпоследовательностями ΤΝΕα человека, и/или мономер ΤΝΕα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере один солевой мостик в ΤΝΕα человека усилен или замещен дисульфидным мостиком, и/или мономер ΤΝΕα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где растворимость и/или стабильность в плане протеолиза усилена путем введения мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного ΤΝΕα, и/или мономер ΤΝΕα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где потенциальная токсичность снижена или отменена путем введения по меньшей мере одной точечной мутации, где указанный мономер ΤΝΕα человека имеет аминокислотную последовательность, представленную остатками 2-158 в 8Еф ГО N0: 17.
16. 16. Иммуногенный аналог по п.14 или 15, где аминокислотная последовательность аналога выбран из группы, состоящей из 8ЕЕ) ГО N0: 18, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, и любую аминокислотную последовательность на их основе, которая содержит только консервативные аминокислотные замены.
17. 17. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, который может экспрессироваться в виде растворимого белка из бактериальных клеток.
18. 18. Фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, или комплементарный ему фрагмент нуклеиновой кислоты.
19. 19. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.18, который представляет собой фрагмент ДНК.
20. 20. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.18, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 16, 48, 50, 52, 54, 56 и 58, или комплементарную ей последовательность нуклеиновой кислоты.
21. 21. Способ отрицательной регуляции ΤΝΕα человека у человека, причем данный способ охватывает осуществление представления иммунной системе иммунологически эффективного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога по любому из пп.1-17.
22. 22. Способ по п.21, где представление осуществляется путем введения иммуногенного аналога по любому из пп.1-17 аутологичному хозяину, необязательно, в смеси с адъювантом.
23. 23. Способ по п.22, где адъювант выбран из группы, состоящей из иммуннонаправленного адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и производное микобактерии; масляного препарата; полимера; мицеллообразующего адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикс ШСОМ); частицы; ΌΌΆ; алюминиевых адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта.
24. 24. Способ по любому из пп.21-23, где иммуногенно эффективное количество аналога вводят животному путем, выбранным из парентерального пути, такого как внутрикожный, подкожный и внутримышечный путь; перитонеального; перорального; щечного; подъязычного; эпидурального; спинального; анального и внутричерепного пути.
25. 25. Способ по п.24, где эффективное количество составляет от 0,5 до 2000 мкг.
26. 26. Способ по п.24 или 25, который охватывает по меньшей мере одно введение в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.
27. 27. Способ по п.21, где представление аналога иммунной системе осуществляется путем введения нуклеиновой(-ых) кислоты(-т), кодирующей(-их) аналог, в клетки животных и путем достижения таким образом экспрессии ίη νίνο клетками введенной(-ых) нуклеиновой(-ых) кислоты(-т).
28. 28. Способ по п.27, где введенная(-ые) нуклеиновая(-ые) кислота(-ы) выбрана(-ы) из голой ДНК, ДНК, объединенной в композицию с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, введенной в липосомы, ДНК, встроенной в вирусный вектор, ДНК, объединенной в композицию с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с направленным белком или полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с преципитирующими кальций средствами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан, и ДНК, объединенной в композицию с адъювантом, таким как адъюванты по п.23.
29. 29. Способ по п.35 или 36, где нуклеиновые кислоты вводят внутриартериально, внутривенно или путями по п.24.

    - 125 007810
30. 30. Способ по любому из пп.27-29, который охватывает по меньшей мере одно введение нуклеиновых кислот в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.
31. 31. Способ по п.21, где представление иммунной системе осуществляется путем введения непатогенного микроорганизма или вируса, который переносит фрагмент нуклеиновой кислоты, экспрессирующий и кодирующий аналог.
32. 32. Способ по п.31, где вирус представляет собой непатогенный поксвирус, такой как вирус коровьей оспы.
33. 33. Способ по п.31, где микроорганизм представляет собой бактерию.
34. 34. Способ по любому из пп.31-33, где непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному однократно.
35. 35. Композиция для индукции продукции антител против мультимерного белка, причем данная композиция содержит иммуногенный аналог по любому из пп.1-17 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или несущее средство, и/или адъювант.
36. 36. Композиция для индукции продукции антител против мультимерного белка, причем данная композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты по п.19 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или несущее средство, и/или адъювант.
37. 37. Композиция по п.35 или 36, где аналог составлен в композицию, как определено в любом из пп.22 или 23.
38. 38. Способ получения аналога по любому из пп.1-17, причем данный способ охватывает культивирование клетки хозяина, трансформированной фрагментом нуклеиновой кислоты по п.19, в условиях, которые способствуют экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты по п.19 и последующего получения аналога из культуры в виде белкового продукта экспрессии.
39. 39. Способ по п.38, где клетка хозяина представляет собой клетку бактериального хозяина.
40. 40. Способ по п.39, где аналог представляет собой растворимый продукт экспрессии.