CN109666685B - Hpv卵黄抗体及其在制备治疗hpv感染的药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种HPV E6/E7重组微环DNA的卵黄抗体及其在制备治疗HPV感染的药物的应用。其中HPV E6/E7重组微环DNA作为核酸抗原直接免疫产蛋鸡获得本发明的卵黄抗体。本发明的卵黄抗体可用于制备治疗HPV感染的药物，卵黄抗体制备成冻干粉并超微粉碎，脂质体包裹后制备得到包裹卵黄抗体的纳米脂质体，抗体跨膜进入细胞，对HPV阳性患者输入高活性抗HPV抗体，直接中和细胞内的HPV病毒的E6/E7蛋白。结合抗菌活性成分(抗菌化合物或妇科炎症病原体特异性抗体)、可接受的药学的载体，制备成阴道喷雾剂、阴道洗液、阴道凝胶剂、阴道软胶囊和硬胶囊、阴道栓剂、阴道膜、阴道片剂和泡腾片以及软膏、霜剂等，也可制成男女士用含片、咀嚼片、口香糖等。

Description

HPV卵黄抗体及其在制备治疗HPV感染的药物的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种HPV卵黄抗体及其在制备治疗HPV感染的药物的应用。
背景技术
宫颈癌占女性妇科恶性肿瘤的第二位，现已成为威胁女性健康的重要疾患，中国每年死于宫颈癌的人数将近5万，宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，研究发现引起宫颈癌的关键是HPV的感染。HPV属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是球形、双链环状DNA病毒。HPV主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。HPV的感染有宿主特异性和组织特异性，只能感染人类的皮肤和粘膜受损的基底细胞。
HPV经损伤的宫颈粘膜首先感染基底细胞层，病毒以少量游离DNA状态潜伏在基底细胞内，以实现免疫逃逸。当基底细胞不断分化、成熟、向粘膜表层迁移，HPV病毒就大量增殖。随着粘膜表层上皮细胞的凋亡，病毒颗粒大量释放到上皮表面，作为新的感染源可进一步加重感染。长期HPV持续感染导致宿主细胞相关基因表达发生变化，可逐渐发展为宫颈癌。
HPV至今已鉴定明确的大约有200多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(LR-HPV)，其中HR-HPV 15种，包括HR-HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌。其中HPV16和HPV18是最主要的流行株。
HR-HPV的持续感染，使HR-HPV DNA与宿主宫颈基底膜细胞DNA整合，引起HR-HPVE2片段(E2基因参与转录调节，E2蛋白是主要的病毒转录因子)的缺失，E2片段的缺失加快宫颈病变的进展，增加恶性转化的可能性，主要原因是E2片段的缺失引起HPV E6/E7 mRNA表达，E6/E7蛋白促进﹑维持HR-HPV DNA与宫颈基底细胞DNA整合，使宫颈基底细胞异常增生，HPV E6/E7 mRNA干扰正常细胞周期，导致细胞基因组不稳定，转录生成的E6/E7蛋白，可以灭活抑癌蛋白P53、RB和P21等，使正常的宿主细胞向恶性方向转化，E6/E7蛋白可以使HPV逃避宿主的免疫监视以及干扰机体免疫反应。E6/E7蛋白为癌蛋白，因此可以针对E6/E7蛋白开发治疗HPV感染的药物。
卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk,IgY)为通过免疫注射产蛋鸡，由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗。DNA核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(IgY)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。而目前尚无核酸抗原免疫获得的HPV E6/E7卵黄抗体用于治疗HPV感染的先例。
目前预防性疫苗Gardasil/Cervarix可有效预防HPV感染，但对于已有HPV感染或癌前病变者并无明显治疗作用，故有必要开发针对HPV感染的治疗性药物。
因此开发一种核酸抗原免疫获得的HPV E6/E7卵黄抗体以及其在治疗HPV感染中的应用，对于治疗治疗HPV感染和预防宫颈癌具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包含HPV E6/E7片段的重组DNA片段，其消除E6/E7致癌能力，并增强了E6/E7的免疫原性。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一段包含HPV E6/E7片段的DNA重组片段，其由信号肽序列区、Flt3L序列区、连接区、HPV E6/E7片段、标签区依次连接组成；
所述HPV E6/E7片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；
所述Flt3L序列区的的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明选择了HPV最主要的流行株HPV16和HPV18，通过对其编码E6和E7蛋白的核苷酸序列的剪切和重排消除其编码的蛋白的致癌能力，同时保留了E6和E7的抗原决定簇，保持其免疫原性。
三种HPV E6/E7核苷酸片段编码三种氨基酸序列的三维结构变形的E6/E7融合多肽。
本发明首先对HPV E6、E7的抗原决定簇进行分析，确定其抗原决定簇。后将抗原决定簇的位置重排，并确认重排后的融合多肽消除了致癌能力。经过筛选，上述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核苷酸序列对应的融合多肽符合既保留免疫原性又消除致癌能力的要求。
作为优选的方案，HPV E6/E7核苷酸片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。
本发明的E6/E7融合多肽是在细胞核内表达的蛋白，其免疫力弱。因此，由信号肽序列表达的信号肽诱导三维结构变形的E6/E7融合蛋白分泌至细胞外，从而增强抗原特异性体液免疫应答及细胞免疫应答。
上述信号肽可使用包括哺乳动物等的高等真核细胞内的信号肽，如tPA(组织型纤溶酶原激活物)、HSV gDs，或可使用生长激素等的分泌信号序列。作为优选的方案，上述信号肽使用tPA。
进一步，本发明的tPA信号肽序列区的核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示。
免疫增强肽指激活与免疫应答相关的细胞(如，树突状细胞等)以增强免疫应答的肽。Flt3L为本发明的免疫增强肽，用于增强HPV-E6/E7重组片段的免疫原性。
作为优选的方案，上述连接区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
作为优选的方案，上述标签区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
作为优选的方案，上述DNA片段尾端还包含终止密码子。
综上所述，本发明的DNA重组片段最优的核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示。
本发明的目的之二在于提供一种重组微环DNA，微环DNA作为目的一的重组DNA片段的载体具有稳定、安全的优点。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种HPV E6/E7重组微环DNA，其包含目的一的重组DNA片段。
微环DNA是亲本质粒(parentalplasmid，PP)体内位点特异性重组的产物。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中间的DNA序列切断，亲本质粒被分成2个超螺旋分子，即具有复制功能的小质粒(miniplasmid，MP)和携带真核表达框的微环(minicircle，MC)DNA。
微环DNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性，可在体内长期表达高水平的转基因产物。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与共价键密闭环状DNA(cccDNA)相同，使MC成为安全、高效的理想载体。
与传统质粒和病毒载体比较，微环DNA在动物细胞内表达外源基因具有一系列独特的优势：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)去除了传统质粒中的抑制信号，表达外源基因较传统质粒稳定，高效。
因此本发明的重组微环DNA具有安全、稳定、高效、产业化生产成本低的优点。
本发明的目的之三在于提供一种重组微环DNA作为核酸抗原制备的卵黄抗体，其抗体效价高，特异性强。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的目的二的重组微环DNA作为核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡，获得卵黄抗体(IgY)。
DNA核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(IgY)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。
因此本发明的HPV E6/E7的卵黄抗体采用重组微环DNA作为核酸抗原免疫获得，具有抗体效价高，特异性强的优点。
本发明的目的之四在于提供一种上述HPV E6/E7的卵黄抗体的制备方法，其制备较为简单，且成本较低。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的HPV E6/E7的卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)目的二的重组微环DNA作为抗原，免疫产蛋鸡；
2)取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄；
3)纯化蛋黄中的所述重组微环DNA的卵黄抗体。
卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。
已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。
工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。
本发明的目的之五在于提供一种上述卵黄抗体在用于制备治疗HPV感染的药物的用途，其制备的药物具有效价高、特异性强的优点。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的卵黄抗体能够直接中和HPV病毒的E6/E7蛋白。E6/E7蛋白可以使HPV逃避宿主的免疫监视以及干扰机体免疫反应。E6/E7蛋白被抗体中和后将不能灭活抑癌蛋白P53、RB和P21，因此可用于治疗HPV感染，以及预防HPV阳性患者产生E6/E7蛋白进而进一步发展为宫颈癌。
由此，本发明的卵黄抗体可用于制备治疗HPV感染的药物。
本发明的目的之六在于提供一种治疗HPV感染的药物，其包含HPV E6/E7卵黄抗体，具有安全、直接中和细胞内的HPV病毒的E6/E7蛋白的优点。
优选的，所述药物为阴道喷雾剂、阴道洗液、阴道凝胶剂、阴道软胶囊或硬胶囊、阴道栓剂、阴道膜、阴道片剂或泡腾片、阴道软膏、阴道霜剂等，或男女士用含片、咀嚼片、口香糖等。
上述药物可用于HPV阳性女性快速阳转阴以及对于宫颈癌、口腔癌的预防有重要意义。本发明的目的之七在于提供转一种用于制备治疗HPV感染的药物的组合物，其包含上述卵黄抗体，并能够完成卵黄抗体的跨膜转运，使其直接进入细胞内，中和细胞内的HPV病毒产生的E6/E7蛋白。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于制备治疗HPV感染的药物的组合物，其特征在于，所述组合物包含脂质体微囊；所述脂质体微囊的活性成分为本发明的卵黄抗体或制备所述卵黄抗体的重组微环DNA免疫的鸡的蛋黄的水溶性成分的一种或多种，所述活性成分由脂质体包裹形成脂质体微囊。
作为优选的方案，上述脂质体为纳米脂质体。
优选的，所述脂质体微囊的制备过程包括以下步骤：
①粉碎：将所述活性成分用冷冻干燥机干燥，制得干粉，使用超微粉碎机粉碎，加工成纳米级超微粒子；
②包裹：将卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，制得溶液1；再将步骤①制得的纳米级超微粒子加入磷酸盐缓冲液中，与溶液1混合，超声处理，蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡后继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心去上清，沉淀用水洗，离心，得沉淀，用PBS稀释，即制得包裹活性成分的脂质体微囊。
优选的，所述活性成分还包含抗妇科炎症病原体的特异性抗体。
进一步，所述抗妇科炎症病原体的特异性抗体由淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌和疱疹病毒混合后匀浆，免疫产蛋鸡，并纯化抗体获得。
优选的，所述抗妇科炎症病原体的特异性抗体与本发明的重组微环DNA免疫获得的卵黄抗体的重量比为0.5-1.5:0.5-1.5。
这种纳米脂质体化的抗人乳头瘤病毒(HPV)和妇科炎症病原体特异性复合抗体具有很强的渗透能力和延效作用，会渗透阴道粘膜并进入体内抑灭人乳头瘤病毒(HPV)及妇科炎症病原体；完全可用于治疗和辅助治疗HPV病毒感染以及妇科多种病毒和致病菌混合感染。
优选的，用于制备阴道凝胶剂时，按重量份数计，所述组合物包含：脂质体微囊2-16份，甘油20-50份，水20-30份，乳糖0.5-2份，蔗糖2-5份，柠檬酸钠0.1-0.5份。
脂质体(liPosome)是由磷脂及其他附加成分形成的一种双分子层小囊泡。由于这种双分子膜层具有生物膜特征,可与细胞融合,将脂质体囊泡中包裹的药物或其他成份导入细胞中。脂质体常作为核酸载体将其导入细胞，目前脂质体作为蛋白载体导蛋白入细胞技术也逐渐得到重视。脂质体可以与细胞膜融合而只将蛋白导入细胞。
本发明通过脂质体方法，实现抗体的跨膜转运，使抗体直接中和细胞内的HPV病毒产生的E6/E7蛋白，使抑癌蛋白P53、RB和P21免于被降解，进而达到治疗HPV感染的效果，以及HPV阳性患者避免发展为宫颈癌。因此上述组合物用于制备治疗HPV感染的药物，对已感染HPV女性预防宫颈癌有重要意义。解决了目前临床上对宫颈粘膜细胞内HPV病毒持续感染造成宫颈癌无有效解决方法的难题，以及能够用于治疗HPV感染。
本发明的有益效果在于：1)本发明提供的HPV E6/E7重组微环DNA包含HPV16的E6/E7基因片段以及信号肽序列和免疫增强肽序列，可作为核酸抗原引起机体免疫反应。2)DNA核酸抗原免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(IgY)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。3)本发明的卵黄抗体可用于制备治疗HPV感染的药物，阴道用药对HPV阳性患者输入高活性抗HPV抗体。4)结合纳米脂质体的方法，本发明的卵黄抗体跨膜进入细胞，直接中和细胞内的HPV病毒产生的E6/E7蛋白。因此本发明的卵黄抗体对于治疗HPV感染和预防宫颈癌有重要意义。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1卵黄抗体(IgY)的制备
1.重组微环DNA的制备
1)设计两端加BglII和SalI酶切位点的SEQ ID NO:8所示的HPV E6/E7重组片段，并合成，得目的基因；
2)将上述目的基因片段和ZY781载体用BglII和SalI同时双酶切，胶回收后按常规方法将目的片段克隆至载体ZY781的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本质粒(PP)；
3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T，过夜培养，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
4)将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/ml kana的TB培养液中，37℃，250rpm过夜培养；
5)取过夜培养的菌液与Minicle Induction Mix按等体积混合，于32℃，250rpm反应5h-8h。反应完结束后，离心，提取质粒，即为重组微环DNA质粒。
其中Minicle Induction Mix：向100ml LB中加入1M NaOH 4ml和20％阿拉伯糖200μl，混合后经0.22μm滤膜过滤。
2.卵黄抗体的制备
1)上述重组微环DNA作为核酸抗原，免疫产蛋鸡：首次免疫,将抗原与等体积弗氏完全佐剂混合乳化,免疫方式为鸡翅根处肌肉注射；初次免疫三周后进行第二次免疫,抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合,剂量与第一次相同；二周后,进行第三次免疫,方法与第二次免疫相同；三次免疫后，每2个月强化免疫1次，使抗体维持在一个较高的水平。首次免疫40天开始捡取高免疫蛋。
2)将所获得的高免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/lHCL液调节PH至5.5–6.0，4–6℃下静置过夜，稀释液8000-12000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得三种微环DNA抗HPV特异性IgY粗品。
将所制得的微环DNA抗HPV特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得三种高活性的微环DNA抗HPV特异性纯IgY。
将所制得的三种微环DNA抗特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得三种微环DNA抗HPV特异性IgY纯品干粉。
应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的微环DNA抗HPV特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量在98％以上。
实施例2治疗HPV感染的凝胶1
1.脂质体微囊的制备
①将实施例1获得的特异性IgY和应用冷冻干燥机干燥，即制干粉。加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，获得纳米化抗体。
②把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化特异性IgY加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L PBS稀释，即制得脂质体微囊。
2.凝胶制备
按重量份数，取脂质体微囊8份，甘油25份，水30份，乳糖1份，蔗糖2份，柠檬酸钠0.3份，混合后调节pH 5.0。
pH为5.0，呈弱酸性，阴道内环境同样偏酸性，避免对阴道内环境稳态的破坏。使用阴道凝胶剂型对患者输入高活性抗HPV抗体，通过纳米脂质体方法，实现抗体的跨膜转运，使抗体直接中和细胞内的HPV病毒产生的E6/E7蛋白，避免抑癌蛋白P53、RB和P21的降解，解决了目前临床上对宫颈粘膜细胞内HPV病毒阳性感染导致宫颈癌无有效解决方法的难题。
除上述阴道凝胶外，本发明的鸡卵黄抗体还可用于制备阴道洗液或阴道栓剂。
实施例3治疗HPV感染的凝胶2
1.脂质体微囊的制备
与实施例2相同。
2.凝胶制备
按重量份数，取脂质体微囊15份，甘油40份，水22份，乳糖2.5份，蔗糖3份，柠檬酸钠0.2份，混合后调节pH 5.0。
实施例4治疗HPV感染的凝胶3-微环DNA抗HPV和妇科炎症病原体特异性复合IgY制剂
1.抗妇科炎症病原体的特异性复合IgY抗体
①抗原制备
从阴道炎患者体内摄取淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌以及疱疹病毒，并采用常规方法培养这些病原菌、毛滴虫和疱疹病毒。
先将所制得的四种致病菌和毛滴虫按1:1:1:1:1的比例混合并用常规方法粉碎，然后以5:1的比例与疱疹病毒提纯液混合，并置入“组织捣碎匀浆机”中以8000-12000rpm充分捣碎搅拌均匀。然后将这种细菌病毒蛋白混合液以1-10:1-10的比例(通常为1:1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得细菌病毒蛋白复合抗原。
②抗体制备
与实施例1中卵黄抗体的制备过程相同。
应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗妇科炎症病原体特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量为98％以上。
2.脂质体微囊的制备
取制备得到的抗妇科炎症病原体特异性IgY，过程按照实施例2中脂质体微囊的制备方法进行。
3.制备抗HPV和妇科炎症病原体特异性复合IgY纳米脂质体微囊
将所制得的微环DNA抗HPV特异性IgY纳米脂质体微囊(实施例2)按1:1与抗妇科炎症病原体特异性IgY纳米脂质体微囊混合，加入匀质机充分混合均匀；然后，再用超声波进一步匀化，即制得纳米脂质体抗人乳头瘤病毒(HPV)和妇科炎症病原体特异性复合IgY。
4.凝胶制备
按重量份数，取步骤3获得的复合IgY纳米脂质体微囊16份，甘油40份，水28份，乳糖1份，蔗糖3份，柠檬酸钠0.4份，混合后调节pH 5.0。
这种纳米脂质体化的抗人乳头瘤病毒(HPV)和妇科炎症病原体特异性复合抗体具有很强的渗透能力和延效作用，会渗透阴道粘膜并进入体内抑灭人乳头瘤病毒(HPV)及妇科炎症病原体；完全可用于治疗和辅助治疗HPV病毒感染以及妇科多种病毒和致病菌混合感染。
实施例5凝胶的保存情况试验
取实施例1制备的卵黄抗体和实施例2制备的脂质体微囊、凝胶1进行试验。将三者保存于24℃恒温箱，每隔30天取出，应用ELISA方法对抗体的保存情况进行检测。检测结果如表1所示。
表1 ELISA方法检测卵黄抗体效价结果
Figure BDA0001913220180000111
Figure BDA0001913220180000121
实验证明，随着保存时间的延长，卵黄抗体的效价降低最快，其次为脂质体微囊，本发明制备的卵黄抗体凝胶的保存情况最好。
实施例6效果检验
1.临床试验
①试验对象：选择HPV阳性患者72例，年龄23-58岁。纳入标准包括：一过性感染、持续或反复感染患者，包括部分轻度细胞学改变(CINⅡ级以下)的患者，剔除CINⅢ以上、罹患宫颈癌以及宫颈癌术后患者。
②试验过程
试验对象分为实验组和对照组，分别使用本发明的卵黄抗体凝胶1(实施例2)(42例)和干扰素制剂(30例)。
标本采集：在患者非月经期取样，取样前避免阴道内用药；使用获得药监局认证的专用一次性宫颈细胞取样系统进行取样，切忌使用棉拭子取样；检测所需样本为宫颈脱落细胞而非宫颈分泌物，取样前一定要求使用棉拭子将宫颈分泌物擦拭干净，尽量避免样本中含过多的血液及黏液；按照厂家提供一次性宫颈细胞取样系统说明书进行取样。
治疗周期：实验组使用本发明的凝胶，连续使用3个月，第一个月除月经期及经期前后各3天外，连续使用本产品18天，每天1支，每支2.5g；第2、3月隔日使用。停用4周后复查。对照组使用外用干扰素制剂，连续使用3个月，停用4周后复查。
疗效观察指标：采用广东凯普生物科技股份有限公司的检测产品21种HPV分型检测试剂盒(PCR+膜杂交法)对HPV阳性患者治疗前后进行检测，判定HPV阳转阴的情况并记录。
2.结论：卵黄抗体凝胶实验组临床结果显示，转阴病例数38例，未转阴数4例，转阴率90.48％；外用干扰素对照组转阴病例数11例，未转阴数19例，转阴率36.7％。
由此，本发明的HPV E6/E7卵黄抗体对于HPV感染患者阳转阴有重要的作用，可用于制备治疗HPV感染的药物。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>江苏润洁生物科技有限公司
<120> HPV卵黄抗体及其在制备治疗HPV感染的药物的应用
<160> 8
<170> PatentIn Version 2.1
<210> 1
<211>729
<212> DNA
<213> HPV16 E6/E7
<400> 1
aggaagctgc cccagctgtg caccgagggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 60
ggcggcggca gctacaacaa gcccctgtgc gacctgctga tcaggtgcat caactgccag 120
aagcccctgt gccccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 180
aacccctacg ccgtgtgcga caagtgcctg aagttctaca gcaagggcgg cggcggcagc 240
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc cagaccacca tccacgacat catcctggag 300
tgcgtgtact gcaagcagca gctgctgagg agggaggtgt acgacttcgc cttcagggac 360
ctgtgcatcg tgtacggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420
agcgagtaca ggcactactg ctacagcctg tacggcaggt gcatgagctg ctgcaggacc 480
ctgcacgagt acatgctgga cctgggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 540
ggcggcagcc actacaacat cgtgaccttc tgctgcaagt gcgacagcac cctgaggctg 600
tgcgtgcaga gcacccacgt ggacatcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 660
ggcggcggca gcctgatggg caccctgggc atcgtgtgcc ccatcaccac cgacctgtac 720
tgctacgag 729
<210> 2
<211>777
<212> DNA
<213> HPV18 E6/E7
<400> 2
aggccctaca agctgcccga cctgtgcacc gagctgtaca acctgctgat caggtgcctg 60
aggtgccaga agcccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 120
gccttcaagg acctgttcgt ggtgtacagg gacagcatcc cccacgccgc ctgccacaag 180
tgcatcgact tctacagcag gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 240
ggcagcctgc aggacatcga gatcacctgc gtgtactgca agaccgtgct ggagctgacc 300
gaggtgttcg agggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgag 360
ctgaggcact acagcgacag cgtgtacggc tacaggggcc agtgccacag ctgctgcaac 420
cccaaggcca ccctgcagga catcgtgctg cacctggacg gcgtgaacca ccagcacctg 480
cccgccggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cgacctgagg 540
gccttccagc agctgttcct gaacaccctg agcttcgtgt gcccctgggg cggcggcggc 600
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcaggcaca ccatgctgtg catgtgctgc 660
aagtgcgagg ccaggatcga gctggtggtg gagagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 720
ggcagcggcg gcggcggcag caacgagatc cccgtggacc tgctgtgcca cgagcag 777
<210> 3
<211>1506
<212> DNA
<213> HPV16/18 E6/E7
<400> 3
aggaagctgc cccagctgtg caccgagggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 60
ggcggcggca gctacaacaa gcccctgtgc gacctgctga tcaggtgcat caactgccag 120
aagcccctgt gccccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 180
aacccctacg ccgtgtgcga caagtgcctg aagttctaca gcaagggcgg cggcggcagc 240
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc cagaccacca tccacgacat catcctggag 300
tgcgtgtact gcaagcagca gctgctgagg agggaggtgt acgacttcgc cttcagggac 360
ctgtgcatcg tgtacggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420
agcgagtaca ggcactactg ctacagcctg tacggcaggt gcatgagctg ctgcaggacc 480
ctgcacgagt acatgctgga cctgggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 540
ggcggcagcc actacaacat cgtgaccttc tgctgcaagt gcgacagcac cctgaggctg 600
tgcgtgcaga gcacccacgt ggacatcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 660
ggcggcggca gcctgatggg caccctgggc atcgtgtgcc ccatcaccac cgacctgtac 720
tgctacgaga ggccctacaa gctgcccgac ctgtgcaccg agctgtacaa cctgctgatc 780
aggtgcctga ggtgccagaa gcccggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 840
ggcggcagcg ccttcaagga cctgttcgtg gtgtacaggg acagcatccc ccacgccgcc 900
tgccacaagt gcatcgactt ctacagcagg ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 960
ggcggcggcg gcagcctgca ggacatcgag atcacctgcg tgtactgcaa gaccgtgctg 1020
gagctgaccg aggtgttcga gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 1080
ggcagcgagc tgaggcacta cagcgacagc gtgtacggct acaggggcca gtgccacagc 1140
tgctgcaacc ccaaggccac cctgcaggac atcgtgctgc acctggacgg cgtgaaccac 1200
cagcacctgc ccgccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1260
gacctgaggg ccttccagca gctgttcctg aacaccctga gcttcgtgtg cccctggggc 1320
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcaggcacac catgctgtgc 1380
atgtgctgca agtgcgaggc caggatcgag ctggtggtgg agagcggcgg cggcggcagc 1440
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc aacgagatcc ccgtggacct gctgtgccac 1500
gagcag 1506
<210> 4
<211> 471
<212> DNA
<213>Flt3L序列
<400> 4
atcacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct ccgacttcgc tgtcaaaatc 60
cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca ccgtggcctc caacctgcag 120
gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg cacagcgctg gatggagcgg 180
ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg agcgcgtgaa cacggagata 240
cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct gtcttcgctt cgtccagacc 300
aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg tggcgctgaa gccctggatc 360
actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc agcccgactc ctcaaccctg 420
ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc cgacagcccc g 471
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213>连接区
<400> 5
ggcggcggca gcggcgat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213>HIS标签
<400> 6
catcatcacc atcatcat 18
<210> 7
<211> 69
<212> DNA
<213> 信号肽tPa
<400> 7
atggatgcta tgaaacgggg cctgtgctgc gtgctgctcc tgtgcggcgc tgtgtttgtg 60
agccctagc 69
<210> 8
<211>2085
<212> DNA
<213> HPV16/18 E6/E7重组片段
<400> 8
atggatgcta tgaaacgggg cctgtgctgc gtgctgctcc tgtgcggcgc tgtgtttgtg 60
agccctagca tcacccagga ctgctccttc caacacagcc ccatctcctc cgacttcgct 120
gtcaaaatcc gtgagctgtc tgactacctg cttcaagatt acccagtcac cgtggcctcc 180
aacctgcagg acgaggagct ctgcgggggc ctctggcggc tggtcctggc acagcgctgg 240
atggagcggc tcaagactgt cgctgggtcc aagatgcaag gcttgctgga gcgcgtgaac 300
acggagatac actttgtcac caaatgtgcc tttcagcccc cccccagctg tcttcgcttc 360
gtccagacca acatctcccg cctcctgcag gagacctccg agcagctggt ggcgctgaag 420
ccctggatca ctcgccagaa cttctcccgg tgcctggagc tgcagtgtca gcccgactcc 480
tcaaccctgc cacccccatg gagtccccgg cccctggagg ccacagcccc gacagccccg 540
ggcggcggca gcggcgatag gaagctgccc cagctgtgca ccgagggcgg cggcggcagc 600
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc tacaacaagc ccctgtgcga cctgctgatc 660
aggtgcatca actgccagaa gcccctgtgc cccggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 720
agcggcggcg gcggcagcaa cccctacgcc gtgtgcgaca agtgcctgaa gttctacagc 780
aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcca gaccaccatc 840
cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgc aagcagcagc tgctgaggag ggaggtgtac 900
gacttcgcct tcagggacct gtgcatcgtg tacggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 960
agcggcggcg gcggcagcag cgagtacagg cactactgct acagcctgta cggcaggtgc 1020
atgagctgct gcaggaccct gcacgagtac atgctggacc tgggcggcgg cggcagcggc 1080
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccac tacaacatcg tgaccttctg ctgcaagtgc 1140
gacagcaccc tgaggctgtg cgtgcagagc acccacgtgg acatcggcgg cggcggcagc 1200
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ctgatgggca ccctgggcat cgtgtgcccc 1260
atcaccaccg acctgtactg ctacgagagg ccctacaagc tgcccgacct gtgcaccgag 1320
ctgtacaacc tgctgatcag gtgcctgagg tgccagaagc ccggcggcgg cggcagcggc 1380
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgcc ttcaaggacc tgttcgtggt gtacagggac 1440
agcatccccc acgccgcctg ccacaagtgc atcgacttct acagcagggg cggcggcggc 1500
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcctgcagg acatcgagat cacctgcgtg 1560
tactgcaaga ccgtgctgga gctgaccgag gtgttcgagg gcggcggcgg cagcggcggc 1620
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgagctg aggcactaca gcgacagcgt gtacggctac 1680
aggggccagt gccacagctg ctgcaacccc aaggccaccc tgcaggacat cgtgctgcac 1740
ctggacggcg tgaaccacca gcacctgccc gccggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 1800
agcggcggcg gcggcagcga cctgagggcc ttccagcagc tgttcctgaa caccctgagc 1860
ttcgtgtgcc cctggggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1920
aggcacacca tgctgtgcat gtgctgcaag tgcgaggcca ggatcgagct ggtggtggag 1980
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcaa cgagatcccc 2040
gtggacctgc tgtgccacga gcagcatcat caccatcatc attaa 2085

Claims (8)

1.一段包含HPV E6/E7片段的DNA重组片段，其特征在于，由信号肽序列区、Flt3L序列区、连接区、HPV E6/E7片段、标签区依次连接组成；
所述HPV E6/E7片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述Flt3L序列区的的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述连接区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述标签区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述信号肽序列区的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
2.重组微环DNA，其特征在于，所述微环DNA包含权利要求1所述的DNA重组片段。
3.权利要求2所述的重组微环DNA作为核酸抗原制备的卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体的制备方法包括以下步骤：
1）权利要求2所述的重组微环DNA作为核酸抗原，免疫产蛋鸡：首次免疫，将所述核酸抗原与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，免疫方式为鸡翅根处肌肉注射；初次免疫三周后进行第二次免疫，所述核酸抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合，剂量与第一次相同；二周后，进行第三次免疫，方法与第二次免疫相同；三次免疫后，每 2 个月强化免疫 1 次；首次免疫40天开始捡取免疫蛋；
2）取步骤1）所述的免疫蛋，获得蛋黄；
3）纯化蛋黄中的所述重组微环DNA的卵黄抗体。
4.权利要求3所述的卵黄抗体在用于制备治疗HPV感染的药物的用途。
5.一种用于制备治疗HPV感染的药物的组合物，其特征在于，所述组合物包含脂质体微囊；所述脂质体微囊的活性成分为权利要求3所述的卵黄抗体，所述活性成分由脂质体包裹形成脂质体微囊。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述脂质体微囊的制备过程包括以下步骤：
①粉碎：将所述活性成分用冷冻干燥机干燥，制得干粉，使用超微粉碎机粉碎，加工成纳米级超微粒子；
②包裹：将卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，制得溶液1；再将步骤①制得的纳米级超微粒子加入磷酸盐缓冲液中，与溶液1混合，超声处理，蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡后继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心去上清，沉淀用水洗，离心，得沉淀，稀释后制得包裹活性成分的脂质体微囊。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，用于制备阴道用药时，所述活性成分还包含抗妇科炎症病原体的特异性抗体；
所述抗妇科炎症病原体的特异性抗体是由淋球菌、白色念珠菌、毛滴虫、金黄色葡萄球菌、阴道嗜血杆菌和疱疹病毒混合后匀浆，免疫产蛋鸡，并纯化获得的卵黄抗体。
8.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，用于制备阴道凝胶剂时，按重量份数计，所述组合物包含：脂质体微囊2-16份，甘油20-50份，水20-30份，乳糖0.5-2份，蔗糖2-5份和柠檬酸钠0.1-0.5份。
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