CN103172732A - 一种抗小鹅瘟蛋黄抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明采用了物理、化学等多重灭活技术，使用酸化水稀释法结合辛酸法、高速离心、超滤等现代生物技术，将蛋黄中的免疫球蛋白进行有效的分离纯化。不含任何有害物质和外源性污染，安全性高，不会在注射部位残留，对机体无刺激及毒副作用，对胴体品质无影响。携带方便，使用时无需解冻，用灭菌生理盐水溶解至冻干前体积即可，注射方便快捷；抗逆性强，效价稳定，保存时间长。常温条件下保存24个月抗体仍然有效，2～8℃条件下可大大延长保存期。本专利为联合抗体，可以对小鹅瘟等多种鹅传染疾病起到良好的预防及治疗效果。

Description

一种抗小鹅瘟蛋黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及禽类生物制药技术领域，具体地说，本发明涉及一种抗小鹅瘟蛋黄抗体及其制备方法。

背景技术

我国是水禽生产大国，尤其是养鹅业。近几年来随着产业结构的调整，养鹅业发展的速度更快，但疫病也不断增加。在多种鹅传染病中，小鹅瘟、鹅禽流感、鹅副黏病毒病、鹅出血性坏死性肝炎、鹅鸭瘟病毒感染等均具有很高的发病率和死亡率，常造成巨大的经济损失，严重影响养鹅业的健康发展。由于多种传染病的发生，鹅病少、好养鹅的格局已经改变为鹅病多、生物制剂少、病死率高及难养的局面。

小鹅瘟是由小鹅瘟病毒(鹅细小病毒，Goose Parvovirus，GPV)引起的一种雏鹅的急性或者亚急性败血性传染病，以渗出性肠炎、肝、肾、心等实质器官炎症为特征，致病性强，死亡率高。本病最早由方定一教授在1956年发现，在我国的江苏、安徽、广东、广西、湖南、湖北、河南、河北、山东、吉林、内蒙古等地流行，目前已在匈牙利、法国、德国、意大利、荷兰、英国、俄罗斯等世界范围内的养鹅国家流行。该病在新疫区往往导致雏鹅的100％死亡，在老疫区也会导致雏鹅40％～60％的死亡率，造成巨大的经济损失，是养鹅业威胁最大的疾病之一。小鹅瘟病毒主要自然感染1月龄以内的雏鹅，10日龄以内的雏鹅最为易感，死亡率可达到90％～100％，一月龄以上的鹅少有发病，发病雏鹅从粪便中排出大量的病毒，可通过直接或者间接接触而迅速传播。该病流行有一定的周期性，大流行每2～4年一次，小流行一年一次。1977年Kisary指出，20日龄以内的雏鹅免疫功能并未完全发育成熟，导致弱毒疫苗免疫后难以达到理想的预防效果，通过免疫种鹅虽然可使雏鹅获得较高的母源抗体保护，可由于种鹅的个体差异以及饲养管理较差，导致母源抗体参差不齐，所以在一些管理较差的地区仍经常发生该病的流行。在这种情况下，利用小鹅瘟抗体进行被动保护来预防该病的发生，是一种除疫苗之外非常有效的方法。

传统的蛋黄抗体制备方法存在如下缺点1.蛋黄内含有一些可以垂直传播的病原，如在蛋黄抗体生产中未进行严格消毒和灭活，即可导致人为传毒。2.蛋壳表面污染的常在菌，用粗制方法无法灭活；3.高浓度蛋黄液为污染菌的繁殖提供了最有利的条件；4.贮存不便，贮存成本较高；5.含有大量蛋白质、磷脂等大分子结构物质，容易引起注射后难以吸收，并会造成肿胀、出血等，影响抗体作用；6.使用极不方便，因其粘度大，易堵塞注射器。所以通过更先进的方法制备高纯度高效价的精致蛋黄抗体尤为必要。IgY分离的关键是除去蛋黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分，目前常用的方法有以下几种：有机物沉淀法、有机溶剂抽提法、天然胶法、中链脂肪酸法、去污剂分离法、水稀释法等。IgY的提纯主要通过超滤法或沉淀法来完成。沉淀法所用的沉淀剂可以是无机物、有机物或有机溶剂，也可以采用多种方法联合沉淀，或超滤法和沉淀法结合提取。IgY的纯化目前主要采用层析方法：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等等。从目前工艺路线上看水稀释法、无机物沉淀法、超临界气体提取、有机物沉淀法工艺路线较短，而其他方法需两步或更多步骤获的沉淀；从工艺条件上看有机溶剂沉淀法需-20℃冷冻，超临界气体法需要超临界气体抽提设备，对设备要求较高；从原材料成本看，天然胶法采用的是天然胶，成本较高；从回收率和纯度方面看，水稀释法和超临界气体法的产品纯度和回收率都较高。

精制蛋黄抗体在使用时，目前市场多以一种液态抗体为主，而且绝大部份都没有很好的对蛋黄液内的脂肪进行提取，致使抗体在常温下保存随着温度和时间的增长抗体的效价受到相当大的影响。有时没有使用冷链运输，使得液态抗体效价降低，不能达到理想的效果。市场上有称小鹅瘟、鹅副粘病毒病二联抗体销售，但效果有待确实。其它产品未见有应用于大规模生产。对于这些疾病及其混合感染仍缺乏相关高效的生物制品。

刘力威等人，“鸡抗小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与应用，[J].黑龙江畜牧兽医，2006，(9)：78～80”，采用黑龙江兽医研究所第一研究室自制的GPV免疫用抗原、GPV琼括抗原及阳性血清和抗小鹅瘟鹅源血清琼括抗体(效价416)以及蛋鸡制备鸡抗小鹅瘟卵黄抗体，将免疫蛋用自来水洗去蛋表面的污物，再用0.5％新洁尔灭或拜洁等溶液浸泡消毒，去蛋壳、蛋清，收集卵黄。卵黄\生理盐水\氯仿按1∶2∶1的比例依次加入充分混匀，置室温静止。待卵黄及氯仿沉淀，析出上清液即为卵黄抗体提取液，收集上清液，按卵黄抗体量加入0.01％柳硫汞(终浓度)和1000IU/mL青霉素、链霉素，加入后充分摇匀，分装，4℃保存。该方法制备工艺简单便于操作，但蛋黄提取、纯化、浓缩、灭活等仅靠一步操作难以得到高纯度，高效价的抗体。不足以保证最终产品的使用及储存效果。

专利CN1927886A公开了一种防治小鹅瘟病的异源抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备方法，该方法改变了使用母鹅进行高免用于制备抗小鹅瘟病的先例，改用鸭和鸡以及效价大于1∶16的自制琼括抗体，制备抗小鹅瘟蛋黄抗体，包括小鹅瘟种毒的制取，高免抗原的制取，蛋黄抗体的制取。该方法所制备的抗小鹅瘟蛋黄抗体的效价大于1∶16，但是该方法没有采用冷冻干燥或其它技术，并缺少保存期试验数据，无法得知此方法制备的液体蛋黄抗体保存条件及保存期的效果。

专利CN1509765A提供了蛋黄抗体冻干制剂，该制剂是抗产肠素大肠西氏菌(ETEC)的三个菌型K88/K89/987P的多价蛋黄抗体冻干制剂。该制剂是利用酸化蒸馏水去除高免蛋黄中的脂类，再用少量氯仿去除残余不溶性物质，经超滤浓缩及冻干制得。该技术冻干过程中，未使用冻干保护剂，所获得的产品所需保存温度较低，保存成本较高，保存时间受限。

专利CN101113176A公开了一种鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，该方法将所获得的高免蛋黄液用蒸馏水稀释、灭活后，再进行萃取、离心及杀死外源病毒的处理，然后加入黄芪多糖、多粘菌素、山梨醇、甘露醇作为保护剂进行冻干，制得固体鸡传染性法氏囊精制蛋黄抗体。采用该方法制得的抗体需要在2～8℃条件下保存，而且冻干过程中保护剂组成较多，配制过程复杂，成本较高。

因此，目前缺乏一种高纯度、高效价、能够有效控制多种鹅传染病，便于保存，且具有较好的存储效果，生产方法简单，成本低廉，易于操作，并可应用于大规模生产的抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备方法。该方法通过对蛋黄抗体液进行提取、脱脂、冻干，制备出高纯度、高效，存储效果好，便于保存使用的抗小鹅瘟蛋黄抗体。

为此，本发明提供了一种一种抗小鹅瘟蛋黄抗体，其中，所述抗小鹅瘟蛋黄抗体为异源抗小鹅瘟脱脂蛋黄抗体浓缩提取液的冻干制剂

为实现本发明，本发明还提供了一种抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备方法，包括：

步骤A，将小鹅瘟病毒HN株接种到制备抗原用材料进行孵育，并将孵育后的鹅胚冷却，将所收获的鹅胚尿囊液经透析浓缩制得无污染小鹅瘟种毒液；

步骤B，向由无污染小鹅瘟种毒液经分离纯化及灭活获得的纯化灭活的无污染小鹅瘟种毒液中加入油溶性表面活性剂，完全溶解后制成水相；将白油/油溶性表面活性剂混合物与硬脂酸铝混合、灭菌后制成油相；将水相与油相混合乳化，加入硫柳汞，制成小鹅瘟灭活油乳剂免疫原；

步骤C，用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原免疫非免疫产蛋鸡，收集高免蛋；

步骤D，从收集高免蛋中收集蛋黄液、并进行灭菌处理制得灭菌高免蛋黄液；

步骤E，从灭菌高免蛋黄液中提取蛋黄抗体，经灭活，过滤除菌，超滤除病毒以及超滤浓缩，制得脱脂蛋黄抗体浓缩提取液；

步骤F，冷冻干燥脱脂蛋黄抗体浓缩提取液/冻干保护剂混合物，制备固态脱脂蛋黄抗体；

特征在于：步骤F冷冻干燥脱脂蛋黄抗体浓缩提取液/冻干保护剂混合物的程序包括将装有脱脂蛋黄抗体浓缩提取液/冻干保护剂混合物的西林瓶放入冻干箱；将温度降低到-40℃；在-40℃保持4h；以1.0℃/h的速度升温18～20h；以4～6℃/h的速度升温至25℃，干燥，制得固态脱脂蛋黄抗体。

在本发明的一个实施例中，步骤F中所述冻干保护剂包括甘露醇和海藻糖，其中甘露醇的含量为2wt％～5wt％，海藻糖的含量为1wt％～4wt％。优选所述冻干保护剂中甘露醇的含量为2wt％～3wt％，海藻糖的含量为1wt％～2wt％。

根据本发明，步骤A中所述小鹅瘟病毒HN株(Goose ParvovirusHN)由普莱柯生物工程股份有限公司鉴定，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC)，保藏日期为2011年11月3日，保藏编号为NO：V 201136。

根据本发明，步骤A中所述制备抗原用材料为易感鹅胚；所述孵育是在38～38.5℃条件下进行，孵育时间为168h。过程中不翻蛋；所述鹅胚冷却是在2～8℃条件下冷却12～24h。

在本发明的一个具体的实施例中，选择发育良好的12日龄易感鹅胚用作制备抗原用材料。将冻干小鹅瘟HN株病毒种用灭菌的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)稀释，稀释比为1∶100，经尿囊腔接种到若干枚12日龄易感鹅胚，每胚接种量为0.2ml，接种后于38～38.5℃孵育，不翻蛋；孵育完成后，收获72～120h死亡鹅胚，在2～8℃条件下冷却12～24h；将检验无菌的鹅胚尿囊液混合后进行透析浓缩，制得无污染小鹅瘟种毒液；将所制得的无污染小鹅瘟种毒液定量分装，冷冻保存，并注明收获日期、毒种代次等。

根据本发明方法，步骤B中所述无污染小鹅瘟种毒液分离纯化是将无污染小鹅瘟种毒液以3500rpm离心处理30min，制得无污染小鹅瘟种毒上清液。步骤B中所述灭活是在密闭灭菌容器中，在终浓度0.1v％～0.3v％甲醛溶液存在条件下，将无污染小鹅瘟种毒上清液于37℃条件下处理24h，制得纯化灭活的无污染小鹅瘟种毒液。

在本发明方法的一个具体的实施例中，将无污染小鹅瘟种毒液以3500rpm离心处理30min，吸取无污染小鹅瘟种毒上清液加入灭菌容器，加入甲醛溶液，使终浓度为0.1v％～0.3v％，边加边振摇，使其充分混合，密闭后置于37℃温箱中灭菌处理24h(期间振摇3～4次)。

根据本发明方法，步骤B中所述水溶性表面活性剂为灭菌吐温-80，其加入量为纯化灭活的无污染小鹅瘟种毒液的4wt％。所述水相的配制方法是将水溶性表面活性剂加入纯化灭活的无污染小鹅瘟种毒液中，充分振摇，使水溶性表面活性剂完全溶解。

根据本发明方法，步骤B中所述白油为注射用白油；所述油溶性表面活性剂为司本-80；所述白油/油溶性表面活性剂混合物中白油含量为94wt％，油溶性表面活性剂含量为6wt％。所述硬脂酸铝与白油/油溶性表面活性剂混合物的重量比为1∶49；所述油相的配制方法是将白油与油溶性表面活性剂混合后，加入硬脂酸铝，加热，搅拌至透明后高压灭菌。

根据本发明方法，步骤B中所述混合乳化是将水相缓慢加入油相罐内与油相混合，搅拌，乳化10min，乳化搅拌转速为3400rpm。混合乳化过程中水相和油相的体积比为1∶2。

在根据本发明方法的一个具体实施例中，首先，按纯化灭活的无污染小鹅瘟种毒液的4wt％加入灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80完全溶解，制成水相；取注射用白油94份，司本-80 6份混合后，加入硬脂酸铝2份，边加热边搅拌至透明，制成油相，高压灭菌备用；然后，取油相2份置于油相罐内，开动电机搅拌，缓慢加入1份水相，再以3400rpm乳化10min；最后，在乳化终止前加入1％硫柳汞，使其终浓度为0.01％；将所制得的小鹅瘟灭活油乳剂免疫原定量分装，加盖密封。

根据本发明方法，步骤C中用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原免疫非免疫产蛋鸡的程序包括，首次免疫前整体免疫力的提高，首次免疫、二次免疫、三次免疫以及四次免疫，其中，整体免疫力的提高是每日用黄芪多糖供非免疫产蛋鸡饮用；首次免疫是用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射非免疫产蛋鸡；二～四次免疫是用步骤C制成的小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射已接受前次免疫的产蛋鸡。

在根据本发明方法的一个具体实施例中，首次免疫前整体免疫力的提高是在首次免疫前7～10日，每日用体积比2％～5％的黄芪多糖供非免疫产蛋鸡饮用；首次免疫是用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射140日龄非免疫产蛋鸡，100羽份/只；二次免疫是在首免后7日用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射，0.5ml/只；三次免疫是在二次免疫后7～14日用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射，1.0ml/只；四次免疫是在三免后7～14日用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射，1.5ml/只；以后每隔6周或抗体效价低于1∶64时加强免疫一次。

根据本发明方法，步骤C中所述收集高免蛋是收集GPV抗体效价≥1∶64的四次免疫高免蛋。

在根据本发明方法的一个具体实施例中，从四免后每隔10日抽样测定四免产蛋鸡高免蛋黄中GPV抗体效价，抗体效价≥1∶64为合格。之后即可收集高免蛋，置4℃贮存备用。

在根据本发明方法的一个具体实施例中，步骤C中所述抗体效价采用琼扩试验进行测定。

制备琼脂板。100ml 8.0％氯化钠溶液中加入1g琼脂粉，加热融化后，加入终浓度为0.01％硫柳汞防腐，于直径90mm的平皿中加入20ml琼脂溶液，冷却后按中央1孔外围6孔打孔，孔径3mm，间距4mm，制成琼脂板。封底置于4℃条件下备用。

取所制备的琼脂板，将待测蛋黄液用0.01mol/L的PBS(pH7.4)倍比稀释，并加入琼脂凝胶版周围孔中，在琼脂凝胶版中间孔中加入GPV抗原，然后放入湿盒中，于37℃恒温箱内反应24h，再在室温条件下放置24～48h，然后判定结果，以出现沉淀带的最高稀释度蛋黄液为该待测蛋黄液的抗体效价。

在根据本发明方法的一个实施例中，步骤D对所收集的高免蛋的蛋壳进行消毒处理后，采取手工或机械方式打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集高免蛋黄。充分搅拌使高免蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经121℃、30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min，制得灭菌灭活高免蛋黄液。

根据本发明方法，步骤E所述提取蛋黄抗体的过程包括酸化蒸馏水法提取蛋黄抗体，以及辛酸法提取蛋黄抗体。

根据本发明，所述酸化蒸馏水法提取蛋黄抗体包括以酸化蒸馏水为提取剂从灭菌灭活高免蛋黄液中提取蛋黄抗体，离心处理，制得粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液，其中，提取过程的反应温度为2～8℃，反应时间为2～6h。所述酸化蒸馏水为pH值为4.1～4.3的灭菌蒸馏水，其用量为相当于高免蛋黄液6倍体积。

在本发明的一个具体的实施例中，采用酸化蒸馏水法提取蛋黄抗体，先在反应罐中加入相当于灭菌灭活高免蛋黄液6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至4℃。然后，将灭菌灭活高免蛋黄液加入，边加边搅拌，4℃静置4h。采用管式低温连续离心机，以14000rpm的转速离心分离上清液，制得粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液。

根据本发明，所述辛酸法提取蛋黄抗体包括以辛酸为提取剂从粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液中提取蛋黄抗体，过滤，制得脱脂蛋黄抗体辛酸提取液，其中，提取过程的反应温度为室温，反应时间为4～6h。所述辛酸至少为为化学纯试剂或分析纯试剂，其用量为0.1v％～0.3v％。

在本发明的一个具体的实施例中，辛酸法提取蛋黄抗体，是将制得的粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液加入一个反应罐中，按其总量的0.2v％加入辛酸，搅拌均匀，室温条件下放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，制得脱脂蛋黄抗体辛酸提取液。

在本发明方法的一个实施例中，步骤E中所述灭活是将脱脂蛋黄抗体辛酸提取液与0.1v％的饱和甲醛溶液混合，搅拌均匀，室温条件下放置24h，期间振摇数次，制得灭活脱脂蛋黄抗体辛酸提取液。

根据本发明方法，步骤E中所述过滤除菌包括用0.22μm微孔滤芯将灭活脱脂蛋黄抗体辛酸提取液过滤除菌，制得除菌灭活脱脂蛋黄抗体提取液；超滤除病毒是用截留分子量为1000KDa的超滤膜对除菌灭活脱脂蛋黄抗体提取液进行超滤除病毒处理，制得除菌除病毒灭活脱脂蛋黄抗体提取液。所述超滤浓缩是用截留分子量为100KDa的超滤膜将除菌除病毒灭活脱脂蛋黄抗体提取液浓缩2倍，制得脱脂蛋黄抗体浓缩提取液。

在本发明的一个事实例中，在步骤E结束后，将所制得脱脂固态蛋黄抗体，密封装箱，于2～8℃条件下贮存。

根据本发明，所述小鹅瘟HN株病毒为新分离鉴定的病毒，其具有以下特征：

(i)雏鹅于攻毒后4日发病，病初精神萎顿，拒食，拉灰白色稀粪，攻毒后6日出现死亡，至攻毒后10日死亡雏鹅数达17只，死亡率85％，剖检死亡雏鹅，死亡较早的雏鹅大体病变较轻，肠管变薄，脾脏和胰腺有充血，后期死亡的雏鹅病变较明显，主要集中在消化道，小肠后端和回盲部膨大，剖开肠管可见长条形栓子。

(ii)理化特性鉴定结果显示，该毒株可抵抗氯仿、乙醚、胰酶、酸、热的处理。

(iii)血凝性试验结果显示，该毒株无血凝性。以上都符合小鹅瘟病毒的特性。

(iv)该病毒株免疫原性良好，能有效控制小鹅瘟，保护率达到80％～100％。

本发明采用了物理、化学等多重灭活技术，采用酸化水稀释法结合辛酸法、高速离心、超滤等现代生物技术，将蛋黄中的GPV抗体进行有效的分离纯化。不含任何有害物质和外源性污染，安全性高，不会在注射部位残留，对机体无刺激及毒副作用，对胴体品质无影响。

上述用语酮体，是指躯干，尤其是指牲畜屠宰后，除去头、尾、四肢、内脏等的剩余部分，这里是指鹅肉。

本发明将分离纯化后的蛋黄抗体浓缩提取液在有冻干保护剂存在条件下进行冷冻干燥，所获得的固态蛋黄抗体携带方便，使用时无需解冻，用灭菌生理盐水溶解至冻干前体积即可，注射方便快捷；根据本发明方法制得的固态蛋黄抗体抗逆性强，效价稳定，保存时间长。该蛋黄抗体常温条件下可以保藏24个月，而不丧失抗体效价，在2～8℃条件下保存的时间可大大延长，具有很好的贮存稳定性和运输安全性。

病毒毒种保藏说明

小鹅瘟病毒HN株(Goose Parvovirus HN)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号，武汉大学)进行保藏，保藏日期：2011年11月3日，保藏编号：CCTCC NO：V201136。

具体实施方式

下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。

实施例

实施例1：制备抗小鹅瘟蛋黄抗体

1.制备无污染小鹅瘟种毒液

将毒种用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)进行1∶100稀释，经尿囊腔接种12日龄非免鹅胚，每胚0.2ml，接种后于38～38.5℃孵育，不必翻蛋。接种后每日照蛋一次，弃去48h内的死胚，以后每间隔8h照蛋一次，收获72h～120h死胚，置4℃冷却24h。将冷却后的鹅胚置生物安全柜内，收获无污染的鹅胚尿囊液，抽样作无菌检验及病毒含量测定。将检验无菌的鹅胚尿囊液混合后进行透析浓缩，制得无污染小鹅瘟种毒液；吸取将所制得的无污染小鹅瘟种毒液放于同一灭菌容器中，定量分装，注明收获日期、毒种代次等，置于-20℃条件下保存。

2.制备小鹅瘟灭活油乳剂免疫原

(1)油相配制

将注射用白油94份，司本-80 6份混合后，加入硬脂酸铝2份，边加热边搅拌至透明后高压灭菌制成油相。

(2)水相配制

按抗原的4％加入灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80完全溶解，制成水相。

(3)乳化

取油相2份置油相罐内，开动电机搅拌，徐徐加入1份水相，再以3400rpm的转速乳化10min，并在乳化终止前加入1％硫柳汞，使其终浓度为0.01％，制得小鹅瘟灭活油乳剂免疫原。将所制得的小鹅瘟灭活油乳剂免疫原定量分装，加盖密封。

3.用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原免疫非免疫产蛋鸡

(1)免疫程序

在首免前10日，每日用体积比3％的黄芪多糖供鸡饮用，提升鸡体整体免疫力，首免，用小鹅瘟灭活疫苗肌肉注射140日龄商品蛋鸡，100羽份/只；二免，在首免后7日用制备的免疫原肌肉注射，0.5ml/只；三免，在二免后14日用制备的免疫原肌肉注射，1.0ml/只；四免，在三免后10日用制备的免疫原肌肉注射，1.5ml/只。以后每隔6周或抗体琼扩效价低于1∶64时加强免疫一次。

(2)收集高免蛋

从四免后每隔10日抽样测定鸡高免蛋黄中GPV抗体琼扩效价，琼扩效价≥1∶64为合格。将所收集的经检测合格的高免蛋，置于4℃贮存备用。

4.制备灭菌灭活高免蛋黄液

对所收集的高免蛋的蛋壳进行消毒处理后，采取手工或机械方式打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集高免蛋黄。充分搅拌使高免蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经121℃、30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min，制得灭菌灭活高免蛋黄液。

5.提取蛋黄抗体并制备脱脂蛋黄抗体浓缩提取液

(1)抗体的酸化蒸馏水法提纯

先在反应罐中加入相当于灭菌灭活高免蛋黄液6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至4℃。然后，将灭菌灭活高免蛋黄液加入，边加边搅拌，4℃静置4h。采用管式低温连续离心机，以14000rpm的转速离心分离上清液，将制得的粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液并转入另一反应罐中。

(2)抗体的辛酸法提纯

按粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液总量的0.2v％加入辛酸，搅拌均匀，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，制得制得脱脂蛋黄抗体辛酸提取液。

(3)脱脂蛋黄抗体辛酸提取液灭活

按脱脂蛋黄抗体辛酸提取液总量的0.1v％加入饱和甲醛溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次，制得灭活脱脂蛋黄抗体提取液。

(4)过滤除菌

用0.22μm微孔滤芯过滤除菌制得灭活除菌脱脂蛋黄抗体提取液。

(5)除病毒

用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤灭活除菌脱脂蛋黄抗体提取液，除去其中的病毒，制得除病毒灭活除菌脱脂蛋黄抗体提取液。

(6)超滤浓缩

用截留分子量为100KDa的将除病毒灭活除菌脱脂蛋黄抗体提取液超滤膜浓缩2倍制得脱脂蛋黄抗体浓缩提取液。

6.蛋黄抗体的冷冻干燥

向提纯并经检验合格的脱脂蛋黄抗体浓缩提取液中加入由3wt％甘露醇及2wt％海藻糖等组成的冻干保护剂，分装于西林瓶放入冻干箱，冻干过程中温度最低降至-40℃，在此温度下保持6h，制品以1.5℃/h升温20h，至基本干燥，再以4℃/h升温至25℃干燥至完全冻干，制得固态脱脂蛋黄抗体。

7.固态脱脂蛋黄抗体贮存

将固态脱脂蛋黄抗体压塞出箱，贮存于2～8℃。

实施例2：小鹅瘟精制蛋黄抗体治疗效果试验

将01、02、03三批小鹅瘟蛋黄抗体分别注射40只1日龄、10日龄、20日龄雏鹅，每只雏鹅注射0.5ml。注射后48h、96h、144h、192h分别用100LD₅₀强毒注射各10只，每次攻毒时设10只攻毒对照和10只空白对照，隔离饲养，观察10天，记录雏鹅死亡情况，结果见表1、表2、表3。

表1  1日龄雏鹅试验结果

表2  10日龄雏鹅试验结果

表3  20日龄雏鹅试验结果

试验结果显示，3批小鹅瘟精制蛋黄抗体，注射不同日龄的雏鹅，在144h前攻毒都能达到100％的相对保护率，至192h，也可达到80％以上的保护率。

实施例3：蛋黄抗体的保存期试验

测定了产品在不同条件下的保存效果，在降低保存成本和保证抗体效价不降低的情况下，制品可在20～25℃保存，保存期为24个月。具体保存期试验结果见表4。

表4小鹅瘟精制蛋黄抗体在不同条件下保存期试验结果

Claims (10)

1.一种抗小鹅瘟蛋黄抗体，其特征在于，所述抗小鹅瘟蛋黄抗体为异源抗小鹅瘟脱脂蛋黄抗体浓缩提取液的冻干制剂。

2.一种根据权利要求1所述的抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备方法，包括：

步骤A，将小鹅瘟病毒HN株接种到制备抗原用材料进行孵育，并将孵育后的鹅胚冷却，将所收获的鹅胚尿囊液经透析浓缩制得无污染小鹅瘟种毒液；

步骤B，向由无污染小鹅瘟种毒液经分离纯化及灭活获得的纯化灭活的无污染小鹅瘟种毒液中加入油溶性表面活性剂，完全溶解后制成水相；将白油/油溶性表面活性剂混合物与硬脂酸铝混合、灭菌后制成油相；将水相与油相混合乳化，加入硫柳汞，制成小鹅瘟灭活油乳剂免疫原；

步骤C，用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原免疫非免疫产蛋鸡，收集高免蛋；

步骤D，从收集高免蛋中收集蛋黄液、并进行灭菌及灭活处理制得灭菌灭活高免蛋黄液；

步骤E，从灭菌灭活高免蛋黄液中提取蛋黄抗体，经灭活，过滤除菌，超滤除病毒以及超滤浓缩，制得脱脂蛋黄抗体浓缩提取液；

步骤F，冷冻干燥脱脂蛋黄抗体浓缩提取液/冻干保护剂混合物，制备固态脱脂蛋黄抗体；

其特征在于：步骤F冷冻干燥脱脂蛋黄抗体浓缩提取液/冻干保护剂混合物的程序包括将装有脱脂蛋黄抗体浓缩提取液/冻干保护剂混合物的西林瓶放入冻干箱；将温度降低到-40℃；在-40℃保持4h；以1.0℃/h的速度升温18～20h；以4～6℃/h的速度升温至25℃，干燥，制得固态脱脂蛋黄抗体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤F中所述冻干保护剂包括甘露醇和海藻糖，其中甘露醇的含量为2wt％～5wt％，海藻糖的含量为1wt％～4wt％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述冻干保护剂中甘露醇的含量为2wt％～3wt％，海藻糖的含量为1wt％～2wt％。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C中用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原免疫非免疫产蛋鸡的程序包括，首次免疫前整体免疫力的提高，首次免疫、二次免疫、三次免疫以及四次免疫，其中，整体免疫力的提高是每日用黄芪多糖供非免疫产蛋鸡饮用；首次免疫是用小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射非免疫产蛋鸡；二～四次免疫是用步骤C制成的小鹅瘟灭活油乳剂免疫原肌肉注射已接受前次免疫的产蛋鸡。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤E所述提取蛋黄抗体的过程包括酸化蒸馏水法提取蛋黄抗体，以及辛酸法提取蛋黄抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述酸化蒸馏水法提取蛋黄抗体包括以酸化蒸馏水为提取剂从高免蛋黄液中提取蛋黄抗体，离心处理，制得粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液，其中，提取过程的反应温度为2～8℃，反应时间为2～6h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述酸化蒸馏水为pH值为4.1～4.3的灭菌蒸馏水，其用量为相当于高免蛋黄液6倍体积。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述辛酸法提取蛋黄抗体包括以辛酸为提取剂从粗脱脂蛋黄抗体酸化蒸馏水提取液中提取蛋黄抗体，过滤，制得脱脂蛋黄抗体辛酸提取液，其中，提取过程的反应温度为室温，反应时间为4～6h。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：其特征在于：所述辛酸至少为化学纯试剂或分析纯试剂，其用量为0.1v％～0.3v％。