KR20060033870A - Ｈｅｒ-2 변이체의 정제 - Google Patents

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마리 에스클링
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파멕사 에이/에스
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Abstract

본 발명은 곤충 세포 배양체로부터 수득된 EGFR 단백질군의 새로운 정제 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 배양 배지의 투석여과 및 완충액 교환 공정, b) 고정형 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC) 공정, c) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 공정, 및 d) 음이온 교환 크로마토그래피 공정 (AIE)의 후속 공정을 포함한다. 이 방법은 또한 이러한 정제 방법이 적용되어 만들어진 HER-2 단백질의 면역원성 변이체 및 이러한 변이체의 제조 수단도 제공한다.
HER-2 변이체, 정제, 곤충 세포

Description

ＨＥＲ-2 변이체의 정제{PURIFICATION OF HER-2 VARIANTS}
본 발명은 단백질의 친화 정제 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 개선된 금속 친화성 단백질 정제 방법, 특히 곤충 세포에서 재조합적으로 생산된 히스티딘이 풍부한 단백질 또는 히스티딘 태그형 단백질의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 EGFR (endothelial growth factor receptor: 상피세포 성장 인자 수용체) 단백질군, 특히, 암관련 항원인 HER-2로부터 유래된 히스티딘 태그형 단백질 변이체에 적합한 특이적인 정제 방법에 관한 것이기도 하다.
또한, 본 발명은 인간의 천연 HER-2 분자를 표적으로 하는 인간에 있어서 면역 반응을 유발할 수 있는 인간 HER-2의 면역원성 변이체에 관한 것이기도 하다.
암관련 막 단백질인 HER-2는 EGFR 단백질군의 일종이다. 이 단백질은 특정암, 특히 유방암 및 직장결장암의 능동 특이 면역요법에서 면역원으로서 유망한 것으로 나타났다.
본 출원인은 WO00/20027의 HER-2 항원에 대한 능동 백신접종에 관하여 특허출원한 바 있다 (전술한 특허출원의 내용은 전부 본 발명에 참고로 통합되었다). 이 분야에서의 계속된 연구로 인해 이러한 백신에 대한 바람직한 HER-2 변이체가 동정되었지만 단백질 화학에서의 일반적인 문제점은 고순도의 재조합 단백질을 만 족할만한 수율로 얻는 개선된 방법을 고안하는데 있다.
고정형 금속 이온 친화 크로마토그래피 (IMAC)는 처음 금속 킬레이트 크로마토그래피라는 명칭으로 Porath (Porath, J., J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage [1975] Nature 258:598-599.)에 의해 도입되었고 이전에도 몇몇 문헌을 통해 검토된 바 있다 (Porath, J. [1992] Protein Purification and Ex-pression 3:263-281; 및 상기 문헌에 언급된 논문들). IMAC 정제 방법은 Cu2+ 및 Ni2+와 같은 소프트 그목 이온이 로딩된 킬레이팅 매트릭스의 사용에 기초한다. 단백질 표면 상의 전자 공여기, 특히 히스티딘의 이미다졸 측쇄는 로딩된 금속의 배위되지 않은 자리 (non-coordinated sites)와 결합할 수 있다. 전자 공여기와 금속 간의 상호반응은 이미다졸에 의한 치환 또는 pH 저하에 의해 가역화될 수 있다. 따라서, 히스티딘과 같은 전자 공여기를 갖는 단백질은 가역적인 금속 착물/단백질 상호반응에 의해 정제될 수 있다.
1991년, Ford 등 (Ford, C., I. Suominen, C. Glatz [1991] Protein Expression and Purification 2:95-107)은 히스티딘 잔기를 갖는 테일을 갖는 재조합 단백질 (폴리히스티딘 재조합 단백질, "His-태그형 단백질")에 적용된 바와 같이 IMAC 기술 (Ni-NTA 리간드)를 이용한 단백질 정제 방법을 설명하였다. 이 방법은 두개 이상의 히스티딘 잔기가 함께 매우 강한 금속 이온 착물을 형성한다는 사실을 이용하고 있다.
이 기술에는 다양한 변형법이 있는데, 예컨대 his 태그가 나중에 효소적으로 제거될 수 있도록 특이적인 프로테아제에 대한 인식 부위를 포함시키는 등, 히스티딘 잔기를 여러가지 조합으로 적절한 재조합 단백질에 "태그"로서 부착시키는 등의 변형법이 그 예이다.
곤충 세포에서 단백질을 발현시키기 위해서는 여러가지 특화된 배양 배지가 필요하며, 세균, 곰팡이 및 포유동물 세포에서는 발견되지 않는 곤충 세포들로부터 유래된 성분에 의한 재조합 단백질의 오염을 수반한다. 따라서, 세균, 곰팡이 또는 포유동물 세포에서 생산된 재조합 단백질을 대상으로 고안된 정제 방식은, 곤충 세포에서 생산된 단백질을 정제하는 경우에는 반드시 최적의 선택이라고는 할 수 없게 된다.
따라서 곤충 세포에서의 재조합 생산으로부터 유래된 제약 등급의 단백질을 얻기 위해서는, 개선된 단백질 정제 방법에 대한 필요성이 꾸준이 제기되고 있었다.
발명의 목적
본 발명의 한가지 목적은 곤충 세포에서 발현된 재조합 EGFR 단백질군의 개선된 정제 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 특이적인 능동 면역요법에 의해 예컨대 암을 치료하는데 유용한 HER-2 단백질의 면역원성 변이체를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명자들은 EGFR 단백질군을 약학적 용도, 특히 백신 제제로서 적합한 정도의 순도까지 정제하는 새로운 방법을 창안하였다.
따라서, 한가지 측면에서, 본 발명은 곤충 세포 배양체에서 재조합적으로 생산된 것으로서, 고정형 금속 친화 크로마토그래피 수단에 의해 정제하는데 적합한 EGFR군 유래형 단백질을 정제하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 곤충 세포 배양체로부터, 상기 EGFR군 유래형 단백질을 함유하는, 실질적으로 세포를 함유하지 않는 시료를 수득한 다음, 후속적으로 아래 공정에 의해, 상기 EGFR군 유래형 단백질을 부화(enriching) 시키는 공정을 포함하여 이루어진다:
- 배양 배지를 투석여과하고 완충액 교환시키는 공정,
- 고정형 금속 친화 크로마토그래피 (IMAC) 공정,
- 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 공정, 및
- 음이온 교환 크로마토그래피 (AIE) 공정.
본 발명의 또 다른 측면에 따라 SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열 잔기 17-677을 포함하는 HER-2 단백질의 면역원성 변이체가 제공된다.
발명의 상세한 설명
다음에 본 발명에서 사용된 몇가지 용어와 표현에 관하여 정의한다.
"EGFR군 유래형 단백질"이라 함은 인간의 EGFR (또는 ErbB-1); 인간의 HER-2/new (ErbB-2); HER-3 (ErbB-3); 또는 HER-4 (ErbB-4)와 동종 또는 동일한 단백질을 가리킨다.
상세한 설명과 특허청구범위에서 "자가형" EGFR 단백질군이라 함은 그 자신의 EGFR 단백질군에 대해 백신 접종을 받게 될 동물의 EGFR 폴리펩타이드군을 가리키는 것이다. 즉, 이 용어는 백신 접종될 동물과 관계될 때만 타당하다.
"T 임파구" 및 "T 세포"는 체액성 면역 반응에서 헬퍼 활성과 같은 이펙터 기능 뿐만 아니라 여러가지 세포 매개형 면역 반응에 책임이 있는 흉선 기원의 임파구와 호환적으로 사용될 것이다. 마찬가지로, "B 임파구" 및 "B 세포"는 항체를 생산하는 임파구와 호환적으로 사용될 수 있다.
"항원 제시 세포" (APC)는 T 세포에 에피토프를 제시하는 세포이다. 전형적인 항원 제시 세포로는 대식 세포, 수지 세포 및 기타 식작용을 하는 세포 및 포음세포 (pinocytizing cells)를 들 수 있다. B 세포 역시 MCH 클래스 II 분자에 결합된 TH 에피토프를 TH 세포에 제시함으로써 APC로서 기능하지만, 본 발명의 상세한 설명과 청구범위에서 APC라는 용어는 일반적으로 전술한 식세포 및 포음 세포를 의미하는 것이다.
"헬퍼 T 임파구" 또는 "TH 세포"는 CD4 항원 제시 세포 상에서 MHC 클래스 II 분자에 결합된 TH 에피토프의 인식을 통하여 B 세포 및 세포독성 T 세포에 보조를 제공하는 CD4 양성 T 세포를 가리킨다.
"세포독성 T 임파구"(CTL)이라 함은 활성화되기 위해 TH 세포의 도움을 필요로 하는 CD8 양성 T 세포를 가리키는 것이다.
본 발명에서 "특이적" 면역 반응이라 함은 주로 어떤 분자 또는 준동일 (quasi-identical) 분자 그룹, 또는 상기 분자 또는 상기 준동일 분자 그룹의 CTL 에피토프를 제시하는 세포에 지향된 폴리클로날 면역 반응을 가리킨다.
본 발명의 문맥상 "폴리펩타이드"라는 용어는 2 내지 10개의 아미노산 잔기의 짧은 펩타이드, 11 내지 100개 아미노산 잔기의 올리고펩타이드와, 아미노산 잔기가 100개보다 많은 폴리펩타이드를 모두 포괄한다. 또한, 이 용어는 단백질, 즉, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 갖는 기능적 바이오분자도 포함하도록 의도된다; 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함할 경우, 이들은 복합체를 형성하거나, 공유적으로 링크되거나 또는 비공유적으로 링크될 수 있다. 단백질 중의 폴리펩타이드(들)은 글리코실화 및/또는 지질화될 수 있고/ 또는 배합군(prosthetic groups)을 함유할 수도 있다.
"서브서열"이란 자연발생적인 아미노산 서열 또는 핵산 서열로부터 직접 유래하는, 각각 적어도 3개의 아미노산 또는 적어도 3개의 뉴클레오타이드의 연속 스트렛치를 의미한다.
본 발명에서 "자가 EGFR 단백질군의 하향 조절"이라는 용어는 살아있는 생명체에서 상응하는 EGFR 단백질군의 양 및/또는 활성을 감소시키는 것을 의미한다. 하향 조절은 스캐빈저 세포 (대식 세포 및 기타 식세포 등)에 의한 CEA의 제거를 포함하는 여러가지 메카니즘에 의해 달성되며, 보다 중요한 것은, 항원을 지니거나 산생하는 세포들이 동물에 있어서 CTLs에 의해 사멸된다는 것이다.
"면역원"이라 함은 특정 동물에 있어서 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 가리키는 것이다. 따라서 자가 EGFR 단백질군은 자가 숙주에서는 면역원이 아님이 이해될 것이다 - 자가 단백질에 대해 면역 반응을 유발하기 위해서는 강력한 애쥬번트를 사용하고/사용하거나 자가 단백질과 함께 T 헬퍼 에피토프를 제시하여야 하며 그 경우 "면역원"은 자가내성을 파괴할 수 있는 조성의 물질이다.
"면역학적 유효량"이라 함은 면역학 기술분야에서 일반적으로 통용되는 의미, 즉, 면역원과 면역학적 특성을 공유하는 분자에 유의적으로 연관된 면역 반응을 유발할 수 있는 면역원의 양을 가리킨다.
"약학적으로 허용가능한"이라는 의미는 기술 분야에서 통용되는 의미, 즉, 문제의 질병을 치료할 때 사람에 있어서 의약의 일부로서 허용될 수 있는 물질로서 사용된다는 것으로서 따라서 치료된 대상자의 상태를 개선시키기보다는 악화시킬 고도로 독성인 물질의 사용은 효과적으로 피하는 것이다.
"외래 T 세포 에피토프"란 어떤 동물종에서 T 세포를 자극하고 MHC 분자에 결합할 수 있는 펩타이드이다. 바람직한 외래 T 세포 에피토프는 "무차별(promiscuous)" 에피토프, 즉, 어떤 동물종 또는 동물 집단 중의 특정 부류의 MHC 분자의 실질적인 분획에 결합하는 에피토프이다. 기술 분야에서 이 용어와 흔히 호환적으로 사용되는 용어는 "범 T 세포 에피토프 (universal T-cell epitopes)"이다. 이러한 무차별 T 세포 에피토프는 단지 매우 제한적인 수만 알려져 있으며, 이하에서 이들에 대해 자세히 설명한다. 본 발명에서 사용되는 면역원이 동물 집단의 가능한 한 커다란 분획에서 효과적이기 위해서는, 1) 동일한 유사물질 (analogue) 내로 여러개의 외래 T 세포 에피토프를 삽입하거나 2)각각에 서로 다른 무차별 에피토프가 삽입되어 있는 여러개의 유사물질을 제조할 필요가 있을 수 있다. 또한 외래 T 세포 에피토프의 개념은 은닉성(cryptic) T 세포 에피토프, 즉, 자가 단백질로부터 유래하며 문제의 자가 단백질의 일부로서가 아니라, 분리 형태로 존재할 경우 면역원성 거동만을 발휘하는 에피토프의 사용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"외래 T 헬퍼 임파구 에피토프" (외래 TH 에피토프)는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 외래 T 세포 에피토프이며, MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에 제시될 수 있다. 따라서 "외래성"이라는 특성은 두가지 측면을 가지고 있다는 점을 덧붙이는 것이 중요하다, 즉: 외래 TH 에피토프는 1)문제의 동물에 의해 MHC 클래스 II 컨텍스트에 제시되고 2) 그 외래 에피토프는 면역화 표적 항원과 동일한 폴리펩타이드로부터 유래하는 것이 아니다 - 따라서 그 에피토프 역시 표적 항원에 대해 외래인 것이다.
"CTL 에피토프"는 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있는 펩타이드이다.
"애쥬번트"라는 용어는 백신 기술 분야에서 널리 사용되는 의미, 즉, 1)그 자체로는 백신의 면역원에 대한 특이적인 면역 반응을 이끌어내지 못하지만, 2)그럼에도 불구하고 그 면역원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있는 물질 또는 물질들의 조성물을 의미한다. 또는, 다른 말로 하면, 애쥬번트 단독에 의한 예방접종은 그 면역원에 대한 면역 반응을 제공하지 못하고, 면역원에 의한 예방접종은 면역원에 대한 면역 반응을 일으킬수도, 일으키지 못할 수도 있지만, 면역원과 애쥬번트를 병용한 백신 접종은 면역원 단독에 의해 유발되는 것보다 더 강하게 면역원에 대한 면역 반응을 유발한다.
"투석여과 (diafiltration)"란 한외여과막을 이용하여 거대 분자 용액 중에서 상이한 크기의 바이오분자를 분획화하거나, 염이나 용매를 제거하고, 완충액을 교환하는 기술이다. 한외여과막에 의해 체류된 거대 분자는 농축되는 한편 용매와 저분자량종들은 제거된다. 그러나, 거대 분자 시료의 단순 농축으로는 소형종들을 완전히 제거하지는 못한다. 따라서, 소형종들은 복수회의 세척 볼륨을 이용해서 시료로부터 "세척"해 내야만 한다 (투석여과). 투석여과 공정 후, 추가의 분석이나 정제를 위해 시료를 농축할 수 있다. 이것은 분리 공정 중에 시료가 희석될 수 있음으로 해서, 부가적인 농축 단계를 요하는 젤 여과나 투석에 비해 유리한 점이다. 투석여과에서는 2단계 공정으로 일어날 수 있는 그러한 손실이나 오염이 없다.
"고정형 금속 친화 크로마토그래피 (IMAC: immobilised metal affinity chromatography)"라 함은 특정의 이가 금속 이온에 대한 단백질의 친화도의 결과로서 그 단백질을 정제하는 크로마토그래피 기술이다. 이에 관해서는 배경기술란을 참조할 수 있다.
"크기 배제 크로마토그래피 (SEC: size exclusion chromatogrphy)"라 함은 단백질과 기타 거대 분자들이 그의 물리적인 크기에 따라 분획화되는 크로마토그래피 기술이다. 소형 분자들은 매트릭스의 포어 내에 남아 있고 따라서 천천히 용출되는 반면 대형 분자들은 배제됨으로 해서 매트릭스로부터 조속히 용출된다.
"음이온 교환 크로마토그래피 (AIE: anion exchange chromatography)"라 함은 총음전하를 띤 분자들은 컬럼 매트릭스에 유지되고 이어서 용출 완충액으로부터 음이온과 대체되거나 또는 단백질의 총전하와 교환에 의해 용출되는 기술이다.
바람직한 구체예에 관한 설명
본 발명은 곤충 세포에서 재조합적으로 생산된 EGFR 유래 단백질 군의 증식에 특히 적합한 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인간의 암관련 항원인 HER-2의 면역원성 변이체를 제조하려는 노력의 일환으로 창안된 것이다 - 이 변이체들은 글락소스미쓰클라인사 (GlaxoSmithKline)가 소유하고 인비트로겐사 (Invitrogen)가 시판하는 발현계인 DES
Figure 112005076406495-PCT00001
발현계에서 생산된다. 이 발현계는 S2 드로조필라 세포와 특화시킨 벡터를 이용한다. 그러나, 재조합 생산을 위해 숙주 세포로서 S2 세포를 이용하는 것은 문제의 HER-2 변이체에 대응하는 일단의 문제점들을 제기하였고, 이러한 문제점들은 본 발명의 방법을 이용하여 해결되었다 (즉, S2 세포로부터 파생된 공유주 단백질 (co-migrating proteins)과 관련한 문제점).
본 발명의 실시에에서 사용되는 특정 단백질은 사람에 있어서 면역원성인 인간의 HER-2의 변이체로서 - 이 변이체는 SEQ ID NO: 2, 잔기 17-677에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 이 아미노산 서열은 그 자체로는 IMAC에 적합하지 않기 때문에, 아미노디펩티다제 (디펩티딜 펩티다제 I, DPPI, Pedersen J 외, 1999, Protein Expression and Purification 15, 389-400 참조)에 의해 절단될 수 있는 N 말단 히스티딘 태그 (SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 1-14)를 갖는다. 전술한 디아민펩티다제에 대한 종결 소열은 SEQ ID NO: 2의 잔기 15와 16으로 구성되어 있다.
따라서, 일반적으로 본 발명의 정제 방법은 특히 IMAC에 의한 정제를 용이화해주는 이종 아미노산 서열을 포함하는 EGFR 유래형 단백질 군에 특히 적합하다. 이 서열은 EGFR군 유래형 단백질에는 자연적인 것일 수 있지만 그보다 더 이종적인 아미노산 서열이기도 하다 (즉 EGFR 유래형 단백질 군과는 천연적으로 관계가 없다). 이러한 목적에 바람직한 아미노산 서열은 히스티딘 잔기가 풍부하다 (예컨대, His 6 태그 및 히스티딘 잔기를 여러개 연속하여 갖는 다른 아미노산 서열들). IMAC 정제를 용이화시켜주는 가장 바람직한 이종 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 잔기 1-14를 갖는 서열이다.
본 발명의 방법으로 처리될 EGFR 유래형 단백질은 사람의 EGFRE 또는 사람의 HER-2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 것이 바람직하고, 이 실질적인 부분은 주로 사람의 EGFR 또는 사람의 HER-2의 세포외 부분으로부터 유래된 것이 특히 바람직하다.
가장 바람직하게는 사람의 HER-2의 변이체인 것이 좋고, 가장 바람직한 구체예에서, 사람의 HER-2의 변이체는 적어도 하나의 외래 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 사람의 HER-2 항원의 특정 변이체의 재조합적 생산과 관련한 작업과 관련하여 창안되었다. 이러한 변이체들은 사람의 HER-2 세포외 도메인의 아미노산 서열 내로 도입되는 무차별 외래 T 헬퍼 에피토프를 포함한다는 특징이 있다. 바람직한 사람의 HER-2의 변이체로는 파상풍 독소 에피토프 P2 (SEQ ID NO: 2의 잔기 269-282) 및 P30 (SEQ ID NO: 2의 잔기 649-669)를 들 수 있고 가장 바람직한 변이체는 SEQ ID NO: 2의 잔기 1-677로 구성된 아미노산 서열이다.
투석여과/완충액 교환
투석여과/완충액 교환 단계는 약 2 내지 약 25℃의 온도에서 수행된다. 그러나, 바람직하게는 상기 범위보다 낮은 온도, 예컨대, 20 ℃ 미만, 예컨대 15 ℃ 미만, 또는 10 ℃ 미만에서 수행하는 것이 좋다. 가장 바람직한 온도는 2 내지 9 ℃, 예컨대 약 3 ℃ 내지 약 9 ℃, 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 8 ℃, 특히 바람직하게는 약 4 내지 약 6 ℃의 온도 범위가 좋다. 이 보다 높은 온도 (예컨대 10 ℃ 초과)에서는 단백질이 응집하는 경향이 있고, 이는, Tween 타입 세제와 같은 세제를 첨가함으로써 가라앉을 수 있다.
일반적으로, 투석여과는 배양 배지 시료 중의 거대 분자 화합물들을 초기 농축하기 위해 2회 정도 수행되며 그 후 배양 배지를 완충액으로 교환해준다. 이러한 공정은 당해 기술 분야의 표준 공정에 따라 수행되며, 실시예를 참고할 수 있다. 농축 단계는 거대 분자 화합물을 2 내지 25배, 예컨대 2 내지 20배, 3 내지 15배, 3 내지 10배 농축하도록 하는 것이 좋다. 바람직한 거대 분자의 농축은 4 내지 8배 범위이고, 가장 바람직한 농축 배수는 약 5배 또는 배지 중 총 단백질 농도가 3 mg/ml 이하, 또는 바람직하게는 약 2 mg/ml 이하가 되도록 하는 것이다.
완충액 교환은 일반적으로 연속적인 2공정으로 수행되며, 그 첫번째 공정은 pH 6.5 이상 pH 7.2 이하, 그 두번째 공정은 pH 7.0 이상 pH 8.0 이하에서 수행된다. 그러나, 두 공정 모두 동일한 중복 pH 범위에서 동일한 pH 에서 수행할 수 있다. 일반적으로 완충액 교환은 인산염 완충액을 이용하여 수행한다.
완충액 교환 종결 후, IMAC 공정에서 크로마토그래피 매트릭스에 대한 결합을 놓고 경쟁할 제제를 시료에 첨가함으로써 다음 공정의 스트린젠시를 증가시키는 것이 바람직하며, 이에 따라, 오염 성분에 의해 무의미한 결합량을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 이미다졸, 히스티딘 또는 고염분 완충액을 투석여과된 완충액에 첨가함으로써 스트린젠시를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 이미다졸을 사용할 경우, 약 0.05 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 mM, 예컨대 약 1 내지 약 10 mM의 범위의 농도에 도달하도록 첨가하는 것이 좋다. 특히 바람직한 이미다졸 농도 범위는 약 2 내지 약 9 mM, 예컨대 약 3 내지 약 8 mM이다. 가장 바람직한 이미다졸의 농도 범위는 약 4 내지 약 6 mM, 예컨대 약 5 mM 이다.
고염분 완충액 (종종 NaCl)을 사용할 경우, 그 농도는 100 mM 내지 약 1 M 범위 이다.
투석여과 및 완충액 교환된 시료에 IMAC 공정에 앞서 세제를 첨가하는 것이 바람직하다. 세제는 보통 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 및 Tween 85와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, Triton X100과 같은 알킬아릴 폴리에테르 알코올, 비이온계 세제 및 옥틸글리코사이드와 같은 탄수화물 기제 세제 중에서 선택된다. 세제는 약 0.05% (v/v) 내지 10% (v/v), 예컨대 약 0.1% (v/v)의 농도 범위에 도달하도록 첨가된다.
IMAC
IMAC 공정은 완충액 교환된 시료를 적용하기에 앞서 이가 금속으로 크로마토그래피 매질을 하전시키는 것을 포함한다. 일반적으로 이가 금속 이온은 Ni2+, Cu2+, Zn2+, Co2+, 및 Fe2+ 중에서 선택된다. 바람직하게는, 이가 금속은 Zn2+인 것이 좋다.
IMAC 중의 크로마토그래피 매질의 용출은 이미다졸, 히스티딘, 고염분 완충액을 적용하거나 또는 크로마토그래피 매질 (대개 크로마토그래피 컬럼)의 pH로 변경함으로써 수행한다. 예컨대, 용출에 이미다졸을 이용할 경우, 이미다졸을 단일 공정으로 약 50 mM 내지 약 500 mM의 농도 (예컨대 100 내지 400 mM), 바람직하게는 약 200 mM의 농도로 적용시키는 것이 바람직하다. 또는, 히스티딘을 사용할 경우에는 약 20 mM 내지 400 mM (예컨대 50 내지 200 mM), 바람직하게는 약 100 mM의 농도로 단일 공정으로 적용한다. 고염분 완충액은 대개 NaCl을 약 1 M 이하, 또는 심지어 2 M의 농도로 함유한다.
SEC
SEC 매트릭스의 평균 포어 크기는 10 kDa 내지 600 kDa의 구형 단백질을 분리시키는 크기이다.
시료를 매트릭스에 적용한 후, 인산염 또는 TRIS 완충액으로 용출시키거나 또는 HEPES와 같은 생물학적 완충액으로 용출시킨다. 바람직한 완충액은 TRIS 완충액이다.
SEC 동안 pH는 약 7 내지 약 8로, 바람직하게는 약 7.5로 유지시킨다.
적절하고 필요하다면 (즉 인산염 완충액을 SEC 공정에 사용한 경우), SEC로부터 수득된 EGFR군 유래형 단백질을 함유하는 시료를 AIE 전에 희석하여 인산염 농도를 15 mM 미만으로, 예컨대 10 내지 12.5 mM의 농도로 조정한다. 그러나, 이러한 인산염 완충액 농도를 이용함으로써 AIE를 수행할 수 있다는 것은 놀라운 일이다.
AIE
본 발명 정제 방법의 마지막 공정은 적어도 1회의 AIE 단계인데, 그 적어도 한 단계는 강한 음이온 교환 매트릭스를 이용하여 수행한다 - 바람직한 구체에에서는 약한 음이온 교환 매트릭스를 이용하기도 한다. 이것은 강한 또는 약한 음이온 교환 매트릭스 상에서 SEC 후에 수득된 EGFR군 유래형 단백질을 함유하는 시료를 로딩시키는 것이 좋다. 일반적으로, 용출은 pH 7 내지 8, 바람직하게는 약 pH 7.5에서 완충된 (인산염, TRIS 또는 HEPES와 같은 생물학적 완충액) NaCl 용액을 이용하여 수행된다.
이러한 공정 후 용출물 중에 수득된 단백질은 임상 등급의 순도를 가지며 후속적으로 곤충 세포 배양체로부터 유래된 오염물질을 실질적으로 함유하지 않는다.
약한 음이온 교환 매트릭스를 이용하는 AIE 공정은 종국적인 AIE 공정의 일부로서 포함시키는 대신, IMAC 공정과 SEC 공정 사이의 공정으로서 적용가능하다.
부가적인 임의 공정들
투석여과 후, 바이러스 제거 공정 (예컨대 2% Tween 20 및 0.3% TnBP)을 포함시키는 것이 바람직하고 AIE 후 바이러스 여과 공정을 포함시키는 것이 바람직하며 (예컨대, Planova 15N 필터 또는 유사한 필터), 이 두 공정 모두는 결과적인 생성물이 임상적으로 허용될 수 없는 오염물질을 확실히 포함하지 않도록 하기 위해 실시된다. 그러나, 무바이러스계가 사용될 경우에는 이들 두 공정은 필수적인 것은 아니다.
본 발명의 HER-2 변이체
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 인간의 HER-2 종양 항원의 변이체를 정제할 때 착안되었다. 이 특별한 변이체는 자가 HER-2에 대한 면역학적 반응을 유발하기 위한 백신 제제로서 특히 적합한 것으로 입증되었기 때문에 이 특정의 변이체 역시 본 발명의 일부를 구성한다.
일반적으로, 이 특정 HER-2 변이체의 특정 용도, 조성, 재조합 산물, 적절한 벡터 및 숙주 세포 뿐만 아니라 기타 이에 관한 상세 는 Wo 00/20027에 개시되어 있다. 따라서, 다음에서는 이 변이체와 특히 관련된 간단한 논의만을 하기로 한다.따라서, WO 00/20027의 개시 내용 전체는 본 발명 명세서에 참고로 통합되며 HER-2 변이체와 관련된 면역화 및 이들의 일반적인 제조 방법과 이들의 조성물에 관한 필요한 교시 내용이 상기 공보의 내용에 의해 제공된다. 또한 자가 HER-2에 대한 핵산 백신접종과 관련한 WO 00/20027의 개시 내용 역시 본 발명에 참고로 통합된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO: 2, 잔기 17-677에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HER-2 단백질의 면역원성 변이체에 관한 것이다. 이 변이체는 SEQ ID NO: 2, 잔기 1-677에 제시된 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드인 것이 바람직하다. 즉, SEQ ID NO: 2의 잔기 1-14로 구성된 히스티디닐이 풍부한 정제 태그와, SEQ ID NO: 2의 잔기 15 및 16으로 구성된 아미노펩티다제 종결 서열도 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에는 또한 HER-2 단백질의 면역원성 변이체를 코딩하는 핵산 단편, 예컨대 DNA 단편도 포함된다. 특히 바람직한 DNA 단편은 SEQ ID NO: 1에 제시된 HER-2 변이체 코딩 서열이다.
HER-2 변이체의 재조합적 생산시 유용한 도구는 본 발명의 핵산 단편을 지니는 벡터이다. 특히 바람직한 것은 자가 복제가능한 벡터이다. 일반적으로, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니염색체 및 바이러스 중에서 선택된다.
발현 벡터가 특히 바람직하다. 본 발명의 전형적인 발현 벡터는 5'→3' 방향 및 작동가능한 결합으로, 본 발명의 핵산 단편의 발현을 추진하기 위한 프로모터, 필요에 따라, 폴리펩타이드 단편의 막 내로 분비 또는 통합될 수 있는 선도 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 단편 및 필요에 따라 종결자를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
재조합 생산을 위해, 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 특히 바람직하다. 특히 흥미로운 숙주 세포는 곤충 세포이며, 가장 바람직한 것은 S2 세포와 같은 드로조필라 유래 숙주 세포이다.
본 발명의 벡터를 지니며 본 발명의 핵산 단편을 발현하고, 필요에 따라 그 표면에 본 발명의 HER-2 단백질의 면역원성 변이체를 분비 또는 제시하는 안정한 세포주 역시 본 발명의 일부이다.
뿐만 아니라, 본 발명은 전술한 HER-2 단백질의 면역원성 변이체를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 및 필요에 따라 애쥬번트와 혼합하여 포함하는, 사람에 있어서 HER-2 단백질에 대한 면역화용 면역원성 조성물도 제공한다. 적절한 조성에 관한 상세는 WO 00/20027에서 찾아볼 수 있다.
또한, 이러한 백신은 핵산 백신의 형태일 수 있다 (이 기술에 관한 상세는 WO 00/20027을 참조). 따라서, 전술한 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 및 필요에 따라 애쥬번트와 혼합하여 포함하는 사람에 있어서 HER-2 단백질에 대한 면역화를 위한 면역원성 조성물도 본 발명의 일부이다.
또한,
- 본 발명에 설명된 HER-2 단백질의 면역원성 변이체 또는 그 변이체를 포함하는 면역원성 조성물, 또는
- 본 발명에 설명된 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 면역원성 조성물
의 면역원성 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 자가 HER-2에 대하여 인간을 면역화시키는 방법도 본 발명의 범위에 포괄된다.
이 면역화 방법 (및 본 발명에 설명된 면역화를 위한 다른 수단)을 암의 치료 또는 완화를 위해 사용하는 것이 특히 바람직하다.
실시예 서문
다음의 예시는 암 관련 HER-2 단백질의 면역원성 유사체인 "104.1 분자" (참고 SEQ ID NO: 2)를 이용하는 것이다. 그러나, 당업자라면 본 발명의 일반적인 교시 내용이 다른 His 태그된 단백질, 특히 곤충 세포계에서 재조합적으로 생산된 것들에도 적용가능함을 이해할 것이다.
정제 방법은 다음의 4가지 일반적인 정제 공정으로 구성된다:
1. 발효 상등액의 완충액을 교환하면서 투석여과.
2. 고정형 금속 친화 크로마토그래피 (IMAC)
3. 겔 여과/크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
4. 음이온 교환 크로마토그래피 (AIE)
현재 바람직한 방법에는 부가적으로 2개의 바이러스 제거 공정이 포함되는데 한 공정은 불활성화 공정이고 다른 하나는 바이러스 여과 공정이다.
투석여과/완충액 교환
투석여과는 세가지 목적을 위해 수행된다. 즉, 1) 물질 "104.1"을 농축하는 것, 2) 후속적인 포집 (capture) 공정을 방해할 수 있는, 금속 이온과 같은 저분자량 물질을 발효 배지로부터 제거하는 것, 그리고 3) 완충액을 금속 킬레이트 크로마토그래피 (IMAC)에 더욱 적합한 완충액으로 교환하는 것이 그것이다. 완충액 교환은 하나 또는 두개의 공정으로 일어난다. 최초의 공정은 50 mM 인산염 완충액 pH 7.0; 두번째 공정은 50 mM 인산염 완충액 pH 7.5에서 수행하는 것이 가장 적합하다. 투석여과를 pH 7.5에서 수행하면 이와 같은 pH 순열이 중요한 것으로 보이는데, 이는 바로 pH 7.5로 가면 곤충 세포 발효배지로부터 미동정 성분들의 침전이 일어나기 때문이다. 농축은 주로 후속적인 IMAC에서의 로딩 시간을 감소시키고 완충액 교환 공정에서 완충액의 소모를 감소시키기 위해 수행되는 것으로서, 후속적인 IMAC가 그 속성상 농축 공정 단계이기도 하기 때문에 반드시 필수적인 것은 아니다. 농축 배수는 약 5배 또는 배지의 총단백질 농도가 3 mg/ml 이하 (바람직하게는 2 mg/ml 이하)가 되도록 수행하나, 단백질 농도가 그다지 높지 않으면 10배 농축도 가능하고, 심지어 20배 또는 25배 농축도 가능할 것으로 예상된다. 프로토콜 중에 설명된 5배를 초과하는 농축은 공정을 개선시킬 수 있는데, 이는 후속되는 IMAC 컬럼 상에서의 로딩 시간을 줄여줄 것이기 때문이다.
IMAC를 위한 시료 조제
용출 완충액에 이미다졸을 사용할 경우, 0-10 mM의 최종 농도로 이미다졸을 첨가함으로써 IMAC 컬럼에 적용하기에 앞서 투석여과물을 조제할 수 있는데; 이미다졸 (또는 유사 물질)이 첨가되지 않을 경우, 본 발명자들은 104.1과 함꼐 곤충 세포로부터의 다른 단백질의 공동 정제를 경험하였다.
다른 한편, L-히스티딘을 이용하여 용출하는 경우, 용출 완충액에 염을 대신 첨가한다. 또한 Tween 20 (여과 후) 을 최종 농도 0.1% (v/v)가 되도록 첨가한다. IMAC 공정에서는 5%까지 적용가능하고 초과 농도가 농도가 0.1%보다 큰 경우에는 다이머 형성이 줄어들 것이다. 다른 세제 역시 유용할 것으로 기대되며, 특히, 기타의 Tween 세제가 그러하다 (Tween 40, 60, 80 및 85).
IMAC
물질 104.1은, 컬럼 매트릭스 상에 고정된 착물화 이가 금속 이온에 친화성을 갖는 소위 His-태그를 N 말단에 갖는다. 결정적으로 중요한 변수들은 이가 금속 이온을 선택하는 것과 용출제/용출방법을 선택하는데 있다. Ni2+, Cu2+, 및 Zn2+은 모두 킬레이트화 금속 이온으로서 사용될 수 있다. 그러나, Zn2+는 후수한 회수율과 적은 불순물을 나타내었다. 포집된 104.1의 용출을 위해 몇가지 전략이 이용될 수 있다. 1) 컬럼에 이미다졸을 적용하는 것 2) 컬럼에 히스티딘을 적용하는 것 3) 컬럼에 고염분 농축 완충액을 적용하는 것, 그리고 4) 컬럼의 pH를 변경하는 것이 그것이다.
현재 바람직한 방법은 100 mM L-히스티딘을 한 단계로 적용함으로써 용출시키는 것이다. 그러나, 50 mM 정도의 낮은 농도도 사용가능하나, 덜 농축된 104.1이 얻어지며 회수율도 낮다. 이미다졸 (200 mM 용액으로서 적용되는)을 사용할 수도 있으며 보다 낮은 농도 (50 mM 정도까지 낮은)로도 동일한 회수율 효과를 얻을 수 있다.
SEC
하기 실시예는 SEC를 TRIS 완충액 중에서 실시한 것을 설명한 것이다. 그러나, 인산염 역시 잘 작용할 것으로 보이며, 다만, TRIS가 인산염에 비해 후속 AIE에 더욱 적합하다. 인산염 또는 염을 함유하는 TRIS 완충액을 사용할 경우, 인산염 농축을 감소시키기 위해 AIC 컬럼 상에 적용하기에 앞서 SEC 용출물을 희석할 필요가 있으며, 이것은 TRIS 완충액만에 대해서는 필요하지 않다.
IMAC를 0.4% 보다 높은 Tween-20 농도에서 실시할 경우, SEC에서는 < 0.4%로 조정하여야 하는데, 이는, Tween-20의 농도가 0.2%를 초과하면 104.1 단백질이 AIE 컬럼에 결합하지 않기 때문이다. 이것은 AIE를 다른 완충계에서 실시할 경우에는 달라질 수도 있다.
AIE 크로마토그래피를 위한 시료 조제
SEC로부터 얻은 알맞은 분획들은 물, 1배 부피 용출물 + 3배 부피 물로 희석하여, 인산염 농축물을 감소시키는데, 이는 인산염 중에서의 실시 중 이것이 AIE 크로마토그래피를 방해하기 때문이다. 이 문제는 SEC 설명란에서도 논의된다.
AIE 크로마토그래피
중요한 변수들은 시료와 완충계의 pH 및 이온 세기이다.
SEC를 TRIS에서 수행한 경우, 시료 조제 (물로 희석)를 피할 수 있어 로딩 부피 (및 로딩 시간)이 줄어든다. 염을 함유하는 TRIS 완충액 중에서 AIE를 실시할 경우, 이온 세기가 3 mS/cm 미만이 될 때까지 TRIS 완충액 중에서 AIE를 희석한다.
최종 벌크 산물을 SDS-PAGE, 웨스턴 블라팅 (WB), ELISA, HPLC, 육안 검사, OD280, Lamulus Amoebocyte Lysate (LAL) 및 아미노산 분석을 이용하여 분석한다. 중간체 산물은 SDS-PAGE, WB, ELISA 및 OD280으로 분석한다.
AIE는 2개의 연속 공정으로 수행되는 것이 바람직하다는 것이 명백하며, 그 첫번째 공정은 약한 음이온 교환 매트릭스를 이용하고 두번째 공정은 강한 음이온 교환 매트릭스를 이용하는 것이다. 그러나 약한 AIE 매트릭스를 이용하는 공정은 IMAC 공정과 SEC 공정 사이로 도입되도록 순서를 옮길 수 있다.
도 1은 IMAC의 크로마토그래피 프로파일이다. 화살표는 104.1 피크를 가리킨다.
도 2는 SEC의 크로마토그래피 프로파일이다. 화살표는 모노머 피크를 가리킨다.
도 3은 AIE의 크로마토그래피 프로파일이다. 화살표는 104.1 피크를 가리킨다.
도 4는 pMT/hHER2MA5-5DUniHis 벡터 p992, 플라스미드 지도를 도시한 것이다. hHER2MA5-5D: hHER2MA5-5DUH 단백질을 코딩하는 유전자 (뉴클레오타이드 3604-5592).
P2 에피토프: hHER2MA5-5DUH 단백질에서 P2 에피토프를 코딩하는 서열 (뉴클레오타이드 4357-4401).
P30 에피토프: hHER2MA5-5DUH 단백질에서 P30 에피토프를 코딩하는 서열 (뉴클레오타이드 5500-5562).
ColE1: 이. 콜라이 (E. coli)에서의 복제 오리진 (뉴클레오타이드 701-1434).
암피실린 내성 유전자: 세균에 암피실린 내성을 부여하는 유전자 (뉴클레오타아ㅣ드 1579-2439).
메탈로티오네인 프로모터: 몇가지 화합물 (예컨대, 카드뮴)에 의해 유도될 수 있는 프로모터 (뉴클레오타이드 3050-3415).
Kozak 유사 서열: 리보좀 결합 좌위 (뉴클레오타이드 3493-3501).
BiP 시그널 서열: 세포외 구획으로 HER2 변이체 단백질을 분비시키는 시그널 서열 (뉴클레오타이드 3502-3555).
UniHis 서열: HER2 AutoVac 단백질의 정제에 사용되는 UniHis 태그를 코딩하는 서열 (뉴클레오타이드 3556-3597().
디펩티다제 종결 서열: HER2 AutoVac 단백질로부터 UniHs 태그를 절단하고자 할 때 사용된다 (뉴클레오타이드 3598-3603).
HER-2 변이체 104.1의 배양
세포주 생산
S2 드로조필라 멜라노가스터 세포의 폴리클로날 배양체를, HER2 변이체 104.1을 코딩하는 유전자를 함유하는 pMT 벡터 (DES
Figure 112005076406495-PCT00002
계, Invitrogen)로 트랜스펙션시켰다; 이 pMT 벡터의 완전한 핵산 서열은 SEQ ID NO:1에 제시되어 있다. 이와 병립적으로, 트랜스펙션된 세포들을 선별할 수 있도록 하이그로마이신을 사용할 수 있는 하이그로마이신 내성 부여 유전자를 지니는 플라스미드로 세포들을 트랜스펙션시켰다.
단일 세포 클론을 분리하기 위해 한정 희석 기술을 이용하였고, 선별된 세포주들로부터 마스터 세포 은행 (MCB: Master Cell Bank)을 만들었다.
HER 단백질 AutoVac 생산
MCB로부터 얻은 하나의 바이알을 T-플라스크에 복원시키고 (resuscitated), 25℃에서 Excell420 배지 (JRH)를 함유하는 진탕 플라스크에서 증식시켜 바이오반응기에 접종하는데 충분한 바이오매스를 얻었다. 4 mM 글루타민, 0.1% Pluronic F67, 및 0.5 mL/L PD30 소포제가 보강된 ExCell 420 3000 mL에 총 45 x 109 세포를 희석하였다. 이 3000 mL를 이용하여 Applikon 바이오반응기 (7L 작업 용량)에 접종하였으며, 여기서 배양체를 25℃에서, dO2 = 50% (100% = 공기 포화), pH = 6.5 ±0.1 (5 % H3PO4 및 0.5 M NaOH를 이용하여 조정)를 이용하여 170 rpm으로 교반하면 서 3일간 배양하였다.
이 배양체를 4 mM 글루타민, 0.1% Pluronic F68, 및 0.5 mL/L PD30 소포제가 보강된 ExCell 420으로 희석하여 총 세포 농도 15 x 106 세포/mL로 만들고 25℃, dO2 = 50 % (순수 산소로 분무), pH = 6.5 ± 0.1 (5 % H3PO4 및 0.5 M NaOH로 조정)로 유지되고 142 rpm으로 교반되는 15 L 작업 용량의 Applikon Bioreactor에 접종하였다. 이 배양체를 총 부피 10L가 될 때까지, 4 mM 글루타민과 0.1 % Pluronic F68이 보강된 ExCell 420으로 연속 희석하였다. 세포 수가 15 x 106 세포/mL 미만으로 떨어지는 것을 방지하기 위하여 희석 속도를 매일 조정한다. PD30 소포제를 수동으로 배양체에 첨가하여 총 농도를 0.5 mL/L로 유지시킨다.
충전이 종결되면, 제거된 배지와 함께 세포 손실을 방지하기 위하여 BioSep 세포 (AppliSens) 어쿠스틱 체류 장치를 이용하여 1RV/일 (1일 반응기 용량)로 관류를 개시한다. 30 x 106 세포/mL의 세포 농도에서, 총 2 μM CdCl2 (10 mM 원액)을 배양액과 배지 저장소에 첨가함으로써 배지를 유도한다.
발효 배지를 수확, 원심분리하여 무세포 상등액을 얻고, PALL 필터 0.8/0.22 ㎛를 통하여 여과한다. 얻어진 무균 상등액을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하거나 (-80℃에서 세달까지 보관하여도 이렇다할 안정성 문제는 검출되지 않았다) 4℃에서 1주일 이내 보관한다 (이 경우에도 단백질의 이렇다할 변성은 검출되지 않았다).
유도한지 10일 후 배양을 종결하고 바이오반응기 중의 잔류 배양 배지를 폐기한다.
실시예 2
투석여과/농축 및 완충액 교환
사용에 앞서, 실시예 1로부터의 발효 상등액은 -80℃에서 보관된 경우에는, 4℃로 하룻밤 서서히 해동 (마지막 3 내지 4시간은 냉수에서 수행가능)한 후에, 4℃에서 최대 3일간 보관하였다. 또는, 발혀 상등액을 직접 사용한다.
발효 상등액을 4℃에서 15분간, 10,000 rpm으로 SCA 3000 튜브에서 Sorvall RE 5C Plus Centrifuge 중에서 원심분리한다.
투석여과는 5 ± 3℃의 냉실에서 Pellicon 2 Cassette filter 30K 0.5 m2 (Millipore, Cat# P2B030A05)이 구비된 ProFlux M12 (Millipore) 상에서 수행한다. 사용에 앞서 필터를 0.1 M NaOH 중에 보관한다. 투석여과전 필터를 밀리-Q 워터를 통해 철저히 세정한다; 표준 저장소를 밀리-Q 워터 (3L)로 충전하고 저장소에 200 mL가 남을 때까지 필터를 통해 물로 수세한다. 이 공정을 필터를 통해 총 12 리터가 통과될 때까지 3회 반복한다. 이제, 투석여과를 개시할 수 있다:
열량측정법으로 측정시 최대 15L의 발효 상등액을 약 5배 농축하거나 또는 배지 중 최종 단백질 농도가 2 mg/ml 이하가 되도록 농축한다.
재순환 펌프를 가동시킨다. 백프레셔 (backpressure) 밸브를 부분적으로 잠궈서 백 프레셔 (예컨대 0.2 bar)를 나타내는 출구 압력을 얻어야 한다. 펌프 속도 는 30-50%로 조정한다. 압력차는 0.7-1.2 Bar여야 하며, 이는 필터의 최대 용량을 사용하는 경우 얻어지고 플로우오버 필터가 3-4 L/분 (예컨대 출구 P = 0.2 Bar, 입구 P = 1.0 bar, ΔP=0.8)에 대응한다. 입구 압력은 튜빙 수명과 성능을 고려하여 최대 1.4 bar여야 한다. 이보다 높은 입구 압력이 요망될 경우, 재순환 펌프 압력을 증가시키거나 (%) 튜빙에 대한 기계 압력을 튜빙에 보다 높은 압력을 가함으로써 상승시킬 수 있다 (스케일 0-5). 백 프레셔 밸브가 잠기면, 보다 높은 입구 압력 및 보다 높은 출구 압력이 얻어진다. 백 프레셔 밸브는 완전히 잠그면 안된다.
이어서, 농축 발효 상등액을 하나 또는 두가지 공정에서 완충액 교환시키는데, 여기서 첫번째 공정은 10배 용량 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0이고, 이어서 임의의 두번째 공정은 10배 용량 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.5이다: ProFlux M12 Millipore 장치 상의 표준 저장소를 최종 부피가 3L가 될 때까지 완충액으로 충전시키고 사이드 저장소도 완충액으로 충전시킨다. 장치 상의 세팅은 시료를 농축시킬 때와 동일하다.
완충액 교환 시료의 부피 (Vb)를 측정하고 시료를 SDS-PAGE를 위해 채취한다 (Sb). 농축된 완충액 교환 샘플을 11 ml와 50 ml 로트로 나누고 -80℃로 급속 냉동 한다.
투석여과물의 분석
완충액 교환 효율을 확인하기 위하여 pH와 이온 세기를 측정한다.
총 단백질 농도를 분광광도계를 이용하여 1 cm 큐벳 중 280 nm에서 평가한다. 50 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.5로 10배 희석된 시료 (50 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.5)를 레퍼런스로서 이용한다 (Abs280 1 = 1 mg/ml 총 단백질). 총 단백질 농도는 열량측정 Bradford법 (BioRad)에 의해 부가적으로 측정할 수 있다. 변이체 104.1의 특이 농도는 ELISA로 측정하고 투석여과물은 SDS-PAGE로 부가 분석하고 은으로 염색하여 WB-ECL 검출한다.
투석여과 공정에 대한 비고
완충액 교환은 pH가 7.5로 변화하기 전 pH 7.1 미만에서 개시하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면, 발효 배지로부터 잔류 성분들이 침전한다.
투석여과된 시료들은 -80℃에서 수개월간 정량적 HER-2 ELISA의 성능 변화 없이 보관되었다. 그러나, 해동시, 아주 잠깐 37℃ 및 54℃에 노출되는 경우에도 동일한 ELISA에서 투석여과물의 성능은 극적으로 감소하였다. -80℃로부터 해동한 후 0℃ (얼음/물) 및 4℃에서 유지될 경우, 투석여과물의 ELISA 성능은 적어도 4시간까지는 안정하다.
투석여과 후, 투석여과물 중에 존재할지도 모르는 여하한 바이러스를 불활성화시키는 것이 편리하다. 이를 위해, 시료를 2-8℃에서 해동 및 수집한 후 1.0/0.45/0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 후, 50% Tween-20, 및 TnBP를 각각 2% 및 0.3%의 최종 농도로 부가한다. 이 용액을 2-8℃에서 16-20시간 동안 살살 교반하면서 유지한다. 이어서 용액을 후속적인 IMAC 크로마토그래피 공정 실시에 앞서 0.2 ㎛ 여과한다 (실시예 3).
실시예 3
IMAC
IMAC에 대한 일반적인 크로마토그래피 원리는 단백질 상의 "태그"와 컬럼 매트릭스 상의 금속 이온 킬레이트 착물 상의 친화도이다. 크로마토그래피 매트릭스는 POROS 20MC이거나 또는 바람직하게는 50MC (두가지 모두 Applied Biosystems사 제품)이며 킬레이팅 금속 이온은 Zn2+인 것이 좋다. 104.1 분자에 His-태그를 제공하고 컬럼 매트릭스에 대한 His-태그의 결합 완충계는 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 0.1% Tween20, pH 7.5이다.
컬럼 재료 ml 당 2-4 mg 104.1을 로딩한 다음 100 mM L-히스티딘, 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.5, 0.1 % Tween20을 이용하여 용출시킨다. 또는 200 mM 이미다졸을 이용하여 용출할 경우, 결합을 위한 완충계는 5 mM 이미다졸도 함유한다.
장치: VISION Work Station (Applied Biosystems).
소프트웨어: Data analysis software for Vision, BioCAD 700E, version 3 series software, Perseptive Biosystem.
검출: λ= 280 및 220 nm에서의 UV 흡수도.
전도도: 0 - 200 mS
pH 보정: 7.0 및 10에서
온도: 실온 (20-24℃)의 컬럼 및 완충액에서 공정을 수행하고 얼음 상에서 시료를 로딩한 다음 10℃에서 분획을 수집하였다.
시료 조제
104.1 분자를 함유하는 투석여과물에, IMAC에서 용출을 위해 이미다졸 함유 완충액이 사용될 경우 800 mM 이미다졸을 최종 농도가 5 mM 이미다졸이 될 때까지 첨가하는 반면, IMAC에서 용출을 위해 L-히스티딘이 사용될 경우에는 Tween-20을 최종 농도 0.1% (v/v)가 될 때까지 첨가한다. 컬럼에 적용하기 직전에 시료를 0.22 ㎛ 필터를 통해 진공 여과한다. 샘플을 5 ± 3℃ (바람직하게는 4℃)에서 컬럼에 적용할 때까지 유지시키며 적용시 얼음 상에서 유지시킨다. 실온에서의 조작 시간은 최소화하여야 한다.
컬럼
2000-2500 psi에서 충전된 16 x 100 mm (20.1 ml) PEEK 컬럼 (Applied Biosystems) 중 POROS 20MC 또는 50 MC (바람직한 예) - 정제 공정의 규모에 따라 다른 컬럼도 동등하게 유용하다.
컬럼 하전(스트립-하전) 프로그램
유속: 10 ml/분.
1. 50 mM NaPO4 (NaH2PO4/ Na2HPO4의 약칭) 5 CV pH 7.5, 0.1% Tween-20 (스 트립).
2. 5 CV H2O (Milli-Q).
3. 40 CV 100 mM ZnCl2, pH 4.5.
4. 40 CV H2O (Milli-Q).
5. 20 CV 50 mM NaPO4 pH 7.5, 0.1% Tween-20.
컬럼은 각각의 실시에 앞서 하전시켜야 한다.
크로마토그래피 프로그램
유속 30 ml/분, 로딩 5 ml/분.
100 mM L-히스티딘을 이용한 용충 피크에서 분획 수집 크기 9 ml, 및 5 ml (또는 적절한 경우, 200 mM 이미다졸을 이용한 경우의 용출 피크에서). 냉각된 (10℃) 분획 컬렉터에 수집한다.
바이러스 불활성화 투석여과물을 함유하는 용액을 4℃ 컬럼 상에 로딩하고, 50 mM NaPO4 pH 7.5, 0.1% Tween 20, 100　mM 히스티딘을 이용하여 용출하기에 앞서 20 CV 50 mM NaPO4 pH 7.5, 0.1% Tween 20, 0.5　M NaCl로 세정한 다음 5 CV 50 mM NaPO4 pH 7.5, 0.1% Tween 20로 세정한다.
크로마토그램으로부터 용출된 피크로부터 분획을 수집한다 (도 1 참조). 개시 피크에서 수집을 시작하여 총 50 ml (또는 1.5 컬럼 부피)를 수집하거나 또는 SDS-PAGE/WB 결과 또는 ELISA에 기초하여 분획을 총 50 ml까지 수집한다. 이 푸울 을 5±3℃에서 하룻밤 보관하거나 SEC를 바로 실시한다. 5±3℃, -20℃ 및 이보다 더 차가운 -70℃에서 7일까지 보관하여도 SDS-PAGE 및 WB-CL 상에서 분석시 0.22 ㎛ 필터를 통한 여과 후 총 단백질에는 아무런 손실도 없는 것으로 나타났다.
컬럼의 위생 처리
5 CV 1M NaOH, 2M NaCl, 이어서 10 CV 물로 컬럼을 세척한다. 부가적인 위생 처리가 필요할 경우에는 제조업체로부터의 RSP를 참고한다. 5-30℃에서 30% EtOH 중에 컬럼을 보관한다.
IMAC 중간체의 분석
출발 물질, 유속 및 용출 분획을 WB-ECL 및 SDS-PAGE/ 은 염색을 이용하여 분석한다.
IMAC 푸울 분석
WB-ECL 및 SDS-PAGE/ 은 염색을 이용하여 푸울을 분석하고, HPLC 및 OD280nm에 의해 분석한다 (10배 희석 샘플). 특이적인 104.1 농도를 ELISA로 결정한다.
실시예 4
SEC 겔 여과 크로마토그래피
겔 여과 공정을 mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7.5에서 수행한다. 그러나, 완충계로서 Tris를 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4로 대체할 수 있다. 실시예 3의 IMAC에 의해 수득된 50 ml를 Superdex 200 예비 등급 매트릭스 상에서 Superloop (Pharmacia)에 의해 로딩한다.
장치: 컬럼 상의 백 프레셔를 감소시키기 위해 반 예비적 유동 세포가 구비된 Perfusion Chromatography용 BioCAD 700E Work Station.
소프트웨어: Vison, BioCAD 700E용 데이터 분석 소프트웨어, 버젼 3 시리즈 소프트웨어, Perseptive Biosystem.
검출: λ= 280 및 220 nm에서의 UV 흡수도.
전도도: 0 - 200 mS
pH 보정: 7.0 및 10에서 보정
온도: 완충액 및 컬럼은 실온 (20-24℃)이고 시료는 4℃로부터 직접 로딩한다. 모노머 104.1을 함유하는 분획은 만일 컬렉터가 냉각되지 않은 경우 수집 후 직접 4℃로 옮겨야 한다.
시료 조제
완충액, 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 0.1% Tween20, 100 mM L-히스티딘 (또는 200 mM 이미다졸), pH 7.5 중 IMAC로부터 얻어진 푸울은 특별한 조제를 요하지 않는다. 이 시료를 로딩시까지 (5±3℃)로 유지시켜야 한다.
컬럼
최종 유속 15 ml/분으로 Pharmacia column XK 50x960mm (1884 ml)에 충전된 Superdex 200 예비 등급. 최대 로딩량 50 ml.
크로마토그래피 프로그램
일반 유속 8 ml/분, 로딩 5 ml/분.
분획 크기 9.0 ml
1. 평형 1.5 CV 20 mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7.5
2. 로드: 50 ml Super Loop를 통하여, 5 ml/분
3. 용출 1.2 CV 20 mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7.5
모노머 피크 (도 2 참조)로부터의 분획들을 젤을 비교하여 수집하고/수집하거나 SE/RP-HPLC에 의해 순수한 생성물을 얻는다 (약 130 ml). 이 푸울을 5±3℃에서 밤새 보관하거나 또는 실시예 5의 AIE 크로마토그래피를 바로 직접 수행할 수 있다. 5±3℃, -20℃ 및 이보다 더 차가운 -70℃에서 7일 이하 보관하여도 SDS PAGE 및 WB-ECL에 의해 분석시 0.22 ㎛ 필터를 통한 여과 후 총 단백질은 전혀 손실되지 않은 것으로 나타났다.
감작화 및 컬럼 청소
6.5 ml/분 (20 cm/h)으로 1-2시간, 이어서 3 베드 용량의 완충액을 이용하여 역류 방향으로 0.5 NaOH 중에서 러닝시켜 컬럼을 청소한다. 위생관리를 위해 역방향으로 0.5-1.0 NaOH 러닝, 13 ml/분 (40 cm/h)으로 30-60분간, 이어서 멸균 완충액 3-5 베드 용량으로 30-60분간 러닝시킨다. 컬럼을 20% 에탄올에서 4-8℃로 보관 한다. 부가적인 정보에 관해서는 제조업체의 매뉴얼을 참고한다.
SEC 중간체 분석
WB-ECL, SDS-PAGE/은 염색 및 SE/RP-HPLC에 의해 출발 물질 및 용출된 분획들을 분석한다.
SEC 푸울 분석
푸울을 WB-ECL 및 SDS-PAGE/은 염색, HPLC 및 OD280 nm으로 분석한다. 특이적인 104.1 농도를 ELISA로 측정한다.
SEC에 대한 비고
샘플을 IMAC와 Superloop으로부터의 로딩 사이에 5±3℃로 유지시킨다.
분획 컬렉터가 냉각되지 않으면 (10℃), 수집 직후 분획들을 냉실/냉장고로 이동시켜야 한다.
컬럼을 자주 사용할 경우, 일정 유속 (0.2 ml/분)으로 20 mM Tris, pH 7.5, 0.1% Tween 20를 컬럼에 적용한다 (또는 20 mM Tris 대신 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4를 사용하고, 이 경우, Tween-20을 0.5%로 사용함).
실시예 5
AIE 크로마토그래피
최초의 임의 공정
먼저 음이온 교환 크로마토그래피를 Poros 50PI 매트릭스 컬럼 상에서 최초로 임의적으로 수행한다. 이 컬럼에는 20 mM Tris HCl, 0.1%　Tween　20, pH 7.5가 구비되어 있다. 평형화 후, 시료를 바이오 버든 테스팅 (bio burden testing)을 위해 유지시킨다.
4℃에서 컬럼 상에 SEC 용출물을 로딩하고 컬럼을 20 CV 20 mM Tris HCl, 0.1%　Tween　20, pH 7.5로 세정한 다음, 생성물을 20 mM Tris HCl, 250 mM NaCl, 0.1　%　Tween 20 pH 7.5로 용출시킨다. 생성물 푸울을 0.2 ㎛ 여과하고 OD280 nm, 104.1 ELISA, RP-HPLC 및 SE-HPLC로 분석하고 2-8℃에서 3일까지 저장한다.
Poros 50PI 컬럼을 H2O (milli-Q)로 플러싱하고, 20 mM NaOH에서 보관하기에 앞서 10 CV의 2 M NaCl, 1 M NaOH로 세정한다. 5 CV의 0.5 M NaOH로 위생처리하고 평형화 및 후속적인 재사용에 앞서 H2O (milli-Q)로 플러싱한다.
필수 공정
음이온 교환 크로마토그래피를 pH 7.5 (20 mM TRIS)에서, 바람직하게는 PEEK 4.6x100 mm (1.662 ml) 컬럼 중 강한 음이온 교환 관류 매트릭스 POROS 50HQ (Applied Biosystems)에서 수행한다. 104.1을 200 mM NaCl에서 용출시킨다.
장치: Perfusion Chromatography용 VISION Work Station.
소프트웨어: Vison, BioCAD 700E용 데이터 분석 소프트웨어, 버젼 3 시리즈 소프트웨어, Perseptive Biosystem.
검출: λ= 280 및 220 nm에서의 UV 흡수도.
전도도: 0 - 200 mS
pH 보정: 7.0 및 10에서 보정
온도: 공정을 실온 (20-24℃)의 완충액 및 컬럼을 이용하여 수행하고 시료는 얼음으로부터 로딩한다. 분획 컬렉터를 10℃로 냉각하였다.
시료 조제
최초의 임의 AI 공정이 생략된 경우, SEC 중간체를 0.1% Tween-20을 함유하는 물에서 살살 자석 교반하면서 1 + 3 (25%까지) 희석할 수 있다. 그렇지 않으면, POROS 50 PI 용출물을 15배 용량 20 mM Tris HCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5로 희석하여 전도도를 감소시킨다. 시료는 로딩전까지 그리고 로딩 중에 차갑게 (5±3℃) 유지시켜야 한다.
컬럼
POROS 50HQ를 2000-2500 psi에서 4.6 x 100 mm (1.662 ml) PEEK 컬럼 중에 충전시킨다.
크로마토그래피 프로그램
일반적 유속 10 ml/분, 로딩 샘플 5 ml/분.
분획 크기: 샘플 로딩 중에는 9 ml, 1차 용출 공정 중에는 1 ml, 2차 용출 공정 중에는 5 ml.
음이온 교환 크로마토그래피를 4℃에서 Poros 50HQ 매트릭스 상에서 수행한 다. 이 컬럼을 20 mM Tris HCl, 0.1%　Tween　20, pH 7.5를 이용하여 평형화시킨다. 평형화후 시료를 바이오 버든 테스트를 위해 유지시킨다.
시료를 컬럼 상에 로딩시키고 컬럼을 10 CV 20 mM Tris HCl, 0.1%　Tween　20, pH 7.5 및 10 CV 20 mM Tris HCl, 20 mM NaCl, 0.1%　Tween　20, pH 7.5로 세정한 다음 생성물을 20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 0.1　%　Tween 20 pH 7.5로 용출시킨다.
농도가 2.5 mg/ml가 초과하거나 OD280mm가 2.5를 초과하는 농촉물을 얻기 위해 겔 결과를 비교하여 용출 피크로부터의 분획들 (도 3 참조)을 수집한다. 이 분획들은 밤새 5±3℃에서 수집 전까지 유지시킬 수 있다. 5±3℃, -20℃ 및 이보다 더 차가운 -70℃에서 7일까지 상기 푸울을 보관하여도 SDS PAGE 및 WB-ECL로 분석시 0.22 ㎛ 필터를 통한 여과후 총 단백질에는 아무런 손실이 없었다.
컬럼 감작화
컬럼을 10 컬럼 용량 (CV)의 1 M NaOH, 2 M NaCl, 이어서 20 CV의 물로 세정한다. 추가의 위생 처리가 요구될 경우 제조업체의 매뉴얼을 참고한다. 컬럼을 30% 에탄올 중 5-30℃에서 보관한다.
분석
출발 물질, 유속 및 용출 분획등을 WB-ECL 및 SDS-PAGE/은 염색에 의해 분석한다.
AIE 푸울의 분석
AIE 푸울을 WB-ECL 및 SDS-PAGE/은 염색, 외관 및 명세, pH, HPLC, LAL 및 OD280 nm에 의해 분석한다 (3배 희석 시료 사용). 특이적인 104.1 농도를 ELISA를 이용하여 결정한다.
AIE에 대한 비고
SEC 중간체가 1 + 3 (25%) 미만으로 희석되면 104.1은 인산염 완충액으로부터의 간섭으로 인해 AIE로부터 런 쓰루에서 검출된다.
런쓰루에서 검출량의 104.1 없이 25 mg까지 104.1을 AIE 컬럼에 적용하였다.
임의적인 바이러스 여과
바이러스 여과 및 후속적인 희석 및 약물의 충전을 클래스 100 환경에서 실시한다. 1 이상의 Poros 50 HQ 런으로부터의 여과전 정제된 벌크를 냉동 보관물로부터 제거하고 2-8℃에서 해동한다. 이들을 0.1 ㎛ 여과하고 Planova 20N 바이러스 여과막을 통해 통과시킨다. 필터를 통합 테스팅을 위해 유지시킨다. 바이러스 여과 물질을 OD280 nm의 측정에 의해 2.5-3.0 mg/ml의 농도로 조정한다.
최종 벌크 산물의 보관
최종 벌크 산물은 0.22 ㎛ 필터를 통한 여과 후, 폴리프로필렌 용기 또는 CZ 바이알 중 -70℃ 미만의 온도에서 보관한다.
이렇게 얻어진 산물은 임상 용도에 적합한 순도를 갖는다

Claims (48)

  1. 곤충 세포 배양체에서 재조합적으로 생산되고, 고정형 금속 친화 크로마토그래피 수단에 의해 정제하는데 적합한 EGFR군 유래형 단백질의 정제 방법으로서, 상기 방법은 상기 EGFR 유래형 단백질 군을 함유하며 실질적으로 세포를 함유하지 않는 시료를 상기 곤충 세포 배양체로부터 수득한 후, 다음의 후속 공정을 이용함으로써 상기 EGFR군 유래형 단백질을 부화 (enriching) 시키는 것인 방법:
    - 배양 배지를 투석여과하고 완충액 교환시키는 공정,
    - 고정형 금속 친화 크로마토그래피 (IMAC) 공정,
    - 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 공정, 및
    - 음이온 교환 크로마토그래피 (AIE) 공정.
  2. 제1항에 있어서, EGFR군 유래형 단백질은 IMAC에 의한 정제를 용이하게 해주는 이종 (heterologous) 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 이종 아미노산 서열은 히스티딘 잔기가 풍부한 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 이종 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 잔기 1-14를 포함하는 것인 방법.
  5. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, EGFR군 유래형 단백질은 인간의 EGFR 또는 인간의 HER-2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 실질적인 부분은 EGFR 또는 HER-2의 세포외 부분으로부터 주로 유래되는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, EGFR군 유래형 단백질은 인간의 HER-2의 변이체인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 인간의 HER-2의 변이체는 적어도 하나의 외래 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 인간의 HER-2의 변이체는 파상풍 독소 에피토프 P2 (SEQ ID NO: 2의 잔기 269-282) 및 P30 (SEQ ID NO: 2의 잔기 649-669)를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 인간의 HER-2의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 17-677을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 인간의 HER-2 변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 1-677로 구성된 것인 방법.
  12. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투석여과/완충액 교환 공정은 약 2 내지 약 25℃, 바람직하게는 약 3 내지 약 8℃에서 수행되며, 온도가 10℃를 초과할 경우 Tween과 같은 세제를 필요에 따라 부가하여 수행하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 투석여과는 먼저 배양 배지 시료 중의 거대 분자 화합물을 초기 농축하는 공정과 이어서 완충액으로 배양 배지를 교환하는 후속 공정의 두 공정으로 수행되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 거대 분자 화합물은 약 2 내지 약 25배 농축되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 거대 분자 화합물은 약 3-5배 농축되는 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 완충액 교환은 후속적인 하나의 또는 두가지 후속 공정으로 수행되며 이중 첫번째 공정은 pH 6.5 내지 7.2에서, 두번째 공정은 pH 7.0 내지 8.0에서 수행되는 것인 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인산염 완충액이 완충액 교환에 사용되는 방법.
  18. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이미다졸, 히스티딘 또는 고염분 완충액을 투석여과 및 완충액 교환된 시료에 첨가하거나 또는 완충액 교환된 시료를 후속적으로 변경시키지 않는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 이미다졸이 첨가될 경우, 이미다졸은 약 0.05 내지 약 20 mM의 농도 범위에 도달하도록 첨가되는 방법.
  20. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 및 Tween 85와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, Triton X100과 같은 알킬아릴 폴리에테르 알코올, 비이온계 세제 및 옥틸글리코사이드와 같은 탄수화물 기제 세제 중에서 선택된 세제를, 약 0.05% (v/v) 내지 10% (v/v), 예컨대 약 0.1% (v/v)의 농도 범위에 도달하도록 투석여과 및 완충액 교환된 시료에 첨가하는 방법.
  21. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, IMAC 공정은 크로마토그래피 매질을 완충액 교환된 시료 적용에 앞서 이가 금속 이온으로 하전시키는 것을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 이가 금속 이온은 Ni2+, Cu2+, Zn2+, Co2+, 및 Fe2+, 중에서 선택되고 바람직하게는 Zn2+.인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 크로마토그래피 매질의 용출은 이미다졸, 히스티딘, 고염분 완충액을 적용시키거나, 또는 크로마토그래피 매질 상의 pH를 변화시킴으로써 수행하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 크로마토그래피 매질의 용출은 이미다졸을 약 50 mM 내지 약 500 mM, 바람직하게는 약 200 mM의 농도로 일회 적용시킴으로써 수행하거나, 또는 용출은 히스티딘을 약 20 mM 내지 400 mM, 바람직하게는 약 100 mM의 농도로 일회 적용시킴으로써 수행하는 것인 방법.,
  25. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, SEC 공정은 인산염 또는 TRIS 완충액 또는 HEPES와 같은 생물학적 완충액을 이용한 용출을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, pH를 약 7-8, 바람직하게는 약 7.5로 유지시키는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 이어서, SSEC 매트릭스의 평균 포어 크기는 10 kDa 내지 600 kDa의 구형 단백질을 분리시키는 크기인 방법.
  28. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 필요에 따라, SEC로부터 얻어진 EGFR군 유래형 단백질을 함유하는 시료를, AIE 공정에 앞서 희석함으로써 인산염 농도를 10 내지 12.5 mM 범위와 같이 15 mM 미만의 농도로 조정하는 방법.
  29. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, AIE 공정은 SEC 후에 수득된 EGFR군 유래형 단백질을 함유하는 시료를 강한 음이온 또는 약한 음이온 교환 매트릭스 또는 두가지 매트릭스 모두에 로딩시키는 것을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, pH 7 내지 8에서 완충된 NaCl 용액을 이용하여 용출을 수행하는 방법.
  31. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투석여과/완충액 교환 공정과 IMAC 공정 사이에 바이러스 불활성화 공정을 도입하는 방법.
  32. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, AIE 공정 후에 바이러스 여과 공정을 수행하는 방법.
  33. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, IMAC 공정과 SEC 공정 사이에 약한 음이온 교환 컬럼을 이용하는 AIE 공정을 도입하는 방법.
  34. SEQ ID NO: 2에 제시된 잔기 17-677의 아미노산 서열을 포함하는 HER-2 단백질의 면역원성 변이체.
  35. 제34항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 잔기 1-677에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 HER-2 단백질의 면역원성 변이체.
  36. 제34항 또는 제35항에 따른 HER-2 단백질의 면역원성 변이체를 코딩하는 핵산 단편.
  37. 제36항에 있어서, DNA 단편인 핵산 단편.
  38. 제36항 또는 제37항에 따른 핵산 단편을 지니는 벡터.
  39. 제37항에 있어서, 자가 복제할 수 있는 벡터.
  40. 제37항 또는 제39항에 이어서, 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니염색체 및 바이러스 중에서 선택된 것인 벡터.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 5'→3' 방향 및 작동가능한 결합으로, 제36항 또는 제37항에 따른 핵산 단편의 발현을 추진하기 위한 프로모터, 필요에 따라, 폴리펩타이드 단편의 막 내로 분비 또는 통합될 수 있는 선도 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 제36항 또는 제37항에 따른 핵산 단편 및, 필요에 따라 종결자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 따른 벡터를 지니는 형질전환된 숙주 세포.
  44. 제41항 또는 제42항에 따른 벡터를 지니며 제36항 또는 제37항에 따른 핵산 단편을 발현하고, 필요에 따라 제34항 또는 제35항에 따른 HER-2 단백질의 면역원성 변이체를 그의 표면에 분비 또는 지니는 안정한 세포주.
  45. 제34항 또는 제35항에 따른 HER-2 단백질의 면역원성 변이체를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 및 임의의 애쥬번트와 혼합하여 포함하는, 사람에 있어서 HER-2 단백질에 대한 면역화를 위한 면역원성 조성물.
  46. 제41항 또는 제42항에 따른 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 및 임의의 애쥬번트와 혼합하여 포함하는, 사람에 있어서 HER-2 단백질에 대한 면 역화를 위한 면역원성 조성물.
  47. - 제34항 또는 제35항에 따른 HER-2 단백질의 면역원성 변이체, 또는
    - 제45항에 따른 면역원성 조성물, 또는
    - 제41항 또는 제42항에 따른 벡터, 또는
    - 제46항에 따른 면역원성 조성물
    의 면역원적 유효량을 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 자가(autologous) HER-2에 대하여 사람을 면역화시키는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 자가 HER-2 단백질에 대한 면역화를 암의 치료 또는 경감을 위해 사용하는 방법.
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