CN116983403A - 一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 - Google Patents
一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116983403A CN116983403A CN202311254938.1A CN202311254938A CN116983403A CN 116983403 A CN116983403 A CN 116983403A CN 202311254938 A CN202311254938 A CN 202311254938A CN 116983403 A CN116983403 A CN 116983403A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vzv
- seq
- protein
- npm
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 title claims description 291
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 36
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 145
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 130
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 128
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 113
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 105
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 91
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 claims abstract description 83
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 61
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims abstract description 46
- 229940124742 varicella zoster vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 79
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 53
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 51
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 claims description 46
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 41
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 claims description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 36
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 claims description 28
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 28
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 28
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 28
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 28
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 22
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 21
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 claims description 18
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 claims description 18
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 12
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 claims description 12
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical group O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 9
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 9
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 9
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims description 4
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 11
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 56
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 7
- 101900123149 Varicella-zoster virus Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 68
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 51
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 46
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 46
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 44
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 19
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 19
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 15
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 10
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 7
- 238000011192 particle characterization Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 4
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- -1 VZV gE-4T Chemical compound 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- 239000005740 Boscalid Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 229940124925 Zostavax Drugs 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WYEMLYFITZORAB-UHFFFAOYSA-N boscalid Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1=CC=CC=C1NC(=O)C1=CC=CN=C1Cl WYEMLYFITZORAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940118790 boscalid Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 2
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- PIGTXFOGKFOFTO-FVFWYJKVSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[[(3S,4S,4aR,6aR,6bS,8R,8aR,12aS,14aR,14bR)-8a-carboxy-4-formyl-8-hydroxy-4,6a,6b,11,11,14b-hexamethyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O([C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)C[C@@H](O)[C@]1(CCC(C[C@H]14)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PIGTXFOGKFOFTO-FVFWYJKVSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFGKGUXTPFWHIX-UHFFFAOYSA-N 6-[2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]acetyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 DFGKGUXTPFWHIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- WSIDPNAQWCYKLR-UHFFFAOYSA-H C(=O)[O-].[U+6].C(=O)[O-].C(=O)[O-].C(=O)[O-].C(=O)[O-].C(=O)[O-] Chemical compound C(=O)[O-].[U+6].C(=O)[O-].C(=O)[O-].C(=O)[O-].C(=O)[O-].C(=O)[O-] WSIDPNAQWCYKLR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101800000592 Capsid protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 206010048768 Dermatosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 238000006124 Pilkington process Methods 0.000 description 1
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 241000241413 Propolis Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000212749 Zesius chrysomallus Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229920005549 butyl rubber Polymers 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000017941 granulin Human genes 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- YIEDSISPYKQADU-UHFFFAOYSA-N n-acetyl-n-[2-methyl-4-[(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl]acetamide Chemical compound C1=C(C)C(N(C(C)=O)C(=O)C)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1C YIEDSISPYKQADU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940069949 propolis Drugs 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N squalene group Chemical group CC(C)=CCC\C(\C)=C\CC\C(\C)=C\CC\C=C(/C)\CC\C=C(/C)\CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 239000002349 well water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种水痘‑带状疱疹疫苗,具体而言,该疫苗包含免疫组合物,所述免疫组合物包含抗原组分和颗粒蛋白组分。颗粒蛋白组分包含纳米颗粒蛋白,抗原组分与所述颗粒蛋白组分之间通过结合肽1与结合肽2共价结合,形成免疫原性复合物。该疫苗的T细胞免疫原性和抗体免疫原性表现优异。本发明还公开了所述水痘‑带状疱疹疫苗的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别涉及预防或治疗水痘-带状疱疹病毒(VZV)相关疾病的免疫组合物产品及其生产制备方法。
背景技术
带状疱疹是由水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus, VZV)初次感染人体导致水痘后潜伏在脊髓后角神经元中,受刺激再活化引起的一种沿神经节段分布的红斑水疱样皮肤病,较常见于高龄、免疫缺陷、使用免疫抑制剂等患者,其症状及遗留的后遗神经痛给患者造成很大困扰。到目前为止,该疾病一直没有有效的治疗药物,接种疫苗成为防治该类疾病的唯一途径。
多数人携带VZV时病毒潜伏在神经元内,在经历不同的潜伏期后,VZV便可释放并感染其他细胞。带状疱疹疫苗的主要保护机制是:通过诱导细胞免疫反应,抑制病毒在神经元内被激活、并通过神经扩散到细胞,体液免疫产生的抗体也有一定的保护作用。
当前全球范围内已问世共有两种带状疱疹疫苗,重组疫苗Shingrix®(GSK)和减毒疫苗Zostavax®(MERCK),两种疫苗均覆盖50岁及以上人群。gE蛋白是VZV表达最丰富的一种糖蛋白,具有较高免疫原性。重组疫苗Shingrix®产品由活性成分、AS01B佐剂系统、其他辅料组成。活性成分为VZV的糖蛋白 E(gE),其系通过DNA重组技术在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中转染蛋白编码序列、表达特异性抗原,经纯化、冻干制成。注射用gE蛋白为无菌白色粉末。AS01B佐剂系统混悬液系含有两种免疫增强成分(3-O-去酰基-4’-单磷酰脂A (MPL)和皂树皂苷QS-21)的脂质体制剂。注射用混悬液(AS01B佐剂系统)为泛乳光的无色到浅褐色液体。年龄增长引起的 CD4+T细胞数量减少及免疫反应下降是激活VZV病毒的关键因素,对特异性T细胞免疫力的增强是带状疱疹疫苗的核心竞争力, Shingrix®(GSK)所含的佐剂AS01B可有效持续促进50岁以上人群体内特异性CD4+T 细胞的发育和分化。相比于Zostavax®(MERCK),Shingrix®(GSK)对带状疱疹和带状疱疹引发的疱疹后神经痛均有更强的防护效果,二者均已被批准应用于多个国家。Shingrix®成为国内首个上市的带状疱疹疫苗,Zostavax®在国内尚未上市。
虽然使用AS01B的Shingrix®带状疱疹疫苗能把Zostavax®疫苗的51%保护力提高到超过90%,但是Shingrix®/AS01B也具有明显的不足,佐剂产能受到限制且佐剂导致的疫苗副作用较大。AS01B佐剂诱导炎症反应的能力很强,接种者在接种后常表现为全身性肌肉关节痛、乏力、发热等症状,鉴于此,很多适龄人群不愿接种该疫苗,疫苗的接种率、依从性都大大降低。因此,研发新的副作用小的疫苗,增加适龄人群的接种率、依从性,具有深远的临床意义。
发明内容
本发明提供了一种水痘-带状疱疹疫苗及其制备方法,所述疫苗为纳米颗粒疫苗,该疫苗可避免采用AS01B佐剂,从而消除或降低由该类佐剂引发的副作用;同时,与疫苗Shingrix®相比,所述纳米颗粒疫苗的T细胞免疫原性和抗体免疫原性均高于Shingrix®,从而可提供比Shingrix®更高的保护效力,在临床上具有深远价值。同时,还解决了目前水痘-带状疱疹疫苗技术和供应种类不足的问题,填补了纳米颗粒类型的水痘-带状疱疹疫苗供应基本空白的现状。
纳米颗粒疫苗:基于纳米颗粒蛋白形成的疫苗,纳米颗粒蛋白主要用于展示抗原。
本发明提供了一种免疫原性复合物,其包括由抗原组分和颗粒蛋白组分通过共价结合反应形成的蛋白。
本发明提供一种免疫组合物,其含有本发明中的免疫原性复合物和药学上可接受的载体,可以是冻干制剂剂型或注射液制剂剂型。
本发明提供一种疫苗,其含有本发明中的免疫组合物和佐剂。
本发明提供了一种免疫原性复合物,其包含:
(1)抗原组分,其包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白或其免疫原性片段;
(2)颗粒蛋白组分,其包含纳米颗粒蛋白。
本发明提供了一种免疫原性复合物,其包含:
(1)抗原组分,其包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白或其免疫原性片段、连接
肽1和结合肽1;
(2)颗粒蛋白组分,其包含纳米颗粒蛋白、连接肽2和结合肽2;
所述抗原组分与所述颗粒蛋白组分之间通过结合肽1与结合肽2共价结合。
本发明提供了一种免疫原性复合物,其包含:
(1)抗原组分,由水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白或其免疫原性片段、连接
肽1和结合肽1组成;
(2)颗粒蛋白组分,由纳米颗粒蛋白、连接肽2和结合肽2组成;
所述抗原组分与所述颗粒蛋白组分之间通过结合肽1与结合肽2共价结合。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述抗原组分由VZV gE蛋白在C端通过连接肽1与结合肽1融合形成。
在一些实施方案中,“免疫原性片段”指的是寡肽、多肽或蛋白质的一部分,其具有免疫原性且当施用于对象后引发保护性免疫应答。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述颗粒蛋白组分由纳米颗粒蛋白在N端通过连接肽2与结合肽2融合形成。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,抗原组分从N端到C端依次为:水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白或其免疫原性片段、连接肽1和结合肽1;颗粒蛋白组分从N端到C端依次为:结合肽2、连接肽2、纳米颗粒蛋白;所述抗原组分与所述颗粒蛋白组分之间通过结合肽1与结合肽2共价结合,形成免疫原性复合物。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述抗原组分和/或所述颗粒蛋白组分中包含组氨酸标签。
本发明提供了一种免疫原性复合物,其包含:
(1)抗原组分,其包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白或其免疫原性片段、连接肽1;
(2)颗粒蛋白组分,其包含纳米颗粒蛋白亚基。
在一些实施方案中,VZV gE蛋白与纳米颗粒蛋白的一个亚基连接形成融合蛋白,所述融合蛋白再与所述纳米颗粒蛋白的另一个亚基结合。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述颗粒蛋白组分包含纳米颗粒蛋白,优选地,纳米颗粒蛋白可以是病毒样颗粒蛋白, 病毒样颗粒蛋白由病毒结构蛋白形成,优选地,由细菌噬菌体衣壳蛋白AP205形成。所述颗粒蛋白组分和所述抗原组分可通过共价结合形成颗粒结构。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所用的纳米颗粒蛋白还可选自:NPM颗粒、铁蛋白颗粒(Ferritin)、I53-50颗粒等。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所用的纳米颗粒蛋白I53-50颗粒由I53-50A、I53-50B两个亚基组成。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述结合肽1含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述结合肽2含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述连接肽1包括(GGGGS)n或(EAAAK)n的氨基酸序列,n可取大于0且小于等于5的整数。在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述连接肽1优选为(GGGGS)3(SEQ ID NO:3)、(EAAAK)3(SEQ ID NO:4)或GGSGGSGSEKAAKAEEAAR(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述连接肽2包括(GGS)n、(SGGSGG)n或(GSGGSGGSG)n的氨基酸序列,n可取大于0且小于等于10的整数。在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述连接肽2优选为GGSGGSGGS(SEQ ID NO:6)、GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:7)、SGGSGG(SEQ ID NO:8)、GSGGSGGSG (SEQ IDNO:9)。
优选地,本发明的水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白采用氨基酸序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的信号肽表达;更优选信号肽序列为SEQ ID NO:12。
具体地,由于VZV gE蛋白前544氨基酸的序列都不属于跨膜区,具有抗原性,因此本发明VZV gE蛋白的设计依据VZV gE第1-544氨基酸序列(VZV gE第1-544位氨基酸如SEQID NO:13所示),其中第1-30位氨基酸为VZV gE固有的天然分泌信号肽,VZV gE第31-544为不含信号肽的氨基酸序列(如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列)。本发明使用VZV gE第31-544这段序列,或者出于提高蛋白表达量考虑使用其他序列结构的非天然信号肽代替上述天然结构的信号肽。将上述不连接信号肽或者使用其他非天然结构的信号肽连接 VZV gE第31-544位氨基酸,使得VZV gE在C端通过特定连接肽1(linker 1)与结合肽1(所述结合肽1命名为“4T”)连接,同时可在融合蛋白C端加组氨酸(例如6His)纯化标签;将编码上述融合蛋白的编码基因插入到真核细胞表达载体(例如pcDNA3.4)中,在CHO细胞进行表达,得到VZV gE-结合肽1形成的融合蛋白,该抗原组分经镍柱亲和层析以及分子筛层析等获得高纯度蛋白,该抗原组分即VZV gE-4T。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,发明提供的上述任何一种免疫原性复合物中,所述颗粒蛋白组分为在纳米颗粒蛋白的N端通过连接肽2与结合肽2形成融合蛋白;优选地,纳米颗粒蛋白为NPM、AP205 capsid protein3(AP205)或Ferritin蛋白。具体地,在一些可选方案中将结合肽2(所述结合肽2命名为“4C”)通过连接肽2与纳米颗粒蛋白的编码基因连接,插入到原核表达载体(例如pET-28a(+)、pET-30a(+))中, 在E.coli细胞进行表达,获得结合肽2与纳米颗粒蛋白的融合蛋白,所述融合蛋白可经过层析进行纯化,例如经过阴离子交换层析、疏水层析进行纯化,获得产物。纳米颗粒蛋白优选为NPM、AP205或Ferritin;所形成的颗粒蛋白组分命名为NPM-4C、AP205-4C、Ferritin-4C。
具体地,在一些可选方案中,在合适的反应条件下,将上述任何一种抗原组分与颗粒蛋白组分进行共轭结合反应,通过抗原组分的结合肽1与颗粒蛋白组分的结合肽2形成共价键结合发生偶联实现,从而形成所述免疫原性复合物。采用不同纳米颗粒蛋白可形成不同的免疫原性复合物,这些免疫原性复合物分别命名为VZV gE-NPM、VZV gE- AP205 或VZVgE-Ferritin。
优选地,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述抗原组分采用信号肽MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(SEQ ID NO:12)表达,包含VZV gE蛋白(SEQ ID NO:14)、连接肽1(EAAAK)3(SEQ ID NO:4)、结合肽1 ( SEQ ID NO:1)、组氨酸标签;更优选地,所述抗原组分序列如SEQ ID NO:15所示。
优选地, 本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述抗原组分采用信号肽MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(SEQ ID NO:12)表达,包含VZV gE蛋白(SEQ ID NO:14)、连接肽1(GGGGS)3(SEQ ID NO:3)、结合肽1 ( SEQ ID NO:1)、组氨酸标签;更优选地,所述抗原组分VZV gE-4T序列如SEQ ID NO:16所示。
在一些实施方案中,本发明提供了一种免疫原性复合物,其包含:
(1)抗原组分,其包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白、连接肽1和结合肽1;
(2)颗粒蛋白组分,其包含纳米颗粒蛋白、连接肽2和结合肽2。
所述连接肽1为任何本领域常用的连接肽,包括但不限于(GGGGS)n或(EAAAK)n的氨基酸序列,n可取大于0且小于等于5的整数, 优选为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4;所述连接肽2为任何本领域常用的连接肽,包括但不限于(GGS)n、(SGG)n或(GSGGSGGSG)n 的氨基酸序列,n可取大于0且小于等于10的整数, 优选为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9;所述纳米颗粒蛋白为NPM、AP205或Ferritin铁蛋白。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述纳米颗粒蛋白NPM包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
优选地,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述颗粒蛋白组分包含NPM-4C,如SEQ ID NO:18所示,其是如SEQ ID NO:2所示的结合肽2通过如SEQ ID NO:7所示的连接肽2与如SEQ ID NO:17所示的纳米颗粒蛋白NPM连接获得的融合蛋白。
在另一些实施方案中,本发明提供了一种免疫原性复合物,其包含:
(1)抗原组分,其包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白和连接肽1,所述连接肽1包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;
(2)颗粒蛋白组分,其包含纳米颗粒蛋白亚基;优选地,所述纳米颗粒蛋白亚基为I53-50A和/或I53-50B亚基。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述纳米颗粒蛋白I53-50包含I53-50A和/或I53-50B亚基;优选地,I53-50A包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列,I53-50B包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
具体地,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白与纳米颗粒蛋白的一个亚基连接形成融合蛋白,所述融合蛋白再与所述纳米颗粒蛋白的另一个亚基结合。优选地,所述纳米颗粒蛋白的亚基为I53-50A或I53-50B。进一步地,在一些可选方案中,抗原组分中的VZV gE蛋白通过连接肽1在C端与纳米颗粒蛋白I53-50A亚基形成VZVgE-I53-50A融合蛋白;然后,该融合蛋白再与纳米颗粒蛋白I53-50B亚基结合。
如上所述,当纳米颗粒蛋白选择I53-50时,I53-50包含I53-50A、I53-50B两个亚基,上述将含有特定信号肽或者不含有信号肽的VZV gE蛋白膜外区域通过连接肽1与I53-50A连接,可在C端加组氨酸(例如6H)纯化标签,编码上述融合蛋白的编码基因插入到真核细胞表达(例如pcDNA3.4)中,在CHO细胞进行表达、纯化,得到的融合蛋白命名为VZV gE-I53-50A;同时可以在I53-50B的C端加组氨酸(例如6H)纯化标签,并将编码上述蛋白的基因插入到原核细胞表达载体(例如pET-30a(+))中,在E.coli细胞进行表达、纯化,得到的蛋白命名为I53-50B。然后,在合适的反应条件下,将VZV gE- I53-50A与I53-50B进行共价结合反应,从而形成水痘-带状疱疹纳米颗粒,命名为VZV gE- I53-50。
优选地,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,包含VZV gE- I53-50A(表达蛋白采用SEQ ID NO:12所示的信号肽、包含如SEQ ID NO:14所示的VZV gE蛋白通过连接肽1与如SEQ ID NO:19所示的I53-50A连接获得的融合蛋白), 如SEQ ID NO:21所示。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述纳米颗粒蛋白Ferritin包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
优选地,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述颗粒蛋白组分包含Ferritin-4C(由如SEQ ID NO:2所示的结合肽2通过如SEQ ID NO:8所示的连接肽2与如SEQID NO:22所示的纳米颗粒蛋白Ferritin形成的融合蛋白),如SEQ ID NO:23所示。
在一些实施方案中,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述纳米颗粒蛋白AP205包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
优选地,本发明提供的任何一种免疫原性复合物中,所述颗粒蛋白组分包含AP205-4C(由如SEQ ID NO:2所示的结合肽2通过如SEQ ID NO:9所示的连接肽2与如SEQ IDNO:24所示的纳米颗粒蛋白AP205形成融合蛋白),如SEQ ID NO:25所示。
在一些实施方案中,本发明提供一种免疫原性复合物,包含如下(1)-(7)项中的任意一项或者多项:
(1)所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示;
(2)所述连接肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示;
(3)所述结合肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
(4)所述纳米颗粒蛋白选自NPM、AP205或Ferritin;
(5)所述纳米颗粒蛋白亚基选自I53-50A和/或I53-50B;
(6)所述连接肽2包括(GGS)n、(SGGSGG)n或(GSGGSGGSG)n的氨基酸序列,n可取大于0且小于等于10的整数;
(7)所述结合肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方案中,本发明提供一种免疫原性复合物,包含如下(1)-(3)项中的任意一项或者多项:
(1)所述NPM的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示;所述Ferritin的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示;所述AP205的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示;
(2)所述I53-50A的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示;所述I53-50B的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示;
(3)所述连接肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQID NO:9所示。
在一些实施方案中,本发明提供一种免疫原性复合物,包含如下(1)-(6)项中的任意一项或者多项:
(1)水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示;
(2)连接肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示;
(3)结合肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
(4)纳米颗粒蛋白选自NPM、AP205或Ferritin;其中,所述NPM的氨基酸序列如SEQID NO:17所示,所述Ferritin的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示,所述AP205的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示;
(5)连接肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示;
(6)结合肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方案中,本发明提供一种免疫原性复合物,包含如下(1)-(6)项中的任意一项或者多项:
(1)水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示;
(2)连接肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;
(3)结合肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
(4)纳米颗粒蛋白为NPM,其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示;
(5)连接肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示;
(6)结合肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方案中,本发明提供一种免疫原性复合物,水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白采用氨基酸序列如SEQ ID NO: 10-12任一所示的信号肽表达;抗原组分和/或所述颗粒蛋白组分包含组氨酸标签。
在一些实施方案中,本发明提供一种免疫原性复合物,由抗原组分和颗粒蛋白组分组成,所述抗原组分的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示,所述颗粒蛋白组分的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
进一步地,本发明还提供了上述任何一种免疫原性复合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将抗原组分、颗粒蛋白组分编码基因分别连接入表达载体中,构建成表达重组质粒和表达宿主菌株,表达目的蛋白,并纯化;
(2)将步骤(1)中获得的抗原组分与颗粒蛋白组分共孵育,获得免疫原性复合物。
本发明提供一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫原性复合物的制备方法:
(1)将水痘-带状疱疹病毒抗原组分、颗粒蛋白组分编码基因分别连接入表达载体中,构建成表达重组质粒;
(2)构建能够在宿主细胞中表达所述水痘-带状疱疹病毒抗原组分、颗粒蛋白组分的重组菌株;
(3)应用该重组菌株表达融合蛋白,并进行融合蛋白的纯化;
(4)将上述抗原组分和颗粒蛋白组分共孵育,发生共轭结合反应,获得免疫原性复合物。
优选地,将上述步骤(4)获得的免疫原性复合物进行纯化,获得疫苗原液。
优选地,所述的一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫原性复合物的制备方法,步骤(1)中表达所述水痘-带状疱疹病毒抗原组分的质粒可选pcDNA3.4, 表达所述颗粒蛋白组分的质粒可选pET-28a(+)、pET-30a(+)。
本发明所述的一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫原性复合物的制备方法步骤(2)中表达所述水痘-带状疱疹病毒抗原的宿主细胞为CHO,表达所述颗粒蛋白组分载体的宿主细胞为E.coli。
本发明所述一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫原性复合物,所述免疫原性复合物的抗原组分包含上述VZV gE-结合肽1形成的融合蛋白。
本发明所述的一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫原性复合物中,VZV gE-4T与NPM-4C结合比例为6:1,结合条件为pH 7.4 0.1M Tris-HCl,25%(w/v)Sucrose,22℃反应48小时;VZV gE-I53-50A与I53-50B结合比例为1:3,结合条件为 pH7.4、20mM Tris-HCl,150mM NaCl,25℃,反应2小时;VZV gE-4T与AP205-4C的结合比例为2:1,结合条件为pH6.2 40mM Na2HPO4,25%(w/v)Sucrose,200mM 枸橼酸钠(Na3C6H5O7·2H2O),22℃反应24小时; VZVgE-4T与Ferritin-4C结合比例为6:1,结合条件为pH 7.4 0.1MTris-HCl,25%(w/v)Sucrose,22℃反应48小时。内毒素检测均小于100 EU/ml,符合规模化生产要求。
本发明还提供了一种免疫组合物,所述免疫组合物包含上述任何一种免疫原性复合物和药学上可接受的载体;优选地,所述药学上可接受的载体包含稳定剂、赋形剂、表面活性剂、缓冲剂、pH调节剂,稳定剂为蔗糖、精氨酸,赋形剂为甘露醇,表面活性剂为吐温80,缓冲剂为磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物,pH调节剂为盐酸。
在一些实施方案中,本发明所述的免疫组合物,其所含的免疫原性复合物用量为0.25-100μg/剂,优选为0.5-50μg/剂,更优选的为0.5μg/剂、1μg/剂、2μg/剂、3μg/剂、4μg/剂、5μg/剂、10μg/剂、15μg/剂、20μg/剂、25μg/剂、30μg/剂、35μg/剂、40μg/剂、45μg/剂、50μg/剂。小鼠实验用剂量为人用剂量的1/10。
在一些实施方案中,本发明提供的免疫组合物为注射液或冻干制剂,优选为冻干制剂。
在一些实施方案中,本发明提供的免疫组合物为冻干制剂,其包含VZV gE-NPM免疫原性复合物、稳定剂、赋形剂、表面活性剂、缓冲剂、pH调节剂;优选地,所述稳定剂为蔗糖、精氨酸,赋形剂为甘露醇,表面活性剂为吐温80,缓冲剂为磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物,pH调节剂为盐酸。
在一些实施方案中,本发明提供的免疫组合物为冻干制剂,其包含VZV gE-NPM免疫原性复合物、蔗糖、精氨酸,甘露醇,吐温80,磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物,盐酸。所述冻干制剂的每单位剂量中包含:VZV gE-NPM 0.5-50μg,优选25μg-50μg;蔗糖10-20mg,优选12-15 mg;甘露醇10-30 mg,优选20-25 mg;吐温80 0.1-0.5 mg,优选0.2-0.3mg;精氨酸2-8mg,优选3-5 mg;磷酸氢二钠二水合物0.5-1.5 mg,优选1-1.2 mg;磷酸二氢钠二水合物0.5-1mg,优选0.6-0.8 mg;盐酸8.0-9.5mg,优选8.2-9.0 mg。
在一些实施方案中,本发明提供的免疫组合物为冻干制剂,其包含VZV gE-NPM 免疫原性复合物25μg或50μg、蔗糖12.5 mg、甘露醇25mg、吐温80 0.25 mg、精氨酸4.35mg、磷酸氢二钠二水合物1.085 mg、磷酸二氢钠二水合物0.62mg,盐酸8.66 mg。
在一些实施方案中,本发明提供的免疫组合物为注射液,其包含VZV gE-NPM免疫原性复合物、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂、pH调节剂;优选地,所述稳定剂为蔗糖,表面活性剂为吐温80,缓冲剂为二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠,pH调节剂为盐酸。
在一些实施方案中,本发明提供的免疫组合物为注射液,其包含VZV gE-NPM免疫原性复合物、蔗糖、吐温80、二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠,盐酸。所述注射液的每单位剂量中包含:VZV gE-NPM 免疫原性复合物0.5-50μg,优选25μg-50μg;蔗糖10-30mg,优选15-25 mg;吐温80 0.05-0.5 mg,优选0.1-0.3 mg;二水合磷酸氢二钠0.2-1mg,优选0.3-0.8 mg; 二水合磷酸二氢钠0.1-0.5 mg, 优选0.2-0.4 mg;盐酸0.2-0.5mg,优选0.25-0.35 mg。
在一些实施方案中,本发明提供的免疫组合物为注射液,其包含VZV gE-NPM免疫原性复合物 25μg或50μg、蔗糖20 mg、吐温80 0.125 mg、二水合磷酸氢二钠 0.5425mg、二水合磷酸二氢钠0.31mg,盐酸0.3mg。
本发明进一步提供了一种水痘-带状疱疹疫苗,其包括上述任何一种免疫组合物和佐剂,所述佐剂选自:铝盐类佐剂、弗氏完全佐剂、蜂胶佐剂、水油佐剂、细胞因子、CpGDNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物、脂质体中的至少一种。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹疫苗,所述水油佐剂为含角鲨烯的角鲨烯类佐剂。在小鼠实验中,所述免疫原性复合物(如VZVgE-NPM)用量0.5μg/剂时搭配使用25μl /剂的含角鲨烯的角鲨烯类佐剂,就能实现良好的免疫效果。
本发明所述的一种水痘-带状疱疹疫苗,人用每单位剂量的疫苗中,含所述免疫原性复合物用量为5-50μg/剂,优选为5µg、25µg或50µg,并且含角鲨烯0.105mg至10.5mg。
本发明所述的角鲨烯类佐剂含:(w/w)角鲨烯(Squalene)0.5%-5%、司盘(Span)850.05%-1%、吐温(Tween)80 0.05%-1%、10mM 枸橼酸盐缓冲液。
本发明所述角鲨烯类佐剂含:(w/w)含角鲨烯Squalene 1.5%-5%、司盘Span 850.05%-1%、吐温Tween 80 0.05%-1%、10mM枸橼酸盐缓冲液。
本发明所述角鲨烯类佐剂优选含:(w/w)角鲨烯(Squalene)2%-4.5%、司盘(Span)85 0.2%-0.5%、吐温(Tween)80 0.2%-0.5%、10mM 枸橼酸盐缓冲液。其中角鲨烯用量更优选的为2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%(w/w),司盘85更优选的为0.3%-0.4%(w/w),吐温80更优选的为0.3%-0.4%(w/w)。
本发明具体实施方式使用的角鲨烯类水油佐剂成分可以为:(w/w)角鲨烯3.9%、司盘85 0.47%、吐温80 0.47%、10mM 枸橼酸盐缓冲液。
本发明具体实施方式使用的角鲨烯类水油佐剂成分可以为:(w/w)角鲨烯 4.3%、司盘85 0.5%、吐温80 0.5%、10mM 枸橼酸盐缓冲液。
本发明具体实施方式使用的角鲨烯类水油佐剂成分可以为:(w/w)角鲨烯4.03%、司盘85 0.5%、吐温80 0.5%、枸橼酸0.016%、枸橼酸钠0.264%。
本发明具体实施方式使用的角鲨烯类水油佐剂成分可以为:(w/w)角鲨烯3.0225%、司盘85 0.375%、吐温80 0.375%、枸橼酸0.012%、枸橼酸钠0.198%。
本发明具体实施方式使用的角鲨烯类水油佐剂成分可以为:(w/w)角鲨烯2.015%、司盘85 0.25%、吐温80 0.25%、枸橼酸 0.08%、枸橼酸钠0.132%。
本发明具体实施方式使用的角鲨烯类水油佐剂成分可以为:(w/w)角鲨烯0.403%、司盘85 0.05%、吐温80 0.05%、枸橼酸 0.0016%、枸橼酸钠0.0264%。
进一步地,本发明具体实施方式使用的角鲨烯佐剂(佐剂1)成分优选为:角鲨烯10.50mg(4.2%)、司盘85 1.25mg(0.5%)、吐温80 1.25mg(0.5%)、枸橼酸0.04mg(0.264%)、枸橼酸钠0.66 mg(0.016%)(w/w)。该佐剂可以配合VZV gE-NPM的注射液处方使用,可选地,小鼠实验用单位剂量疫苗中佐剂1的用量可以为25μl/剂,人用单位剂量疫苗中佐剂1的用量可以为250μl/剂(0.25ml/剂)。
如上所述,免疫原性复合物VZV gE-NPM、佐剂用量对于人体和小鼠所用剂量不同,对应关系为:作为人用剂量时,VZV gE-NPM、佐剂用量均为在小鼠中用量的10倍,例如:小鼠用VZV gE-NPM 5μg/剂、人用剂量需为50μg/剂;小鼠用佐剂50μl/剂、人用佐剂剂量需为500μl/剂(0.5 ml/剂),小鼠用佐剂为25μl/剂、人用剂量需为250μg/剂(0.25 ml/剂),以此类推。
本发明中对照疫苗涉及佐剂AS01B佐剂,AS01B成分为:每0.5mL的AS01B佐剂含5 0μg 皂树皂苷QS-21、50μg 3-O-去酰基-4’-单磷酰脂A (MPL)、1mg二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、0.25mg胆固醇、4.385mg氯化钠、0.15mg无水磷酸氢二钠、0.54mg磷酸二氢钾。本发明所用AS01B佐剂是GSK公司市售疫苗Shingrix®中与VZV gE蛋白搭配销售的佐剂产品。
本发明进一步提供一种成套试剂盒,其特征在于,包含本发明所述的一种水痘-带状疱疹疫苗,以及用于接种所述疫苗所需的器具和容器。
本发明提供一种水痘-带状疱疹疫苗,包含VZV gE-NPM免疫组合物(即含有VZVgE-NPM的免疫组合,可制成冻干制剂或注射液制剂)和佐剂(为液体)。VZV gE-NPM免疫组合物和佐剂分瓶包装。佐剂中成分含量为角鲨烯10.50mg、司盘85 1.25mg、吐温80 1.25mg、枸橼酸钠0.04mg、枸橼酸0.66 mg;该佐剂配合VZV gE-NPM冻干制剂使用与注射液使用时,佐剂瓶中所装佐剂各成分浓度前者是后者情况的1/2(稀释一倍)。VZV gE-NPM免疫复合物含量为50μg/剂或25μg/剂(两种规格)。
对于VZV gE-NPM免疫组合物为冻干制剂剂型:临床接种前需从佐剂瓶抽取全部液体到装有VZV gE-NPM冻干制剂的瓶中,混匀后使用,复溶后每次人用剂量为0.5 ml,分别含VZV gE-NPM免疫原性复合物50μg或25μg。
对于VZV gE-NPM免疫组合物为注射液制剂剂型:VZV gE-NPM注射液每次人用剂量为0.25 ml,佐剂每次人用剂量为0.25 ml。临床接种前需从佐剂瓶抽取全部液体到装有VZVgE-NPM注射液的瓶中,混匀后使用,复溶后每次人用剂量为0.5 ml,分别含VZV gE-NPM免疫原性复合物50μg或25μg。
本发明提供一种水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物、免疫组合物或疫苗在制备用于预防或治疗带状疱疹的药物中的应用。
本发明采用的所有试剂均可商业化购买获得。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明免疫原性复合物填补了全球范围内纳米颗粒类型的水痘-带状疱疹疫苗供应基本空白的现状。经尝试不同重组颗粒蛋白后发现,采用本发明使用的不同纳米颗粒蛋白NPM、I53-50、AP205及Ferritin,获得的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物VZVgE-NPM、VZV gE- I53-50、VZV gE- AP205、VZV gE-Ferritin均可获得较为理想的技术效果:颗粒粒径均一、分布均匀无聚集,产品性能稳定,内毒素合格,适合进行非临床开发及抗体免疫原性试验测试,从而适合作为水痘-带状疱疹疫苗。
(2)相对于目前已上市的重组蛋白水痘-带状疱疹疫苗Shingrix®,本发明的水痘-带状疱疹疫苗进一步提高了机体内产生抗体的水平和T细胞的免疫效果。在本发明提供的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物制备成功后,针对Shingrix®进行了不同的非临床的细胞及抗体免疫原性实验测试对比。本发明提供的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物引发的T细胞的免疫原性和抗体免疫原性均高于Shingrix®,说明本发明提供的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物均可诱导出优于该商品化疫苗Shingrix®的细胞免疫和体液免疫反应。本发明提供的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物在使用特定角鲨烯类佐剂的情况下会比GSK已上市的水痘-带状疱疹重组蛋白疫苗Shingrix®更早介入免疫系统诱导过程,起到更好的免疫防护作用。
更重要地,本发明提供的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物的使用量显著减少的情况下仍能达到与Shingrix®相似的效果。例如,小鼠经初免减毒水痘苗(模拟感染)后序贯加免两针,VZV gE-NPM可诱导出优异的体液免疫反应,同时可诱导出显著高于对照组同等抗原用量产生的IFN-γ和IL-2水平,1/10剂量即0.5μg的VZV gE-NPM即可达到全剂量即5μg Shingrix所能达到的效果。
(3)本发明选用特定连接肽(EAAAK)3,其无论对VZV gE与结合肽1形成的融合蛋白表达量,还是对于引发免疫组合物的免疫原性效果均有促进作用。综合Western Blot、SDS-PAGE和免疫原性试验等结果发现,选择 (EAAAK)3连接VZV gE和结合肽1可以获得最理想的效果。
(4)本发明选用特定信号肽MEFGLSWVFLVAIIKGVQC进行转染表达可以获得相对最高的表达量。
(5)本发明将角鲨烯含量不同的角鲨烯类佐剂与VZV gE-NPM组合使用,观察效果发现,本发明提供的疫苗可在角鲨烯很低含量下即可发挥理想的免疫原性效果,从而可大大节省价格昂贵的角鲨烯用量,进而降低成本。
(6)本发明选用特定种类含量配比的稳定剂、赋形剂、表面活性剂、缓冲剂、pH调节剂,由此将免疫复合物做成的冻干制剂处方可达到最为理想的稳定性。
(7)本发明提供的纳米颗粒类型的水痘-带状疱疹疫苗制备方法成本低、适合大规模生产。
本发明中颗粒蛋白组分采用大肠杆菌发酵与层析纯化方式进行制备,VZV gE抗原采用CHO细胞反应器培养与层析纯化进行制备,均适合工业化大规模生产,并且具备表达量高、工艺与收率稳定、操作简单等优势。一个批次重组颗粒蛋白组分的产量可对应多批次VZV gE抗原进行结合,提高生产效率。对比普通重组蛋白疫苗,本发明纳米颗粒疫苗在同等或更低的剂量下具有更高的免疫保护水平优势,可节约大规模生产的成本。
本发明提供的重组颗粒蛋白组分的制备方法,无需特殊设备,利于放大,适合工业化生产,生产时间短,工艺简洁稳定,可减少工业化大生产的成本;使用本发明提供的重组颗粒蛋白组分方法制备出的蛋白产品,有效降低了由颗粒中杂质、宿主蛋白质、外源性DNA、抗生素、细菌内毒素等物质的残留所带来的副作用,提高了安全性。
附图说明
图1示出不同连接肽1(linker 1)对于VZV gE-结合肽1蛋白序列表达及免疫原性的影响, 其中:
a为不同结构的连接肽1即(G4S)3、(EAAAK)3及无连接肽的VZV gE-结合肽1(VZVgE-4T)蛋白序列在CHO细胞中培养表达第8天后取上清做SDS-PAGE的结果,箭头指向目的蛋白位置;
b、c分别为CHO细胞瞬时转染和稳定转染表达时,收获液上清目的蛋白含量(ELISA法检测);
d、e、f为制备成VZV gE-NPM后,含有不同连接肽1的VZV gE-结合肽1形成的VZVgE-NPM在动物体内的免疫测试效果。
图2示出VZV gE与纳米颗粒蛋白NPM结合形成VZV gE-NPM的相关检测结果, 其中:
a为VZV gE-NPM做SDS-PAGE的结果;
b为VZV gE-NPM做Western Blot(一抗为anti-VZV gE抗原)的结果;
c为VZV gE-NPM 纯化过程收集的样品做SEC鉴定的结果。
图3示出VZV gE与纳米颗粒蛋白NPM结合形成VZV gE-NPM的又一相关检测结果,其中:
a为VZV gE-NPM纯化过程收集的样品做SDS-PAGE的结果;
b为NPM空颗粒的DLS检测结果;
c为VZV gE-NPM的DLS检测结果。
图4示出VZV gE与纳米颗粒蛋白I53-50结合形成VZV gE-I53-50的相关检测结果,其中:
a为分子筛纯化VZV gE-I53-50A做SEC鉴定的结果;
b为纯化后的VZV gE-I53-50A做SDS-PAGE的结果;
c为I53-50空颗粒的DLS检测结果。
图5示出VZV gE与纳米颗粒蛋白I53-50结合形成VZV gE-I53-50的又一相关检测结果, 其中:
a为结合形成VZV gE-I53-50的SEC鉴定结果;
b为纯化后的I53-50A、I53-50B、VZV gE-I53-50A的SDS-PAGE结果;
c为VZV gE-I53-50的DLS检测结果。
图6示出VZV gE与纳米颗粒蛋白Ferritin结合形成VZV gE-Ferritin的相关检测结果,其中:
a为Ferritin-4C纯化后的SDS-PAGE鉴定结果;
b为VZV gE-Ferritin纯化后的SDS-PAGE鉴定结果;
c为VZV gE-Ferritin的DLS检测结果。
图7示出VZV gE-AP205结合产物纯化的鉴定结果及粒径检测结果,其中:
a为结合形成AP205-4C纯化后的SDS-PAGE鉴定结果;
b为VZV gE -AP205的DLS检测结果。
图8示出VZV gE- NPM电镜检测结果。
图9示出VZV gE-I53-50电镜检测结果。
图10示出VZV gE-Ferritin电镜检测结果。
图11示出VZV gE-AP205电镜检测结果。
图12示出VZV gE-NPM、VZV gE-I53-50、VZV gE-Ferritin、VZV gE-AP205四个颗粒疫苗在小鼠模型中的细胞和体液免疫反应,其中:
a为免疫后第13天四个纳米颗粒疫苗在小鼠模型中产生的IgG抗体滴度;
b为免疫后第28天四个纳米颗粒疫苗在小鼠模型中产生的IgG抗体滴度;
c为免疫后第28天四个纳米颗粒疫苗在小鼠模型中产生的脾脏细胞因子IL-2检测结果;
d为免疫后第28天四个纳米颗粒疫苗在小鼠模型中产生的脾脏细胞因子IFN-γ检测结果。
图13示出VZV gE-NPM颗粒疫苗在水痘减毒苗初免小鼠模型中诱导的细胞和体液免疫反应,其中:
a为免疫后第58天VZV gE-NPM在小鼠模型中产生的IgG抗体滴度;
b为免疫后第58天VZV gE-NPM在小鼠模型中产生的脾脏细胞因子IFN-γ检测结果;
c为免疫后第58天VZV gE-NPM在小鼠模型中产生的脾脏细胞因子IL-2检测结果。
图14示出VZV gE-NPM颗粒疫苗搭配不同角鲨烯含量的佐剂诱导的免疫反应结果。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。下列实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规试剂公司购买得到。
实施例1 连接肽1及信号肽的确定
1、材料-连接肽1和信号肽:
(1)连接肽1:
设计1-不使用连接肽1(无linker 1);设计2-GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3);设计3-EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:4)
(2)信号肽:
MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO:10),MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:11),
MEFGLSWVFLVAIIKGVQC(SEQ ID NO:12)。
2、实验方法:
(1)不应用连接肽1或者应用不同结构连接肽1的确认实验:
VZV gE蛋白前544氨基酸的序列都不属于跨膜区,具有抗原性,因此设计VZV gE疫苗依据为第1-544位氨基酸序列,并将第1-30位氨基酸组成的原始信号肽替换为本发明所选择确定的如SEQ ID NO:12所示的特定信号肽,并连接如SEQ ID NO:14所示的水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白膜外区域VZV gE31-544,再通过如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的连接肽1(linker 1)与如SEQ ID NO:1所示的结合肽1(即“4T”)连接,形成融合蛋白,同时在该融合蛋白的C端加组氨酸6His纯化标签。将编码上述融合蛋白的编码基因插入到真核细胞表达载体pcDNA3.4中,在CHO细胞进行表达,得到融合蛋白VZV gE-结合肽1,即VZV gE-4T,作为抗原组分。
(2)应用不同信号肽的确认实验:
连接肽1为SEQ ID NO:3所示,信号肽为SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12所示,信号肽在VZV gE31-544的N端连接,表达VZV gE-4T、VZV gE- I53-50A。具体如下:
制备VZV gE-4T:VZV gE31-544如SEQ ID NO:14所示,VZV gE31-544 N端连接的信号肽为SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示,VZV gE31-544 C端连接的如SEQID NO:3所示的连接肽1使得VZV gE在C端与结合肽1(所述结合肽1命名为“4T”)连接,同时在融合蛋白C端加6His纯化标签;将编码上述融合蛋白的编码基因插入到真核细胞表达载体pcDNA3.4中,在CHO细胞进行表达,得到融合蛋白VZV gE-4T,作为抗原组分。
制备VZV gE- I53-50A:VZV gE31-544如SEQ ID NO:14所示,VZV gE31-544 N端连接的信号肽为SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示,再通过如SEQ ID NO:3所示的连接肽1与如SEQ ID NO:19所示的I53-50A融合,将编码上述融合蛋白的编码基因插入到真核细胞表达载体pcDNA3.4中,在CHO-S细胞进行表达,得到融合蛋白VZV gE-I53-50A,作为抗原组分。
3、实验结果:
(1)应用不同连接肽1的实验结果:
在CHO细胞中选用无linker、(G4S)3和(EAAAK)3 三种设计瞬时转染表达VZV gE-4T时,目的抗原均有表达,如图1中a、图1中b所示,其中,图1中a为CHO瞬时转染表达上清SDS-GAGE鉴定结果,图1中b为上述表达上清ELISA方法鉴定结果。结果表明,三种设计均可以在CHO细胞中进行瞬时转染表达,其中采用(EAAAK)3获得的表达量最高,无linker(nolinker)其次,采用(G4S)3linker获得的表达量最低。
进一步地,如图1中b、图1中c所示,在CHO细胞中分别进行瞬时转染和稳定转染表达条件下,表达上清用ELISA方法鉴定目的蛋白含量,其结果与图1中a所示的SDS-PAGE趋势一致,选用(EAAAK)3作为linker时获得目的产物的表达量为最好,无linker时与之相似。采用(G4S)3作为linker时,目的产物的表达量没有无linker及(EAAAK)3作为linker时的表达量高。
当将含有不同结构的linker1制成VZV gE-4T并使其与NPM-4C结合从而制备成VZVgE-NPM后,在动物体内的免疫测试并获得相应效果,如图1中d、图1中e、图1中f 所示(具体见实施例10 )可知,采用(EAAAK)3取得最优的免疫学效果,(EAAAK)3优于(G4S)3,采用(EAAAK)3和(G4S)3均优于无linker的设计。
综上,本发明使用 (EAAAK)3和(G4S)3连接VZV gE与结合肽1(即4T),最优选使用(EAAAK)3(SEQ ID NO:4),制备融合蛋白VZV gE-结合肽1(即VZV gE-4T)。
(2)应用不同信号肽的实验结果:
应用上述不同信号肽参与实验,由瞬时转染结果可得,表达量最高的为SEQ IDNO:12所示信号肽。因此,本发明使用SEQ ID NO:12所示信号肽进行稳定转染。
表1 带有不同信号肽的目标蛋白的表达量检测
表2 本申请实施例中结合肽、连接肽、信号肽氨基酸序列
实施例2 VZV gE-结合肽1融合蛋白编码基因的表达
将第1-30位氨基酸组成的原始信号肽替换为本发明所选择确定的如SEQ ID NO:12所示的特定信号肽,并连接如SEQ ID NO:14所示的水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白膜外区域VZV gE31-544(信号肽连接在VZV gE31-544的N端),再通过连接肽1(linker 1)(G4S)3(如SEQ ID NO:3所示)或(EAAAK)3(如SEQ ID NO:4所示)与如SEQ ID NO:1所示的结合肽1(即“4T”)连接,同时在C端加组氨酸6His纯化标签。将编码上述融合蛋白的编码基因插入到真核细胞表达载体pcDNA3.4中,在CHO细胞进行表达,得到融合蛋白VZV gE-结合肽1,即“VZV gE-4T”,作为抗原组分。信号肽和连接肽1的选择确定步骤如实施例1所示。在细胞内表达时产生的连接在VZV gE31-544 N端的信号肽,在宿主细胞内被切除,分泌出宿主细胞的VZV gE-4T不含信号肽。
使用SEQ ID NO:4所示的连接肽1形成的VZV gE-4T(不含信号肽)如SEQ ID NO:15所示,使用SEQ ID NO:3所示的连接肽1形成的VZV gE-4T(不含信号肽)如SEQ ID NO:16所示,见表3。
表3 本申请实施例中VZV gE-结合肽1融合蛋白序列
实施例3:VZV gE-结合肽1融合蛋白的纯化
将实施例2表达获得的融合蛋白VZV gE-4T(如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示)抗原组分经过镍柱亲和层析以及分子筛层析纯化,获得高纯度蛋白。具体步骤如下:
1、实验材料:囊式滤器(Bricap C01:180cm2)购自Cobetter,Pellicon2超滤膜包购自Millipore,镍离子亲和填料Ni Bestarose FF购自博格隆,分子筛(HiLoad 16/600Superdex 200pg)购自Cytiva,超滤夹具及蠕动泵Masterflex L/S
超滤用耗材:密理博10kDa Pellicon2 再生纤维素微膜 (0.1m2表面积)。
2、实验方法:
(1)样品处理:含有上述VZV gE-结合肽1融合蛋白的CHO细胞培养上清液,通过离心机12000g高速离心60min,收获约2.35L上清。再使用科百特0.45+0.2um过滤器(型号:Bricap C01:180 cm²)做澄清过滤处理。
(2)切向流过滤
该步骤目的主要是对上述澄清后料液进行浓缩,并置换到亲和层析用缓冲液,以减少培养基中EDTA对镍亲和填料的影响,常温条件下进行。
使用的超滤设备和相关方法包括:
超滤工艺:水洗,0.1M氢氧化钠冲洗并循环30分钟消毒,蠕动泵流速400mL/min,水洗6L后,检测pH约为10,超滤膜包平衡,使用1L TBS缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.4) 漂洗膜包;1升TBS缓冲液平衡膜包,渗透液pH达到 7.38。
VZV gE-4T培养上清浓缩:将上述约2.3L澄清料液进行浓缩,蠕动泵流速500mL/min,样品搅拌速度约150r/min,监测进口端压力13psi,回流端压力5psi(渗透流速大约52ml/min),按照该工艺参数,浓缩料液至0.46L;换液:使用2.8L TBS缓冲液进行6倍洗滤,监测进口端压力12psi,回流端压力5psi。
浓缩样品回收:关闭滤出端后,控制蠕动泵流速200mL/min,回收VZV gE-4T超滤组分,总计约0.5L;超滤膜包分别使用水、0.1M氢氧化钠消毒并循环60分钟,最终保存于0.1M氢氧化钠。
(3)镍离子亲和层析
使用镍离子亲和填料层析柱完成亲和纯化。层析柱体积10mL,层析流速5mL/min,上样超滤样品70mL。
层析程序:层析柱CIP与冲洗,缓冲液TBS (20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.4)平衡柱子,上样,TBS溶液洗涤,20mM 咪唑+TBS缓冲液洗去杂蛋白,500mM 咪唑+TBS缓冲液洗脱VZV gE-结合肽1(即VZV gE-4T)组分。
(4)分子筛纯化
使用HiLoad 16/600 Superdex 200pg进行精纯,分子筛柱体积120mL,VZV gE-4T亲和纯化样品的上样量控制在约4%柱体积。
层析程序:层析柱CIP与冲洗;缓冲液TBS (20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.4)平衡柱子,上样,TBS溶液洗脱,收集VZV gE-4T组分。
实施例4: 结合肽2-NPM融合蛋白的表达和纯化
纳米颗粒蛋白NPM(如SEQ ID NO:17所示)在N端通过连接肽2 (如SEQ ID NO:7所示,序列见表1)与结合肽2(如SEQ ID NO:2所示,序列见表1)连接,从而形成结合肽2-NPM融合蛋白,即NPM-4C( 如SEQ ID NO:18所示),NPM、NPM-4C相关序列见表4。
表4 本申请实施例中NPM,NPM-4C融合蛋白序列
将所述融合蛋白的编码基因在大肠杆菌内进行表达,收获菌体后需要通过高压均质破碎释放目标蛋白并进行料液澄清,主要目的是去除菌体碎片与杂质蛋白。料液澄清主要通过加热处理完成。使用两步加热的方法进行加热处理,对E.coli破碎后上清液进行第一步加热和第二步加热(即“两步加热”),并对两步加热步骤的除杂效果和重组颗粒蛋白组分的纯度进行测算。
取离心收集的E.coli 湿菌体60g,重悬于240ml的缓冲液(20mM Tris-HCl、2mMPMSF 、pH=9.0),使用高压匀质机1000bar压力下破碎,离心后收集到280ml上清液,取其中40ml 进行两步加热操作。对破碎后的上清液、第一步加热离心上清液,第二步加热离心沉淀重悬液进行SDS-PAGE分析。
如表5所示,第一步加热中,调节pH=9.0,80℃,水浴加热1小时,恢复至室温后离心收集到约35ml上清液。第二步加热中,向其中加入100mM Tris-HCl,5mM EDTA, 4% Triton,pH 7.4缓冲液35ml,再加入7ml的1M Tris-HCl pH7.4,混匀。置于60匀水浴加热10min,立即离心收集沉淀,使用20mM Tris-HCl ,5mM EDTA ,pH= 9.0的缓冲液复溶沉淀。
表5 重组颗粒蛋白组分产品两步加热提取方法
在两步加热工艺之后,层析纯化之前加入不同浓度的尿素和氯化钠可以显著减少目标重组颗粒蛋白以外的杂质,在Fractogel DEAE M 层析前对重组颗粒蛋白组分样品进行预处理的优选工艺条件为8M尿素和50-200mM氯化钠浸泡。
上述重组颗粒蛋白组分样液使用离子交换和疏水层析进行精制,第一步层析纯化使用Fractogel DEAE M层析工艺,具体步骤和参数参见表6。Fractogel DEAE M洗脱收集液样品先进行缓冲液稀释,再添加50%(w/v)蔗糖稳定剂,具体参数参见表7。然后使用疏水层析Octyl Bestarose 4FF层析工艺进行精纯(第二步层析纯化),具体步骤和参数参见表8。
第一步层析方法:层析填料-Fractogel DEAE M,保留时间-12.5min
表6 第一步层析方法
表7 第二步层析前样品稀释方法
第二步层析方法:层析填料- Octyl Bestarose 4FF,保留时间-12.5min
表8 第二步层析方法
结果与分析:
通过纯度检测发现,进一步经过以上层析介质组合进行精制后,获得产品的纯度可达到99.0%以上。
实施例5:VZV gE和NPM的结合、颗粒表征
一、VZV gE和NPM的结合:
1、VZV gE-NPM结合产物的产生:
将SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的VZV gE-结合肽1(VZV gE-4T)与如SEQ IDNO:18所示的结合肽2-NPM(NPM-4C),按照BCA蛋白浓度比6:1混合,并添加50%(w/v)蔗糖母液至约25%(w/v)蔗糖终浓度,以及添加总反应体积10%的1M Tris-HCl pH7.4母液以起到稳定pH的左右。结合反应在22℃条件下进行,反应时间48小时。作为示例,VZV gE-NPM结合体系具体地可以为:VZV gE-4T(1mg/mL)6mL、NPM-4C(1mg/mL)1mL、50%蔗糖8.75mL、1M Tris-HCl 7.4 1.75mL, 总体积17.5mL。
2、VZV gE-NPM结合产物的纯化:
使用Cytiva HiLoad 16/600 Superdex 200pg(柱体积120mL)或者CytivaSuperdex 200 Increase 10/300 GL(柱体积23mL)进行VZV gE-NPM结合产物的纯化,并分离除去未与NPM-4C结合的VZV gE抗原。如果使用分子筛HiLoad 16/600 Superdex 200pg,VZV gE-NPM结合样品的上样量控制在约3%~6%;如果使用分子筛Superdex 200 Increase10/300 GL,VZV gE-NPM结合样品的上样量控制在0.5mL~1mL。
层析程序:层析柱CIP与冲洗、平衡缓冲液12.5%(w/v)蔗糖 TBS溶液 (20mM Tris-HCl,150mM NaCl,12.5%(w/v)蔗糖 pH7.4) 平衡柱子、上样、12.5%(w/v)蔗糖 TBS溶液洗脱,收集VZV gE-NPM组分。
二、颗粒表征:
1、实验材料:上述实施例中制备得到的VZV gE-NPM颗粒
2、检测方法:
(1)TEM检测:
使用漂浮法来制备负染样品。选用400目有支持膜的载网,对其预先做亲水性处理,准备好去离子水和2%甲酸铀负染液。取制备好的3µL蛋白样品(0.12mg/ml),直接滴在支持膜的载网一面;计时1分钟后,用干净的滤纸从载网边缘吸取去多余的液体;稍干后再用去离子水液滴上依次快速漂洗两次;然后取5µl负染液漂洗一次,最后滴加5µl负染色液计时1分钟,结束后用镊子夹起载网用滤纸吸去染液,留一薄层让其自然晾干,待检测。在120kV的透射电镜(FERRITINI Tecnai Spirit)下进行检查,再低倍下观察载网的整体染色情况,选择厚度合适的孔进行观察,在高倍镜下选择合适的区域进行拍照和保存。
(2)SDS-PAGE和Western blot方法
SDS-PAGE供试品用LDS样品上样缓冲液(4x)加还原剂DTT配制,70℃加热5min,冷却至室温,10000rpm离心20s,涡旋混匀,最终上样量5µg。供试品和非预染蛋白分子量标准品上样至4-12% Bis-Tris 凝胶,搭配MES电泳缓冲液,设置电压150V、电泳持续约60分钟。电泳结束后,取出凝胶,将凝胶置于一个洁净的容器中,加入适量考马斯亮蓝染色液至没过凝胶,在摇床上染色2h。染色结束后倒掉染色液,用纯化水浸泡脱色,在摇床上持续脱色至凝胶底色脱尽,使用GelDoc Go凝胶成像仪对凝胶进行拍照。Western blot供试品上样量为0.5µg,跑胶方法同SDS-PAGE,使用Trans-Blot®Turbo仪器及相应试剂进行转膜,使用iBind仪器搭配Anti-gE鼠单抗和偶联AP酶的羊抗鼠二抗进行孵育,然后用显色液进行显色,GelDoc Go进行拍照。
(3)DLS方法
将纯化制备好的供试品浓度稀释至0.25mg/mL,使用Zetasizer Lab仪器,将 ≥1mL的待测样品注入样品池中,运行仪器进行检测,结合Z-Average (nm)和PolydispersityIndex (PI)值,以及Size Distribution by Intensity/Volume的分布曲线进行数据分析,并报告结果。
三、结果:
按照上述方法将SEQ ID NO:15所示的VZV gE-4T与如SEQ ID NO:18所示的NPM-4C进行结合反应,采用SDS-PAGE灰度法测得结合率为79.2%。如图2所示,图2中a为本发明的VZV gE-NPM制备后经SDS-PAGE检测所显示的结果,图2中b为本发明VZV gE-NPM结果经Western Blot检测的结果,图2中c显示本发明的VZV gE-NPM结合及稳定性的结果。图2中c的SEC鉴定结果中峰1为VZV gE与NPM 6:1混合结合后形成的纳米颗粒,峰2为结合后剩余的VZV gE抗原蛋白。图3中a为VZV gE与NPM结合后纯化分离的结果,图3中b为NPM空颗粒粒径分析结果,DLS结果显示颗粒直径为27.6 nm,产品稳定,内毒素合格。图3中a所示的B2-B6为图2中c的峰1所包含并收集的样品,B8-C1为图2中c的峰2所包含并收集的样品。图3中c为gE与NPM结合后的粒径分析结果,DLS结果显示颗粒直径为34.4 nm,产品稳定,内毒素合格。
图8为VZV gE-NPM颗粒电镜检测结果照片(VZV gE-NPM 0.13mg/mL,18500×),图片显示颗粒分布均匀,无聚集现象。
SEQ ID NO:16所示的VZV gE-4T与NPM-4C进行结合反应,获得了与上述结果相同的技术效果。
以上结果表明本发明提供的VZV gE与NPM组装正常,分子量区间合理。
实施例6:VZV gE-I53-50A、I53-50B的表达纯化、二者结合、颗粒表征
与其他颗粒不同,VZV gE和I53-50的结合是通过分别表达纯化VZV gE-I53-50A融合蛋白和I53-50B,并使得二者结合,进而获得VZV gE-I53-50。本申请实施例中的I53-50A、I53-50B、VZV gE- I53-50A序列结构见表9。
一、I53-50B的表达、纯化
1. 实验材料:
囊式滤器(Bricap C01:180cm2)购自Cobetter,膜包购自Millipore,NiBestarose FF购自博格隆,分子筛(HiLoad 16/600 Superdex 200pg)购自Cytiva。
2. 实验方法:
1)诱导表达:将I53-50B的编码基因在大肠杆菌内进行表达,接种I53-50B BL21Condon-plus/BL21(DE3)单克隆菌种于50 mL LB(Kan+)培养基中, 37℃,250 rpm下培养4-5 h,待培养液OD600约0.6-0.8时,将菌液转移至18℃,加入IPTG 至终浓度为0.5 mM, 200rpm下诱导蛋白表达16 h。
2)离心收菌:将培养完毕的菌液转移至做好标记的干净50 mL离心管中室温下6000 rpm离心收集菌体,丢弃培养液,用10 mL 300 mM NaCl,50 mM Tris 7.4,1 mM DTT,0.75% CHAPS溶液重悬菌体,并在振荡器中充分涡旋混匀。
3)超声破碎:将装有重悬菌液的50 mL管置于冰中进行超声破碎。变幅杆2号,100%功率,超声5 s,停5 s,每个样品超声总时长为10 min。
4)离心收集目的蛋白:15000 rpm,4 ℃,30 min,收集细胞破碎上清。目的蛋白I53-50B序列如SEQ ID NO:20所示。
5)Histrap纯化目的蛋白:Wash 缓冲液为300 mM NaCl,50 mM Tris pH7.4,1 mMDTT,0.75% CHAPS,30 mM Imidazole;Elution 缓冲液为300 mM NaCl,50 mM Tris pH7.4,1 mM DTT,0.75% CHAPS,300 mM Imidazole。使用Histrap Excel-5 mL或HistrapBogelong-10 mL柱纯化,wash 缓冲液 5CV平衡柱子,目的蛋白用0.22 μm滤器过滤并用wash 缓冲液稀释至45 mL选择S1进样,wash 缓冲液 10CV洗去杂蛋白,Elution 缓冲液5CV洗脱目的蛋白。
6)置换缓冲液:使用浓缩管将Histrap洗脱的目的蛋白溶液换成300 mM NaCl,50mM Tris pH7.4,0.75% CHAPS溶液,后测定蛋白浓度,适当温度保存用于后续结合反应。
二、VZV gE-I53-50A目的蛋白的表达、纯化和结合反应
1、实验材料:囊式滤器(Bricap C01:180cm2)购自Cobetter,膜包购自Millipore,Ni Bestarose FF购自博格隆,分子筛(HiLoad 16/600 Superdex 200pg)购自Cytiva。
2、实验方法:
1)将VZV gE-I53-50A的编码基因插入到真核细胞表达pcDNA3.4中,并在CHO-S细胞内进行表达,复苏CHO-S细胞,于ExpiCHO培养基中悬浮培养。培养条件如下,温度:37℃,湿度:80%,CO2浓度:8%,转速:120 rpm。
2)扩大培养CHO-S细胞,倍增时间约为:16 h/代,当密度达到6×106个/mL时,准备转染。
3)用冷的OptiPRO™ Medium(4℃)稀释携带VZV gE目的基因的质粒。
4)ExpiFectamine™ CHO Reagent使用前颠倒混匀4-5次,确保充分混匀。随后用冷的OptiPRO™ Medium(4℃)稀释ExpiFectamine™ CHO Reagent,稀释后静置2-3min立即与稀释的DNA混合。
5)将步骤3和4混合好的溶液静置2-3min(静置时长不超过5min),再加入到提前准备好的CHO-S细胞中,加入转染混合物的同时不断摇匀细胞使转染复合物充分与细胞混合。
6)转染结束后将细胞放入37℃摇床,80%湿度,8% CO2,120 rpm转速的培养条件下表达培养。
7)表达day 1天补加ExpiCHOTMEnhancer,选择Max Titer表达模式补加ExpiCHOTMFeed溶液,缓慢加入并不断摇晃培养瓶。随后将培养温度降为32℃。
8)表达day 5天按Max Titer表达模式补加ExpiCHOTMFeed溶液,缓慢加入并不断摇晃培养瓶。
9)根据实际情况在表达day 5/7/9/11天时记录细胞活率和细胞数,并在第7天取样进行SDS-PAGE检测。
10)收集细胞表达上清:离心参数8000 rpm,30 min,收集上清,用0.22μm滤膜过滤,并做好标记留存。
11)用平衡缓冲液(20mM PBS, pH 6.0)将细胞上清稀释3倍降低电导,用磷酸调整pH至6.0,DEAE层析柱纯化VZV gE-I53-50A,平衡缓冲液:20mM PBS,pH 6.0,洗脱缓冲液:20mM PBS,pH 6.0,1M NaCl。
12)分子筛再次纯化VZV gE-I53-50A如图4中a所示,洗脱缓冲液:20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.4,SDS-PAGE鉴定纯化后的gE-I53-50A如图4中b所示,测定VZV gE-I53-50A蛋白浓度,冻存于-80℃。目的蛋白序列VZV gE-I53-50A如SEQ ID NO:21所示。
13)VZV gE-I53-50A与I53-50B按照1:3的质量比混合,进行结合实验,结合条件为pH 7.4、20mM Tris-HCl,150mM NaCl,25℃,室温反应2小时,获得结合后的产物VZV gE-I53-50。
14)分子筛分离纯化结合后的产物如图5中a所示,SDS-PAGE鉴定纯化后的VZV gE-I53-50,并与I53-50A和I53-50B进行对比如图5中b所示。检测VZV gE-I53-50的粒径,并与I53-50进行对比如图4中c、图5中c所示。
三、颗粒表征:
1、实验材料:上述实施例中制备得到的VZV gE-I53-50颗粒
2、检测方法:同实施例5。
四、结果:
图4中a至图5中c显示本发明主张的带疱VZV gE-I53-50颗粒结合及稳定性的结果:图4中a、图4中b显示VZV gE-I53-50A抗原制备纯化结果;其中图4中a的峰1为VZV gE-I53-50A纯化后的结果,图4中b的泳道2至泳道8为图4中a的峰1所包含并收集的样品。图4中c的DLS结果显示I53-50颗粒直径为30.7 nm,并且产品稳定,内毒素合格。图5中a、图5中b显示本发明主张的VZV gE-I53-50结合及结合后纯化结果,图5中a的峰2为VZV gE-I53-50A与I53-50B经1:3混合结合后形成的纳米颗粒,峰3为结合后剩余的I53-50B蛋白。图5中b展示了SDS-PAGE中VZV gE-I53-50A纯化后并与I53-50A、I53-50B对比的分析鉴定结果;图5中c的DLS结果显示VZV gE-I53-50颗粒直径为60.15 nm,并且产品稳定,内毒素合格。
VZV gE-I53-50颗粒的电镜检测结果见图9。VZV gE-I53-50颗粒电镜检测结果照片(VZV gE-I53-50 0.13mg/mL,18500×),VZV gE-I53-50A能与I53-50B反应形成纳米颗粒,分子量大小符合预期。图片显示颗粒分布均匀,无聚集现象。
表9 本申请实施例中的I53-50A、I53-50B、VZV gE- I53-50A
实施例7:VZV gE、Ferritin的表达纯化、二者结合、颗粒表征
重组纳米颗粒蛋白Ferritin在N端通过SEQ ID NO:8所示的连接肽2与SEQ ID NO:2所示的结合肽2形成的融合蛋白,从而形成结合肽2- Ferritin融合蛋白,即“Ferritin-4C”。 本申请实施例中的Ferritin、Ferritin-4C序列见表10。
表10 本申请实施例中的Ferritin、Ferritin-4C
一、Ferritin-4C的表达、纯化
1. 实验材料:
囊式滤器(Bricap C01:180cm2)购自Cobetter,膜包购自Millipore,HisTrapexcel购自Cytiva,分子筛(HiLoad 16/600 Superdex 200pg)购自Cytiva。
2. 实验方法:
1)诱导表达条件:将Ferritin-4C的编码基因在大肠杆菌内进行表达,接种Ferritin-4C BL21(DE3)单克隆菌种于400 mL LB(Amp+)培养基中, 37℃,220 rpm下培养4-5 h,待培养液OD600约0.6-0.8时,将菌液转移至18℃,加入IPTG 至终浓度为0.5 mM,200 rpm下诱导蛋白表达16 h。目的蛋白Ferritin-4C序列如SEQ ID NO:23所示。
2)离心收菌:将培养完毕的菌液室温下7000 g离心收集菌体,丢弃培养液,用40mL 150 mM NaCl,20 mM Tris pH7.4溶液重悬菌体。
3)超声破碎:将重悬菌液置于冰水浴中进行超声破碎。变幅杆2号,50%功率,超声3s,停7 s,超声总时长为12 min。
4)离心收集目的蛋白:13000 g,4 ℃,30 min。弃上清,用20mM Tris-HCl, 150mMNaCl, 8M Urea, 2% Triton X-100, pH 7.4溶液溶解包涵体1h。
5)Histrap纯化目的蛋白:Wash buffer 1为20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 8MUrea, pH 7.4;Wash buffer 2为20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 8M Urea, 2% Triton X-100, pH 7.4;Elution buffer为20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1M Imidazole, pH 7.4。待包涵体溶解后,13000g离心30min,取上清,上Histrap excel-5ml NI柱;使用Washbuffer 2平衡Histrap excel-5ml 10 CV后,上样;上样结束用Wash buffer 2对层析柱冲洗40CV,去除内毒素;用Wash buffer 1对层析柱冲洗10CV,去Triton X-100;用 2%Elution buffer冲洗10CV,洗去杂蛋白;用2%-100% Elution buffer 线性洗脱目的蛋白15CV;洗脱结束后SDS-PAGE检测蛋白纯度。
6)稀释复性:稀释复性和SEC buffer为20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 25%(w/v)Sucrose, pH 7.4。收集镍柱纯化后的目的蛋白用浓缩管浓缩的同时用SEC buffer梯度稀释Urea至0.25 M,样品浓缩至1ml后进行分子筛分离纯化,洗脱buffer为SEC buffer,洗脱结束后SDS-PAGE检测蛋白纯度,SDS-PAGE鉴定纯化后的Ferritin-4C如图6中a所示。BCA法测定蛋白浓度,适当温度保存用于后续结合反应。
二、VZV gE-结合肽1和结合肽2-Ferritin的结合与结合产物纯化
将SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的VZV gE-结合肽1与结合肽2-Ferritin(Ferritin-4C),按照BCA蛋白浓度比6:1混合,添加50%(w/v)蔗糖母液至约25%(w/v)蔗糖终浓度,以及添加总反应体积10%的1M Tris-HCl pH7.4母液以起到稳定pH的左右。结合反应在22℃条件下进行,反应时间48小时。
采用SDS-PAGE灰度法,计算上述VZV gE-结合肽1与结合肽2-Ferritin的结合率为80%。
分子筛分离纯化结合后的产物(纯化buffer为20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 25%(w/v)Sucrose, pH 7.4),收集VZV gE-Ferritin组分。SDS-PAGE鉴定纯化后的VZV gE-Ferritin 纳米颗粒,如图6中b所示。
三、颗粒表征:
1、实验材料:上述实施例中制备得到的VZV gE-Ferritin颗粒。
2、检测方法:同实施例5。
四、结果:
图6中a显示本发明主张的Ferritin-4C纳米颗粒纯化后的SDS-PAGE鉴定结果,图6中b显示本发明主张的带疱纳米颗粒VZV gE-Ferritin结合后纯化的SDS-PAGE鉴定结果,图6中c为VZV gE-Ferritin 纳米颗粒的粒径检测结果,DLS结果显示颗粒直径为34.17 nm,产品稳定;图10为VZV gE-Ferritin 纳米颗粒电镜负染检测结果照片,图片显示颗粒分布均匀,无聚集现象。以上结果表明本发明提供的VZV gE-Ferritin颗粒组装正常,分子量区间合理。
图6与图10为SEQ ID NO:15所示的VZV gE-4T与Ferritin-4C进行结合反应获得的效果;SEQ ID NO:16所示的VZV gE-4T与Ferritin-4C进行结合反应,获得了与上述结果相同的技术效果。
实施例8: AP205融合蛋白的表达和纯化、与VZV gE的结合、颗粒表征
重组纳米颗粒蛋白AP205在N端通过SEQ ID NO:9所示的连接肽2与SEQ ID NO:2所示的结合肽2形成的融合蛋白,从而形成结合肽2-AP205融合蛋白,即“AP205-4C”。本申请实施例中的AP205、AP205-4C序列见表11。
表11 本申请实施例中的AP205、AP205-4C序列
一、AP205-4C的表达和纯化:
1. 实验材料:
Ni-NTA购自QIAGEN,核酸酶(Benzonase)购自Sigma,透析袋购(300KD)来自Spectrum Labs。
2.实验方法:
将AP205-4C的编码基因在大肠杆菌内进行表达,将菌泥(2.4L培养)在50ml溶解缓冲液中重悬,室温孵育15分钟,然后冰浴10分钟,超声12次,每次30秒,每次间隔60秒(超声功率比为30%)。将超声裂解液离心20分钟(15000g,4℃),弃上清,将沉淀收集后用尿素缓冲液重悬破包涵体,300rpm室温搅拌过夜。第二天将尿素重悬液离心80分钟(15000g,25℃),收集上清,用注射器进行过滤(0.45μm),加250U核酸酶(Benzonase,Sigma),室温孵育5分钟。AP205-4C序列如SEQ ID NO:25所示。
将Ni-NTA(QIAGEN)柱料(3ml)用超纯水(5CV,15ml)清洗两次,用平衡缓冲液2(5CV,15ml)清洗两次,加入样品重悬液,室温震荡10min,4700g离心4min去上清。柱料用45ml平衡缓冲液1稀释复性,静置柱料后去上清,重复操作3次。用45ml淋洗缓冲液1清洗,静置去上清,重复操作3次。柱料用45ml淋洗缓冲液2清洗,静置柱料去上清,共6次。柱料用15ml淋洗缓冲液3清洗,静置柱料去上清,重复操作3次。柱料用1 ml洗脱缓冲液,室温震荡(900 rpm)10分钟后,离心10分钟(13000g,4℃),取出上清洗脱液备用。将1 ml洗脱液置于透析袋(300kD,Spectrumlabs)中,封闭好后至于1L透析缓冲液中透析3小时,后换至1L新的透析缓冲液中透析过夜。次日取出后离心,4℃保存备用。具体参数参见下表12。
表12 层析方法
结果与分析:
通过纯度检测发现,经过以上纯化与透析组合进行精制后,获得产品的纯度可达到95.0%以上。
二、VZV gE-结合肽1和结合肽2-AP205的结合与结合产物纯化
1、VZV gE-AP205结合产物的产生:
将SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的VZV gE-4T与AP205-4C,按照BCA蛋白浓度比2:1混合,并添加50%(w/v)蔗糖母液至约25%(w/v)蔗糖终浓度,200mM 枸橼酸钠(Na3C6H5O7·2H2O), 40mM Na2HPO4,pH6.2母液以起到稳定pH的作用。结合反应在22℃条件下进行,反应时间24小时。
2、VZV gE-AP205结合产物的纯化:
使用透析袋(300kD,Spectrumlabs)进行VZV gE-AP205结合产物的纯化,应用磁力搅拌器(350 rpm)分离除去未与AP205-4C结合的gE抗原。透析分4次,每次不少于4小时, 透析缓冲液为50mM 甘氨酸,25mM 枸橼酸钠,0.1%(v/v) Tween 20,pH6.2。透析后取出结合产物,离心(13000g,4℃)10分钟,取上清4℃保存。
三、颗粒表征
1、实验材料:上述实施例中制备得到的VZV gE-AP205颗粒。
2、检测方法:同实施例5。
四、结果
如图7所示,图7中a为本发明主张的VZV gE-AP205制备后经SDS-PAGE检测所显示的结果。图7中b为AP205-4C的DLS检测结果,结果显示颗粒直径为17.31 nm,内毒素合格。图11为VZV gE- AP205纳米颗粒电镜负染检测结果照片,图片显示颗粒分布均匀,无聚集现象。
图7与图11为SEQ ID NO:15所示的VZV gE-4T与AP205-4C进行结合反应获得的效果;SEQ ID NO:16所示的VZV gE-4T与AP205-4C进行结合反应,获得了与上述结果相同的技术效果。
以上结果表明本发明提供的VZV-gE与AP205组装正常,分子量区间合理。
总结:
由实施例5至实施例8可见,制备所得的四种纳米颗粒产品均可作为本发明主张的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物,均可获得较为理想的技术效果:颗粒粒径均一、分布均匀无聚集,内毒素合格,适合进行非临床开发及抗体免疫原性试验测试,从而适合作为水痘-带状疱疹纳米颗粒的候选疫苗。
实施例9:颗粒热稳定性
一、实验方法:
1、实验仪器:UNcle全能型蛋白稳定性分析仪
2、操作方法:取相同浓度(0.1mg/ml)的蛋白样品,在UNi管中每孔加入9 μl,每个样品重复3个孔,在25~95℃温度范围内,设置升温速率1℃/min,每个蛋白分别测定3 次Tm、Tagg266值,分析BCM的趋势走向得出结果。
二、实验结果
测定上述实施例中获得的VZV gE-NPM(如SEQ ID NO:15所示的VZV gE-4T与SEQID NO:18所示的NPM-4C形成)、VZV gE-I53-50、VZV gE-Ferritin、VZV gE-AP205四个颗粒的热稳定性:采用UNcle在266nm波长通过SLS测得VZV gE-NPM、VZV gE-I53-50、VZV gE-AP205的Tagg266(℃)分别为61.5±4.88、53.1±6.02、82.3±2.50(使用Uncle仪器无法测出gE-Ferritin的Tagg266(℃))。测得VZV gE-I53-50、VZV gE-Ferritin、VZV gE-AP205的Tm(℃)分别为59.0±0、60.3±0.45、69.7±0.95(使用Uncle仪器无法测出gE-NPM的Tm(℃))。如SEQ ID NO:16所示的VZV gE-4T与SEQ ID NO:18所示的NPM-4C形成的VZV gE-NPM获得了与上述结果相同的技术效果。
以上数据说明,四个颗粒的热稳定性良好。
实施例10:VZVgE-NPM、VZV gE-I53-50、VZV gE-Ferritin、VZV gE-AP205对Balb/c小鼠的免疫原性测试
本发明提供的水痘-带状疱疹纳米颗粒免疫原性复合物制备成功后,将上述组合物作为疫苗针对GSK已上市的水痘-带状疱疹重组蛋白疫苗Shingrix®进行了不同的非临床的细胞及抗体免疫原性实验测试。
1、实验材料
(1)实验动物
重组水痘-带状疱疹疫苗(Shingrix®)购自GSK公司,5-6周SPF级Balb/c小鼠,雌性,购自维通利华。VZV gE多肽由南京金斯瑞合成。检疫合格后的小鼠,进行金属耳标标记,按体重随机分组,分组后每笼4只,自由摄食、饮水。动物于SPF标准动物房饲养,供给SPF动物专用无菌饲料和灭菌去离子水,饲养间昼夜12 h交替光照,温度21 ± 2 ℃,湿度30-70%。
(2)受试品和对照品
①受试疫苗原液
受试疫苗蛋白原液由广州派诺生物技术有限公司制备:VZV gE-NPM(实施例4-5)、VZV gE-I53-50(实施例6)、VZV gE-Ferritin(实施例7)、VZV gE-AP205(实施例8),VZV gE-4T(实施例2-3)。
②受试疫苗佐剂
佐剂1:角鲨烯10.50mg(4.2%)、司盘85 1.25mg(0.5%)、吐温80 1.25mg(0.5%)、枸橼酸0.04mg(0.264%)、枸橼酸钠0.66 mg(0.016%)(w/w)。
佐剂1由广州派诺生物技术有限公司按照下述步骤制备:
称取角鲨烯和司盘85,磁力搅拌器搅拌均匀,即为油相。称取吐温80和注射用水,磁力搅拌器搅拌至吐温80全部溶解。取枸橼酸钠缓冲液加入到注射用水中,搅拌均匀。然后加入配制好的吐温80溶液,搅拌均匀,即为水相。将分散机浸入水相中,打开分散机,将油相缓慢滴入水相中,形成初乳。将初乳倒入微射流内,12000psi均质直至平均粒径小于180nm即可,平均粒径约为160nm。0.2μm滤膜过滤除菌后即为角鲨烯类佐剂1。
③疫苗对照品
Varilrix®(水痘减毒疫苗)、Shingrix®(重组水痘-带状疱疹疫苗)。
2、实验方法
(1) 疫苗配制
① 本发明疫苗配制
免疫原性复合物原液(VZV gE-NPM)按剂量用TBS(pH7.4)稀释到25μL,之后再与25μL的佐剂1混合,注意避光,避免氧化。
②对照疫苗配制
Varilrix(水痘减毒疫苗):
本品含硼硅玻璃管制注射剂瓶及丁基橡胶塞(预灌封注射器,内含稀释液0.5ml/支),西林瓶(内含疫苗冻干粉);连接预灌封注射器与西林瓶,将稀释液全部注入西林瓶内溶解冻干粉,摇匀,完全溶解后应澄明无异物。
Shingrix®(重组水痘-带状疱疹疫苗):
复溶后1剂量(0.5mL)含gE蛋白50μg,用一次性无菌注射器抽取西林瓶中全部AS01B佐剂溶解冻干粉,摇匀,完全溶解后应澄明无异物。
Shingrix 0.5μg, 取2500μL TBS 溶解Shingrix抗原蛋白,混匀后吸取250μL此溶液,再加入250μL AS01B佐剂混匀,小鼠模型试验每剂含50µL体积,0.5ug抗原蛋白。
(2) 动物实验免疫程序
a. 两针免疫—比较不同结构连接肽1(VZV gE-NPM no linker, VZV gE-NPM(G4S)3linker,VZV gE-NPM (EAAAK)3linker,所述(G4S)3linker、(EAAAK)3linker均为连接肽1)。
采用适应性观察合格的BALB/c雌鼠18只,随机分为3组,每组6只动物。在每只小鼠双腿的尾侧或头侧胫骨肌内注射50μL(每条腿25μL)。表13为实验分组与给药剂量,免疫程序为:D0初免,D14二免,初免后D28采血分离血清,测定特异性IgG抗体,D28取脾脏分离白细胞测定细胞免疫指标。结果如图1中的d、e、f 所示。
表13 实验分组与给药剂量
b.两针免疫—四种免疫原性复合物与Shingrix®(VZV gE-NPM、VZV gE-I53-50、VZV gE-Ferritin、VZV gE-AP205、Shingrix®;)。
采用适应性观察合格的BALB/c雌鼠40只,随机分为5组,每组8只动物。在每只小鼠双腿的尾侧或头侧胫骨肌内注射50μL(每条腿25μL)。表14为实验分组与给药剂量,免疫程序为:D0初免,D14二免,初免后D13、D28采血分离血清,测定特异性IgG抗体, D28取脾脏分离白细胞测定细胞免疫指标。
本部分实验(“b.两针免疫—四种免疫原性复合物与Shingrix®”)中, VZV gE-NPM为实施例5中linker 1为(EAAAK)3的VZV gE-4T(即SEQ ID NO:15)与SEQ ID NO:18所示的NPM-4C形成的免疫原性复合物。
结果如图12所示。
表14 实验分组与给药剂量
*:Shingrix®组的剂量指VZV gE蛋白。
c.减毒初免+两针加免
采用适应性观察合格的BALB/c雌鼠24只,随机分为3组,每组8只动物,给药体积50μL/只。免疫程序为:D-35 Varilrix(水痘减毒疫苗)为皮下注射,在颈后皮下注射50μL;
供试品为VZV gE-NPM(VZV gE-NPM剂量为0.5μg,佐剂1为 25μL)、Shingrix(剂量5μg, 佐剂AS01B 50μL)和Shingrix 0.5(剂量0.5μg, 佐剂AS01B 25μL)。供试品D0、D28各免疫一次,肌肉注射,在双腿的尾侧或头侧胫骨肌内注射50μL(每条腿25μL)。供试品第一次免疫当天为D0,D14、D58采血分离血清,测定特异性IgG抗体,D58取脾脏分离白细胞测定细胞免疫指标。结果见图13所示。VZV gE-NPM为SEQ ID NO:15所示的VZV gE-4T与SEQ ID NO:18所示的NPM-4C形成的免疫原性复合物,制备方法如实施例5所示。图13中给出VZV gE-4T所用linker为(EAAAK)3。
(3) 特异性IgG抗体检测
将收集到离心管中的全血室温静置2h或4℃冰箱内静置过夜,待血液凝固、血块收缩后,4000rpm离心10min,取上清于干净的离心管中,保存于-20℃。
用VZV gE蛋白(浓度为2μg/mL)包被96孔酶标板 (Thermo Fisher Scientific),100 ng/50 μL/孔,4℃过夜包被,然后用PBST(0.05%Tween20)洗涤2次后加入封闭液(Thermo Fisher Scientific),200 μL/孔,室温(25℃±3℃)封闭1-4h后洗涤2次,随后加入稀释的免疫血清室温孵育1h后洗涤4次,加入1:5000稀释的二抗Goat Anti-Mouse IgGH&L (HRP)工作液,50 μL/孔。室温孵育1h后洗涤6次,随后每孔加入100 μL显色液,室温避光显色10min后每孔加入100 μL 1M HCL进行终止。酶标仪设置主波长450nm,参比波长620nm,样品吸光值=OD450-OD620。终止后5min内完成测定。
数据处理:
满足以下条件,数据可靠:
对照血清OD值±0.2、样本起始浓度对应OD值<3.0、空白孔对应OD值小于0.1、复孔(响应值)变异系数应小于20%。
将样本原始数据移入“excel Endpoint ELISA template”求出抗体滴度。计算时,cut off值为0.15。数据用柱状图展示GMT(geometric mean titer)。
(4) 小鼠细胞因子ELISpot检测
小鼠采血安乐死后,在超净台中进行无菌操作。固定小鼠、暴露腹腔、分离脾脏后,用镊子将脾脏存放于盛有适量预冷的无菌1×PBS的样本管内,使脾脏被液体完全浸泡。用组织解离器(美天旎)将脾脏分离成单个细胞,然后加入已用PBS洗涤4次且用α-MEM完全培养基调节1-4小时的试剂盒96孔板中。
细胞设置3个密度,分别为5×106个/50μL/孔、2.5×106个/50 μL/孔、1.25×106个/50μL/孔,然后加入多肽刺激物100 ng/50μL/孔,其中阴性对照孔(每只动物均设置)和阳性对照孔含细胞5×106个/50 μL/孔,阴性对照孔不用多肽刺激,补加50μL完全培养基,阳性对照孔加入50μL阳性刺激物(PMA终浓度为6 μg/mL,ION终浓度为2μg/mL)。37℃,5%CO2培养箱中培养20h左右。后续步骤按试剂盒(MABTECH)说明书进行,依次加入生物素化的单抗、Streptavidin-ALP与显色底物BCIP/NBT-plus,10min后通过自来水缓慢冲洗停止显色。室温避光晾干反应条,用ELISpot reader 检测计数斑点。
数据处理:
细胞因子斑点数=多肽刺激孔斑点数(细胞密度5×106个/50μL/孔)-自身阴性对照孔斑点数(细胞密度5×106个/50μL/孔)。数据用柱状图展示平均值。
(5) 统计学分析
使用 Graphpad Prism 9.1.2 软件分析结果。 用 Unpaired t test或One-WayANOVA 分析差异,当P<0.05时两组数据被定义为具有显著差异。
2、检测结果:
(1)结合图1中的d、e、f 所示,采用“a.两针免疫”获得结果可见:
图1 d示出第28天IFN-γ水平,图1e示出第28天 IL-2水平,图1f示出第28天IgG水平。对于连接肽1(linker1),分子设计含linker,无论(G4S)3还是(EAAAK)3,其免疫原性均强于无linker1设计,表现为有linker 1设计分子诱导出明显高于无linker 1设计的细胞免疫反应,并且抗体反应也呈升高趋势。同时发现,采用(EAAAK)3作为linker1可以诱导出比(G4S)3显著更强的免疫反应。
采用“b.两针免疫”获得结果,结合图12所示,可见:
抗体反应:如图12,其中a示出D13(第13天)四个纳米颗粒组综合评估结果,效果均高于对照组,其中VZV gE-NPM,VZV gE-I53-50以及VZV gE-Ferritin 纳米颗粒体系均产生了显著高于对照组的抗体滴度,而VZV gE-AP205组的抗体滴度也呈高于对照组的趋势。其中b示出D28(第28天)抗体滴度所有纳米颗粒组与对照组相比均显示出显著性差异。
细胞反应:其中c、d示出D28(第28天)脾脏细胞因子检测结果,结果显示VZV gE-NPM诱导出显著高于对照组的IFN-γ和IL-2反应。VZV gE-I53-50和VZV gE-Ferritin组诱导出显著高于对照组的IL-2反应。整体而言,所有纳米颗粒组的细胞因子反应均高于对照苗。
可见,在使用非强效佐剂的情况下,本发明的纳米颗粒平台(四种免疫原性复合物,VZV gE-NPM、VZV gE-I53-50、VZV gE-Fe、VZV gE-AP205)可以诱导出优于Shringrix的细胞和体液免疫反应,同时在副作用或安全性上,通过纳米颗粒平台制备的水痘-带状疱疹疫苗搭配非强效佐剂具有明显优势。
(2)采用“c.减毒初免+两针加免” 获得结果,结合图13所示,可见:
经初免减毒水痘苗(模拟感染)后序贯加免两针免疫小鼠,VZV gE-NPM可诱导出优异的体液免疫反应,同时可诱导出显著高于同等抗原用量的对照组的IFN-γ和IL-2细胞因子免疫反应,并且由图13可以得出:1/10剂量的VZV gE-NPM即可达到Shingrix全剂量即5μg所能达到的效果。证明了颗粒疫苗在不同免疫程序下均优于对照苗。
实施例11:VZV gE-NPM配合不同角鲨烯含量的佐剂对Balb/c小鼠的免疫原性测试
一、实验材料、实验方法参考实施例10。
1、调整不同实验组所用佐剂中的角鲨烯含量(佐剂中其余成分对应含量也做适应性调整,具体如下,但其余成分改变对免疫效果没有影响)。不同组所用角鲨烯佐剂各成分含量如下:
佐剂 25µL组(组 1) ,其中角鲨烯含量 4.03%(w/w) ,相当于1.01mg,即40.3mg/ml;司盘85含量0.5%(w/w),相当于0.125mg,即5mg/ml;吐温80含量0.5%(w/w),相当于0.125mg,即5mg/ml;枸橼酸含量为0.016%(w/w),相当于0.004mg,即0.16mg/ml;枸橼酸钠含量为0.264%(w/w) 相当于0.066mg,即2.64mg/ml。
佐剂2.5µL 组(组2),其中角鲨烯含量 0.403%(w/w),相当于组 1剂角鲨烯质量的0.01,相当于0.101mg,即4.03mg/ml;司盘85含量 0.05%(w/w)相当于组 1剂司盘质量的0.01,相当于0.0125mg,即0.5mg/ml;吐温80含量 0.05%(w/w)相当于组 1剂吐温80质量的0.01,相当于0.0125mg,即0.5mg/ml;枸橼酸含量 0.0016%(w/w)相当于组 1剂枸橼酸质量的 0.01,相当于0.0004mg,即0.016mg/ml;枸橼酸钠含量 0.0264%(w/w)相当于组 1剂枸橼酸钠质量的 0.01,相当于0.0066mg,即0.264mg/ml。
佐剂 18.75µL组(组 3),其中角烯含量 3.0225%(w/w),相当于组 1角烯质量的0.75,相当于0.7575mg,即30.225mg/ml;司盘85含量 0.375%(w/w)相当于组 1剂司盘质量的0.75,相当于0.0938mg,即3.75mg/ml;吐温80含量0.375%(w/w)相当于组 1剂吐温80质量的 0.75,相当于0.0938mg,即3.75mg/ml;枸橼酸含量 0.012%(w/w)相当于组 1剂枸橼酸质量的 0.75,相当于0.003mg,即0.12mg/ml;枸橼酸钠含量 0.198%(w/w)相当于组 1剂枸橼酸钠质量的 0.75,相当于0.0795mg,即1.98mg/ml。
佐剂 12.5µL组(组 4),其中角鲨烯含量 2.015%(w/w),相当于组1角鲨烯质量的0.5倍,相当于0.505mg,即20.15mg/ml;司盘85含量 0.25%(w/w)相当于组 1剂司盘85质量的0.5,相当于0.0625mg,即2.5mg/ml;吐温80含量0.25%(w/w)相当于组 1剂吐温80质量的0.5,相当于0.0625mg,即2.5mg/ml;枸橼酸含量 0.08%(w/w)相当于组 1剂枸橼酸质量的0.5,相当于0.002mg,即0.08mg/ml;枸橼酸钠含量0.132%(w/w)相当于组 1剂枸橼酸钠质量的 0.5,相当于0.033mg,即1.32mg/ml。
对照组(NA):仅含VZV gE-NPM,不含佐剂。
2、每组所用VZV gE-NPM抗原蛋白动物模型给药剂量均为5ug,在第0天初免,第14天中间取血,第14天加强免疫,第28天取全血分离血清并取脾脏。VZV gE-NPM为SEQ ID NO:15所示的VZV gE-4T与SEQ ID NO:18所示的NPM-4C形成的免疫原性复合物,制备方法如实施例5所示。
二、实验结果:
如图14所示,用本实验中VZV gE-NPM样品分别在第0和14天进行基础免疫,动物模型给药量为5ug。第28天进行取样,检测及分析。分析图形采用普通单因素方差分析与邓尼特多重比较检验法进行分析制图。
在相同剂量抗原(5μg gE-NPM蛋白)条件下,应用不同含量的角鲨烯佐剂可见,18.75μL组、12.5μL组均可达到与25μL组效果相当的效果,且18.75μL组相对比25μL组的效果甚至还要更好。由于每组所用VZV gE-NPM抗原蛋白动物模型给药剂量均为5ug,故可知,VZV gE-NPM与角鲨烯的质量比— 202:1(组1)、20.2:1(组2)、151.5:1(组3)、101:1(组4)。
可见,经28天取样后分级结果显示,本发明中以VZV gE-NPM为代表组成的疫苗,在不同程度的低角鲨烯含量的佐剂条件下也可发挥理想的免疫效果。
本发明中人用单位剂量重组带状疱疹疫苗中角鲨烯佐剂成分优选为:角鲨烯10.50mg(4.2%)、司盘85 1.25mg(0.5%)、吐温80 1.25mg(0.5%)、枸橼酸0.04mg(0.264%)、枸橼酸钠0.66 mg(0.016%)(w/w)。
实施例12:VZV gE-NPM疫苗冻干制剂不同组成处方稳定性考察及最佳冻干处方筛选确定
1、实验方法:通过设计不同的组成配方,选择不同含量的醇、氨基酸、表面活性剂组成处方,采用SEC-HPLC、SDS-PAGE方法检测疫苗组合物纯度,以及比较各不同处方的稳定性。
处方中蛋白VZV gE-NPM为0.1mg/ml, 高温指将冻干品放置40℃恒温箱,分别在3天、7天、14天、28天理化检测SDS-PAGE和SEC-HPLC。
2、实验结果: 如下表15所示。
综合以上实验结果可以看出,各因素对本发明颗粒蛋白疫苗的稳定性影响情况不尽相同,保持免疫原性复合物含量不变(VZV gE-NPM 0.1mg/ml),通过筛选确定出糖、醇、氨基酸、表面活性剂的最佳种类和浓度为:蔗糖25mg/ml、甘露醇50 mg/ml、精氨酸8.7 mg/ml、吐温80 0.5 mg/ml。其中,VZV gE-NPM为SEQ ID NO:15所示的VZV gE-4T与SEQ ID NO:18所示的NPM-4C形成的免疫原性复合物,其制备方法如实施例5所示。
由此,可确定VZV gE-NPM冻干制剂配方:包含VZV gE-NPM 25μg或50μg、蔗糖12.5mg、甘露醇25mg、吐温80 0.25 mg、精氨酸4.35mg、磷酸氢二钠二水合物1.085 mg、磷酸二氢钠二水合物0.62mg,盐酸8.66mg。
实验测得上述最佳冻干制剂配方的关键温度:塌陷温度Tc为-39摄氏度,玻璃态转化温度Tg 51.6摄氏度,玻璃态转化温度Tg' -55(Tc、Tg、Tg'是冻干配方的关键温度,用来指导冻干工艺的预冻和一次干燥温度设置以及存储的最高温度,一般预冻温度要低于Tg',一次干燥温度要低于Tc,成品储存温度要低于Tg)。
考虑到疫苗冻干制剂成品在运输、储存中可能经受的极端条件,将该冻干配方制剂置于高温(40℃7d、14d)、震荡(将样品固定于在脱色摇床上,设定转速240rpm,时长24h)、光照(样品直立放在4℃光照箱内,3d)条件下,复溶24h后体内效价测定可见上述处理后的制剂样品活性均能保持稳定(采用5-6周BALB/c雌鼠,D0初免、D14二免,D14中间采血,D28终点采血及脾脏),免疫学活性均保持良好。
由此,最终确定人用单位剂量重组带状疱疹疫苗(冻干制剂)处方组成,该疫苗为将注射用VZV gE-NPM冻干制剂配方复溶于佐剂中制成,0.5 ml/剂,冻干制剂处方如下表16所示。
其中,VZV gE-NPM、佐剂用量对于人和小鼠在接种时有所不同:作为人用剂量时,VZV gE-NPM、佐剂用量均为小鼠用量的10倍,例如小鼠用VZV gE-NPM 5μg/剂对应人用剂量50μg/剂,小鼠用佐剂为50μl/剂对应人用剂量500μl/剂(0.5 ml/剂)。
表15 重组带状疱疹疫苗冻干VZV gE-NPM制剂处方筛选
表16 VZV gE-NPM疫苗冻干制剂的处方组成
综上所述,上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种免疫原性复合物,其特征在于,包含:
抗原组分,由水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白或其免疫原性片段、连接肽1和结合肽1组成;
颗粒蛋白组分,由纳米颗粒蛋白、连接肽2和结合肽2组成;
所述抗原组分与所述颗粒蛋白组分之间通过结合肽1与结合肽2共价结合。
2.根据权利要求1所述的免疫原性复合物,其特征在于如下(1)-(6)项中的任意一项或者多项:
(1)水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示;
(2)连接肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示;
(3)结合肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
(4)纳米颗粒蛋白选自NPM、AP205或Ferritin;其中,所述NPM的氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示,所述Ferritin的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示,所述AP205的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示;
(5)连接肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示;
(6)结合肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性复合物,其特征在于:所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE蛋白采用氨基酸序列如SEQ ID NO: 10-12任一所示的信号肽表达;抗原组分和/或所述颗粒蛋白组分包含组氨酸标签。
4.根据权利要求3所述的免疫原性复合物,其特征在于,其中抗原组分的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示,所述颗粒蛋白组分的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
5.权利要求1-4任一项所述的免疫原性复合物的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将抗原组分、颗粒蛋白组分编码基因分别连接入表达载体中,构建成表达重组质粒和表达宿主菌株,表达目的蛋白,并纯化;
(2)将步骤(1)中获得的抗原组分与颗粒蛋白组分共孵育,获得免疫原性复合物。
6.一种免疫组合物,其特征在于,包含权利要求1-4任一所述的免疫原性复合物,还包括药学上可接受的载体,所述药学上可接受的载体包含稳定剂、赋形剂、表面活性剂、缓冲剂、pH调节剂,其中稳定剂为蔗糖、精氨酸,赋形剂为甘露醇,表面活性剂为吐温80,缓冲剂为磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物,pH调节剂为盐酸。
7.根据权利要求6所述的免疫组合物,其特征在于,所述免疫组合物为冻干制剂,所述冻干制剂的每单位剂量中包含:VZV gE-NPM 25μg-50μg 、蔗糖12-15 mg 、甘露醇20-25 mg、精氨酸3-5 mg 、聚山梨酯80 0.2-0.3 mg 、磷酸氢二钠二水合物 1-1.2 mg 、磷酸二氢钠二水合物0.6-0.8 mg、盐酸8.0-9.5 mg。
8.一种水痘-带状疱疹疫苗,其特征在于,包含权利要求7所述的免疫组合物和佐剂,所述佐剂包含(w/w)角鲨烯1.5%-5%、司盘85 0.05%-1%、吐温80 0.05%-1%、10mM枸橼酸盐缓冲液。
9.根据权利要求8所述的疫苗,其特征在于,人用每单位剂量的疫苗中,包含5µg、25µg或50µg权利要求1-4任一所述的免疫原性复合物,0.105mg至10.5mg的角鲨烯。
10.权利要求1-4任一所述的免疫原性复合物,权利要求6-7任一所述的免疫组合物,或权利要求8-9任一所述的疫苗在制备用于预防或治疗带状疱疹的药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311596984.XA CN117462666A (zh) | 2022-09-30 | 2023-09-27 | 一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2022112078092 | 2022-09-30 | ||
CN202211207809 | 2022-09-30 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311596984.XA Division CN117462666A (zh) | 2022-09-30 | 2023-09-27 | 一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116983403A true CN116983403A (zh) | 2023-11-03 |
CN116983403B CN116983403B (zh) | 2023-12-19 |
Family
ID=88530579
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311596984.XA Pending CN117462666A (zh) | 2022-09-30 | 2023-09-27 | 一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 |
CN202311254938.1A Active CN116983403B (zh) | 2022-09-30 | 2023-09-27 | 一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311596984.XA Pending CN117462666A (zh) | 2022-09-30 | 2023-09-27 | 一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN117462666A (zh) |
WO (1) | WO2024067888A1 (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110922488A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-03-27 | 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所) | 一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒及制备方法和应用 |
CN112062862A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-12-11 | 中国科学院过程工程研究所 | 疫苗通用载体及其制备方法和应用 |
CN112521511A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-19 | 中山大学 | 一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 |
US20210128717A1 (en) * | 2018-05-04 | 2021-05-06 | SpyBiotech Limited | Vaccine composition |
CN114767844A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-07-22 | 泰州拜奥生物技术有限公司 | 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其应用 |
CN115894707A (zh) * | 2021-07-28 | 2023-04-04 | 江苏瑞科生物技术股份有限公司 | 一种基因重组水痘-带状疱疹病毒融合蛋白及其制备方法和应用 |
CN116143949A (zh) * | 2023-02-23 | 2023-05-23 | 中山大学 | 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE16703049T1 (de) * | 2015-01-15 | 2018-07-12 | University Of Copenhagen | Virusähnliche partikel mit effizienter epitopanzeige |
CA3095216A1 (en) * | 2018-02-28 | 2019-09-06 | University Of Washington | Self-asssembling nanostructure vaccines |
CN111658617A (zh) * | 2019-10-14 | 2020-09-15 | 四川大学 | 一种含铝佐剂疫苗的冻干制剂及其制备方法和用途 |
CN113876943A (zh) * | 2020-07-03 | 2022-01-04 | 神州细胞工程有限公司 | 浓缩的水包油型亚微乳佐剂及其制备方法 |
CN114081943B (zh) * | 2021-11-08 | 2024-04-02 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种水痘-带状疱疹mRNA疫苗组合物及其制备方法和应用 |
-
2023
- 2023-09-27 CN CN202311596984.XA patent/CN117462666A/zh active Pending
- 2023-09-27 CN CN202311254938.1A patent/CN116983403B/zh active Active
- 2023-10-23 WO PCT/CN2023/126034 patent/WO2024067888A1/zh unknown
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20210128717A1 (en) * | 2018-05-04 | 2021-05-06 | SpyBiotech Limited | Vaccine composition |
CN110922488A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-03-27 | 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所) | 一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒及制备方法和应用 |
CN112062862A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-12-11 | 中国科学院过程工程研究所 | 疫苗通用载体及其制备方法和应用 |
CN112521511A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-19 | 中山大学 | 一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 |
CN115894707A (zh) * | 2021-07-28 | 2023-04-04 | 江苏瑞科生物技术股份有限公司 | 一种基因重组水痘-带状疱疹病毒融合蛋白及其制备方法和应用 |
CN114767844A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-07-22 | 泰州拜奥生物技术有限公司 | 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其应用 |
CN116143949A (zh) * | 2023-02-23 | 2023-05-23 | 中山大学 | 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2024067888A1 (zh) | 2024-04-04 |
CN117462666A (zh) | 2024-01-30 |
CN116983403B (zh) | 2023-12-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11993634B2 (en) | Recombinant varicella-zoster virus (VZV) vaccine | |
CN109602901B (zh) | 一种带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用 | |
SU1487802A3 (ru) | Способ получения липосом | |
CN109666685B (zh) | Hpv卵黄抗体及其在制备治疗hpv感染的药物的应用 | |
KR20160079920A (ko) | 신규한 sars 면역원성 조성물 | |
WO2023116374A1 (zh) | 带状疱疹疫苗组合物 | |
JP7417532B2 (ja) | 多価インフルエンザナノ粒子ワクチン | |
JP6808650B2 (ja) | 短縮型ロタウイルスvp4タンパク質およびその適用 | |
WO2023051701A1 (zh) | 抗SARS-CoV-2感染的mRNA、蛋白以及抗SARS-CoV-2感染的疫苗 | |
KR101290475B1 (ko) | 인플루엔자 바이러스 및 비형 간염 바이러스로부터의항원을 포함하는 비로좀 입자 | |
CN115819616A (zh) | 一种基因重组vzv融合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN116983403B (zh) | 一种预防或治疗水痘-带状疱疹病毒相关疾病的免疫组合物产品及其制备方法 | |
CN115010812B (zh) | 一种非洲猪瘟抗原介导细胞免疫的多聚体及应用 | |
CN113278634B (zh) | 一种预防和治疗默克尔细胞癌的新型疫苗 | |
CN115894707A (zh) | 一种基因重组水痘-带状疱疹病毒融合蛋白及其制备方法和应用 | |
JP2024516309A (ja) | コロナウイルス組成物及びインフルエンザ組成物ならびにそれらの使用方法 | |
CN111454977B (zh) | 一种新型鹅星状病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法 | |
EP1802746B1 (en) | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus | |
CN101314035B (zh) | 一种生物多糖微胶囊的用途 | |
WO2024114650A1 (zh) | 一种重组带状疱疹疫苗及其制备与应用 | |
CN117126253B (zh) | Hsv免疫原性重组蛋白、其制备方法和应用、以及用其制备的疫苗 | |
US20240131139A1 (en) | Adjuvanted subcutaneously-administered polypeptide sars-cov-2 vaccines composition and methods | |
CN114099660B (zh) | 一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法 | |
JP7317796B2 (ja) | 呼吸器疾患を治療するための方法および組成物 | |
WO2023192949A2 (en) | Compositions and methods for inducing an immune response against epstein-barr virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |