CN115894707A - 一种基因重组水痘-带状疱疹病毒融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基因重组水痘-带状疱疹病毒融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明利用基因重组技术，将由VZVgE蛋白截短获得的多肽片段gE1，和多肽片段gE2串联重组，并添加了人工信号肽，构建了目的融合基因，插入pcDNA3.1(+)表达载体，转化大肠杆菌DH5α，进行重组表达质粒的验证。然后将鉴定正确的重组表达质粒转染CHO细胞进行目的融合基因的表达，再经纯化得到了基因重组VZV融合蛋白gE1‑gE2，其纯度可达95％以上。与单纯的VZVgE蛋白相比，基因重组VZV融合蛋白能够诱导较之更强的细胞免疫反应。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其是基因工程疫苗领域，特别是涉及一种由VZV gE蛋白截短获得的多肽片段gE1，和多肽片段gE2串联重组构建而得的融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)属疱疹病毒α亚科，为双链DNA病毒，约为125000bp，编码约70个开放阅读框。病毒核衣壳直径约80～120nm，呈二十面体，周围包绕一层内膜及一层部分来自细胞膜的包膜。VZV原发感染引起水痘，患儿的全身症状和皮疹消退以后有少量残存的病毒会终身潜伏于宿主的脊髓后根神经节、颅神经节和肠道神经节的神经细胞中。日后当机体免疫力降低时，潜伏在神经细胞中的病毒会被再激活，导致疼痛性的皮肤疾病——带状疱疹(herpes zoster，HZ)。
对于水痘和带状疱疹，主要是对症处理，目前仍无特效治疗方法，抗病毒药物，如阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦等，虽有助于水痘及带状疱疹患者迅速康复，但不能终止病毒排出，无法预防隐性感染。而暴露VZV后给予过量的免疫球蛋白，对于中止或减轻疾病负担也是有限的，因此，疫苗在控制水痘感染方面发挥着重要作用，接种疫苗是最有效和最可靠的预防和控制水痘的手段。
水痘疫苗最早由日本的高桥(Takahashi M)研究组于1974年研发成功，称为Oka疫苗(vOka)。水痘减毒活疫苗是目前唯一获准用于预防水痘的疫苗，但其还存在着一定的导致潜伏感染的风险。相比于减毒活疫苗，灭活疫苗虽然相对安全，但接种量更大，一般接种2-3剂后才能产生较好的保护效果。
VZV糖蛋白E(glycoprotein E，gE)亚单位疫苗是目前的水痘疫苗的主流研究方向，gE由病毒的ORF68基因编码，1872个碱基组成的该基因位于VZV基因组短片段区。gE存在于病毒颗粒的表面和受感染细胞的表面和胞质内，是生成感染性病毒颗粒的必需糖蛋白，是病毒囊膜和宿主细胞膜上含量最丰富的包膜糖蛋白。在处于恢复期的水痘和带状疱疹患者血清中，VZV抗体主要针对gE、gB和gH，尤其是以gE为主要靶点诱导的细胞免疫和体液免疫，能保护动物免受病毒攻击，因此gE也是细胞免疫和体液免疫应答的重要靶点。已有相当多的针对VZV gE蛋白的研究：野生型或全长gE蛋白一般为623个氨基酸。由包含信号肽的gE蛋白主要部分、疏水锚区域(残基546-558)和C-端尾巴组成。不同研究对gE蛋白的蛋白分子结构区分略有不同，有的研究者将蛋白分子分为亲水胞外区(包含信号肽)、疏水跨膜区(残基545-561)和胞内尾部(例如可参考Grose C.Glycoproteins encoded by varicella-zoster virus:biosynthesis,phosphorylation and intracellular trafficking.AnnuRevMicrobil.1990,44:59-80)，但上述不同的区分方式对gE蛋白的应用及制备不产生实质的区别。典型的药物组合物中的蛋白质将不同于全长蛋白，而是截短型蛋白。如在利用现代生物分子学技术制备重组VZV gE蛋白时，一般将截短gE蛋白，使其缺少羧基端疏水锚区。目前，有很多文献和专利报道了VZV糖蛋白E的改造及表达，如截短型gE aa1-511(Vafai etal.1993,1994,1995)；截短型gE aa1-546(Haumont et al.1996,Jacquet etal.2002；GlaxoSmithKline EP0405867B1 1990,WO0043527A12000)；截短型gE aa1-539(CN102517302 2011)；包含gE aa37-161的融合蛋白的表达(CN105906721 2016)等等。
已有部分文献报道利用基因重组技术表达gE亚单位疫苗，但多数均在研发中，其有效性和安全性均有待进一步确定。也有部分学者一直在致力于研究融合蛋白表达gE蛋白，但还未取得实质性进展。因此，设计研究一款可以稳定高质量表达，且既可增强体液免疫反应、又可增强细胞免疫反应的融合蛋白，并将其应用到VZV疫苗或治疗药物的研发是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是以VZV糖蛋白E截短的两段多肽片段的融合基因为基础，提供一种基因重组VZV融合蛋白及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提供一种基因重组水痘-带状疱疹病毒融合蛋白，所述融合蛋白是由VZV gE截短得到的多肽片段gE1和多肽片段gE2串联重组构建而得。
本发明所述的融合蛋白，当gE1在融合蛋白的N端时，gE2在融合蛋白的C端；当gE1在融合蛋白的C端时，gE2在融合蛋白的N端。
在某些实施方式中，gE1在融合蛋白的N端，gE2在融合蛋白的C端。
本发明中所述的水痘-带状疱疹病毒gE蛋白具体的氨基酸序列是GenBank登录号为AAK19946.1的水痘-带状疱疹病毒Oka株糖蛋白E的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)：
MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRYAAWTGGLAAVVLLCLVIFLICTAKRMRVKAYRVDKSPYNQSMYYAGLPVDDFEDSESTDTEEEFGNAIGGSHGGSSYTVYIDKTR。
本发明所述的多肽片段gE1是除去了gE蛋白的信号肽(aa1-30)和羧基末端疏水锚定区(aa547-623)后得到的gE蛋白的第31-546位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明中所述gE1包含但不限于根据现有技术EP0405867B公开的内容(合适的VZVgE抗原是被截短以除去羧基端锚区域(547位氨基酸开始)的VZV糖蛋白gE)，以及在真核细胞中表达蛋白一般获得的蛋白序列将缺少前导序列(也称为信号肽，1-30位氨基酸)而获得。
本发明所述的多肽片段gE2至少包含gE蛋白的第31-101位氨基酸，至多包含gE蛋白的第31-194位氨基酸。
本发明所述的多肽片段gE2选自VZV gE蛋白的第31-101位氨基酸、第31-119位氨基酸、第31-140位氨基酸、第31-161位氨基酸、第31-181位氨基酸或第31-194位氨基酸中的一种，序列如SEQ ID NO：3-8所示。
在某些实施方式中，基因重组VZV融合蛋白是由：(1)gE1和(2)gE2串联重组构建而得。其氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。所述gE2为gE蛋白的第31-101位氨基酸。
在某些实施方式中，基因重组VZV融合蛋白是由：(1)gE1和(2)gE2串联重组构建而得。其氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。所述gE2为gE蛋白的第31-119位氨基酸。
在某些实施方式中，基因重组VZV融合蛋白是由：(1)gE1和(2)gE2串联重组构建而得。其氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。所述gE2为gE蛋白的第31-140位氨基酸。
在某些实施方式中，基因重组VZV融合蛋白是由：(1)gE1和(2)gE2串联重组构建而得。其氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。所述gE2为gE蛋白的第31-161位氨基酸。
在某些实施方式中，基因重组VZV融合蛋白是由：(1)gE1和(2)gE2串联重组构建而得。其氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。所述gE2为gE蛋白的第31-181位氨基酸。
在某些实施方式中，基因重组VZV融合蛋白是由：(1)gE1和(2)gE2串联重组构建而得。其氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。所述gE2为gE蛋白的第31-194位氨基酸。
本发明的第二个目的是提供一种基因重组VZV融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
S1、人工合成上述融合蛋白的基因序列，并将融合蛋白的基因连接入表达载体中，构建成重组表达质粒。
S2、将构建的重组表达质粒转化宿主菌，通过双酶切鉴定和DNA测序，选取鉴定正确的重组质粒。
S3、利用鉴定的重组质粒转染宿主细胞(优选为中国仓鼠卵巢细胞(CHO))，并表达基因重组VZV融合蛋白，对其进行纯化。
融合蛋白基因序列委托药明生物合成。
重组表达质粒的构建具体为：
添加信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示)，添加8×His标签。载体选择pcDNA3.1(+)，按照宿主CHO细胞进行密码子优化。将人工合成的融合蛋白的基因重组到目的载体pcDNA3.1(+)中，得到pcDNA3.1(+)-gE1-gE2-8×His重组表达质粒。
优选地，S2具体为：
将S1获得的重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落，菌液PCR扩增融合蛋白gE1-gE2基因片段。提取阳性单菌落质粒，进行双酶切鉴定并将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析。
优选地，S3具体为：
转染前一天，以适当的浓度将CHO细胞(来自Thermo公司的EXPICHO)接种于不含血清的细胞表达培养基OptiPROTM SFM中，震荡悬浮培养(37℃，8％CO2)。使用OptiPROTM SFM培养基制备转染试剂和pcDNA3.1(+)-gE1-gE2-8×His重组表达质粒复合物，转染重组质粒，其中转染剂为ExpiFectamine CHO试剂。转染8天后收集细胞上清，检测蛋白表达水平，进行后续的纯化。融合蛋白采用固定化金属离子亲和层析(IMAC)和尺寸排阻层析(SEC)-HPLC相结合的方法进行纯化，得到纯化后的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2。
以上实验步骤的具体操作均可参照现有技术进行，在此不做赘述。
本发明的第三个目的是提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括上述融合蛋白中的至少两种。
在某些实施方式中，本发明所述的免疫原性组合物包含融合蛋白gE1-gE2(aa31-101)和选自gE1-gE2(aa31-119)、gE1-gE2(aa31-140)、gE1-gE2(aa31-161)、gE1-gE2(aa31-181)以及gE1-gE2(aa31-194)中的一种或几种。
在某些实施方式中，本发明所述的免疫原性组合物包含融合蛋白gE1-gE2(aa31-119)和选自gE1-gE2(aa31-101)、gE1-gE2(aa31-140)、gE1-gE2(aa31-161)、gE1-gE2(aa31-181)以及gE1-gE2(aa31-194)中的一种或几种。
在某些实施方式中，本发明所述的免疫原性组合物包含融合蛋白gE1-gE2(aa31-140)和选自gE1-gE2(aa31-101)、gE1-gE2(aa31-119)、gE1-gE2(aa31-161)、gE1-gE2(aa31-181)以及gE1-gE2(aa31-194)中的一种或几种。
在某些实施方式中，本发明所述的免疫原性组合物包含融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)和选自gE1-gE2(aa31-101)、gE1-gE2(aa31-119)、gE1-gE2(aa31-140)、gE1-gE2(aa31-181)以及gE1-gE2(aa31-194)中的一种或几种。
在某些实施方式中，本发明所述的免疫原性组合物包含融合蛋白gE1-gE2(aa31-181)和选自gE1-gE2(aa31-101)、gE1-gE2(aa31-119)、gE1-gE2(aa31-140)、gE1-gE2(aa31-161)以及gE1-gE2(aa31-194)中的一种或几种。
在某些实施方式中，本发明所述的免疫原性组合物包含融合蛋白gE1-gE2(aa31-194)和选自gE1-gE2(aa31-101)、gE1-gE2(aa31-119)、gE1-gE2(aa31-140)、gE1-gE2(aa31-161)以及gE1-gE2(aa31-181)中的一种或几种。
本发明的第四个目的是提供一种由上述融合蛋白或免疫原性组合物制备而得的基因重组VZV疫苗。
本发明所述的基因重组VZV疫苗包括上述的融合蛋白，或免疫原性组合物，以及任选地可药用佐剂。
本发明所述的可药用佐剂为铝盐类佐剂、弗氏完全佐剂、蜂胶佐剂、油水乳剂、细胞因子、CpG、DNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物或脂质体中的至少一种。
在某些实施方式中，所述脂质体佐剂为AS01B。
AS01B佐剂的配方为：每剂量(0.5mL)包含MPL 50μg，QS-21 50μg，NaCl 4.385mg，DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，KH2PO4 0.54mg，Na2HPO4(无水)0.15mg，以及注射用水。
在某些实施方式中，所述佐剂为包括BFA-R837/PolyI:C、QS-21/PolyI:C和BFA-MPL/PolyI:C中任一项的脂质体制剂。
本发明的有益效果在于：
本发明利用基因重组技术，将去除了信号肽和C端疏水锚定区而获得的VZV gE蛋白的第31-546位氨基酸(即多肽片段gE1)与VZV gE蛋白的第31-161位氨基酸或第31-140位氨基酸等(即多肽片段gE2)串联重组，并添加了人工信号肽和8×His标签，构建了目的融合基因，插入pcDNA3.1(+)表达载体，转化大肠杆菌DH5α，进行重组表达质粒的验证。然后将鉴定正确的重组表达质粒转染CHO细胞进行目的融合基因的表达，再经纯化得到了重组VZV融合蛋白，其纯度可达95％以上。与单纯的VZV gE蛋白相比，重组VZV融合蛋白，尤其是重组VZV融合蛋白结合AS01B佐剂制备的重组VZV疫苗能够诱导较之更强的体液免疫反应，和细胞免疫反应。
本发明现时研究不同佐剂与重组抗原的组合接种效果，复合佐剂均表现出明显优于单独的MPL、PolyI:C或CpG佐剂的佐剂活性，激发的细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平普遍更高，相比较而言，以BFA-MPL/Poly I:C复合佐剂和抗原配伍后促进产生的抗原特异性细胞因子IFN-γ和IL-2的水平最高。
附图说明
图1为纯化后的融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)和gE1-gE2(aa31-140)的SDS-PAGE检测结果
发明详述
为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本文中所使用的术语“融合蛋白”通常是指通过基因工程技术得到的具有生物学功能活性的蛋白分子。在本文中，所述的融合蛋白是由水痘-带状疱疹病毒Oka株的gE蛋白除去了信号肽(aa1-30)和羧基末端疏水锚定区(aa547-623)而得到的多肽片段gE1，和gE蛋白的至少第31-101位氨基酸，至多第31-194位氨基酸，即多肽片段gE2串联重组构建而得的融合蛋白。在一些实施方式中，多肽片段gE2为gE蛋白的第31-101位氨基酸，重组获得的融合蛋白为gE1-gE2(aa31-101)。在一些实施方式中，多肽片段gE2为gE蛋白的第31-119位氨基酸，重组获得的融合蛋白为gE1-gE2(aa31-119)。在一些实施方式中，多肽片段gE2为gE蛋白的第31-140位氨基酸，重组获得的融合蛋白为gE1-gE2(aa31-140)。在一些实施方式中，多肽片段gE2为gE蛋白的第31-161位氨基酸，重组获得的融合蛋白为gE1-gE2(aa31-161)。在一些实施方式中，多肽片段gE2为gE蛋白的第31-181位氨基酸，重组获得的融合蛋白为gE1-gE2(aa31-181)。在另一些实施方式中，多肽片段gE2为gE蛋白的第31-194位氨基酸，重组获得的融合蛋白为gE1-gE2(aa31-194)。
在本文中所使用的术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明的解释说明，而不能理解为对本发明的限制。此外，实施例中无论是否有His标签或N端信号肽，不影响保护范围，熟悉本领域的技术人员根据本申请发明的内容对实施例进行非本质的改进和调整，仍属于本申请发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员可理解的常规实验方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1合成融合基因gE1-gE2(aa31-161)
委托药明生物，按照本发明所述SEQ ID NO：24的序列对融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)的基因序列进行人工合成。
实施例2构建pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-161)-8×His重组表达质粒
添加信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示)，添加8×His标签。载体选择pcDNA3.1(+)，按照宿主CHO细胞进行密码子优化。将合成的融合蛋白的基因序列重组到目的载体pcDNA3.1(+)中，得到pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-161)-8×His重组表达质粒，反应体系如表1所示。
表1处理好的目的片段与载体连接反应体系
| 名称 | 体积 |
| 酶切后载体 | 5μL |
| 纯化的PCR产物 | 5μL |
| 无缝组装MIX | 10μL |
| 总体积 | 20μL |
以上连接液在52℃恒温环境下连接30min，得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-161)-8×His。
实施例3重组质粒pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-161)-8×His的筛选与鉴定
重组表达质粒的转化：
(1)将浓度为100ng/μL的重组表达质粒吸取1-3μL加入到100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置20-30分钟。(2)42℃水浴90s不要摇动。(3)迅速冰浴中放置3分钟左右。(4)每管中加入500-800μL 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm温和振荡培养约40分钟。
重组表达质粒的验证：
(1)制备含氨苄青霉素的LB平板。(2)取100μL菌液，然后平铺在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，用无菌玻璃涂布器将细菌轻轻地涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250rpm摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序。
克隆质粒的鉴定方法：
PCR扩增gE1-gE2(aa31-161)片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3μL，ddH2O 14μL。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液PCR方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得的两个片段，与预期片段大小相符。
重组表达质粒抽提：
接1％含pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-161)-8×His重组表达质粒的大肠杆菌DH5α感受态细胞于2mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100μg质粒。并测序验证目的基因，测序结果与设计的基因组序列一致。
实施例4细胞转染及gE1-gE2(aa31-161)蛋白纯化
细胞转染：
CHO细胞在不含血清的细胞表达培养基中，于锥形瓶内，37℃，8％CO2震荡培养并扩增CHO细胞。转染前测定活细胞密度和存活率，细胞密度应达7×106～10×106个/mL，存活率95～99％时按照ExpiFectamineTM CHO转染试剂盒进行转染操作。将新鲜的细胞表达培养基预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/mL，50mm振幅培养箱90rpm进行震荡培养，37℃，8％CO2。使用OptiPROTM SFM培养基制备转染试剂和pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-161)-8×His重组表达质粒复合物(4℃)，即1mL CHO细胞准备40μL OptiPROTM SFM添加0.8μg重组表达质粒，混匀放置5min。另准备40μL OptiPROTM SFM添加3μL ExpiFectamineTM CHO试剂，混匀放置5min，室温下再放置1～5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶中摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行震荡培养，37℃，8％CO2。转染后18-22小时，添加Enhancer和ExpiCHO Feed，按照试剂盒说明书执行。例：1mL细胞添加6μLEnhancer和0.24mL ExpiCHO Feed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行培养，37℃，8％CO2。转染后8天收集，进行后续纯化重组的融合蛋白。
蛋白纯化：
采用装载NiSO4的Hi Trap 5ml Chelating HP层析柱(美国GE公司)。鳌合层析介质预处理后装柱，分别用50mmol/L EDTA、0.2mol/L NaOH、超纯水洗柱。5倍以上的裂解缓冲液平衡后，细胞裂解上清直接上柱，以溶液A(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/L NaCl)与溶液B(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/L NaCl，0.25mol/L咪唑)为流动相进行洗脱。收集目标组分，继续进行SEC分离。采用HiLoad 26/60 Superdex-200 pre-grade凝胶柱(美国GE公司)。以溶液C(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/L NaCl)为流动相洗脱1个柱体积(约320mL)，洗脱速率为2.5mL/min。收集目标蛋白组分，用SDS-PAGE检测纯度。得到gE1-gE2(aa31-161)纯化蛋白，SDS-PAGE分析蛋白，如附图1所示，经纯化后的目的蛋白纯度可达95.6％。
实施例5合成融合基因gE1-gE2(aa31-140)
委托药明生物，按照本发明所述SEQ ID NO：23的序列对融合蛋白gE1-gE2(aa31-140)的基因序列进行人工合成。
实施例6构建pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-140)-8×His重组表达质粒
添加信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示)，添加8×His标签。载体选择pcDNA3.1(+)，按照宿主CHO细胞进行密码子优化。将合成的融合蛋白的基因序列重组到目的载体pcDNA3.1(+)中，得到pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-140)-8×His重组表达质粒，反应体系同表1所示。环境下连接30min，得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-140)-8×His。
实施例7重组质粒pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-140)-8×His的筛选与鉴定
重组表达质粒的转化：
(1)将浓度为100ng/μL的重组表达质粒吸取1-3μL加入到100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置20-30分钟。(2)42℃水浴90s不要摇动。(3)迅速冰浴中放置3分钟左右。(4)每管中加入500-800μL 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm温和振荡培养约40分钟。
重组表达质粒的验证：
(1)制备含氨苄青霉素的LB平板。(2)取100μL菌液，然后平铺在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，用无菌玻璃涂布器将细菌轻轻地涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250rpm摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序。
克隆质粒的鉴定方法：
PCR扩增gE1-gE2(aa31-140)片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3μL，ddH2O 14μL。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液PCR方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得的两个片段，与预期片段大小相符。
重组表达质粒抽提：
接1％含pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-140)-8×His重组表达质粒的大肠杆菌DH5α感受态细胞于2mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100μg质粒。并测序验证目的基因，测序结果与设计的基因组序列一致。
实施例8细胞转染及gE1-gE2(aa31-140)蛋白纯化
细胞转染：
CHO细胞在不含血清的细胞表达培养基中，于锥形瓶内，37℃，8％CO2震荡培养并扩增CHO细胞。转染前测定活细胞密度和存活率，细胞密度应达7×106～10×106个/mL，存活率95～99％时按照ExpiFectamineTM CHO转染试剂盒进行转染操作。将新鲜的细胞表达培养基预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/mL，50mm振幅培养箱90rpm进行震荡培养，37℃，8％CO2。使用OptiPROTM SFM培养基制备转染试剂和pcDNA3.1(+)-gE1-gE2(aa31-140)-8×His重组表达质粒复合物(4℃)，即1mL CHO细胞准备40μL OptiPROTM SFM添加0.8μg重组表达质粒，混匀放置5min。另准备40μL OptiPROTM SFM添加3μL ExpiFectamineTM CHO试剂，混匀放置5min，室温下再放置1～5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶中摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行震荡培养，37℃，8％CO2。转染后18-22小时，添加Enhancer和ExpiCHO Feed，按照试剂盒说明书执行。例：1mL细胞添加6μLEnhancer和0.24mL ExpiCHO Feed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行培养，37℃，8％CO2。转染后8天收集，进行后续纯化重组的融合蛋白。
蛋白纯化：
采用装载NiSO4的Hi Trap 5ml Chelating HP层析柱(美国GE公司)。鳌合层析介质预处理后装柱，分别用50mmol/L EDTA、0.2mol/L NaOH、超纯水洗柱。5倍以上的裂解缓冲液平衡后，细胞裂解上清直接上柱，以溶液A(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/L NaCl)与溶液B(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/L NaCl，0.25mol/L咪唑)为流动相进行洗脱。收集目标组分，继续进行SEC分离。采用HiLoad 26/60 Superdex-200 pre-grade凝胶柱(美国GE公司)。以溶液C(20mmol/L PB，pH7.4，0.15mol/L NaCl)为流动相洗脱1个柱体积(约320mL)，洗脱速率为2.5mL/min。收集目标蛋白组分，用SDS-PAGE检测纯度。得到gE1-gE2(aa31-140)纯化蛋白，SDS-PAGE分析蛋白，如附图1所示，经纯化后的目的蛋白纯度可达96.4％。
实施例9构建载体和蛋白表达
参照上述实施例，构建如下需要表达的目的融合基因，并表达纯化蛋白，如表2所示。
表2不同的目的融合基因
实施例10免疫原性组分的制备
50μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-101)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例11免疫原性组分的制备
50μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-119)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例12免疫原性组分的制备
50μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-140)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥，每人1剂接种剂量为1瓶。
实施例13免疫原性组分的制备
50μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥，每人1剂接种剂量为1瓶。
实施例14免疫原性组分的制备
50μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-181)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例15免疫原性组分的制备
50μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-194)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例16免疫原性组分的制备
50μg的VZV gE蛋白，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥，每人1剂接种剂量为1瓶。
实施例17免疫原性组合物的制备
25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)，25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-194)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例18免疫原性组合物的制备
25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)，25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-140)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例19免疫原性组合物的制备
25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-101)，25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例20免疫原性组合物的制备
25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-161)，25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-119)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例21免疫原性组合物的制备
25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-119)，25μg的基因重组VZV融合蛋白gE1-gE2(aa31-181)，20mg的蔗糖，0.160mg的二水合磷酸二氢钠，0.116mg的磷酸二钾，0.08mg的聚山梨酯80，分装到2mL管制瓶中，每瓶0.5mL，置冻干机冷冻干燥。
实施例22疫苗的制备
实施例10-16任一项所述的免疫原性组分和实施例17-21任一项所述的免疫原性组合物，进一步包含AS01B佐剂。佐剂瓶为0.5mL，每人1剂接种剂量为1瓶，包含50μg的MPL，50μg的QS21，4.385mg氯化钠，1mg DOPC，0.54mg磷酸二氢钾，0.25mg胆固醇，0.15mg无水磷酸二钠，加注射用水至0.5mL。于2～8℃冷藏，避光保存。
实施例23小鼠血清特异性IgG抗体检测
以实施例16所述的免疫原性组分gE(1-546aa)、实施例12和实施例13所述的免疫原性组分gE1-gE2(aa31-140)和gE1-gE2(aa31-161)与AS01B佐剂合用的疫苗免疫，进行血清特异性IgG抗体的检测。
本研究采用C57BL/6小鼠，分为各不同抗原组，每组6只小鼠，首先接种灭活水痘疫苗2000pfu(购自上海荣盛生物药业有限公司)，然后分别在第35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10人用剂量)，于重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)分离血清，采用ELISA法进行gE蛋白特异性IgG抗体检测。
结果如表3所示，以基因重组VZV gE1-gE2疫苗免疫的小鼠可以产生更高滴度的特异性IgG抗体，且基因重组VZV gE1-gE2(aa31-161)疫苗比基因重组VZV gE1-gE2(aa31-140)疫苗更具有优势。
表3特异性IgG抗体检测结果
| 抗原名称 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 |
| gE140 | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| gE161 | 80000 | 40000 | 250 | 250 | 320000 | 250 |
| gE | 2560000 | 1280000 | 1280000 | 1280000 | 2560000 | 1280000 |
| gE1-gE2(aa31-140) | 640000 | 640000 | 1280000 | 640000 | 1280000 | 1280000 |
| gE1-gE2(aa31-161) | 2560000 | 1280000 | 1280000 | 2560000 | 2560000 | 2560000 |
实施例24细胞免疫检测
以实施例16所述的免疫原性组分gE(1-546aa)、实施例12和实施例13所述的免疫原性组分gE1-gE2(aa31-140)和gE1-gE2(aa31-161)与AS01B佐剂制备的疫苗免疫小鼠，进行细胞免疫的检测。本研究采用C57BL/6小鼠，分为各不同抗原组，阴性对照为生理盐水组，每组6只小鼠，首先接种行灭活水痘疫苗2000pfu(购自上海荣盛生物药业有限公司)，然后分别在第35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10人用剂量)，并于第63天评价不同佐剂的体液免疫及细胞免疫效果。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)，取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞，以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物，通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。因CD8+T细胞结果无显著差异，最终呈现的为分泌不同细胞因子细胞占CD4+T细胞的百分比。
表4小鼠细胞免疫检测结果
| 抗原 | IL-2+ | IL-2+IFN-γ+ | IFN-γ+ | 合计 |
| 生理盐水 | 0.062 | — | 0.05706 | 0.12 |
| gE161/5μg | 0.43 | 1 | 0.6262 | 2.06 |
| gE140/5μg | 0.5 | 1.3 | 0.736 | 2.54 |
| gE/5μg | 0.93 | 1.4 | 0.452 | 2.78 |
| gE1-gE2(aa31-161)/5μg | 0.62 | 1.5 | 0.7716 | 2.89 |
| gE1-gE2(aa31-140)/5μg | 0.77 | 1.9 | 0.9142 | 3.58 |
结果表明，基因重组VZV gE1-gE2疫苗与单纯的VZV gE蛋白疫苗相比，能诱导更强的细胞免疫力。这些结果表明，接种以本发明所述的基因重组VZV疫苗可能形成较强的Th1型细胞免疫记忆。
实施例25佐剂效果评价
以实施例16所述的免疫原性组分gE(1-546aa)、实施例12和实施例13所述的免疫原性组分gE1-gE2(aa31-140)和gE1-gE2(aa31-161)为免疫原，发明人以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究，考察不同佐剂联合抗原的免疫原性。以MPL/Poly I:C复合佐剂、QS-21/PolyI:C复合佐剂、R837/Poly I:C复合佐剂及单独的MPL、PolyI:C和CpG佐剂为对照组，通过研究上述组合物的免疫原性，从而评价佐剂的效果。
将VZV gE抗原以5μg的量与0.5ml/剂的佐剂进行充分混合。各佐剂采用脂质体制剂形式，制剂配方中CpG制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，CpG 1mg，Na2HPO40.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。PolyI:C制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，Poly I:C 1mg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。MPL制剂(0.5ml/剂)：DOPC1mg，胆固醇0.25mg，MPL 50μg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
BFA-MPL/Poly I:C复合佐剂的制备：将4g DOPC、1g胆固醇和200mg MPL溶于20mL异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。在脂质薄膜中加入50mL磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。Poly I:C加一定体积生理盐水溶解，为Poly I:C溶液。特定浓度的浓缩脂质体，加磷酸盐水溶液(10mM PB，包含150mM NaCl)稀释混匀至一定浓度，加Poly I:C溶液，混匀，至各组分含量浓度为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL 0.1mg/ml，Poly I:C 2mg/ml，即为最终获得的BFA-MPL/Poly I:C复合佐剂。
BFA-R837/Poly I:C复合佐剂的制备：称取200mg DOPC和50mg胆固醇，溶解于5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)。15mg R837溶解于7.5ml DMSO中，获得R837母液。1ml溶解有DOPC和胆固醇的有机相，加1ml R837母液，加0.5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)，混合后为醇相，磷酸盐水溶液(10mM PB，含150mM NaCl)为水相，水醇比3:1制备样品，去除有机溶剂，以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，检测过滤后的样品粒径为65.01nm，PDI为0.171。Poly I:C加一定体积生理盐水溶解，为Poly I:C溶液。取500μl过滤后的样品，加Poly I:C溶液，加磷酸盐水溶液(10mM PB，150mM NaCl)，混匀，至各组分含量为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，R837 0.1mg/ml，Poly I:C 2mg/ml，即为最终获得的BFA-R837/Poly I:C复合佐剂。
QS-21/PolyI:C复合佐剂的制备：将4g DOPC和1g胆固醇溶于20mL异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。在脂质薄膜中加入50mL磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。QS-21和Poly I:C加一定体积生理盐水溶解，为混合水溶液。特定浓度的浓缩脂质体，加磷酸盐水溶液(10mM PB，包含150mM NaCl)稀释混匀至一定浓度，再加入混合水溶液，混匀，至各组分含量浓度为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，QS-21 0.1mg/ml，Poly I:C 2mg/ml，即为最终获得的QS-21/Poly I:C复合佐剂。
对C57BL/6小鼠接种灭活水痘疫苗2000pfu(购自上海荣盛生物药业有限公司)，之后分别于接种后第35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)，并于第63天评价不同佐剂的细胞免疫效果。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)，取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞，以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物，通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。因CD8+T细胞结果无显著差异，最终呈现的为分泌不同细胞因子细胞占CD4+T细胞的百分比，小鼠免疫检测结果如表5所示。
表5不同佐剂/抗原细胞免疫检测结果
结果显示复合佐剂基本上均表现出明显优于单独的MPL、PolyI:C或CpG佐剂的佐剂活性，激发的细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平普遍更高，相比较而言，以BFA-MPL/Poly I:C复合佐剂和抗原配伍后促进产生的抗原特异性细胞因子IFN-γ和IL-2的水平最高。
以上实施例仅对本发明具有示例性作用，并非对本发明的保护范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基因重组VZV融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含由VZV gE蛋白截短获得的多肽片段gE1和多肽片段gE2，所述多肽片段gE1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述多肽片段gE2至少包含gE蛋白的第31-101位氨基酸，至多包含gE蛋白的第31-194位氨基酸。
2.如权利要求1所述的基因重组VZV融合蛋白，其特征在于，所述多肽片段gE2选自gE蛋白的第31-101位氨基酸、第31-119位氨基酸、第31-140位氨基酸、第31-161位氨基酸、第31-181位氨基酸或第31-194位氨基酸中的一种，序列依次如SEQ ID NO：3-8所示。
3.如权利要求1或2所述的基因重组VZV融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：15-20中任一所示。
4.一种权利要求1-3所述的基因重组VZV融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、人工合成权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的基因序列，并将融合蛋白的基因连接入表达载体中，构建成重组表达质粒；
S2、将构建的重组表达质粒转化宿主菌，通过双酶切鉴定和DNA测序，选取鉴定正确的重组质粒；
S3、利用鉴定的重组质粒转染宿主细胞，并表达基因重组VZV融合蛋白，对其进行纯化。
5.如权利要求4所述的基因重组VZV融合蛋白的制备方法，其特征在于，S1所述的表达载体为pcDNA3.1(+)。
6.如权利要求4所述的基因重组VZV融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
7.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物包括权利要求1-3任一项所述的融合蛋白。
8.一种基因重组VZV疫苗，其特征在于，所述基因重组VZV疫苗包括权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，或权利要求7所述的免疫原性组合物，以及任选的可药用佐剂。
9.如权利要求8所述的基因重组VZV疫苗，其特征在于，所述佐剂为铝盐类佐剂、弗氏完全佐剂、蜂胶佐剂、油水乳剂、细胞因子、CpG、DNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物或脂质体中的至少一种，优选地，所述脂质体佐剂为AS01B。
10.如权利要求8所述的基因重组VZV疫苗，其特征在于，所述佐剂为选自BFA-R837/PolyI:C、QS-21/PolyI:C和BFA-MPL/PolyI:C中任一项的脂质体制剂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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