EA008827B1 - Очистка вариантов her-2 - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение представляет новый способ очистки белка семейства EGFR, полученного из культур клеток насекомых. Процесс содержит последовательные этапы а) диафильтрации и замены культуральной среды буфером; b) аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC); с) эксклюзионной хроматографии (SEC), е) анионообменной хроматографии (AIE). Способ также предоставляет иммуногенный вариант белка HER-2, для которого главным образом адаптирован процесс очистки, а также средства для получения указанного варианта.

Description

Настоящее изобретение относится к области аффинной очистки белков. Более конкретно, настоящее изобретение относится к улучшениям в металло-аффинной очистке белков, особенно, в очистке белков, тагированных гистидином (имеющих на конце гистидиновую последовательность (таг)), или обогащенных гистидином, которые созданы рекомбинантным способом в клетках насекомых. Настоящее изобретение также относится к специфическим схемам очистки, подходящим для вариантов тагированных гистидином белков, производных семейства ЕСЕК, (рецепторов эндотелиального фактора роста) белков, особенно ассоциированного с раком антигена НЕК-2.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуногенному варианту человеческого НЕК-2, который способен вызывать иммунный ответ у людей, который также нацелен на нативную человеческую молекулу НЕК-2.

Уровень техники

Ассоциированный с раком мембранный белок НЕК-2 является членом семейства ЕСЕК белков. Этот конкретный белок является перспективным в качестве иммуногена при активной селективной иммунотерапии некоторых видов рака, в особенности, рака молочной железы и рака ободочной и прямой кишки.

Правопреемник настоящей заявки на патент предварительно подал заявки на патент, имеющие отношение к активной вакцинации против антигена НЕК-2, см. \УО 00/20027, которые включены в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки. Кроме того, исследования в этой области привели в настоящее время к идентификации предпочтительных вариантов НЕК-2 для таких вакцин, но основной задачей в химии белков является разработка улучшенных средств для получения достаточного количества рекомбинантного белка с высокой степенью чистоты.

Аффинная хроматография с иммобилизованным ионом металла (1МАС) впервые была введена Рога111 (РогаШ 1.. ЕСагНзоп, ЕОкзоп, С.ВеИгаде [1975] Ыа1иге 258:598-599) под названием металлохелатная хроматография, и ранее обсуждалась в нескольких статьях (РогаШ 1. [1992] Рго1ет рипПсабоп апб ехргеззюп 3:263-281; и статьях, цитированных в этой работе). Процесс очистки 1МАС основан на использовании хелатной матрицы, загруженной мягкими ионами металлов, такими как Си²⁺ или Νί²⁺. Электронодонорные группы на поверхности белков, особенно имидазольная боковая цепь гистидина, могут связываться с некоординированными участками загруженного металла. Взаимодействие между электронодонорной группой и металлом может быть обращено понижением рН или путем замещения имидазолом. Таким образом, белок, имеющий электронодонорные группы, такие как гистидин, может быть очищен при помощи обратимых взаимодействий металлокомплекс/белок.

В 1991 г. Еогб и др. (Еогб С., 1.8иотшеп, С’.С1а1х [1991] Рго1ет Ехргеззюп апб РигШсабоп 2:95-107) описали очистку белка с использованием технологии 1МАС (лиганда Νί-ΝΤΑ), как применимую к рекомбинантным белкам, имеющим хвосты с гистидиновыми остатками (полигистидиновые рекомбинантные белки, Ήίδ-тагированные белки). Этот способ имеет преимущество, заключающееся в том, что два или более гистидиновых остатка могут объединяться для формирования очень сильных комплексов с ионами металлов.

Существует множество вариантов этого способа, в которых гистидиновые остатки прикрепляют в виде тагов к релевантному рекомбинантному белку в различных комбинациях, например, включающих в себя участки узнавания специфических протеаз с тем, чтобы Ыз-таг мог быть впоследствии ферментативно удален.

Экспрессия белков в клетках насекомых требует использования множества специализированных культуральных сред, а также вызывает загрязнение рекомбинантного белка различными составляющими, производными клетки насекомого, которые не обнаруживаются в клетках бактерий, грибов и млекопитающих. Следовательно, схемы очистки, разработанные для рекомбинантных белков, продуцированных в клетках бактерий, грибов или млекопитающих, безусловно, не являются оптимальным выбором, если необходимо очистить белок, продуцированный в клетках насекомых.

Таким образом, продолжает существовать необходимость в улучшении очистки белков для получения фармацевтически качественного белка, полученного в процессе рекомбинантного продуцирования в клетках насекомых.

Цель изобретения

Целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенного способа для очистки рекомбинантного белка семейства ЕСЕК, экспрессированного в клетках насекомого. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение иммуногенного варианта белка НЕК-2, который является пригодным, например, для лечения рака при помощи специфической активной иммунотерапии.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения разработали новый способ очистки белка семейства ЕСЕК до степени чистоты, которая допустима для фармацевтического применения, в особенности для применения в качестве агентов вакцины.

Следовательно, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу очистки белка, производного семейства ЕСЕК, причем указанный белок рекомбинантно продуцируют в культуре клеток

- 1 008827 насекомых, и указанный белок представляет собой белок, который является подходящим для очистки при помощи аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, при этом способ содержит получение из указанной культуры клеток насекомых по существу бесклеточного образца, содержащего указанный белок, производный семейства ЕСЕК, и последующее обогащение указанного белка, производного семейства ЕСЕК, при помощи этапов диафильтрации и замены культуральной среды буфером, аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (1МАС), эксклюзионной хроматографии (8ЕС), анионообменной хроматографии (А1Е).

Другой аспект настоящего изобретения относится к иммуногенному варианту белка НЕК-2, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО Ш N0: 2, остатки 17-677.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - хроматографический профиль 1МАС, стрелка указывает на пик 104.1;

фиг. 2 - хроматографический профиль 8ЕС. стрелка указывает на пик мономера;

фиг. 3 - хроматографический профиль А1Е, стрелка указывает на пик 104.1;

фиг. 4 - рМТ/йНЕК2МА5-5ПишН18 вектор р992, карта плазмиды.

ЙНЕК2МА5-5Б: ген, кодирующий белок йНЕК2МА5-5БиН (нуклеотиды 3604-5592).

Р2 эпитоп: последовательность, кодирующая Р2 эпитоп в белке йНЕК2МА5-5БиН (нуклеотиды 4357-4401).

Р30 эпитоп: последовательность, кодирующая Р30 эпитоп в белке 11НЕК2МА5-5БиН (нуклеотиды 5500-5562).

Сайт полиаденилирования позднего 8У40: полиА сигнал (нуклеотиды 263-268).

Со1Е1: участок инициации репликации для репликации Е. сой (нуклеотиды 701-1434).

Ген устойчивости к ампициллину: ген, наделяющий бактерию устойчивостью к ампициллину (нуклеотиды 1579-2439).

Металлотионеиновый промотор: промотор, который может быть индуцирован несколькими соединениями (например, кадмием) (нуклеотиды 3050-3415).

Кохак-подобная последовательность: участок связывания с рибосомой (нуклеотиды 3493-3501).

Βίρ сигнальная последовательность: сигнальная последовательность, направляющая белок варианта НЕК-2 для секреции во внеклеточное пространство (нуклеотиды 3502-3555).

ЕшН|8 последовательность: последовательность, кодирующая ЦшНш таг, используемый для очистки белка А1оУас НЕК-2 (нуклеотиды 3556-3597).

Дипептидазная стоп-последовательность: используемая в случае, если от белка А1оУас НЕК-2 должен быть отщеплен свободный конец ИшНЕ (нуклеотиды 3598-3603).

Подробное раскрытие изобретения

Ниже определены некоторые термины и выражения в контексте настоящего изобретения.

Белок, производный семейства ЕСЕК, означает белок, который гомологичен или идентичен человеческому ЕСЕК (или ЕгйВ-1); человеческому НЕК-2/пеи (ЕгйВ-2); НЕК-3 (ЕгйВ-3); или НЕК-4 (ЕгйВ-4).

Аутогенный белок семейства ЕСЕК в настоящей спецификации и формуле изобретения предназначен для обозначения полипептида семейства ЕСЕК животного, которое предназначено для вакцинации против его собственного белка семейства ЕСЕК. Другими словами, предполагается, что указанный термин является релевантным только в случае, если он относится к животному, предназначенному для вакцинации.

Термины Т-лимфоцит и Т-клетка могут быть использованы взаимозаменяемо для лимфоцитов тимического происхождения, которые восприимчивы к различным клеточно-опосредованным иммунным ответам, а также к функциям эффектора, таким как хелперная активность в гуморальном иммунном ответе. Аналогично, термины В-лимфоциты и В-клетки могут быть использованы взаимозаменяемо для лимфоцитов, продуцирующих антитела.

Антиген-представляющая клетка (АРС) представляет собой клетку, которая представляет эпитопы Т-клеток. Обычные антиген-представляющие клетки являются макрофагами, дендритными клетками и другими фагоцитирующими и пиноцитирующими клетками. Следует отметить, что В-клетки также функционируют как АРС путем представления Т_Н эпитопов, связанных с молекулами II класса МНС в Т_Н клетках, но в случае обычного применения в настоящем описании и формуле изобретения термин АРС предназначен для обозначения вышеуказанных фагоцитирующих и пиноцитирующих клеток.

Т-лимфоциты-хелперы или Т_Н клетки означают СБ4 позитивные Т-клетки, которые помогают В-клеткам и цитотоксическим Т-клеткам связываться с молекулами II класса МНС или антигенпредставляющими клетками путем узнавания ТН эпитопов.

Термин цитотоксический Т-лимфоцит (СТЬ) применяется для СБ8-позитивных Т-клеток, которым для активации необходима помощь Т_Н клеток.

Специфический иммунный ответ в настоящем контексте предназначен для обозначения поликлонального иммунного ответа, направленного в основном против молекул или групп квазиидентичных мо- 2 008827 лекул или, в качестве альтернативы, против клеток, которые представляют эпитопы СТЬ молекул или групп квазиидентичных молекул.

Термин полипептид в настоящем контексте предназначен для обозначения как коротких пептидов от 2 до 10 аминокислотных остатков, олигонуклеотидов от 11 до 100 аминокислотных остатков, так и полипептидов с более чем 100 аминокислотными остатками. Кроме того, термин также предназначен для обозначения белков, т.е., функциональных биомолекул, содержащих по меньшей мере один полипептид; причем при содержании по меньшей мере двух полипептидов они могут формировать комплексы, быть ковалентно связанными, или могут быть нековалентно связанными. Полипептид(полипептиды) в белке могут быть гликозилированными и/или липидизированными и/или содержать простетические группы.

Термин подпоследовательность означает любой последовательный фрагмент из по меньшей мере 3 аминокислот, или, если это обосновано из по меньшей мере 3 нуклеотидов, выделенных непосредственно из аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот естественного происхождения, соответственно.

Под термином понижающая регуляция аутогенного белка семейства ЕСЕК в настоящем описании подразумевается снижение в живых организмах количества и/или активности релевантного белка семейства ЕСЕК. Понижающая регуляция может быть достигнута при помощи нескольких механизмов, включающих в себя удаление СЕА макрофагоцитами (например, макрофагами и другими фагоцитирующими клетками), и, что более важно, у животных СТЬ убивают клетки, несущие или скрывающие антиген.

Термин иммуноген предназначен для обозначения субстанции, способной индуцировать иммунный ответ у конкретного животного. Следовательно, следует принять во внимание, что аутогенный белок семейства ЕСЕК не является иммуногеном в аутогенном хозяине - необходимо использовать или сильный адъювант и/или совместно присутствующие эпитопы Т-хелперов с аутогенным белком для поддержания иммунного ответа против аутогенного белка, и в таком случае иммуноген представляет собой композицию частиц, способных разрушить аутотолерантность.

Термин иммуногенно эффективное количество имеет свое обычное значение в данной области техники, т.е., количество иммуногена, способное индуцировать иммунный ответ, который в значительной степени поражает патогенные агенты, имеющие общие с иммуногеном иммунологические признаки.

Термин фармацевтически приемлемый имеет свое обычное значение в данной области техники, т.е., используется для субстанции, которая может быть применена в виде части лекарственного средства для применения человеком при лечении рассматриваемого заболевания и, таким образом, термин фактически исключает применение высокотоксичных веществ, которые могут скорее ухудшить, а не улучшить состояние пациента, проходящего курс лечения.

Чужеродный Т-клеточный эпитоп представляет собой пептид, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки у животных видов. Предпочтительные чужеродные эпитопы представляют собой разнородные эпитопы, т.е., эпитопы, которые связываются со значительной частью молекул II класса МНС у животных видов или популяции. Для эпитопа такого типа термин, который в данной области техники часто используется взаимозаменяемо, представляет собой термин универсальные Т-клеточные эпитопы. Известно только очень ограниченное количество таких разнородных Т-клеточных эпитопов, и более подробно они будут рассмотрены ниже. Следует отметить, что для того, чтобы иммуногены, используемые согласно настоящему изобретению, были эффективными в большой части популяции животных, насколько это возможно, может быть необходимым 1) введение нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов в одну и ту же модель или 2) подготовка нескольких моделей, причем каждая модель имеет различные разнородные встроенные эпитопы. Следует отметить, что концепция чужеродных эпитопов также охватывает применение латентных Т-клеточных эптопов, т. е., эпитопов, которые выделены из своего белка и которые вызывают иммуногенное поведение только в случае их присутствия в изолированной форме без вхождения в состав своего рассматриваемого белка.

Чужеродный эпитоп Т-лимфоцита-хелпера (чужеродный Т_н эпитоп) представляет собой чужеродный Т-клеточный эпитоп, который связывается с молекулой II класса МНС и может присутствовать на поверхности антиген-представляющей клетки (АРС), связанной с молекулой II класса МНС. Следовательно, также необходимо отметить, что свойство чужеродности имеет два аспекта: чужеродный эпитоп Т_н 1) представлен в рассматриваемом контексте II класса МНС у животных, 2) чужеродный эпитоп не является производным того же самого полипептида, что и целевой антиген для иммунизации; таким образом, эпитоп является также чужеродным для целевого антигена.

'СТЬ эпитоп представляет собой белок, который способен связываться с молекулой I класса МНС.

Термин адъювант имеет свое обычное значение в области технологии вакцин, т.е., субстанция или композиция веществ, которые 1) не способны сами по себе вызывать специфический иммунный ответ против иммуногена вакцины, но которые 2) тем не менее, способны усиливать иммунный ответ против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только одним адъювантом не обеспечивает иммунного ответа против иммуногена, вакцинация иммуногеном может вызывать или может не вызывать иммунный ответ против иммуногена, но объединенная вакцинация иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунный ответ против иммуногена, который сильнее иммунного ответа, индуцированного только иммуногеном.

- 3 008827 ''Диафильтрация представляет собой способ, использующий ультрафильтрационные мембраны для удаления соли или растворителя, замены буферов или разделения на фракции биомолекул, различающихся по размеру, в макромолекулярных растворах. Макромолекулы, удержанные ультрафильтрационной мембраной, концентрируют до тех пор, пока не будут удалены растворитель и низкомолекулярные виды. Однако простое концентрирование макромолекулярного образца полностью не удаляет более мелкие виды. Следовательно, более мелкие виды должны быть вымыты из образца с использованием многочисленных объемов для промывания (диафильтрация). После процесса диафильтрации образец может быть концентрирован для дальнейшего анализа или очистки. Это является преимуществом по сравнению с гель-фильтрацией или диализом, когда образец может быть разбавлен во время отдельного процесса, требующего дополнительного этапа концентрации. При использовании диафильтрации отсутствуют потери или загрязнение, что может иметь место в двухэтапном процессе.

Аффинная хроматография с иммобилизованным металлом (1МАС) представляет собой способ хроматографии, в котором очищают белки последовательно в соответствии с их аффинностью к некоторым двухвалентным ионам металла, см. описание в разделе Уровень техники.

''Эксклюзионная хроматография (8ЕС) представляет собой способ хроматографии, в котором белки и другие макромолекулы фракционируются согласно их физическому размеру. Небольшие молекулы остаются в порах матрицы и, следовательно, элюируют медленно, тогда как большие молекулы не проникают в поры и, следовательно, элюируют из матрицы раньше.

Анионообменная хроматография (А1Е) представляет собой способ хроматографии, в котором молекулы, имеющие суммарный отрицательный заряд, остаются на матрице колонки и, следовательно, элюируют путем замещения аниона из буфера для элюции или путем изменения суммарного заряда белка.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Настоящее изобретение относится к процессу очистки, который приспособлен специально для очистки белков, производных семейства ЕСЕК, которые были рекомбинанто продуцированы в клетках насекомых. Настоящее изобретение было разработано в связи с деятельностью, которая привела к получению иммуногенных вариантов человеческого антигена НЕК-2, ассоциированного с раком, эти варианты продуцировали в системе экспрессии ЭЕ8'К в системе экспрессии, принадлежащей С1ахо8т11ЬК1ше, и продаваемой, например, 1пуЦгодеп. Система использует клетки дрозофилы 82 и специализированные векторы. Однако использование клеток 82 в качестве клеток хозяина для рекомбинантного продуцирования выявило ряд проблем, требующих решения, относительно рассматриваемого варианта НЕК-2, и эти проблемы были решены с использованием изобретенного способа (например, проблема совместной миграции белков, которые выделены из клеток 82).

Конкретный белок, который использовался в примерах, представляет собой вариант человеческого НЕК-2, который является у людей иммуногенным; вариант включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ N0: 2, остатки 17-677. Однако поскольку такая аминокислотная последовательность сама по себе не является подходящей для 1МАС, она содержит Ν-терминальный гистидиновый таг (аминокислотные остатки 1-14 в 8Е0 ΙΌ N0:1), который может быть отщеплен аминодипептидазой (дипептидилпептидазой I, ΌΡΡΙ, например, Ргебегаеи 1 и др., 1999, Рго!ет Ехргеккюи аиб РипПеабоп 15, 389-400). Стоп-последовательность для диаминопептидазы содержит остатки 15 и 16 в 8Е0 Ш N0:2.

Следовательно, обычно способ прямой очистки является особенно подходящим для белков, производных семейства ЕСЕК, которые содержат гетерологичную аминокислотную последовательность, облегчающую очистку при помощи 1МАС. Такая последовательность может быть нативной для белков, производных семейства ЕСЕК, но чаще она представляет собой гетерологичную аминокислотную последовательность (т.е., не связанную естественным образом с белком, производным семейства ЕСЕК). Предпочтительные аминокислотные последовательности для этой цели обогащают гистидиновыми остатками (например, Н15₆-тагом или другими аминокислотными последовательностями с несколькими последовательными остатками гистидина). Наиболее предпочтительная гетерологичная аминокислотная последовательность, которая облегчает очистку при помощи 1МАС, представляет собой последовательность, содержащую остатки 1-14 8Е0 ΙΌ N0:2.

Белок, производный ЕСЕК, подвергаемый разработанному процессу, предпочтительно представляет собой белок, который содержит значительную часть аминокислотной последовательности человеческого ЕСЕК или человеческого НЕК-2, и особенно предпочтительным является то, что эту значительную часть в основном выделяют из внеклеточной части человеческого ЕСЕК или человеческого НЕК-2. Наиболее предпочтительным является вариант человеческого НЕК-2, и в наиболее предпочтительных вариантах осуществления вариант человеческого НЕК-2 содержит по меньшей мере один чужеродный эпитоп Т-клетки-хелпера.

Как указывалось выше, изобретенный процесс разработан в связи с работой над рекомбинантым продуцированием некоторых вариантов человеческого антигена НЕК-2. Эти варианты характерны тем, что включают разнородные чужеродные эпитопы Т-хелперов, которые вводят в аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого НЕК-2. Предпочтительные варианты человеческого

- 4 008827

НЕК-2 содержат эпитопы столбнячного анатоксина Р2 (остатки 269-282 8ЕО Ш N0:2) и Р30 (остатки 649-669 8Е0 Ш N0:2), и наиболее предпочтительный вариант осуществления имеет аминокислотную последовательность, которая состоит из остатков 1-667 8Е0 Ш N0:2.

Диафильтрация/замена буфера

Этап диафильтрации/замены буфера проводят при температуре от примерно 2 до примерно 25°С. Однако предпочтительно используется температура в более низкой части указанного диапазона, например температура ниже 20°С, такая как ниже 15 или ниже 10°С. Наиболее предпочтительная температура находится в диапазоне от 2 до 9°С, например, в диапазоне от 3 до 9°С с наиболее предпочтительным диапазоном температур от примерно 3 до примерно 8°С, и особенно предпочтительным от 4 до примерно 6°С. При более высоких температурах (например, выше 10°С) существует тенденция агрегации белков, и это может быть нейтрализовано добавлением детергента, такого как детергент типа Твин.

Обычно диафильтрацию выполняют в два этапа так, чтобы сначала концентрировать макромолекулярные соединения в образце культуральной среды и затем заменить культуральную среду буфером. Эти процедуры осуществляют, следуя стандартным процедурам в данной области техники, также см. примеры. Предпочтительным является то, что этап концентрирования в результате приводит к увеличению концентрации макромолекулярных соединений в 2-25 раз, например к увеличению концентрации в 2-20 раз, в 3-15 раз, в 3-10 раз. Предпочтительное концентрированно макромолекулярных соединений составляет от 4 до 8 раз, и наиболее предпочтительное концентрирование составляет примерно 5 раз, или до общей концентрации белка среды, не превышающей 3 мг/мл или предпочтительно не превышающей 2 мг/мл.

Замену буфера обычно проводят в два последовательных этапа, из которых первый происходит при рН по меньшей мере 6,5 и по большей мере 7,2 и из которых второй происходит при рН по меньшей мере 7,0 и по большей мере 8,0. Однако возможно выполнение обоих этапов при одном и том же рН в перекрывающихся частях двух диапазонов. Обычно замену буфера выполняют с использованием фосфатного буфера.

После завершения замены буфера жесткость последующих этапов предпочтительно увеличивается путем добавления агента в образец, который конкурирует при связывании с хроматографической матрицей на этапе 1МАС для того, чтобы уменьшить количество незначимого связывания с загрязняющими составляющими. Например, для увеличения жесткости может быть добавлен имидазол, гистидин или буфер с высокой концентрацией соли в образец, подвергнутый диафильтрации и замене буфера. Предпочтительно при использовании имидазола его добавляют для увеличения концентрации в пределах между примерно 0,05 и примерно 20 мМ, предпочтительно в пределах от примерно 0,5 до примерно 15 мМ, например в пределах от примерно 1 до примерно 10 мМ. Особенно предпочтительной является концентрация имидазола в пределах от примерно 2 до примерно 9 мМ, например концентрация от примерно 3 до примерно 8 мМ. Наиболее предпочтительной является концентрация имидазола от примерно 4 до примерно 6 мМ, например концентрация примерно 5 мМ. При использовании буфера с высокой концентрацией соли (часто №1С1) концентрация находится в пределах от 100 мМ до примерно 1М.

Также предпочтительным является добавление детергента в образец, подвергнутый диафильтрации и замене буфера, перед этапом 1МАС. Детергент обычно может быть выбран из полиоксиэтиленового эфира сорбита и жирной кислоты, например Твин-20, Твин-40, Твин-60, Твин-80 и Твин-85, алкиларильного полиэфирного спирта, например Тритон Х-100, неионного детергента и детергента на основе углеводородов, например, октилгликозида. Преимущественно детергент добавляют для увеличения концентрации от примерно 0,05% (об./об.) до 10% (об./об.), например 0,1% (об./об.).

1МАС

Этап 1МАС включает внесение в хроматографическую среду ионов двухвалентного металла до нанесения на нее образца с замененным буфером. Обычно ион двухвалентного металла выбирают из группы, состоящей из Νί²⁺, Си²⁺, Ζη²'. Со²⁺ и Ее²⁺. Предпочтительно двухвалентный металл представляет собой Ζη²⁺.

Элюцию хроматографической среды в 1МАС выполняют путем применения к хроматографической среде (обычно в хроматографической колонке) имидазола, гистидина, буфера с высокой концентрацией соли или путем изменения рН. Например, при использовании для элюции имидазола это преимущественно выполняют путем применения имидазола на одном этапе с концентрацией между примерно 50 мМ и примерно 500 мМ (например, между 100 и 400 мМ), предпочтительно с концентрацией примерно 200 мМ. В качестве альтернативы, при использовании гистидина, это выполняют путем применения гистидина на одном этапе с концентрацией между примерно 20 мМ и 400 мМ (например, между 50 и 200 мМ), предпочтительно примерно 100 мМ. Буфер с высоким содержанием соли обычно содержит Νηί'Ί с концентрацией до примерно 1 или даже 2 М.

8ЕС

Средний размер пор матрицы 8ЕС предпочтительно представляет собой размер, который разделяет глобулярный белок между 10 и 600 кДа.

- 5 008827

После нанесения образца на матрицу элюцию проводят фосфатным буфером или трис-буфером, или, в качестве альтернативы, биологическим буфером, таким как НЕРЕ8. Предпочтительным буфером является трис-буфер.

Во время 8ЕС рН поддерживают в пределах от примерно 7 до примерно 8, и предпочтительно рН сохраняют при примерно 7,5.

Если это релевантно и необходимо (т.е., при использовании фосфатного буфера на этапе 8ЕС), образцы, содержащие белок, производный семейства ЕСЕК, полученный из 8ЕС, разбавляют перед этапом А1Е, для доведения концентрации фосфатов до менее чем 15 мМ, например, в пределах между 10 и 12,5 мМ. Однако удивительным является то, что А1Е вообще можно выполнять, используя такую концентрацию фосфатного буфера.

ΑΙΕ

Окончательным этапом процедуры очистки согласно настоящему изобретению является по меньшей мере один этап А1Е, в которой А1Е выполняют с использованием ионообменной матрицы с сильным анионом - в предпочтительных вариантах осуществления, также существует предшествующий этап, включающий использование ионообменной матрицы со слабым анионом. Это предпочтительно включает загрузку образца, содержащего белок, производный семейства ЕСЕК, полученный после 8ЕС на ионообменную матрицу с сильным или слабым анионом. Обычно элюцию выполняют буферизованным (фосфатом, трис или биологическим буфером, например, НЕРЕ8) раствором ЫаС1 при рН между 7 и 8, предпочтительно примерно рН 7,5.

Белок, полученный в элюате, после этого этапа имеет клиническую степень чистоты и по существу свободен от загрязнений, производных культуры клеток насекомых.

Предполагается, что этап А1Е, использующий ионообменную матрицу со слабым анионом, может быть применим в качестве этапа между этапами 1МАС и 8ЕС, вместо включения его в виде части заключительного А1Е этапа.

Дополнительные необязательные этапы

После диафильтрации предпочтительным является включение этапа вирусной очистки (например, при помощи 2% Твин-20 и 0,3% ТпВР) и, кроме того, предпочтительным является включение этапа фильтрования вирусов после А1Е (например, с использованием фильтра Р1апоуа 15Ν или аналогичного фильтра), где оба этапа включены для гарантии того, что полученный в результате продукт является свободным от клинически неприемлемых загрязнений. Однако в случае применения безвирусной системы эти два этапа не являются существенными.

Вариант ΗΕΚ-2 настоящего изобретения

Как указывалось выше, способ настоящего изобретения был разработан при очистке варианта человеческого антигена опухоли НЕК-2. Доказано, что этот конкретный вариант является особенно хорошо подходящим в качестве агента вакцины для стимулирования иммунологических реакций против аутогенного НЕК-2 так, что этот конкретный вариант также является частью настоящего изобретения.

В общем случае, специфическое использование, лекарственные средства, рекомбинантное продуцирование, подходящие векторы и клетки хозяина, а также другие детали, характерные для этого специфического варианта НЕК-2, можно найти в раскрытии \У0 00/20027. Следовательно, ниже будет предоставлено только краткое обсуждение, которое, в частности, характерно для указанного варианта. Таким образом, раскрытие \¥О 00/20027 включено в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки и предоставляет необходимое описание, имеющее отношение к иммунизации вариантами НЕК-2 и общим способам получения их и их лекарственных форм. Также в настоящее описание включено во всей своей полноте в качестве ссылки раскрытие \¥О 00/20027, относящееся к вакцинации нуклеиновой кислотой против аутогенного НЕК-2.

Как указывалось выше, другой аспект настоящего изобретения относится к иммуногенному варианту белка НЕК-2, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ N0:2, остатки 17-677. Предпочтительным является то, что этот вариант представляет собой полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в 8ЕО ΙΌ N0: 2, остатки 1-677, т.е., вариант, который также включает гистидинил-обогащенный таг очистки, состоящий из остатков 1-14 в 8ЕО ΙΌ N0:2, и аминопептидазную стоп-последовательность, состоящую из остатков 15 и 16 в 8Е0 ΙΌ N0:2.

Также включенным в настоящее описание является фрагмент нуклеиновых кислот, который кодирует этот иммуногенный вариант белка НЕК-2, такой как ДНК фрагмент. Особенно предпочтительный фрагмент ДНК имеет вариант НЕК-2, кодирующий последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0:1.

Полезными инструментами при рекомбинантном продуцировании вариантов НЕК-2 являются векторы, несущие фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Особенно предпочтительным является вектор, способный к автономной репликации. Обычно вектор выбирают из группы, состоящей из плазмиды, фага, космиды, мини-хромосомы и вируса.

Особенно предпочтительными являются векторы экспрессии. Обычный вектор экспрессии настоящего изобретения содержит, в направлении 5'^3' и в рабочем сцеплении, промотор, запускающий экспрессию фрагмента нуклеиновых кислот настоящего изобретения, необязательно, последовательность

- 6 008827 нуклеиновых кислот, кодирующую белок-лидер, обеспечивающий возможность секреции или встраивания в мембрану фрагмента полипептида, фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения и, необязательно, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую терминатор.

Для рекомбинантного продуцирования особенно предпочтительной является клетка хозяина, трансформируемая вектором настоящего изобретения. Особо интересной клеткой хозяина является клетка насекомого, и наиболее предпочтительной являемся клетка хозяина, выделенная из дрозофилы, например, клетка 82.

Также частью настоящего изобретения является стабильная клеточная линия, которая несет вектор настоящего изобретения и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения, и которая, необязательно, секретирует или несет на своей поверхности иммуногенный вариант белка НЕК-2 настоящего изобретения.

Кроме того, настоящее изобретение также предоставляет иммуногенную композицию для иммунизации человека против белка НЕК-2, содержащую иммуногенный вариант белка НЕК-2, описанный выше, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем и, необязательно, адъювантом. Подробности подходящих лекарственных форм можно найти в \УО 00/20027.

В качестве альтернативы, вакцина может находиться в виде вакцины нуклеиновых кислот (подробности, касающиеся этого способа, см. в \УО 00/20027). Таким образом, частью настоящего изобретения также является иммуногенная композиция для иммунизации человека против белка НЕК-2, содержащая вектор, описанный выше, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем и, необязательно, адъювантом.

Также объемом настоящего изобретения охвачен способ иммунизации человека против аутогенного НЕК-2, причем способ содержит введение человеческому существу иммуногенно эффективного количества иммуногенного варианта белка НЕК-2, раскрытого в настоящем описании, или иммуногенной композиции, содержащей указанный вариант, или вектора, раскрытого в настоящем описании, или иммуногенной композиции, содержащей указанный вектор.

Особенно предпочтительным является то, что этот способ иммунизации (а также различные средства для иммунизации, приведенные в настоящем описании) используются для лечения или облегчения рака.

Введение к примерам

В нижеследующих примерах используется 104.1 молекула (например, 8ЕО Ш N0:2), которая представляет собой иммуногенный аналог белка НЕК-2, ассоциированный с раком. Однако специалистам в данной области техники следует принять во внимание, что общие принципы настоящего изобретения применимы к другим Нщ-тагированным белкам, особенно белкам, продуцированным рекомбинантным способом в клеточных системах насекомых.

Процесс очистки состоит из следующих 4 общих этапов очистки:

1. Диафильтрации с заменой буфером ферментационного супернатанта.

2. Аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (1МАС).

3. Гель-фильтрации/эксклюзионной хроматографии (8ЕС).

4. Анионообменной хроматографии (А1Е).

Существуют два дополнительных этапа вирусной очистки, включенные в общий предпочтительный процесс, один этап инактивации вирусов и один этап фильтрования вирусов.

Диафильтрация/замена буфера

Диафильтрация служит трем целям: 1) концентрированию вещества 104.1; 2) удалению низкомолекулярных веществ из ферментационной среды, которые могут интерферировать с последующим этапом захвата, например, ионов металла; 3) замене буфера на буфер, более подходящий для металлохелатной хроматографии (1МАС). Замена буфера происходит в один или два этапа. Первый этап является заменой на 50 мМ фосфатный буфер рН 7,0; второй этап является заменой на 50 мМ фосфатный буфер рН 7,5, который является необязательным. Если диафильтрацию выполняют при рН 7,5, такая последовательность рН оказывается критической, поскольку переход непосредственно к рН 7,5 приводит к преципитации неидентифицированных компонентов из клеточной ферментационной среды насекомых. Концентрирование выполняют главным образом для уменьшения времени загрузки в последующей 1МАС и для уменьшения расхода буфера на этапе замены буфера, и не установлено, что оно является существенным для данного процесса, поскольку последующая 1МАС по своей природе представляет собой этап процесса концентрирования. Степень концентрирования составляет в настоящее время примерно 5 раз или до общей концентрации белков среды, не превышающей 3 мг/мл (предпочтительно не превышающей 2 мг/мл), но эксперименты, использующие 10-кратное концентрирование также являются рабочими, если уровень белка не становится слишком высоким, и ожидается, что возможно дальнейшее увеличение, например, в 20 или даже в 25 раз. Кроме того, концентрирование менее чем в 5 раз, описанное в протоколе, может улучшить процесс, поскольку это в последующем может уменьшить время загрузки колонки 1МАС.

- 7 008827

Получение образцов для 1МАС

Диафильтрат может быть приготовлен перед нанесением на колонку 1МАС при помощи добавления имидазола до конечной концентрации 0-10 мМ, если в буфере для элюции используется имидазол; если имидазол (или аналогичное вещество) не добавляли, авторы получали совместно со 104.1 очистку других белков из клеток насекомых. С другой стороны, если элюция проводилась с Б-гистидином, вместо этого в буфер для элюции добавляли соль. Кроме того, добавляли (после фильтрации) Твин-20 до конечной концентрации 0,1% (об./об.). До 5% может быть применено на этапе 1МАС, и концентрация, превышающая 0,1%, будет приводить к уменьшению формирования димеров. Предполагается, что другие детергенты также являются полезными, например, другие детергенты Твин (Твин 40, 60, 80 и 85).

1МАС

Вещество 104.1 имеет так называемый Ηίδ-таг на Ν-конце, который имеет сродство к комплексообразующим ионам двухвалентных металлов, иммобилизованных на матрице колонки. Критическими параметрами являются выбор иона двухвалентного металла и выбор агента/способа элюции. Νί²⁺, Си²⁺ и Ζη²⁺, все, могут быть использованы в качестве хелатообразующего иона металла. Однако Ζη²⁺ обеспечивал хорошее извлечение и меньшее количество примесей. Для элюции захваченного 104.1 может быть использовано несколько стратегий: 1) применение в колонке имидазола; 2) применение в колонке гистидина; 3) применение в колонке буфера с высокой концентрацией соли и 4) изменение рН в колонке.

В процессе, предпочтительном в настоящее время, используется элюция с применением 100 мМ Бгистидина на одном этапе. Однако может быть использовано до 50 мМ, но результатом является менее концентрированный 104.1 и более низкое извлечение. Также возможно использование имидазола (применяемого в виде 200 мМ раствора), и также он может быть использован при более низких концентрациях (до 50 мМ) с таким же эффектом извлечения.

8ЕС

В нижеприведенном примере описано выполнение 8ЕС в Трис-буфере. Однако оказывается, что также хорошо работает фосфатный буфер, но Трис является более подходящим для последующей А1Е, чем фосфатный. При использовании фосфатного или Трис-буфера, содержащего соль, необходимо разбавление элюата 8ЕС перед применением в колонке А1Е для уменьшения концентрации фосфатов, и это не является необходимым при использовании только Трис-буфера.

Если 1МАС была выполнена при концентрации Твин-20, превышающей 0,4%, ее следует довести до <0,4% в 8ЕС, поскольку белок 104.1 не связывается с А1Е колонкой, если концентрация Твин-20 превышает 0,2%. Это может отличаться при проведении А1Е в других буферных системах.

Получение образцов для А1Е хроматографии

Релевантные фракции из 8ЕС разбавляют водой, 1 объем элюата + 3 объема воды, для уменьшения концентрации фосфатов при использовании фосфатов, поскольку они интерферируют с А1Е хроматографией. Этот вопрос также обсуждается в параграфе 8ЕС.

А1Е хроматография

Критическими параметрами являются рН и ионная сила образца и буферных систем.

Если 8ЕС проводили в Трис, приготовление образцов (разбавление водой) может быть исключено и объем загрузки (и время загрузки) будет уменьшен. Если А1Е проводили в Трис-буфере, содержащем соль, А1Е разбавляли в Трис-буфере до тех пор, пока ионная сила не понижалась до 3 мСм/см.

Конечный объединенный продукт анализируют при помощи 8П8-РАСЕ, вестерн-блоттинга (\УВ). ЕЫ8А, ВЭЖХ, визуальным осмотром, ΟΌ₂₈₀, рН, амебоцитным лизатом лимулуса (БАБ) и аминокислотным анализом. Промежуточные продукты анализируют при помощи δΌδ-РАОЕ, ЕБ18А и ΟΌ₂₈₀.

Как будет очевидно, А1Е предпочтительно выполняют в виде двух последовательных этапов, где на первом этапе используется ионообменная матрица со слабым анионом, а на втором этапе используется ионообменная матрица с сильным анионом. Однако следует принять во внимание, что этап, использующий слабую А1Е матрицу, может быть введен между этапами 1МАС и 8ЕС.

Пример 1. Культивирование 104.1 варианта НЕК-2

Создание клеточной линии

Поликлональную культуру клеток 82 Эго^орНПа те1апода§1ег трансфецировали вектором рМТ (система ОЕ8®, 1пу11годеп), содержащим ген, кодирующий 104.1 варианта НЕК-2; полная последовательность нуклеиновых кислот вектора рМТ приведена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1. Клетки параллельно трансфецировали плазмидой, несущей ген, наделяющий резистентностью к гигромицину, предоставляющей возможность использовать гигромицин для отбора трансфецированных клеток.

Способ предельных разбавлении использовали для изоляции единичных клеточных клонов, и из выбранной клеточной линии создавали главный банк клеток (МСВ).

Получение белка НЕК-2 Аи1оУае

Восстанавливали физиологическую активность одной пробирки из МСВ в Т-флаконе и распределяли во встряхиваемые колбы, содержащие среду ЕхСе11 420 (1КН) при 25°С для получения достаточного количества биомассы для инокуляции биореактора. Общее количество клеток 45х10⁹ разбавляли в 3000 мл с ЕхСе11 420, дополненной 4 мМ глутамином, 0,1% Р1игошс Е68 и 0,5 мл/л противовспенивателем ΡΌ30. 3000 мл использовали для инокуляции биореактора АррНсоп (рабочий объем 7 л), в котором куль- 8 008827 тура росла в течение 3-х дней при 25°С, 6О₂=50% (100% = насыщение воздухом), рН=6,5±0,1 (доводили

5% Н₃РО₄ и 0,5М ΝαΟΗ), и перемешивали при 170 об./мин.

Эту культуру разбавляли ЕхСе11 420, дополненной 4 мМ глутамином, 0,1% Р1итошс Е68 и 0,5 мл/л противовспенивателем РИ30, до общей концентрации клеток 15х10⁶ клеток/мл и использовали для инокуляции биореактора АррНсоп с рабочим объемом 15 л, поддерживающим 25°С, 6О₂=50% (барботирование чистым кислородом), рН=6,5±0,1 (доводили 5% Н₃РО₄ и 0,5М ΝαΟΗ), и перемешивали при 142 об/мин. Культуру постоянно разбавляли ЕхСе11 420, дополненной 4 мМ глутамином, 0,1% Р1итошс Е68, до достижения общего объема 10 л. Скорость разбавления регулировали ежедневно для предотвращения падения количества клеток ниже 15х10⁶ клеток/л. В культуру вручную добавляли противовспениватель РИ30 для поддержания общей концентрации 0,5 мл/л.

При завершении наполнения инициировали перфузию из расчета 1 РУ/день (объемов реактора в день), используя акустическое устройство удержания клеток Вю8ер (ЛррИЗепк) для предотвращения потери клеток с удаляемой средой. При концентрации клеток 30х10⁶ клеток/мл культуру индуцировали путем добавления к культуре и в резервуар со средой всего 2 мкМ СбС1₂ (10 мМ исходный раствор).

Собирали ферментационную среду, центрифугировали для получения бесклеточного супернатанта и фильтровали через фильтр РАЬЬ 0,8/0,22 мкм. Полученный в результате стерильный супернатант хранили либо при -80°С до момента использования (хранение до 3-х месяцев при -80°С не создавало обнаруживаемых проблем со стабильностью), либо хранили при 4°С до одной недели (также без какой-либо обнаруживаемой деградации белка).

Культивирование прерывали через 10 дней после индукции и оставшуюся в биореакторе культуральную среду сливали.

Пример 2. Диафильтрация/концентрация и замена буфера

Перед использованием ферментационный супернатант из примера 1, при хранении при -80°С, медленно оттаивали при 4°С в течение ночи (последние 3-4 ч может выполняться в охлажденной воде), и затем хранили в течение максимум 3-х дней при 4°С. В других случаях ферментационный супернатант использовали непосредственно.

Ферментационный супернатант центрифугировали в центрифуге 8отуа11 РЕ 5С Р1и§ в пробирках 8СЛ3000 при 10000 об./мин в течение 15 мин при 4°С.

Диафильтрацию проводили в холодной комнате при 5±3°С на РтоЕ1их М12 (МПНроте) с 2кассетным фильтром РеШсоп 30К 0,5 м² (МИНроте, Са!# Р2В030А05). До использования фильтр хранили в 0,1М ΝαΟΗ. Соответственно, перед диафильтрацией фильтр как следует тщательно промывали водой тПИЮ: стандартный резервуар заполняли водой ιηί11ί-0 (3 л) и промывали водой, пропуская через фильтр до тех пор, пока в резервуаре не оставалось 200 мл. Эту процедуру повторяли 3 раза до тех пор, пока через фильтр не было пропущено всего 12 л. После этого можно было начинать диафильтрацию.

Максимум 15 л ферментационного супернатанта концентрировали примерно в 5 раз или до общей концентрации белка в среде, не превышающей 2 мг/мл, как было измерено калориметрическим способом.

Включали рециркуляционный насос. Клапан противодавления следует частично закрыть для того, чтобы давление на выходе соответствовало обратному давлению (например, 0,2 бар). Скорость всасывания регулировали до 30-50%. Разница давления должна составлять 0,7-1,2 бар, поскольку при этом используется максимальная производительность фильтра, и поток через фильтр соответствует 3-4 л/мин (например, давление на входе Р=0,2 бар, давление на выходе Р=0,1 бар, ДР=0,8). Давление на входе должно составлять максимум 1,4 бара, учитывая срок годности трубы и производительность. Если требуется более высокое давление на входе, давление рециркуляционного насоса может быть повышено (%), или может быть повышено механическое давление в трубе путем использования более высокого давления в трубе (в масштабе 0-5). Если клапан противодавления закрыт, получают более высокое давление на входе и на выходе. Клапан противодавления никогда не следует закрывать полностью.

Затем концентрированный ферментационный супернатант подвергали замене буфера на одном или двух этапах, сначала используя 10 объемов 50 мМ Иа₂НРО₄/МаН₂РО₄, рН 7,0, и затем, на необязательном втором этапе, 10 объемов 50 мМ Ыа₂НРО₄/МаН₂РО₄, рН 7,5: стандартный резервуар в приборе РтоЕ1их М12 МПНроге заполняли буфером до общего объема 3 л, а также заполняли буфером боковой резервуар. Установки прибора такие же, что и при концентрировании образца.

Измеряли объем образца с замененным буфером (УЬ), и образец извлекали для 8И8-РАОЕ (8Ь). Концентрированный образец с замененным буфером делили на части по 11 мл и 50 мл и быстро замораживали до -80°С.

Анализ диафильтрата

Для гарантии эффективности замены буфера измеряли рН и ионную силу.

Общую концентрацию белка оценивали спектрофотометрически при 280 нм в 1 см кювете. Образец, разбавленный в 10 раз (разбавленный в 50 мМ натрийфосфатном буфере рН 7,5) при помощи 50 мМ натрийфосфатного буфера рН 7,5, использовали в качестве контроля (используя аппроксимацию АЬ§₂₈₀ 1=1 мг/мл общего белка). Концентрацию общего белка дополнительно можно измерять калориметриче

- 9 008827 ским способом ВгабГогб (ВюВаб). Удельную концентрацию варианта 104.1 измеряли ЕЬ18А, и, кроме того, анализировали диафильтрат при помощи 8Ό8-ΡΆΟΕ, окрашиванием серебром и детектированием \\'В-ЕСЕ.

Комментарии к этапу диафильтрации

Важно начинать замену буфера при рН ниже 7,1 перед изменением до рН 7,5. В противном случае преципитируются остаточные компоненты из ферментационной среды.

Диафильтрованные образцы хранились при -80°С в течение нескольких месяцев без изменений характеристик в количественном НЕК.-2 ЕЫ8А. Однако при оттаивании даже короткое воздействие температурой 37 и 54°С резко уменьшает характеристики диафильтрата в том же ЕЬ18А. При хранении при 0°С (лед/вода) и 4°С после оттаивания от -80°С характеристики диафильтрата в ЕЬ18А остаются стабильными в течение по меньшей мере 4 ч.

После диафильтрации удобно инактивировать любой вирус, который может присутствовать в диафильтрате. Для этого образцы оттаивают при 2-8°С и объединяют, последовательно фильтруя через 1,0/0,45/0,2 мкм фильтры, куда затем добавляют 50% Твин-20 и ТпВР до конечной концентрации 2 и 0,3%, соответственно. Раствор хранят при 2-8°С в течение 16-20 ч при мягком помешивании. Затем раствор фильтруют через фильтр 0,2 мкм до последующего этапа 1МАС хроматографии (пример 3).

Пример 3. 1МАС

Общим хроматографическим принципом для 1МАС является аффинность между тагом в белке и хелатным комплексом иона металла на матрице колонки. Хроматографическая матрица представляет собой ΡΟΚ.Ο8 20 МС или, предпочтительно, 50 МС (оба из Аррйеб ВюзузГетз), а хелатообразующий ион металла представляет собой Ζη²⁺. Молекула 104.1 снабжена Н15-тагом, и буферная система для связывания Н15-тага с матрицей колонки представляет собой 50 мМ Να₂ΗΡΟ₄/ΝαΗ₂ΡΟ₄, 0,1% Твин-20, рН 7,5.

Загружают 2-4 мг 104.1 на мл материала колонки и затем элюируют с использованием 100 мМ Ьгистидина, 50 мМ Να₂ΗΡΟ₄/ΝαΗ₂ΡΟ₄, рН 7,5, 0,1% Твин-20. В качестве альтернативы, если элюцию выполняют 200 мМ имидазолом, буферная система для связывания также содержит 5 мМ имидазол.

Инструмент: рабочая станция νΐδΙΟΝ (Аррйеб ВюзузГетз).

Программное обеспечение: программное обеспечение анализа данных для νίδίοη, ВюСаб 700Е, версия 3, Еег8ер1|уе ВюзузГет.

Детектирование: УФ поглощение при λ=280 и 220 нм.

Проводимость: 0-200 мСм.

рН калиброван при: 7,0 и 10.

Температура: процедуру проводили с буфером и колонкой при комнатной температуре (20-24°С) и проводили загрузку образцов на льду и сбор фракций при 10°С.

Получение образцов

В диафильтрат, содержащий молекулу 104,1, добавляли 800 мМ имидазол до конечной концентрации 5 мМ имидазола, если для элюции в 1МАС использовался буфер, содержащий имидазол, тогда как при использовании для элюции в 1МАС Ь-гистидина добавляли Твин-20 до конечной концентрации 0,1% (об./об.). Непосредственно перед нанесением на колонку образец фильтровали под вакуумом через 0,22 мкм фильтр. Образец хранили при 5±3°С (предпочтительно 4°С) до нанесения на колонку, где его держали на льду после нанесения. Время обработки при комнатной температуре следует минимизировать.

Колонка

ΡΟΚ.Ο8 20 МС или 50 МС (предпочтительно) в 16х100 мм (20,1 мл) колонке ΡΕΕΚ (Аррйеб Вюзуз!етв), упакованной при 2000-2500 фунтов на кв. дюйм - другие колонки в зависимости от масштаба процедуры очистки являются в равной степени пригодными.

Программа активации колонки (стриппинг-активация)

Поток: 10 мл/мин.

1. 5 СV (объемами колонки) 50 мМ Ν;·ιΡΟ₄ (аббревиатура для Να₂ΗΡΟ₂/ΝαΗ₂ΡΟ.₁) рН 7,5, 0,1% Твин20 (стриппинг).

2. 5 Ον Η₂Ο (М1Ш-0).

3. 40 Ον 100 мМ ΖπΟΚ рН 4,5.

4. 40 Ον Н₂О (МШ1-0).

5. 20 Ον 50 мМ Ν;·1ΡΟ₄ рН 7,5, 0,1% Твин-20.

Колонку следует активировать перед каждым прогоном.

Хроматографическая программа

Скорость потока 30 мл/мин, загрузка 5 мл/мин.

Размер сбора фракций 9 мл, и 5 мл при пике элюции со 100 мМ Ь-гистидином (или, если применимо, при пике элюции с 200 мМ имидазолом). Собирают в охлажденный (10°С) коллектор для фракций.

Раствор, содержащий диафильтрат с инактивированными вирусами, загружали в колонку при 4°С и промывали 20 Ον 50 мМ ХаВСЕ рН 7,5, 0,1% Твин-20, 0,5М ЫаС1, затем 5 Ον 50 мМ ХаВСЕ рН 7,5, 0,1% Твин-20 до элюции при помощи 50 мМ Ν;·1ΡΟ₄ рН 7,5, 0,1% Твин-20, 100 мМ гистидина.

- 10 008827

Фракции объединяли из пика элюции хроматограммы (см. фиг. 1). Сбор начинали в начале пика и собирали всего 50 мл (или 1,5 объема колонки), или фракции объединяли на основании результатов δΌδ РАСЕ/^В или ЕЫ8Л до общего объема 50 мл. Этот пул можно хранить в течение ночи при 5±3°С или сразу провести 8ЕС. Хранение пула до 7 дней при 5±3°С, -20°С и ниже -70°С не показывает потери в общем белке после фильтрации через 0,22 мкм фильтр при анализе δΌδ РАСЕ и ^Б-ЕСЬ.

Санирование колонки

Колонку промывали 5 СУ 1М ΝαΟΗ, 2М ЫаС1, затем 10 СУ воды. Если необходима дополнительная санация, см. К8Р производителя. Колонку хранили в 30% ЕЮН при 5-30°С.

Анализ промежуточных продуктов 1МАС

Начальный материал, проточные фракции и элюированные фракции анализировали ^В-ЕСЬ и δΌδ-РАСЕ/окрашивание серебром.

Анализ пула 1МАС

Пул анализировали ^В-ЕСЬ и δΌδ-РАСЕ/окрашивание серебром, ВЭЖХ и ΟΌ₂₈₀ (на разбавленном в 10 раз образце). Удельную концентрацию 104.1 определяли ЕЬКА.

Пример 4. Гель-фильтрационная хроматография δЕС

Этап гель-фильтрации проводят в 20 мМ Трис, 0,1% Твин-20, рН 7,5, но Трис можно заменить 50 мМ №ьНРО₄/№1Н₂РО₄ в качестве буферной системы. 50 мл из 1МАС по примеру 3 загружали при помощи δοοροΗοορ (Рйаттае1а) на матрицу διιροΓάοχ 200 ргер дгаб.

Инструмент: рабочая станция ВюСаб 700Е для перфузионной хроматографии, оборудованная полупрепаративной проточной ячейкой для уменьшения давления на колонке.

Программное обеспечение: программное обеспечение анализа данных для Уыоп. ВюСаб 700Е, 3 версия, Регаербуе Вюкуйет.

Детектирование: УФ поглощение при λ=280 и 220 нм.

Проводимость: 0-200 мСм.

рН калиброван при: 7,0 и 10.

Температура: буферные системы и колонка находились при комнатной температуре (20-24°С), а образец загружали непосредственно при 4°С. Фракции, содержащие 104.1 мономер, следует поместить в температуру 4°С сразу после сбора, если коллектор не охлаждается.

Получение образцов

Пул из 1МАС в буфере, 50 мМ №₂НРО₄^аН₂РО₄, 0,1% Твин-20, 100 мМ Ь-гистидина (или 200 мМ имидазола), рН 7,5, не требует специального приготовления. До загрузки образцы следует держать охлажденными (5±3°С).

Колонка δире^беx 200 ргер дгаб упаковали в колонку Рйаттае1а ХК 50х960 мм (1884 мл) из расчета 15 мл/мин в качестве конечной скорости потока. Максимальная загрузка 50 мл.

Хроматографическая программа

Общая скорость потока 8 мл/мин, загрузка 5 мл/мин

Размер фракций 9,0 мл

1. Уравновешивание: 1,5 СУ 20 мМ трис, 0,1% Твин-20, рН 7,5

2. Загрузка: через 50 мл δире^1οοр, 5 мл/мин

3. Элюция: 1,2 СУ 20 мМ трис, 0,1% Твин-20, рН 7,5

Фракции из мономерного пика (см. фиг. 2) объединяли путем сравнения с результатами гельфильтрации и/или МС/ОФ-ВЭЖХ результатами для получения чистого продукта (приблизительно 130 мл). Этот пул можно хранить в течение ночи при 5±3°С или сразу использовать для А1Е хроматографии по примеру 5. Хранение пула до 7 дней при 5±3°С, -20°С и ниже -70°С не показало потери общего белка после фильтрации через 0,22 мкм фильтр при анализе δΌδ РАСЕ и ^В-ЕСЬ.

Санация и очистка колонки

Колонку очищали пропусканием 0,5 №1ОН в обратном потоке в течение 1-2 ч при 6,5 мл/мин (20 см/ч), затем - буфера в количестве 3 объемов слоя колонки. Для санации прогоняли 0,5-1,0 №1ОН в обратном потоке, 13 мл/мин (40 см/ч), в течение 30-60 мин, затем стерильный буфер в количестве 3-5 объемов слоя колонки. Колонку хранили в 20% этаноле при 4-8°С. Дополнительную информацию см. в инструкции производителя.

Анализ промежуточного продукта 8ЕС

Начальный материал и элюированные фракции анализировали ^В-ЕСЬ и δΌδ-РАСЕ/окрашивание серебром и МС/ОФ-ВЭЖХ.

Анализ пула 8ЕС

Пул анализировали ^В-ЕСЬ и δΌδ-Р АСЕ/окрашиванием серебром, ВЭЖХ и ОО_280нм. Удельную концентрацию 104.1 определяли при помощи ЕЫБА.

Комментарии к 8ЕС

Следует убедиться в том, что между 1МАС и загрузкой из δире^1οοр образцы хранятся при 5±3°С.

- 11 008827

Если коллектор для фракций не охлаждается (10°С), следует убедиться в том, что фракции перенесены в холодную комнату/холодильник сразу после сбора.

Если колонка используется часто, в колонке используется постоянный поток (0,2 мл/мин) 20 мМ трис, рН 7,5, 0,1% Твин-20 (в качестве альтернативы 50 мМ Να₂ΗΡϋ.₁/ΝαΗ₂Ρ0.₁ используется вместо 20 мМ трис, причем в этом случае используется 0,5% Твин-20).

Пример 5. Хроматография ЛШ

Первый необязательный этап

Сначала необязательно выполняется анионообменная хроматография на колонке с матрицей Роток 50РР Колонку уравновешивают при помощи 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Твин-20 при рН 7,5. После уравновешивания сохраняли образец для тестирования на бионагрузку.

Элюат 8ЕС загружали в колонку при 4°С и колонку промывали 20 СУ 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Твин20 при рН 7,5 с последующей элюцией продукта при помощи 20 мМ Трис-НС1, 250 мМ №С1, 0,1% Твин20, рН 7,5. Пул продукта фильтровали через 0,2 мкм фильтр, анализировали ОЭ^о™, 104.1 ЕЫ8Л, ОФВЭЖХ и ВЭЖХ-МС (эксклюзионная ВЭЖХ) и хранили при 2-8°С в течение 3 дней.

Колонку Роток 50РI промывали Н₂О (ιηί11ί-Ο) и очищали 10 СУ 2М №С1, 1М ΝαΟΗ перед хранением в 20 мМ ΝαΟΗ. Ее санировали 5 СУ 0,5 М ΝαΟΗ и промывали Н₂О (тПН-С) перед уравновешиванием и последующим повторным использованием.

Обязательный этап

Анионообменную хроматографию выполняли при рН 7,5 (20 мМ Трис), предпочтительно на ионообменной перфузионной матрице с сильным анионом РОКО8 50НО (АррЕей ВюкукГетк) на колонке РЕЕК 4,6х100мм (1,662 мл). 104.1 элюировали 200 мМ ЫаС1.

Инструмент: рабочая станция УГЗЮЫ для перфузионной хроматографии.

Программное обеспечение: программное обеспечение анализа данных для У1кюи, ВюСай 700Е, 3 версия, Реткерйуе ВюкукГет.

Детектирование: УФ поглощение при λ=280 и 220 нм.

Проводимость: 0-200 мСм.

рН калиброван при: 7,0 и 10.

Температура: процедуру проводили с буферными системами и колонкой при комнатной температуре (20-24°С), и загружали образец со льда. Коллектор фракций охлаждался до 10°С.

Получение образцов

Если первый необязательный АГЕ этап был опущен, промежуточный продукт 8ЕС разбавляли 1+3 (до 25%) в воде, содержащей 0,1% Твин-20 при мягком помешивании на магнитной мешалке. В других случаях элюат РОКО8 50РI разбавляли в 15 объемах 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Твин-20 при рН 7,5 для уменьшения проводимости. Образцы следует держать охлажденными (5±3°С) до и во время загрузки.

Колонка

РОКО8 50НО упаковывали в колонку 4,6х100 мм (1,662 мл) РЕЕК (Аррйей ВюкукГетк) при 20002500 фунтов на кв. дюйм.

Хроматографическая программа

Общая скорость потока 10 мл/мин, загрузка образца 5 мл/мин.

Размер фракций: 9 мл во время загрузки образца, 1 мл во время 1-го этапа элюции и 5 мл во время 2-го этапа элюции.

Анионообменную хроматографию проводили на колонке с матрицей Рогок 50НО при 4°С. Колонку уравновешивали 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Твин-20 при рН 7,5. После уравновешивания сохраняли образец для тестирования на бионагрузку.

Образец загружали на колонку, и колонку промывали 10 СУ 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Твин-20 при рН 7,5 и 10 СУ 20 мМ Трис-НС1, 20 мМ ЫаС1, 0,1% Твин-20 при рН 7,5 с последующей элюцией продукта 20 мМ Трис-НС1, 200 мМ ЫаС1, 0,1% Твин-20, рН 7,5.

Фракции из пика элюции (см. фиг. 3) объединяли путем сравнения с результатами гель-фильтрации для получения концентрации более чем 2,5 мг/мл или ОП_280нм более чем 2,5. Фракции до объединения можно хранить в течение ночи при 5±3°С. Хранение пула до 7 дней при 5±3°С, -20°С и ниже -70°С не показало потери общего белка после фильтрации через 0,22 мкм фильтр при анализе при помощи 8Ό8 РАСЕ и №В-ЕСЬ.

Санация колонки

Колонку промывали 10 объемами колонки (СУ) 1М №1ОН. 2М ЫаС1 затем 20 СУ воды. При необходимости в дополнительной санации см. инструкцию производителя. Колонку хранили в 30% этанола при 5-30°С.

Анализ

Начальный материал, проточные фракции и элюированные фракции анализировали ^В-ЕСЬ и δΌδ-РАСЕ/окрашивание серебром.

- 12 008827

Анализ пула ΑΙΕ

Пул анализировали ^В-ЕСБ и δΌδ-РАбЕ/окрашивание серебром, по внешнему виду, рН, ВЭЖХ, БАБ и ОЭ₂₈₀ (используя разбавленный в 3 раза образец). Удельную концентрацию 104.1 определяли ЕБ18А.

Комментарии к ΑΙΕ

Если промежуточный продукт 8ЕС разбавляли менее чем 1+3 (25%), то 104.1 обнаруживали в прогоне фосфатного буфера из А1Е в результате интерференции.

До 25 мг 104.1 наносили на колонку А1Е без обнаруживаемых количеств 104.1 в прогоне.

Необязательное фильтрование вирусов

Фильтрование вирусов и последующее разбавление и заполнение лекарственной субстанции происходило в среде С1азз 100. Очищенные предварительным фильтрованием объемы из одного или нескольких прогонов Рогоз 50НО извлекали из холодильника и оттаивали при 2-8°С. Затем их фильтровали через 0,1 мкм фильтр и пропускали через фильтрационную мембрану для вирусов Р1аиоуа 20Ν. Фильтр сохраняли для тестирования на целостность. Материал, отфильтрованный от вирусов, доводили до концентрации 2,5-3,0 мг/мл путем измерения ОЭ_280нм.

Хранение конечного объединенного продукта

После фильтрования через 0,22 мкм фильтр конечный объединенный продукт хранили при температуре ниже -70°С в полипропиленовом контейнере или ί,'Ζ флаконе.

Полученный таким образом продукт имел чистоту, подходящую для клинического применения.

- 13 008827

Список последовательностей <110> РЬагтеха А/3 <120> ΡυΚΙΡΙΕΑΤΙΟΝ ОЕ НЕК-2 νΑΚΙΑΝΤ3 <130> Р10200К00 <160> 2 <170> РаЬепЫп чегзхоп 3.2 <210> 1 <211> 5661 <212> ΟΝΑ <213> АгЫ£1с1а1 зедиепсе <220>

<223> КесотЫпапЬ ехргеззтоп р1азга1<1 άθΓίνβά £гот рмт

<220> <221> <222> <223>	ро1уА З1дпа1 {263) . . (268) ЗУ40 1а£е ро1уас(епу1аЫоп з1Ье
<220> <221> <222> <223>	тазе ЬеаЬиге (1579) . . (2439) Ατηρίϋίΐΐίη гезэзЬапсе депе, епсойес! Ьу сотр1етеп(:агу зЬгагкЭ
<220> <221> <222> <223>	рготокег (3050).. (3415) МекаПокМопетп рготоЬег
<220> <221> <222> <223>	К.В5 (3493)..(3501) Когак-Ике зедиепсе
<220> <221> <222> <223>	СИЗ {3502)..(5592) ΟΝΑ епсосИпд 1ттигюдеп1с, Ыз-каддесЗ νθτίθηί οί Ьитап НЕВ-2
<220> <221> <222 > <223>	зхд ρβρίίάβ (3502)..(3555) ΒίΡ з1дпа1 зедиепсе
<220> <221 > <222> <223>	ш4зс Ееакиге (3556)..(3597) НхзкхсНпе сад
<220> <221> <222>	так_рер£1(1е (3556)..(5589)

- 14008827 <220>

<221> т1зс_£еа£иге <222> (3598)..(3603) <223> ОхреррЩазе 5ίορ ведиепсе <220>

<221> т1зс_£еа£иге <222> (3604)..(5589) <223> Бепе соШпд £ог 1Ье ΗΗΕΚ2ΜΑ5-50ϋΗ ρΓΟΪθίη <220>

<221> т1зс_£еа1:11ге <222> (4357)..(4401) <223> ОхрНОНегга ίοχοϊά Ρ2 θρίΐορβ <220>

<221> т!зс_£еа(;иге <222> (5500)..(5562) <223> ОЗрЬЬНегха ίοχοίά Ρ30 βρίίορβ <400> 1

ддссдсЬсда	дЬсРададдд	ссс£Лсдаад	д£аадсс1а£	сссРаасссР	сбссЬсддЬс	60
РсдаОСсГас	дсд£ассдд£	саЬсаксасс	аЬсассаЬЬд	адРРРааасс	сдсРдаЬсад	120
ссЬсдасРдб	дссРРсЬаад	аРссадасаЬ	даГаадарас	а££даЬдадЬ	££ддасааас	180
сасаас!ада	аЬдсадРдаа	ааааардс!;!;	ЬаЬЬедЪдаа	а£££д1;да£д	сеаььдс-Ь'Ье	240
а£Ь£д£аасс	аРЬаЬаадс!;	дсаабаааса	ад(+аа саас	аасааЬЬдса	ЬЬсаЬЬЬЬаЬ	300
д£££саддЫ;	садддддадд	£д£дддадд£	ЬЬЫЛааадс	аадраааасс	СсЬасаааЪд	360
£дд£а£с)дс1;	дае£а£да£с	адссдасс£д	саддса£дса	адсЬЬддсдЬ	ааЬсаРддбс	4 20
аЬадсЁдЬРР	ссЬдрдГдаа	аеЬдЬРаРсс	дсЬсасааЫ:	ссасасааса	Ьасдадссдд	480
аадсаРааад	£д£ааадсс£	дддд£дсс£а	аЬдадкдадс	£аас£саса£	£аа££дсд££	540
дсдсЬсасОд	сссдс£££сс	ад£ сдддааа	ссЬдЪсдрдс	садс£дса££	ааЬдааксдд	600
ссаасдсдсд	дддададдсд	дЬРЬдсдЬаЬ	ЬдддсдсРсР	ЬссдсРЬссЬ	сдсЬсасЬда	660
с£сдс£дсдс	СсддРсдГЬс	ддсЬдсддсд	адсдд£а£са	дсРсасЬсаа	аддсддсааЬ	720
асддЫаРсс	асадаабсад	ддда£аасдс	аддааадаас	аЬдкдадсаа	ааддссадса	780
аааддссадд	аассдбаааа	аддссдсдРЪ	дсЬддсдЬЬЬ	££сса£аддс	Ьссдсссссс	840
ЬдасдадсаР	сасаааааЬс	дасдсЬсаад	£сададд£дд	сдааасссда	□аддасбаРа	900
аадаГа-сад	дсд£££сссс	сРддаадсЬс	сс£сд£дсдс	ОсЬссРдЬРс	сдассссдсс	960
дсЬРассдда	ЬассЬдбссд	ссЬЬРсЬссс	РГсдддаадс	дкддсдсЬЫ:	сРсаРадсРс	1020
асдс£д£адд	Ра£с£сад££	сдд£д£адд£	сдЬСсдсксс	аадс£дддс£	дЬдЬдсасда	1080
ассссссд£Ь	садсссдасс	дсЬдсдссИ	аЬссддРаас	РаЬсдРскРд	адЬссаассс	1140
ддЬаадасас	дасРЬаЬсдс	сасЬддсадс	адссас£дд£	аасаддаЬРа	дсададсдад	1200

- 15 008827

дбабдбаддс	ддбдсбасад	адббсббдаа	дбддбддссб	аасбасддсб	асасбадаад	1260
дасадбаббб	ддбабсбдсд	сбсбдсбдаа	дссадббасс	ббсддааааа	дадббддбад	1320
сбсббдабсс	ддсааасааа	ссассдсбдд	бадсддбддб	ббббббдббб	дсаадсадса	1380
даббасдсдс	адааааааад	дабсбсаада	адабссбббд	абсббббсба	сддддбсбда	1440
сдсбсадбдд	аасдаааасб	сасдббаадд	даббббддбс	абдадаббаб	саааааддаб	1500
сббсассбад	абссббббаа	аббааааабд	аадббббааа	бсаабсбааа	дбабабабда	1560
дбааасббдд	бсбдасадбб	ассаабдсбб	аабсадбдад	дсассбабсб	садсдабсбд	1620
бсбабббсдб	бсабссабад	ббдссбдасб	ссссдбсдбд	бадабаасба	сдабасддда	1680
дддсббасса	бсбддсссса	дбдсбдсааб	дабассдсда	дасссасдсб	сассддсбсс	1740
адабббабса	дсаабааасс	адссадссдд	аадддссдад	сдсадаадбд	дбссбдсаас	1800
бббабссдсс	бссабссадб	сбаббааббд	ббдссдддаа	дсбададбаа	дбадббсдсс	1860
адббаабадб	ббдсдсаасд	ббдббдссаб	бдсбасаддс	абсдбддбдб	сасдсбсдбс	1920
дбббддбабд	дсббсаббса	дсбссддббс	ссаасдабса	аддсдадбба	сабдабсссс	1980
сабдббдбдс	аааааадсдд	ббадсбссбб	сддбссбссд	абсдббдбса	даадбаадбб	2040
ддссдсадбд	ббабсасбса	бддббабддс	адсасбдсаб	ааббсбсбба	сбдбсабдсс	2100
абссдбаада	бдсббббсбд	бдасбддбда	дбасбсаасс	аадбсаббсб	дадаабадбд	2160
бабдсддсда	ссдадббдсб	сббдсссддс	дбсаабасдд	дабаабассд	сдссасабад	2220
садаасббба	ааадбдсбса	бсаббддааа	асдббсббсд	дддсдаааас	бсбсааддаб	2280
сббассдсбд	ббдадабсса	дббсдабдба	асссасбсдб	дсасссаасб	дабсббсадс	2340
абсббббасб	ббсассадсд	бббсбдддбд	адсаааааса	ддааддсааа	абдссдсааа	2400
ааадддааба	адддсдасас	ддааабдббд	аабасбсаба	сбсббссббб	ббсаабабба	2460
ббдаадсабб	бабсадддбб	аббдбсбсаб	дадсддабас	абабббдааб	дбабббадаа	2520
ааабааасаа	абаддддббс	сдсдсасабб	бссссдаааа	дбдссассбд	асдбсбаада	2580
аассаббабб	абсабдасаб	баассбабаа	ааабаддсдб	абсасдаддс	ссбббсдббс	2640
дсдсдбгбсд	дбдабдасдд	бдаааассбс	бдасасабдс	адсбсссдда	дасддбсаса	2700
дсббдбсбдб	аадсддабдс	сдддадсада	саадсссдбс	адддсдсдбс	адсдддбдбб	2760
ддсдддбдбс	ддддсбддсб	баасбабдсд	дсабсададс	адаббдбасб	дададбдсас	2820
сабабдсддб	дбдааабасс	дсасадабдс	дбааддадаа	аабассдсаб	саддсдссаб	2880
бсдссаббса	ддсбдсдсаа	сбдббдддаа	дддсдабсдд	бдсдддссбс	ббсдсбабба	2940
сдссадсбдд	сдаааддддд	абдбдсбдса	аддсдаббаа	дббдддбаас	дссадддббб	3000

- 16008827

ЬсссадН-ас дасд(Дд£аа аасдасддсс ад£дссад1:д аа(Даа(Дсд

ПЬдсаддаса

3060 ддаСдСдд1:д сссдагдгда сгадегсггг дсгдсаддсс дгссгаЬссг сгддггссда

3120 гаададассс адаасгссдд ссссссассд сссассдсса сссссагаса гаЬдгддСас

3180 дсаадгаада дЪдссЪдсдс аЪдсссеагд

Ъдссссасса ададгггЬдс агсссагаса

3240 адЁссссааа дгддадаасс даассааггс ггсдсдддса даасаааадс ггсгдсасас

3300 дгсгссасгс дааСХ^ддад ссддссддсд гдгдсаааад аддгдааЬсд аасдааадас

3360 ссдгдЪдгаа адссдсдггг ссаааагдг а

Ёаааассдад адоаСсгддс саагд1дсаг

3420 садггдгддг

3480 агсаадгдаа гсагсгсадЪ дсаасгааад дддддагыа садсадсааа

даОсддддЬа ссааадЬсас с

аЬд аад

(Дд Ьеи

Ьдс Су 5 -15

аге Не

ггд Ьеи

егд Ьеи

дсс дгс дгд

3531

мег

Ьуз

А1а

Уа1 -10

Уа1

дсс

ггс

дСд

ддс

егд

год

егд

ддс

аЬд

аад

сас

саа

сас

саа

саг

саа

3579

А1а

РЫ

Уа1

С1у

Ьеи

5ег

Ьеи

61у

мег

Ьуз

Н13

61п

Н1з

(Пп

ΗΪ3

С1п

-5

-1

1

5

саг

саа

саг

саа

саг

саа

дсс

ссс

гсс

асе

саа

дгд

ьдн

асе

ддс

аса

3627

ΗΪ5

С1г.

Н1Б

С1п

Η1Ξ

С1п

А1а

Рго

5ег

ТНг

С1п

Уа1

Суз

ТНг

С1у

ТЫ

10

15

20

дас

агд

аад

егд

едд

сгс

ссг

дсс

адС

ссс

дад

асе

сас

егд

дас

агд

3675

Лер

Ме1.

Ьуз

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

А1а

Зег

Рго

С1и

ТЫ

Н1з

Ьеи

Азр

Мес

25

30

35

40

сЬс

сдс

сас

сгс

гас

сад

ддс

где

сад

дед

дгд

сад

дда

аас

егд

даа

3723

Ьеи

Агд

Н1з

Ьеи

Туг

С1п

С1у

Суз

С1п

Уа1

Уа1

С1п

С1у

Абп

Ьеи

С1и

45

50

55

ЫС

асе

Ъас

егд

ссс

асе

ааг

дсс

аде

(Да

адЬ

ггс

егд

сад

даг

аСс

3771

Ьеи

ТНг

Туг

Ьеи

Рго

ТЫ

Азп

А1а

Зег

Ьеи

Зег

₽Не

Ьеи

С1п

Азр

11е

60

65

70

сад

да<?

дгд

сад

ддс

гас

дед

сгс

аге

дед

сас

аас

саа

дгд

адд

сад

3819

С1п

С1и

Уа1

С1л

С1у

Туг

Уа1

Ьеи

11е

А1а

Ηί$

Азп

С1п

Уа1

Агд

С1п

75

во

85

дЪс

сса

егд

сад

адд

егд

едд

агг

дгд

еда

ддс

асе

сад

сгс

ггг

дад

3867

7а1

Рго

Ьеи

С1п

Агд

Ьеи

Агд

Не

Уа1

Агд

С1у

ТЫ

С1п

Ьеи

РНе

С1и

90

95

100

дас

аас

гаг

дсс

сЬд

дсс

дЬд

сга

дас

аа£

дда

дас

ссд

егд

аас

ааг

3915

Азр

Азп

Туг

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

Ьеи

Азр

Азп

(31у

Азр

Рго

Ьеи

А&п

Азп

105

110

115

120

асе

асе

ссг

дгс

аса

ччч

дсс

гсс

сса

дда

ддс

сЬд

едд

дад

егд

сад

3963

ТЫ

ТЫ

Рго

Уа1

ТЫ

С1у

А1а

Зег

Рго

С1у

С1у

Ьеи

Агд

С1и

Ьеи

С1п

125

130

135

сП

еда

аде

сгс

аса

дад

аЬс

ггд

ааа

дда

ддд

дгс

ид

аге

сад

едд

4011

Ьеи

Агд

5ег

Ьеи

ТЫ

С1и

Не

Ьеи

Ьуз

С1у

(Иу

Уа1

Ьеи

11е

С1п

Агд

140

145

150

- 17008827

аас Азп

ссс Рго

сад С1п 155

сГс Ьеи

Где Суз

Гас сад

дас Азр 160

асд ТЬг

аГГ Не

ГГд Ьеи

Гдд Тгр

аад ьуз 165

дас Азр

аГс Не

ггс РЬе

4059

Туг

С1п

сас

аад

аас

аас

сад

еГд

де Г

сГс

аса

еГд

аГа

дас

асе

аас

еде

ГсГ

4107

Н1з

Ьуз

Азп

Азп

61п

Ьеи

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Не

Азр

ТЬг

Азп

Агд

Зег

170

17 5

180

сдд

дсс

Где

сас

ссс

ГдГ

ГсГ

сед

аГд

ГдГ

аад

ддс

Гее

еде

Где

Ъдд

4155

Агд

А1а

Суз

Н1з

Рго

Сув

Зег

Рго

МеГ

Суз

Ьуз

С1у

Зег

Агд

Суз

Тгр

185

190

195

200

дда

дад

адг

ГсГ

дад

даГ

ГдГ

сад

аде

еГд

асд

еде

асг

дГс

гдг

дсс

4203

С1у

С1и

Зег

Зег

С1и

Азр

Суз

61п

Зег

Ьеи

ТЬг

Агд

ТЬг

νβΐ

Суз

А1а

205

210

215

ддЬ

ддс

ГдГ

дсс

еде

Где

аад

ддд

сса

еГд

ССС

асг

дас

Где

Где

саГ

4251

С1у

61у

Суз

А1а

Агд

Суз

Ьуз

51у

Рго

Ьеи

Рго

ТЬг

Азр

Суз

Суз

ΗΪ3

220

225

230

дад

сад

ГдГ

дсГ

дсс

ддс

Где

асд

ддс

ссс

аад

сас

ГСГ

дас

ъдс

еГд

4299

С1и

С1п

Суз

А1а

А1а

С1у

Суз

ТЬг

61у

Рго

Ьуз

ΗΪ3

Зег

Азр

Суз

Ьеи

235

240

245

дсс

Где

сГс

сас

ГГс

аас

сас

адГ

ддс

аГс

ГдГ

дад

еГд

сас

Где

сса

4347

А1а

Суз

Ьеи

Наз

РЬе

Азп

Βί5

Зег

С1у

11е

Суз

61и

Ьеи

Ηί3

Суз

Рго

250

255

260

дсс

еГд

дГс

сад

Гас

аГс

ааа

дсГ

аас

Гее

ааа

ГГс

аГс

ддГ

аГс

асе

4395

А1а

Ьеи

Уа1

61п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

С1у

Не

ТЬг

2 65

270

275

280

дад

еГд

едд

ГаГ

аса

ГГс

ддс

дсс

аде

ГдГ

дгд

асГ

дсс

Где

ссс

Гас

4443

61и

Ьеи

Агд

Туг

ТЬг

РЬе

С1у

А1а

Зег

Суз

νβΐ

ТЬг

А1а

Суз

Рго

Туг

285

290

295

аас

Гас

егг

ГсГ

асд

дас

дГд

дда

Гее

Где

асе

СГс

дгс

Где

ссс

еГд

44 91

Азп

Туг

Ьеи

Зег

ТЬг

Азр

νβΐ

Н1у

Зег

Суз

ТЫ

Ьеи

νθ1

Суз

Рго

Ьеи

300

305

310

сас

аас

саа

дад

дГд

аса

дса

дад

даГ

дда

аса

сад

едд

ГдГ

дад

аад

4539

Н1з

Азп

51п

61и

Уа1

ТЬг

А1а

С1и

Азр

61у

ТЬг

С1п

Агд

Суз

Б1и

Ьуз

315

320

325

Где

аде

аад

ссс

Где

дсс

еда

дгд

Где

ГаГ

ддс

еГд

ддс

аГд

дад

сас

4587

Сув

Зег

Ьуз

Рго

Суз

А1а

Агд

Уа1

Суз

Туг

С1у

Ьеи

С1у

МеГ

51и

813

330

335

340

ГГд

еда

дад

дГд

адд

дса

дГГ

асе

адГ

дсс

ааГ

аГс

сад

дад

ггг

дсГ

4635

Ьеи

Агд

С1и

Уа1

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

Зег

А1а

Азп

Не

С1п

С1и

РЬе

А1а

345

350

355

360

ддс

Где

аад

аад

аге

ггг

ддд

аде

еГд

дса

ЁГГ

еГд

сед

дад

аде

ГГГ

4 693

С1у

Суз

Ьуз

Ьуз

Не

РЬе

С1у

Зег

Ьеи

А1а

РЬе

Ьеи

Рго

61и

Зег

РЬе

365

37 0

375

даЬ

ддд

дас

сса

дсс

Гее

аас

асг

дсс

сед

сГс

сад

сса

дад

сад

сГс

4731

Авр

С1у

Азр

Рго

А1а

Зег

Азп

ТЫ

А1а

Рго

Ьеи

С1л

Рго

61и

С1п

Ьеи

380

395

390

- 18008827 саа д£д дад асЪ ссд даа дад а£с аса ддЬ 1ас сЬа £ас аСс £са4779

61п Уа1 РЬе 61и ТЬг Ьеи 61и С1и Не ТЬг С1у Туг Ьеи Туг 11еБег

395 400405 дса £дд ссд дас аде с£д ось дас ссс аде дъе хъе сад аас е£д саа4827

А1а Тгр Рго Азр Зег Ьеи Рго Азр Ьеи Зег Уа1 РЬе С1п Азп ЬеиС1п

410 415420 д^а а^с едд дда еда а££ с^д сас ааЬ ддс дсс Ьас Ъсд с^д асе сЬд4875

Уа! 11е Агд 61у Агд Не Ьеи Н1з Азп 61у А1а Туг Зег Ьеи ТЬгЬеи

425 430 435440 саа ддд с^д ддс а£.с аде Ъдд сЪд ддд сЬд сдс Ьса с£д адд даа с£д4923

С1п 61 у Ьеи 61у 11е Бег Тгр Ьеи 61у Ьеи Агд Зег Ьеи Агд С1иЬеи

445 450455 ддс ад'Ь дда с£д дсс с1:с аЬс сас саС аас асе сас сЪс Ьдс Ь£с д£д4971 у Зег С1у Ьеи А1а Ьеи 11е Н1з ΗΪ3 Азп ТЬг НЬз Ьеи Суз РЬеУа1

460 465470 сас асд д£д ссс £дд дас сад сЬс ЪЪЪ едд аас ссд сас саа дс£ сЪд5019

Н1з ТЬг Уа1 Рго Тгр Азр 61 п Ьеи РЬе Агд Азп Рго Н1з С1п А1аЬеи

475 480485 сЬс сас ас£ дсс аас едд сса дад дас дад Сд1с дЬд ддс дад ддс с!;д5067

Ьеи ЙЬз ТЬг А1а Азп Агд Рго 61и Азр 61и Суз Уа! 61 у 61и С1уЬеи

490 495500 дсс £дс сас сад сЬд £дс дсс еда ддд сас £дс Ьдд дд1 сса ддд ссс5115

А1а Суя ΗΪ3 С1п Ьеи Суз А1а Агд 61 у Ηΐδ Суз Тгр 61у Рго <31 уРго

505 510 515520 асе сад £дЬ дЬс аас Ёдс аде сад ЪЬс сЬЪ едд ддс сад дад Ъдс дЬд5163

ТЬг 61п Суз Уа1 Азп Суз Бег С1п РЬе Ьеи Агд С1у 61п 61и СузУа1

525 530535 дад даа Ъдс еда дЬа с£д сад ддд сЬс ссс адд дад Ьа1: д£д аа1: дсс5211

С1и 61и Суз Агд Уа1 Ьеи 61п 61у Ьеи Рго Агд 61и Туг Уа1 АзпА1а

540 545550 адд сас £д£ Ид ссд Ъдс сас сс£ дад ±.дЪ сад ссс сад ааЬ ддс Ъса5259

Агд Н1з Суз Ьеи Рго Суз Ηί$ Рго 61и Суз 61п Рго 61п Азп 61уЗег

555 560565 дЬд асе !дЬ ЬЬЪ дда ссд дад дсС дас сад ЬдС дЬд дсс ЬдЬ дсс сас5307

Уа1 ТЬг Суз РЬе С1у Рго 61и А1а Азр С1п Суз Уа1 А1а Суз А1аН1з

570 575580 аад дас ссЪ ссс £Ьс Ъдс д^д дсс сдс ъдс ссс аде дд£ д-Ьд ааа5355

Туг Ьуз Азр Рго Рго РЬе Суз Уа1 А1а Агд Суз Рго Зег 61у Уа1Ьуз

585 590 595600 ссь дас с£с £сс Ьас аЬд ссс аъс Ъдд аад ЬЬЬ сса да£ дад дад ддс5403

Рго Азр Ьеи Зег Туг Меь Рго 11е Тгр Ьуз РЬе Рго Азр 61и 61и61у

605 610615 дса сад ссЪ ьдс ссс аЬс аас Ъдс асе сас £сс £д£ дЬд дас с1д5451

А1а Суз 61 п Рго Суз Рго Не Азп Суз ТЬг Ηίδ Зег Суз АзрЬеи

620 625630

- 19008827

даЁ Азр

дас Азр

аад Ьуз 635

ддс Ёдс ссс дсс дад сад ада

дсс аде

ССЁ Рго 645

сЪд Ьеи

асд ТЬг

ЁСС Зег

5499

е1у

Суз

Рго А1а

31и 640

51п

Агд

А1а

Зег

ЁЁС

аас

аас

ЁЁС

асе

дЁд

аде

ЁЁС

Ёдд

сЁд

сдс

дЁд

ссс

аад

дЁд

аде

5547

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

νβΐ

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

650

655

660

дсс

аде

сас

сЁд

дад

эёс

дЁс

ЁСЁ

дед

дЁд

дЁЁ

ддс

ЭЁЁ

СЁд

5589

А1а

Зег

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Не

Уа1

Зег

А1а

Уа1

Уа1

С1у

Не

Ьеи

665

610

67 5

ЁадаадсЬЁд дЬассдадсЁ сддаЁссасЁ адЁссадЁдь ддЁддааЁЁс ЁдсадаЁаЬс 5649 садсасадЁд дс 5661 <210> 2 <211> 696 <212> РКТ <213> Аг1д.£д.с1а1 зедиепсе <220>

<223> КесотЫпапЁ ехргеззЬоп рЬазшхд йегЬией £гот р31 <400> 2

МеИ

Ьуз

Ьеи

Суз -15

11е

Ьеи

Ьеи

А1а

Уа1 -10

Уа1

А1а

РЬе

Уа1

С1у -5

Ьеи

Зег

Ьеи

С1у -1

МеЁ 1

Ьуз

ΗΪ3

С1п

Н15 5

С1п

ΗΪ3

С1п

Н1з

С1п 10

ΗΪ3

С1п

ΗΪ3

С1п

А1а 15

Рго

Зег

ТЬг

С1П Уа1 20

Суз

ТЬг

С1у ТЬг

Азр МеЁ 25

Ьуз

Ьеи

Агд

Ьеи 30

Рго

А1а

Зег

Рго

61 и

ТЬг

Н13

Ьеи

Азр

МеЁ

Ьеи

Агд

ΗΪ3

Ьеи

Туг

С1п

35

40

45

С1у

Суз

Й1п

Уа1

Уа1

С1п

С1у

Азп

Ьеи

С1и

Ьеи

ТЬг

Туг

Ьеи

Рго

ты

50

55

60

Азп

А1а

Зег

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

С1п

Азр

Не

С1п

51и

Уа1

С1п

61у

Туг

65

70

75

Уа1

Ьеи

Не

А1а

Н1з

Азп

31п

Уа1

Агд

С1п

νβΐ

Рго

Ьеи

С1п

Агд

Ьеи

80

85

90

Агд

11е

Уа1

Агд

С1у

ТЬг

С1п

Ьеи

РЬе

С1и

Азр

Азп

Туг

А1а

Ьеи

А1а

95

100

105

110

-20008827

УаЬ

Ьеи Азр Азп С1у Азр 115

Рго

Ьеи Азп

Азп 120

ТЬг ТЬг

Рго

Уа1

ТЬг 125

Е1у

А1а

Зег

Рго

С1у

С1у

Ьеи

Агд

61и

Ьеи

С1П

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

С1и

130

135

140

Не

Ьеи

Ьуз

51у

С1у

Уа1

Ьеи

11е

С1п

Агд

Азп

Рго

С1п

Ьеи

Суз

Туг

145

150

155

С1п

Азр

ТЬг

Пе

Ьеи

Тгр

ьуз

Азр

Не

РЬе

ΗΪ5

Ьуз

Азп

Азп

С1п

Ьеи

160

165

170

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

11е

Азр

ТЬг

Азп

Агд

Зег

Агд

А1а

Суз

Н13

Рго

Суз

175

180

185

190

Зег

Рго

Меб

Суз

Ьуз

С1у

Зег

Агд

Суз

Тгр

С1у

С1и

5ег

Зег

С1и

Азр

195

200

205

Суз

С1п

Зег

Ьеи

ТЬг

Агд

ТЬг

Уа1

Суз

А1а

С1у

С1у

Суз

А1а

Агд

Суз

210

215

220

Ьуз

Б1 у

Рго

Ьеи

Рго

ТЬг

Азр

Суз

Суз

ΗΪ8

61и

61п

Суз

А1а

А1а

С1у

225

230

235

Суз

ТЬг

С1у

Рго

Ьуз

Низ

Зег

Азр

Суз

Ьеи

А1а

Суз

Ьеи

Н1з

РЬе

Азп

24 0

245

250

ΗΪΞ

Зе::

С1у

11е

Суз

С1и

Ьеи

Н13

Суз

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

С1п

Туг

Не

255

260

265

270

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

С1у

Пе

ТЬг

С1и

Ьеи

Агд

Туг

ТЫ

РЬе

275

280

285

С1у

А1а

Зег

Суз

νβι

ТЬг

А1а

Суз

Рго

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Зег

ТЬг

Азр

290

2 95

300

Уа1

С1у

Зег

Суз

ТЬг

Ьеи

УаЬ

Суз

Рго

Ьеи

ΗΪ5

Азп

С1п

С1и

Уа1

ТЬг

305

310

315

А1а

(Пи

Азр

(Пу

ТЬг

51п

Агд

Суз

С1и

Ьуз

Суз

5ег

Ьуз

Рго

Суз

А1а

320

325

330

Агд

УаЬ

Суз

Туг

С1у

Ьеи

С1у

Меб

С1и

Низ

Ьеи

Агд

С1и

Уа1

Агд

А1а

335

340

345

350

-21 008827

УаЬ

ТЫ

Зег АЬа

Азп 355

ЬЬе СЬп СЬи

РЬе

АЬа 360

СЬу

Суз

Ьуз

Ьуз

ЬЬе 365

РЬе

СЬу

Зе г

Ьеи

АЬа

РЬе

Ьеи

Рго

СЬи

Зег

РЬе

Азр

СЬу

Азр

Рго

АЬа

Зег

370

375

380

Азп

ТЬг

АЬа

Рго

Ьеи

СЬп

Рго

СЬи

СЬп

Ьеи

СЬп

УаЬ

РЬе

СЬи

ТЬг

Ьеи

385

390

395

СЬи

СЬи

ЬЬе

ТЬг

СЬу

Туг

Ьеи

Туг

ЬЬе

Зег

АЬа

Тгр

Рго

Азр

Зег

Ьеи

400

4 05

4Ь0

Рго

Азр

Ьеи

Зег

УаЬ

РЬе

СЬп

Азп

Ьеи

СЬп

УаЬ

ЬЬе

Агд

СЬу

Агд

ЬЬе

415

420

425

430

Ьеи

НЬз

Азп

СЬу

АЬа

Туг

Зег

Ьеи

ТЫ

Ьеи

СЬп

СЬу

Ьеи

СЬу

ЬЬе

Зег

435

440

445

Тгр

Ьеи

СЬу

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

Агд

СЬи

Ьеи

СЬу

Зег

СЬу

Ьеи

АЬа

Ьеи

450

455

4 60

ЬЬе

НЬз

НЬз

Азп

ТЬг

НЬз

Ьеи

Суз

РЬе

Уа1

НЬз

ТЬг

УаЬ

Рго

Тгр

Азр

4 65

470

475

еьп

Ьеи

РЬе

Агд

Азп

Рго

НЬз

СЬп

АЬа

Ьеи

Ьеи

НЬз

ТЬг

АЬа

Азп

Агд

4 80

485

4 90

Рго

СЬи

Азр

СЬи

Суз

УаЬ

СЬу

СЬи

СЬу

Ьеи

АЬа

Суз

НЬз

СЬп

Ьеи

Суз

495

500

505

5Ь0

АЬа

Агд

СЬу

НЬз

Суз

Тгр

СЬу

Рго

СЬу

Рго

ТЬг

СЬп

Суз

ЧаЬ

Азп

Суз

5Ь5

52 0

525

Зег

СЬп

РЬе

Ьеи

Агд

СЬу

СЬп

СЬи

Суз

УаЬ

СЬи

СЬи

Суз

Агд

УаЬ

Ьеи

530

535

540

СЬп

СЬу

Ьеи

Рго

Агд

СЬи

Туг

УаЬ

Азп

АЬа

Агд

НЬз

Суз

Ьеи

Рго

Суз

545

550

555

НЬз

Рго

СЬи

Суз

СЬп

Рго

СЬп

Азп

СЬу

5ег

УаЬ

ТЬг

Суз

РЬе

СЬу

Рго

560

565

570

СЬи

А1а

Азр

СЬп

Суз

УаЬ

АЬа

Суз

АЬа

НЬз

Туг

Ьуз

Азр

Рго

Рго

РЬе

575

580

585

590

-22008827

Суз

УаЬ

АЬа Агд

Суз 5 95

Рго

Зег СЬу

УаЬ

Ьуз 600

Рго Азр

Ьеи

Зег Туг 605

Меб

Рго

Не

Тгр

Ьуз

РЬе

Рго

Азр

С1и

С1и

СЬу

А1а

Суз

СЬп

Рго

Суз

Рго

610

615

620

Не

Ав η

Суз

ТЬг

Н1з

Зег

Суз

УаЬ

Азр

Ьеи

Азр

Азр

Ьуз

СЬу

Суз

Рго

625

630

635

АЬа

СЬи

СЬп

Агд

АЬа

Зег

Рго

Ьеи

ТЬг

Зег

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

64 0

645

650

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

УаЬ

Рго

Ьуз

УаЬ

Зег

АЬа

Зег

Н13

Ьеи

СЬи

Пе

655

660

665

670

УаЬ

Зет

АЬа

Уа1

УаЬ

СЬу

Не

Ьеи

5

Claims (48)

1. Способ очистки белка, производного семейства ЕСЕК, причем указанный белок создают рекомбинантным способом в культуре клеток насекомых, и указанный белок представляет собой белок, который является подходящим для очистки посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, при этом способ предусматривает получение из указанной культуры клеток насекомых, по существу, бесклеточного образца, содержащего указанный белок, производный семейства ЕСЕК, и последующее обогащение указанного белка, производного семейства ЕСЕК, при помощи последовательных этапов диафильтрации и замены культуральной среды буфером, аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (1МАС), эксклюзионной хроматографии (8ЕС), анионообменной хроматографии (ΑΙΕ).

2. Способ по π. 1, в котором белок, производный семейства ЕСЕК, включает гетерологичную аминокислотную последовательность, которая облегчает очистку при помощи 1МАС.

3. Способ по п.2, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность имеет высокое содержание гистидиновых остатков.

4. Способ по п.З, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность содержит остатки 1-14 8Εζ) ГО N0:2.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белок, производный семейства ЕСЕК, содержит существенную часть аминокислотной последовательности человеческого ЕСЕК или человеческого НЕК-2.

6. Способ по и.5, в котором существенную часть в основном выделяют из внеклеточной части ЕСЕК или НЕК-2.

7. Способ по и. 5 или 6, в котором белок, производный семейства ЕСЕК, представляет собой вариант человеческого НЕК-2.

8. Способ по и.7, в котором вариант человеческого НЕК-2 включает по меньшей мере один чужеродный эпитоп Т-клетки-хелпера.

9. Способ по п.8, в котором вариант человеческого НЕК-2 включает эпитопы столбнячного анатоксина Р2 (остатки 269-282 8Εζ) ГО N0:2) и РЗО (остатки 649-669 8Εζ) ГО N0:2).

10. Способ по п.9, в котором вариант человеческого НЕК-2 включает аминокислотные остатки 17677 8Εζ) ГО N0:2.

11. Способ по и. 10, в котором аминокислотная последовательность варианта человеческого НЕК-2 состоит из остатков 1-677 8Εζ) ГО N0:2.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап диафильтрации/замены буфера выполняют при температуре от примерно 2 до примерно 25°С, предпочтительно при температуре от примерно 3 до примерно 8°С, необязательно с добавлением детергента, такого как Твин, если температура превышает 10°С.

13. Способ по и.12, в котором диафильтрацию выполняют в два этапа: сначала для увеличения концентрации макромолекулярных соединений в образце культуральной среды, и затем замены культуральной среды буфером.

14. Способ по и. 13, в котором макромолекулярные соединения концентрируют в пределах от примерно 2 до примерно 25 раз.

-23 008827

15. Способ по п.14, в котором макромолекулярные соединения концентрируют примерно в 3-5 раз.

16. Способ по любому из пп.12-15, в котором замену буфера выполняют в один или два последовательных этапа, из которых первый происходит при рН по меньшей мере 6,5 и не больше чем 7,2, и второй необязательный этап происходит при рН по меньшей мере 7,0 и не больше чем 8,0.

17. Способ по любому из пп.12-16, в котором для замены буфера используется фосфатный буфер.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором имидазол, гистидин или буфер с высокой концентрацией соли добавляют в образец, подвергнутый диафильтрации и замене буфера, или в котором образец с замененным буфером по существу не изменяют.

19. Способ по п.18, в котором имидазол, если добавляют, то добавляют для достижения концентрации в пределах между примерно 0,05 и примерно 20 мМ.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором детергент, выбранный из полиоксиэтиленового эфира сорбита и жирной кислоты, такого как Твин-20, Твин-40, Твин-60, Твин-80 и Твин-85, алкиларильного полиэфирного спирта, такого как Тритон Х-100, неионного детергента и детергента на основе углеводородов, такого как октилгликозид, добавляют в образец, подвергнутый диафильтрации и замене буфера, для достижения концентрации в пределах между примерно 0,05 и 10% (об./об.), такой как примерно 0,1%.

21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап 1МАС включает внесение в хроматографическую среду ионов двухвалентного металла перед нанесением образца с замененным буфером.

22. Способ по п.21, в котором ион двухвалентного металла выбирают из группы, состоящей из Νί²⁺, Си²⁺, Ζη²⁺, Со²⁺ и Ее²⁺, предпочтительно Ζη²⁺.

23. Способ по п.21 или 22, в котором элюцию хроматографической среды проводят с применением имидазола, гистидина, буфера с высокой концентрацией соли или изменением рН хроматографической среды.

24. Способ по п.23, в котором элюцию хроматографической среды выполняют с применением имидазола в один этап с концентрацией в пределах между примерно 50 мМ и примерно 500 мМ, предпочтительно с концентрацией 200 мМ, или в котором элюцию выполняют с применением гистидина в один этап с концентрацией в пределах между 20 и 400 мМ, предпочтительно примерно 100 мМ.

25. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап δЕС включает элюцию фосфатным буфером, или Трис буфером, или биологическим буфером, таким как НЕРЕδ.

26. Способ по п.25, в котором поддерживают рН примерно 7-8, предпочтительно примерно 7,5.

27. Способ по п.25 или 26, в котором средний размер пор матрицы δЕС разделяет глобулярный белок между 10 и 600 кДа.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором образцы, содержащие белок, производный семейства ЕСЕК, полученные из δЕС, при необходимости, разбавляют до этапа А1Е для доведения концентрации фосфатов до менее чем 15 мМ, такой как в пределах между 10 и 12,5 мМ.

29. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап А1Е включает загрузку образца, содержащего белок, производный семейства ЕСЕК, полученного после δЕС, на ионообменную матрицу с сильным анионом или со слабым анионом, или и на ту, и на другую.

30. Способ по п.29, в котором элюцию выполняют буферизованным раствором №1С1 при рН между 7 и 8.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап инактивации вирусов вводят между этапами диафильтрации/замены буфера и 1МАС.

32. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором за этапом А1Е следует этап фильтрования вирусов.

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап А1Е, использующий ионообменную колонку со слабым анионом, вводят между этапами 1МАС и δЕС.

34. Иммуногенный вариант белка НЕК-2, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в δερ ΙΌ NΟ:2, остатки 17-677.

35. Иммуногенный вариант белка НЕК-2 по п.34, который состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в δερ ΙΌ NΟ:2, остатки 1-677.

36. Фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует иммуногенный вариант белка НЕК-2 по п.34 или 35.

37. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.36, который представляет собой фрагмент ДНК.

38. Вектор, несущий фрагмент нуклеиновой кислоты по п.36 или 37.

39. Вектор по п.38, который способен к автономной репликации.

40. Вектор по п.38 или 39, выбранный из группы, состоящей из плазмиды, фага, космиды, минихромосомы и вируса.

41. Вектор по любому из пп.38-40, который представляет собой вектор экспрессии.

42. Вектор по п.41, содержащий в направлении 5'^3' и в рабочем сцеплении промотор, запускающий экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты по п.36 или 37, необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок-лидер, обеспечивающий возможность секреции или встраи

- 24 008827 вания в мембрану фрагмента полипептида, фрагмент нуклеиновой кислоты по п.36 или 37, и, необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор.

43. Трансформированная клетка хозяина, несущая вектор по любому из пп.38-42.

44. Стабильная клеточная линия, которая несет вектор по и. 41 или 42 и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты по п.36 или 37, и которая, необязательно, секретирует или несет иммуногенный вариант белка НЕЕ-2 по и. 34 или 35 на своей поверхности.

45. Иммуногенная композиция для иммунизации человека против белка НЕЕ-2. содержащая иммуногенный вариант белка НЕК-2 по и.34 или 35 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем и, необязательно, адъювантом.

46. Иммуногенная композиция для иммунизации человека против белка НЕЕ-2. содержащая вектор по п.41 или 42 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем и, необязательно, адъювантом.

47. Способ иммунизации человека против аутогенного НЕК-2, предусматривающий введение иммуногенно эффективного количества иммуногенного варианта белка НЕК-2 по и.34 или 35, или иммуногенной композиции по и.45, или вектора по п.41 или 42, или иммуногенной композиции по и.46 человеку.

48. Способ по и.47, в котором иммунизацию против аутогенного белка НЕК-2 применяют для лечения или облегчения рака.