CN101113176A

CN101113176A - 鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法

Info

Publication number: CN101113176A
Application number: CNA2006100484999A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 乔荣岑; 丁梅; 闵亚杰; 孟照国; 习向峰
Original assignee: LUOYANG PULAIKE BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: LUOYANG PULAIKE BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-01-30

Abstract

一种鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：采用高纯度抗原素，将IBDV B87株毒种接种到SPF鸡胚，然后收获绒尿液、胚体、绒尿膜磨细过滤灭活为抗原，免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，分离蛋黄，用蒸馏水稀释，灭活，萃提，离心，灭活，冻干，检验；将该鸡蛋经Co60辐照射，杀死病毒和细菌；应用新型免疫增强剂黄芪多糖冻干制成，在2－8℃下保存；以法式囊蛋黄抗体为主要成份，配合一种新型免疫增强剂制成的防治、治疗复合性药物，使得肉鸡养殖业内的危害降低，造福于人类，提高人们生活水平。

Description

鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法

技术领域：

本发明涉及禽类生物药制剂技术领域，一种鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法。

背景技术：

鸡法氏囊病是引起幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病，病程短、发病率高、死亡率高。病毒对鸡体的法氏囊损害最大，是世界肉鸡养殖业内危害最严重的传染病之一。幼鸡被感染后，可导致免疫抑制，并可诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败，从而引起疾病的爆发与流行，死亡率20％～50％不等。该病能抑制鸡的体液免疫和细胞免疫，能降低鸡群对疫苗接种的应答反应性，幼鸡感染后全身出血，继发大肠杆菌等疾病引起死亡。随着不同血清型的IBD超强毒或变异株的出现，死亡率也相应的增加；同时还会导致感染鸡的免疫抑制，使多种疫苗免疫失败。在鸡传染性法氏囊发病过程中也有采用传统蛋黄抗体和高免血清进行治疗，根据国内实际情况和人民健康生产的需求，都有很多方面的缺陷。血清有抗体含量低、生产成本高、保存期短等缺点不易被大型养殖场应用；传统方法生产的蛋黄抗体中存在外源病原传播、非特异性抗体含量多、引起过敏反应而死亡、不易保存运输和储存，产生保护作用、周期短等缺点。

已知蛋黄是由水溶相(Water soluble fraction，WSF)和水不相容性(Waterinsoluble fraction，WIF)组成的乳浊液。WIF主要成份为脂蛋白构成。而蛋黄抗体存在于WSF中。WSF脂蛋白含量甚微，其物理性状为棕色或淡黄色的透明液体。因此，蛋黄抗体精制过程即是WSF的分离过程。精制蛋黄抗体提取的方法国内外报道很多，其一是离心提取法这是最原始的方法，通过超速离心将稀释蛋黄液分为上层水溶相和下沉沉淀颗粒相。上层水溶相中仍含有少量脂类，因而并不十分澄明。不适于工业化生产。二是脂溶剂法三氯甲烷、佛利昂使脂蛋白变性沉淀，离心可有效地除去脂类物质，上清液即为WSF。一般而言，该法除脂彻底，WSF透明无色。不足之处是三氯甲烷、佛利昂等化学试剂在产品中的残留及工业废液(物)的环境污染较严重。其三是聚乙二醇法应用聚乙二醇(PEG)提取蛋黄中的抗体，原理还不太清楚，但提取效果较好。一般采取两步法，即第一步添加至终浓度为3％左右的PEG，处理后去上层液再另PEG至终浓度为12％左右沉淀抗体，之后，加稀释剂溶解即成。该法从蛋黄中提取的抗体较纯，回收率也较高，操作简便。不足之处是产品中除去PEG是一个很大的难题。另外还有食品、医药化工试剂提取法如辛酸、海藻酸钠等提取法。已有报道辛酸法用于少量蛋黄抗体的提取。海藻酸钠法碳酸葡聚糖法在日本已申请专利。

研究表明，这种精制蛋黄冻干抗体具有效价稳定、保存时间长、应用方便等优点。同时精制蛋黄抗体不会在注射部位残留。适合工厂化规范化生产需要的蛋黄精制冻干抗体，工艺流程必须保持抗体的活性及效价。为此，我们对4种蛋黄抗体萃提技术进行了比较。柠檬酸沉降法：PEG沉淀法、酸化水溶法、(NH₄)₂SO₄沉淀法，四种方法都能提出抗体，但前三种他们都各有优缺点。柠檬酸沉降法效价低；PEG沉淀法虽然可以得到纯化的卵黄抗体，但由于得到的产物体积较大，还需进一步包埋浓缩，浓缩后的产物效价大幅度下降；酸化水溶法用于提纯不仅费时，原材料消耗大，而且沉淀效果也不理想

发明内容：

为了解决禽病毒对鸡体的法氏囊损害最大，造成肉鸡养殖业危害最严重的传染病的问题，本发明的目的是提供一种鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，以法式囊蛋黄抗体为主要成份，配合一种新型免疫增强剂制成的防治、治疗复合性药物，使得肉鸡养殖业内的危害降低，造福于人类，提高人们生活水平。

该鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，采用高纯度抗原素，将IBDV B87株毒种接种到SPF鸡胚，然后收获绒尿液、胚体、绒尿膜磨细过滤灭活为抗原，免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，分离蛋黄，用蒸馏水稀释，灭活，萃提，离心，灭活，冻干，检验；将该鸡蛋经Co60辐照射，杀死病毒和细菌；应用新型免疫增强剂黄芪多糖冻干制成，在2-8℃下保存，保存期可达三年。

该鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获；病毒繁殖：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤；灭活抗原：免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄15克，蒸馏水稀释，灭活，60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀；灭活：采用钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒；半成品加入黄芪多糖3g，多粘菌素B1微克，山梨醇，甘露醇保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

该鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获，病毒繁殖IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤，灭活抗原，免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄16克，蒸馏水稀释，灭活，60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀，灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品加入黄芪多糖4g、多粘菌素B1.5微克，山梨醇、甘露醇等保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

该鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获，病毒繁殖IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤，灭活抗原，免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄17克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀，灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品加入黄芪多糖5g、多粘菌素B2微克，山梨醇、甘露醇等保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

该鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，采用了硫酸铵法沉淀蛋黄抗体，并且在15-18％的浓度时沉淀。

由于采用了如上所述技术方案，本发明具有如下优越性：

该鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其采用了一种集热灭活、化学灭活为一体的先进钴60(Co60)辐照射灭活综合灭活技术.蛋黄抗体微生物灭活即防污染技术。蛋黄中微生物的来源有两个方面。一是经垂直传播来自母体。如鸡白痢沙门氏菌、禽呼肠孤病毒等；二是经蛋黄由外界进入。先进钴60(Co60)辐照射技术杀灭蛋黄中经卵直接传带的外源病原。对蛋黄中添加的指示微生物能完全彻底灭活，而且不影响抗体效价。无化学残留、无毒副作用。

研究表明，这种精制蛋黄冻干抗体具有效价稳定、保存时间长、应用方便等优点。同时精制蛋黄抗体不会在注射部位残留。适合工厂化规范化生产需要的蛋黄精制冻干抗体工艺流程必须保持抗体的活性及效价。硫酸铵沉淀法提取量明显优于另三种方法，并且在15-18％的浓度时沉淀效果最佳，抗体效价也最高。

它具有纯度高、特异性强、易保存、无残留等优点。该产品对新出现的IBD变异株更有针对性，防止免疫抑制病的发生，对传染性法氏囊病的紧急预防与治疗具有极好的效果。

具体实施方式一：(500羽含量)

生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获；病毒繁殖：IBDV B87株毒种，适当稀释，接种，收获胚液，胚体绒毛尿囊膜，磨细过滤：灭活抗原：免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄15克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取，离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀；灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品加入黄芪多糖3g、多粘菌素B1微克、山梨醇、甘露醇等保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

具体实施方式二：

生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获，病毒繁殖：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤；灭活抗原：免疫产蛋鸡，收集高免蛋，取高免蛋黄16克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀，灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品中加入黄芪多糖4g、多粘菌素B1.5微克、山梨醇、甘露醇保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

具体实施方式三：

生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获；病毒繁殖：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤；灭活抗原：免疫产蛋鸡，收集高免蛋，取高免蛋黄17克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取，离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀；灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品中加入黄芪多糖5g、多粘菌素B2微克、山梨醇、甘露醇保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

Claims

1.一种鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：采用高纯度抗原素，将IBDV B87株毒种接种到SPF鸡胚，然后收获绒尿液、胚体、绒尿膜磨细过滤灭活为抗原，免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，分离蛋黄，用蒸馏水稀释，灭活，萃提，离心，灭活，冻干，检验；将该鸡蛋经Co60辐照射，杀死病毒和细菌；应用新型免疫增强剂黄芪多糖冻干制成，在2-8℃下保存。

2.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获；病毒繁殖：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤；灭活抗原：免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄15克，蒸馏水稀释，灭活，60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀；灭活：采用钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒；半成品加入黄芪多糖3g，多粘菌素B1微克，山梨醇，甘露醇保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

3.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获，病毒繁殖IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤，灭活抗原，免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄16克，蒸馏水稀释，灭活，60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀，灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品加入黄芪多糖4g、多粘菌素B1.5微克，山梨醇、甘露醇等保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

4.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获，病毒繁殖IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤，灭活抗原，免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄17克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀，灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品加入黄芪多糖5g、多粘菌素B2微克，山梨醇、甘露醇等保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

5.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获；病毒繁殖：IBDV B87株毒种，适当稀释，接种，收获胚液，胚体绒毛尿囊膜，磨细过滤：灭活抗原：免疫产蛋鸡、收集高免蛋，取高免蛋黄15克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取，离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀；灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品加入黄芪多糖3g、多粘菌素B1微克、山梨醇、甘露醇等保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

6.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获，病毒繁殖：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤；灭活抗原：免疫产蛋鸡，收集高免蛋，取高免蛋黄16克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取、离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀，灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品中加入黄芪多糖4g、多粘菌素B1.5微克、山梨醇、甘露醇保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。

7.根据权利要求1所述的鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法，其特征在于：生产用毒种的制备：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获；病毒繁殖：IBDV B87株毒种适当稀释，接种，收获胚液、胚体绒毛尿囊膜磨细过滤；灭活抗原：免疫产蛋鸡，收集高免蛋，取高免蛋黄17克，蒸馏水稀释；灭活：60℃加热灭活8-15分钟，萃取，离心，加入终浓度为15-18％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀；灭活：钴60照射杀灭卵黄中的外源病毒，半成品中加入黄芪多糖5g、多粘菌素B2微克、山梨醇、甘露醇保护剂，分装冻干，成品检验，贴签，包装入库。