CN109232735B - 禽腺病毒蛋黄抗体、及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法，该方法操作简便，三次免疫即能制备出含禽腺病毒蛋黄抗体的免疫鸡蛋。该方法制备的禽腺病毒蛋黄抗体能针对多种地域来源的禽腺病毒进行有效保护和治疗，对于1～30日龄的雏鸡均能有效保护和治疗。

Description

禽腺病毒蛋黄抗体、及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种禽腺病毒蛋黄抗体，及其制备方法和应用,属于生物医药领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)感染的疾病是因I群禽腺病毒(FAdV)发病的传染病。FAdV属于腺病毒科(Family Adenoviridae)，基因组(gemone)由没有分节的线形双链(double-stranded)DNA构成。
禽腺病毒呈无囊膜的球形结构,其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列,每个病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA，线状双股DNA与核心蛋白形成直径为60～65nm的髓芯,被包裹于衣壳内。衣壳呈二十面体对称,由252个直径8～10nm的壳粒组成,壳粒排列在三角形的面上,三角形的边每边6个壳粒,其中240个为六邻体(非顶点壳粒),另12个为五邻体基底(顶点壳粒，Penton蛋白)。每个五邻体基底上结合着2根长9～77.5nm的纤维突起(Fiber-1蛋白和Fiber-2蛋白)。
近年来，禽腺病毒引起的疾病发病率突然提高，3～5周龄肉鸡发病尤为危害，严重时死亡率突然上升至80％以上，且禽腺病毒感染鸡群后，潜伏期短，很快成批死亡。针对该病毒引起的疾病，常见的抗病毒和抗菌治疗效果不佳，治愈率低于40％，且耐过鸡发育受阻，严重影响经济效益。
针对该病发病特点，蛋黄抗体是一种潜在的有效治疗手段，然而在现有技术中，由于禽腺病毒不易培养，难以获得高滴度的病毒，尤其是不同分离株差异较大，导致制备的疫苗往往难以提供理想的免疫效果，无法制备出效果良好的蛋黄抗体。
因此，临床上急需要开发出治疗效果良好的蛋黄抗体，能够有效防止该病的流行。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种禽腺病毒蛋黄抗体，该蛋黄抗体能够有效预防和治疗禽腺病毒的感染。
本发明涉及一种制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法，本发明的制备方法操作简便，仅经三次免疫过程即能制备含有高效价的禽腺病毒蛋黄抗体。
本发明还涉及所述方法制备的蛋黄抗体，本发明的蛋黄抗体能对1～30日龄的雏鸡有效地保护和治疗。
本发明还涉及具有广谱性保护和治疗作用的禽腺病毒蛋黄抗体，能针对多种地域来源的禽腺病毒起保护和治疗作用，临床上能对禽腺病毒感染进行有效控制。
本发明还涉及能针对不同血清型腺病毒提供有效的保护和治疗效果的禽腺病毒蛋黄抗体，能针对鸡群不同血清型腺病毒均可提供有效的保护和治疗。
本发明还涉及含有免疫量的禽腺病毒蛋黄抗体的疫苗组合物。
本发明还涉及禽腺病毒蛋黄抗体在制备预防和治疗禽腺病毒感染的药物中的应用。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“禽腺病毒”(Fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科，基因组由没有分节的线形双链DNA构成，所引发的临床症状包括病鸡萎顿，蹲伏，羽毛蓬松，冠髯和面部皮肤苍白，生长不良。病理变化以卡他性气管炎和心包积液综合征为特征。
本发明涉及一种制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)制备禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗；步骤(2)使用所述步骤(1)制备的禽腺病毒亚单位疫苗免疫产蛋鸡，免疫后测定免疫鸡蛋蛋黄中禽腺病毒抗体琼扩效价，收集所述禽腺病毒抗体琼扩效价≥1:32的免疫鸡蛋；步骤(3)分离所述步骤(2)收集的免疫鸡蛋的蛋黄，灭活，提纯；以及步骤(4)对所述步骤(3)灭活并提纯后的蛋黄抗体微滤除菌、超滤除病毒。
本发明的制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法操作过程简单，仅需免疫三次即可制备含有高效价的禽腺病毒蛋黄抗体。本发明首次采用亚单位疫苗免疫产蛋鸡，亚单位疫苗刺激机体快速产生抗体，抗体效价高，安全性好，以此制备的蛋黄抗体能有效防治禽腺病毒的侵染。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(1)中禽腺病毒Fiber-2蛋白为SEQ.ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(1)中所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗的Fiber-2蛋白含量为AGP效价≥1:2。
本发明制备方法中亚单位疫苗Fiber-2蛋白含量为1:2的低含量时，即可制备含有高效价的禽腺病毒蛋黄抗体。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(1)中所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗的Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(2)免疫程序为：所述产蛋鸡120日龄时肌肉注射所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗1ml/只，14日后等剂量肌肉注射所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗，二免10日后再用等剂量所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗肌肉注射进行第三次强化免疫。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(3)中分离蛋黄后还包括使用蒸馏水稀释蛋黄工序，稀释倍数为一倍；所述灭活为低温巴氏灭活，所述低温巴氏灭活为62.5℃温度下灭活30min。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(3)中提纯步骤包括：酸化蒸馏水法提纯步骤和辛酸法提纯步骤；所述酸化蒸馏水法提纯步骤为：先在隔层反应罐的隔层中加入相当于所述灭活的免疫鸡蛋蛋黄6倍体积的灭菌蒸馏水，所述蒸馏水pH值为4.2，并降温至4℃，然后，将灭活的所述蛋黄液加入反应罐，搅拌，4℃静置4h，离心分离上清液；所述辛酸法提纯步骤为：按所述上清液总量的0.2％体积加入辛酸，搅拌，室温放置4h，过滤至澄清，再按所述滤液总量的0.1％加入饱和甲醛溶液，搅拌，室温放置24h。
本发明采用了物理、化学等多重灭活技术，使用酸化水稀释法结合辛酸法、高速离心、超滤等现代生物技术，将蛋黄中的免疫球蛋白进行有效的分离纯化，蛋黄抗体中不含任何有害物质和外源性污染，安全性高，注射免疫鸭群时对胴体品质无影响，可工业化生产。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(1)制备禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗还含有鸡法氏囊病病毒VP2蛋白抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述鸡法氏囊病病毒VP2蛋白抗原为鸡传染性法氏囊病病毒成都株VP2蛋白抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述鸡法氏囊病病毒VP2蛋白抗原含量为AGP效价1:16。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法中，所述步骤(2)使用所述步骤(1)制备的禽腺病毒亚单位疫苗免疫产蛋鸡，免疫后测定免疫鸡蛋蛋黄中禽腺病毒抗体琼扩效价、法氏囊病病毒抗体琼扩效价，收集禽腺病毒抗体琼扩效价≥1:32、法氏囊病病毒抗体琼扩效价≥1∶64的免疫鸡蛋。
本发明还涉及所述方法制备的禽腺病毒蛋黄抗体。本发明的蛋黄抗体能对1～30日龄的雏鸡有效地保护和治疗；且具有广谱性，能针对多种地域来源的禽腺病毒起保护和治疗作用，临床上能对禽腺病毒感染进行有效控制。本发明禽腺病毒蛋黄抗体还能针对不同血清型腺病毒提供有效的保护和治疗效果，不同血清型腺病毒包括血清型2、3、4、5、8、11型。
本发明的制备方法制备的禽腺病毒、法氏囊病病毒蛋黄抗体能对1～30日龄的雏鸡进行有效地预防和治疗。
本发明还涉及所述的禽腺病毒蛋黄抗体在制备预防和治疗禽腺病毒的药物中的应用。
术语“预防和/或治疗”在涉及禽腺病毒感染时是指抑制禽腺病毒的复制、抑制禽腺病毒的传播或防止禽腺病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽腺病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本发明还涉及禽腺病毒蛋黄抗体制备的疫苗组合物，该疫苗组合物能对1～30日龄的雏鸡有效地保护和治疗。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗的制备
1、表达载体构建
提取禽腺病毒FAV-HN株(禽腺病毒，FAV-HN株(Fowl aviadenovirus,strain FAV-HN)，保藏号为：CCTCC NO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日)DNA基因组，扩增Fiber-2基因，进行测序，根据测序结果对Fiber-2基因进行密码子优化，优化后的Fiber-2基因序列如序列表SEQ IDNO.1所示。
优化后Fiber-2基因送由苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg卡那霉素的LB培养基中培养过夜，扩增后的菌种提取质粒并测序分析，确定序列正确，阳性克隆即为pET28a_FAdV_Fiber-2表达菌株。
2、Fiber-2蛋白的表达
将含有上述制备的pET28a_FAdV_Fiber-2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4-0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1-1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(组成为：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH 7.4,定容1L)重悬菌体，超声破碎菌体，破碎后的菌体离心取上清。上清液表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，Fiber-2蛋白的AGP效价达到1：64，内毒素含量为0.46×105EU/ml。
3、大肠杆菌表达Fiber-2蛋白内毒素清除
1.5ml离心管中加入0.5ml待处理溶液和终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(Triton X-114)(5μl)，涡旋振荡。样品在冰上放置5分钟。涡旋振荡冷却的样品后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品放置于37℃离心60s。离心过后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的洗涤剂将会以油滴的形状残留在离心管底部。整个操作循环3次。经测定，Fiber-2蛋白的AGP效价达到1：64，内毒素含量为0.008×105EU/ml。
结果表明Triton X-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素，且对Fiber-2蛋白免疫原性没有影响。
4、Fiber-2蛋白亚单位疫苗的制备
将按上述方法纯化后的Fiber-2蛋白缓缓加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表1。
表1禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗配比
组分 疫苗1
Fiber-2蛋白(AGP效价) 1：2
白油佐剂(V/V％) 66％
实施例2禽腺病毒蛋黄抗体的制备
1、免疫程序
产蛋鸡120日龄时肌肉注射1ml/只疫苗1，14日后等剂量肌肉注射疫苗1，所述二免10日后再用等剂量肌肉注射疫苗1进行第三次强化免疫。
2、收集免疫鸡蛋
从三免后每隔10日抽样测定免疫鸡蛋蛋黄中禽腺病毒抗体，琼扩效价≥1∶32为合格。将所收集的经检测合格的免疫鸡蛋，置于4℃贮存备用。
3、蛋黄的收获及灭活
将蛋壳消毒，采取手工或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经121℃、30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min。
4、蛋黄的提纯
先在隔层反应罐的隔层中加入相当于原蛋黄6倍体积的、pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至4℃。然后，将灭活的蛋黄液加入反应罐，边加边搅拌，4℃静置4h。管式低温连续离心机14000rpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。
按总量的0.2％(体积比)加入辛酸，搅拌均匀，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，再按总量的0.1％加入饱和甲醛溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次。
用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒，制得蛋黄抗体提取液。
实施例3禽腺病毒蛋黄抗体预防试验
3.1 1日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体预防试验
取1日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第1组经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体0.3ml/只，第2组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表2。
表2禽腺病毒蛋黄抗体对1日龄鸡预防试验结果
Figure BDA0001345808440000081
结果显示，第2组对照组全部发病死亡，而第1组免疫组对免疫鸡产生了良好的免疫保护效果。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对1日龄鸡群可提供有效的免疫保护，保护率100％。
3.2 5日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体预防试验
取5日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第3组经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体0.3ml/只，第4组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表3。
表3禽腺病毒蛋黄抗体对5日龄鸡预防试验结果
Figure BDA0001345808440000082
结果显示，第4组对照组全部发病死亡，而第3组免疫组对免疫鸡产生了良好的免疫保护效果。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对5日龄鸡群可提供有效的免疫保护，保护率100％。
3.3 10日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体预防试验
取10日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第5组经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体0.3ml/只，第6组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表4。
表4禽腺病毒蛋黄抗体对10日龄鸡预防试验结果
Figure BDA0001345808440000091
结果显示，第6组对照组全部发病死亡，而第5组免疫组对免疫鸡产生了好的免疫保护效果。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对10日龄鸡群可提供有效的免疫保护，保护率100％。
3.4 20日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体预防试验
取20日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第7组经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体0.5ml/只，第8组皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表5。
表5禽腺病毒蛋黄抗体对20日龄鸡预防试验结果
Figure BDA0001345808440000092
结果显示，第8组对照组全部发病死亡，而第7组免疫组对免疫鸡产生了良好的免疫保护效果。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对20日龄鸡群可提供有效的免疫保护，保护率100％。
3.5 30日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体预防试验
取30日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第9组经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体0.5ml/kg体重，第10组皮下注射生理盐水0.5ml/kg体重，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表6。
表6禽腺病毒蛋黄抗体对30日龄鸡预防试验结果
Figure BDA0001345808440000101
结果显示，第10组对照组全部发病死亡，而第9组免疫组对免疫鸡产生了良好的免疫保护效果。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对30日龄鸡群可提供有效的免疫保护，保护率100％。
以上结果表明，本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体对免疫鸡产生了较好的免疫保护，免疫效果良好。
实施例4禽腺病毒蛋黄抗体治疗试验
4.1 1日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体治疗试验
取1日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第11组、12组分别用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第11组为治疗组，待有3只鸡出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.0ml/只；第12组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表7。
表7禽腺病毒蛋黄抗体对1日龄鸡治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000111
结果显示，第12组全部发病死亡，而第11组治疗组对鸡群产生了良好的治疗效果，全部健活。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对1日龄发病鸡群可提供有效的治疗效果，治愈率100％。
4.2 5日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体治疗试验
取5日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第13组、14组分别用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第13组为治疗组，待有3只鸡出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.0ml/只；第14组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表8。
表8禽腺病毒蛋黄抗体对5日龄鸡治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000112
结果显示，第14组全部发病死亡，而第13组治疗组对鸡群产生了良好的治疗效果，全部健活。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对5日龄发病鸡群可提供有效的治疗效果，治愈率100％。
4.3 10日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体治疗试验
取10日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第15组、16组分别用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第15组为治疗组，待有3只鸡出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.0ml/只；第16组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表9。
表9禽腺病毒蛋黄抗体对10日龄鸡治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000121
结果显示，第16组全部发病死亡，而第15组治疗组对鸡群产生了良好的治疗效果，全部健活。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对10日龄发病鸡群可提供有效的治疗效果，治愈率100％。
4.4 20日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体治疗试验
取20日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第17组、18组分别用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第17组为治疗组，待有3只鸡出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.5ml/只；第18组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表10。
表10禽腺病毒蛋黄抗体对20日龄鸡治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000122
结果显示，第18组全部发病死亡，而第17组治疗组对鸡群产生了良好的治疗效果，全部健活。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对20日龄发病鸡群可提供有效的治疗效果，治愈率100％。
4.5 30日龄雏鸡禽腺病毒蛋黄抗体治疗试验
取30日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第19组、20组分别用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第19组为治疗组，待有3只鸡出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.5ml/kg体重；第20组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表11。
表11禽腺病毒蛋黄抗体针对30日龄鸡治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000131
结果显示，第20组全部发病死亡，而第19组治疗组对鸡群产生了良好的治疗效果，全部健活。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对30日龄发病鸡群可提供有效的治疗效果，治愈率100％。
以上结果表明，本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体对免疫鸡产生了较好的治疗效果，治疗效果良好。
实施例5禽腺病毒蛋黄抗体交叉保护试验
5.1禽腺病毒蛋黄抗体交叉保护预防试验
取5日龄的SPF鸡100只，分成10组。每组10只，第21组～第25组分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体0.3ml/只，第26组～第30组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，用异型血清型(血清型2、3、5、8、11)病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表12。
表12禽腺病毒蛋黄抗体交叉保护预防试验结果
Figure BDA0001345808440000132
Figure BDA0001345808440000141
结果显示，第26组～第30组对照组不同程度发病死亡，而第21组～第25组免疫组对免疫鸡均产生了良好的免疫保护效果，保护率100％。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体对不同血清型腺病毒攻击可提供有效的免疫保护。
5.2禽腺病毒蛋黄抗体交叉保护治疗试验
取5日龄的SPF鸡100只，分成10组。每组10只，第31组、36组分别用血清2型病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第32组、37组分别用血清3型病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第33组、38组分别用血清5型病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第34组、39组分别用血清8型病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第35组、40组分别用血清11型病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第31组～第35组为治疗组，待有鸡只出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.0ml/只；第36组～第40组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表13。
表13禽腺病毒蛋黄抗体交叉保护治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000142
Figure BDA0001345808440000151
结果显示，第36组～第40组对照组不同程度发病死亡，而第31组～第35组治疗组对鸡群均产生了良好的治疗效果，全部健活，治愈率100％。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对鸡群不同血清型腺病毒攻击可提供有效的治疗效果。
实施例6禽腺病毒蛋黄抗体广谱性保护试验
6.1禽腺病毒蛋黄抗体广谱性预防试验
取5日龄的SPF鸡100只，分成10组。每组10只，第41组～第45组分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体0.3ml/只，第46组～第50组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，第41组、第46组分别用新近从中国河南省分离的血清4型禽腺病毒HN04株强毒株攻毒；第42组、第47组分别用新近从中国江苏省分离的血清4型禽腺病毒JS02株强毒株攻毒；第43组、第48组分别用新近从中国吉林省分离的血清4型禽腺病毒JL12株强毒株攻毒；第44组、第49组分别用新近从中国重庆市分离的血清4型禽腺病毒CQ06株强毒株攻毒；第45组、第50组分别用新近从中国广东省分离的血清4型禽腺病毒GD16株强毒株攻毒；攻毒剂量均为105.0TCID50/只，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表14。
表14禽腺病毒蛋黄抗体广谱性预防试验结果
Figure BDA0001345808440000152
Figure BDA0001345808440000161
结果显示，第46组～第50组对照组全部发病死亡，而第41组～第45组免疫组对免疫鸡均产生了良好的免疫保护效果，保护率100％。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体具有广谱的免疫原性，对于不同地域来源的禽腺病毒攻击均能提供有效的免疫保护。
6.2禽腺病毒蛋黄抗体广谱性治疗试验
取5日龄的SPF鸡100只，分成10组。每组10只，第51组、56组分别用新近从中国河南省分离的血清4型禽腺病毒HN04株强毒株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第52组、57组分别用新近从中国江苏省分离的血清4型禽腺病毒JS02株强毒株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第53组、58组分别用新近从中国吉林省分离的血清4型禽腺病毒JL12株强毒株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第54组、59组分别用新近从中国重庆市分离的血清4型禽腺病毒CQ06株强毒株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击；第55组、60组分别用新近从中国广东省分离的血清4型禽腺病毒GD16株强毒株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第51组～第55组为治疗组，待有3只鸡出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.0ml/只；第56组～第60组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表15。
表15禽腺病毒蛋黄抗体广谱性治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000171
结果显示，第56组～第60组对照组全部发病死亡，而第51组～第55组治疗组对鸡群均产生了良好的治疗效果，全部健活，治愈率100％。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体具有广谱的治疗效果，对于不同地域来源的禽腺病毒攻击均能提供有效的治疗效果。
实施例7禽腺病毒蛋黄抗体田间治疗试验
河南商品化鸡场20日龄雏鸡发病,表现精神不振，食欲减退，翅膀下垂，羽毛蓬乱等，于21日龄开始出现死亡，剖检发现肝脏肿大、出血，大量心包积液，采集肝脏组织进行RT-PCR检测，结果为禽腺病毒阳性。22日龄时随机分成两组，第61组使用本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体颈部皮下注射1.5ml/只，第62组使用抗生素/抗病毒药品联合治疗。接种抗体后观察14日。结果见表16。
表16临床自然发病治疗试验结果
组别 日龄 鸡只数量 注射剂量(ml/只) 存活数 治愈率
61 20 1526 1.5 1404 92.0％
62 20 146 — 46 31.5％
结果显示，抗体治疗组1526只雏鸡共存活1404只，治愈率92.0％，而抗生素/抗病毒药品联合治疗组146只雏鸡存活46只，治愈率仅为31.5％。表明本发明制备的禽腺病毒蛋黄抗体针对目前临床多发的禽腺病毒感染起到较为理想的治疗效果，临床上可有效控制禽腺病毒疫情的发生、蔓延。
实施例8禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联亚单位疫苗的制备
1、法氏囊抗原的制备
按病毒RNA提取试剂盒操作从感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株的SPF鸡法氏囊中提取IBDV病毒RNA，并用随机引物进行逆转录。根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，合成寡聚核苷酸引物序列见表17，并进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。
表17法氏囊病毒VP2基因引物
VP2-EcoR1-f CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC
VP2-Sal1-r ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT
取上述制备的VP2cDNA，进行双酶切，并将酶切后的片段连接到pColdⅢ载体上；连接产物直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化菌株涂布在含有100μg氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为pColdⅢ_VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株。
用培养罐通气培养pColdⅢ_VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种pColdⅢ_VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株种子液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。
培养结束后，离心收集菌体，用PBS重悬菌体，超声波破碎菌体，破碎菌体离心收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液。
2、禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联亚单位疫苗的制备
将实施例1制备的Fiber-2蛋白和上述方法制备的VP2蛋白按比例混合，加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表18。
表18禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联亚单位疫苗配比
组分 疫苗2
Fiber-2蛋白(AGP效价) 1：2
VP2蛋白(AGP效价) 1:16
白油佐剂(V/V％) 66％
实施例9禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体的制备
1、免疫程序
产蛋鸡120日龄时肌肉注射实施例8制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联亚单位疫苗1ml/只，14日后等剂量肌肉注射，所述二免10日后再用等剂量肌肉注射进行第三次强化免疫。
2、收集免疫鸡蛋
从三免后每隔10日抽样测定免疫鸡蛋蛋黄中禽腺病毒抗体琼扩效价≥1∶32、法氏囊病病毒抗体琼扩效价≥1∶64为合格。将所收集的经检测合格的免疫鸡蛋，置于4℃贮存备用。
3、蛋黄的收获及灭活、
将蛋壳消毒，采取手工或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经121℃30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min。
4、蛋黄的提纯
先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至4℃。然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4℃静置4h。管式低温连续离心机14000rpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。
按总量的0.2％(体积比)加入辛酸，搅拌均匀，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，再按总量的0.1％加入饱和甲醛溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次。
用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒，制得蛋黄抗体提取液。
实施例10禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体预防试验
10.1二联蛋黄抗体对禽腺病毒预防试验
取30日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第63组经颈部皮下注射免疫实施例9制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体0.5ml/kg体重，第64组皮下注射生理盐水0.5ml/kg体重，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表19。
表19二联蛋黄抗体对禽腺病毒预防试验结果
Figure BDA0001345808440000201
结果显示，第64组对照组全部发病死亡，而第63组免疫组对免疫鸡产生了良好的免疫保护效果，保护率100％。表明本发明制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体针对禽腺病毒可提供有效的免疫保护。
10.2二联蛋黄抗体对法氏囊病病毒预防试验
取30日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第65组经颈部皮下注射免疫实施例9制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体0.5ml/kg体重，第66组皮下注射生理盐水0.5ml/kg体重，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后24小时，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率。结果见表20。
表20二联蛋黄抗体针对法氏囊病病毒预防试验结果
Figure BDA0001345808440000211
结果显示，第66组对照组全部发病死亡，而第65组免疫组对免疫鸡产生了良好的免疫保护效果，保护率100％。表明本发明制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体针对法氏囊病病毒可提供有效的免疫保护，保护率100％。
以上结果表明，本发明制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体能对免疫鸡产生较好的免疫保护，免疫效果良好，能对禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒的感染提供有效保护。在临床上可用于禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒的预防。
实施例11禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体治疗试验
11.1二联蛋黄抗体对禽腺病毒治疗试验
取30日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第67组、68组分别用FAV-HN株病毒液(105.0TCID50/只)通过肌肉注射攻击。第67组为治疗组，待有3只鸡出现禽腺病毒临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例9制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体1.5ml/kg体重；第68组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表21。
表21二联蛋黄抗体针对禽腺病毒治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000212
Figure BDA0001345808440000221
结果显示，第68组全部发病死亡，而第67组治疗组对鸡群产生了良好的治疗效果，全部健活。表明本发明制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体针对禽腺病毒发病鸡群可提供有效的治疗效果，治愈率为100％。
11.2二联蛋黄抗体对法氏囊病病毒治疗试验
取30日龄的SPF鸡20只，分成2组。每组10只，第69组、70组分别用每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。第69组为治疗组，待有3只鸡出现法氏囊临床发病症状时开始全组治疗，分别经颈部皮下注射免疫实施例9制备的禽腺病毒蛋黄抗体1.5ml/kg体重；第70组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察14日，记录发病数、死亡数及治愈率。结果见表22。
表22二联蛋黄抗体针对法氏囊病病毒治疗试验结果
Figure BDA0001345808440000222
结果显示，第70组全部发病死亡，而第69组治疗组对鸡群产生了良好的治疗效果，全部健活，治愈率100％。表明本发明制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体针对法氏囊病病毒发病鸡群可提供有效的治疗效果。
以上结果表明，本发明制备的禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒二联蛋黄抗体对免疫鸡产生了良好的治疗效果，能对禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒的感染提供有效治疗作用。在临床上可用于禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒的治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 禽腺病毒蛋黄抗体、及其制备方法和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 禽腺病毒
<400> 1
atgctgcgtg ctccgaaacg tcgtcactct gaaaacggtc agccggaaac tgaagctggt 60
ccgtctccgg ctccgatcaa acgtgctaaa cgtatggttc gtgcttctca gctggacctg 120
gtttacccgt tcgactacgt tgctgacccg gttggtggtc tgaacccgcc gttcctgggt 180
ggttctggtc cgctggttga ccagggtggt cagctgaccc tgaacgttac cgacccgatc 240
atcatcaaaa accgttctgt tgacctggct cacgacccgt ctctggacgt taacgctcag 300
ggtcagctgg ctgttgctgt tgacccggaa ggtgctctgg acatcacccc ggacggtctg 360
gacgttaaag ttgacggtgt taccgttatg gttaacgacg actgggaact ggctgttaaa 420
gttgacccgt ctggtggtct ggactctacc gctggtggtc tgggtgtttc tgttgacgac 480
accctgctgg ttgaccaggg tgaactgggt gttcacctga accagcaggg tccgatcacc 540
gctgactctt ctggtatcga cctggaaatc aacccgaaca tgttcaccgt taacacctct 600
accggttctg gtgttctgga actgaacctg aaagctcagg gtggtatcca ggctggttct 660
tctggtgttg gtgtttctgt tgacgaatct ctggaaatcg ttaacaacac cctggaagtt 720
aaaccggacc cgtctggccc actgaccgta agcgctaacg gtctgggtct gaaatacgac 780
tctaacaccc tggctgttac cgctggtgct ctgaccgttg ttggtggtgg ttctgtttct 840
accccgatcg ctaccttcgt ttctggttct ccgtctctga acacctacaa cgctaccatc 900
gttaactctt cttctcaccc gttctcttgc gcttactacc tgcagcagtg gaacgttcag 960
ggtctgctgt tcacctctct gtacgttaaa ctggactcta ccaccatggg tacccgtccg 1020
ggtgacaact cttctgctaa cgctaaatgg ttcaccttct gggtttctgc ttacctgcag 1080
cagtgcaacc cgagcggtat ccaggcgggt accgtaagcc cgtctaccgc tgctctggct 1140
gacttcgaac cgatggctaa ccgttctgtt tcttctccgt ggacctactc tgctaacgct 1200
tactaccagc cgtcttcggg tgagttccag gtcttcaccc cggtcgttac cggtgcttgg 1260
aacccgggta acatcggtat ccgtgttctg ccggttccgg ttaccgcttc tggtgaccgt 1320
tacaccctgc tgtgctactc tctgcagtgc accaactctt ctatcttcaa cccggctaac 1380
tctggtacca tgatcgttgg tccggttctg tactcttgcc cggctgcttc tgttccgtaa 1440

Claims (9)

1.一种制备禽腺病毒蛋黄抗体的方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)制备禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白为SEQ.IDNO.1所示核苷酸序列编码的蛋白；
步骤(2)使用所述步骤(1)制备的禽腺病毒亚单位疫苗免疫产蛋鸡，免疫后测定免疫鸡蛋蛋黄中禽腺病毒抗体琼扩效价，收集所述禽腺病毒抗体琼扩效价≥1:32的免疫鸡蛋；
步骤(3)分离所述步骤(2)收集的免疫鸡蛋的蛋黄，灭活，提纯；以及
步骤(4)对所述步骤(3)灭活并提纯后的蛋黄抗体微滤除菌、超滤除病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中所述亚单位疫苗的Fiber-2蛋白含量为AGP效价≥1:2。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)所述亚单位疫苗的Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)免疫程序为：所述产蛋鸡120日龄时肌肉注射所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗1ml/只，14日后等剂量肌肉注射所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗，二免10日后再用等剂量所述禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗肌肉注射进行第三次强化免疫。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中分离蛋黄后还包括使用蒸馏水稀释蛋黄工序，稀释倍数为一倍；
所述灭活为低温巴氏灭活，所述低温巴氏灭活为62.5℃温度下灭活30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中提纯步骤包括：酸化蒸馏水法提纯步骤和辛酸法提纯步骤；
所述酸化蒸馏水法提纯步骤为：先在隔层反应罐的隔层中加入相当于所述灭活的免疫鸡蛋蛋黄6倍体积的灭菌蒸馏水，所述蒸馏水pH值为4.2，并降温至4℃，然后，将灭活的所述蛋黄液加入反应罐，搅拌，4℃静置4h，离心分离上清液；
所述辛酸法提纯步骤为：按所述上清液总量的0.2％体积加入辛酸，搅拌，室温放置4h，过滤至澄清，再按所述滤液总量的0.1％加入饱和甲醛溶液，搅拌，室温放置24h。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)制备禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗还含有鸡法氏囊病病毒VP2蛋白抗原。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述鸡法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤(2)使用所述步骤(1)制备的禽腺病毒亚单位疫苗免疫产蛋鸡，免疫后测定免疫鸡蛋蛋黄中禽腺病毒抗体琼扩效价、法氏囊病病毒抗体琼扩效价，收集禽腺病毒抗体琼扩效价≥1:32、法氏囊病病毒抗体琼扩效价≥1∶64的免疫鸡蛋。
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