CN103495167B

CN103495167B - 一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法

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Publication number: CN103495167B
Application number: CN201310426738.XA
Authority: CN
Inventors: 李阳; 闫艳丽; 刘雪; 王二先; 徐晓艳; 盛璐丝
Original assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: CN103495167A

Abstract

一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下工艺步骤：1）制苗用细胞的传代与培养；2）细胞毒种的繁殖；3）制苗用毒液的繁殖；4）抗原抗体复合物的制备；5）成品制备。采用该方法制备疫苗生产工艺简单且稳定、易操作，质量易控，可显著提高疫苗质量和降低生产成本，生产出的鸡传染性法氏囊病活疫苗安全性好、免疫效力高，对及传染性法氏囊强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。

Description

一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法。

背景技术

随着集约化养禽业的兴起和国际贸易的增加，禽病流行日趋严重，造成家禽的高死亡率，严重制约着养鸡业的发展，造成世界养鸡业严重的损失，危及经济发展、食品安全和社会稳定。鸡传染性法氏囊病(Infection bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infection bursal disease virus，IBDV) 引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，主要感染3-12周龄的青年鸡，该病毒主要在法氏囊的淋巴细胞内增殖，并且对其它免疫器官造成不同程度的损伤，最终导致鸡的法氏囊萎缩而引起鸡的免疫抑制。该病无明显的季节性，一年四季均可发生，常通过被污染的饲料、饮水、粪便、鸡舍用具、人员衣服等途径而传播，潜伏期为1-5天，出现症状后第3天开始死亡，4-6天是死亡高峰期，以后逐渐停止死亡，发病率可达90%以上，死亡率不等，一般为10%-50%。本病在临床上可以导致体重减轻、生长缓慢和骨骼肌出血等症状，卫生条件较差的情况下常伴发其他疾病，死亡率进一步提高，雏鸡个体小，抗病力差，一旦发生疫病，则传染快，死亡率高，死亡率达80%以上，损失更大，给养鸡业带来了巨大的经济损失。

疫苗是由免疫原性较好的病原微生物经繁殖和处理后制成的制品，接种动物机体后，刺激机体产生特异性抗体，当体内的抗体滴度达到一定数值后，就可以抵抗这种病原微生物的侵袭、感染，起到预防这种疾病的作用。随着我国养禽业的迅猛发展，对鸡传染性法氏囊病的防治越来越重要。因此研制出高效、安全、生产工艺简单、价格低廉、适用的鸡传染性法氏囊病的疫苗有重要意义。

抗原抗体复合物疫苗是上世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，由特异性高免血清按照适当比例与抗原混合而成。抗原抗体复合物疫苗中抗体主要起着延缓病毒释放的作用，疫苗注射后，免疫复合物会被存在于脾脏的一种称为树突状淋巴细胞所捕获，继而抗原会缓慢释放。当鸡只的母源抗体下降到疫苗可以出破的水平时，此时释放的疫苗抗原即可在靶器官定植，从而诱导免疫力。其优点在于安全性高，免疫效果比常规疫苗好；可突破母源抗体干扰，雏鸡使用该类疫苗对其他疫苗免疫无干扰作用。

国内外针对于鸡传染性法氏囊病的疫苗多为活疫苗和灭活疫苗。活疫苗因其毒力较强，易造成自身法氏囊损伤，导致免疫抑制性疾病，还会影响其他疫苗的免疫失败。而灭活疫苗使用范围较窄，仅适用于种鸡，且不能引起细胞免疫，免疫效果不明显。目前鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物疫苗有鸡传染性法氏囊复合冻干活疫苗（W2512G-61株）、鸡传染性法氏囊病复合冻干活疫苗（2512株），其制作方法为传统的高免血清与法氏囊病毒结合的方法，该方法制备疫苗所需大量高免血清抗体，需通过屠杀大量动物获得，费时费力，同时生产成本较高，导致疫苗价格较昂贵。

卵黄抗体的研究始于19世纪末20世纪初。1889年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体;1934年,Jukes的实验证明了母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中,从而为雏鸡提供被动免疫保护。

卵黄抗体（IgY）分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。卵黄抗体作为一种具有生物学活性的免疫球蛋白，在生产，加工，储存以及摄食及消化过程中，保持抗体的活性是关键的。多项实验表明鸡IgY具有良好的稳定性、耐酸、耐热。IgY在室温中保存6个月，其中和病毒能力无明显改变。李春晖等(2002)研究了胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响。结果表明IgY经胃蛋白酶酶解24h后仍保持中和抗原的作用，其酶解片段也具有抗体活性。卵黄抗体在生产上还具有无可比拟的优越性。首先，产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。其次，收集鸡蛋方便，无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则。欧洲替代方法验证中心(ECVAM)建议以IgY代替哺乳动物IgG作为实验和生产抗体的来源。第三，每个蛋大约含100mg以上的IgY，一个月可达3g相当于兔子的10-20倍；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯。第四，由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4℃条件下6个月，IgY活性损失很小。所以可待蛋收集到一定量时再进行大规模地提纯IgY。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。

维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。

黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。

本发明基于上述技术背景，提出一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗及其制备方法，该疫苗主要由鸡传染性法氏囊病毒与鸡传染性法氏囊病卵黄抗体按适当比例组合，加适量含免疫增强剂的冻干保护剂经真空冷冻干燥制成。通过该方法制备抗原抗体复合物疫苗，抗体获得途径简单，可提高动物福利，节省人力物力，大幅度降低生产成本。该疫苗可以用于雏鸡免疫，能够突破母源抗体干扰，并且雏鸡使用该疫苗后对其他疫苗无干扰，可诱导产生较强的粘膜免疫应答，提高保护率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法的技术方案，采用该方法制备疫苗生产工艺简单且稳定、易操作，质量易控，可显著提高疫苗质量和降低生产成本，生产出的鸡传染性法氏囊病活疫苗安全性好、免疫效力高，对及传染性法氏囊强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）制苗用细胞的传代与培养：取鸡胚成纤维传代细胞系DF-1细胞系经胰酶细胞分散液消化传代，在培养瓶中以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

2）细胞毒种的繁殖：取生产用传染性法氏囊病毒B87株，按维持液体积量的1%接种于已长成良好单层的鸡胚成纤维传代细胞中，置37～38℃在维持液中继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；

3）制苗用毒液的繁殖：取步骤1）中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种步骤2）得到的含1%法氏囊细胞适应毒B87株的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存；

4）抗原抗体复合物的制备：将步骤3）中病毒悬液进行无菌检验、病毒含量测定，将步骤3）中检验合格病毒悬液与鸡传染性法氏囊病卵黄抗体混合吸附；

5）成品制备：将步骤4）中抗原抗体复合物与冻干保护剂按体积比1:1混合，分装后经冷冻真空干燥制成传染性法氏囊病复合活疫苗。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中病毒悬液与卵黄抗体体积比例为1:1，其中每毫升病毒悬液含病毒10^7.0-7.5TCID₅₀，每毫升鸡传染性卵黄抗体抗体效价为1:1024-2048。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中吸附时间为12～20小时。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中吸附温度为2～6℃。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤5）中冻干保护剂为每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素组合6～10g、明胶4～6g和蔗糖40～70g。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM/F12、10%胎牛血清、90～110U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～60%，维持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、90～100U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～50%。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮按以下步骤制得：

a、按怀牛膝20～40份、茯苓10～30份、淫羊藿10～30份、荨麻5～20份、问荆10～30份、丹参5～20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素组合中含有维生素B1 15～35%、维生素C 40～70%和维生素E 10～30%。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明制备的抗原抗体复合物疫苗，可大大提高活疫苗的体液免疫，产生较高的中和抗体。该疫苗可以用于雏鸡免疫，能够突破母源抗体干扰，并且雏鸡使用该疫苗后对其他疫苗无干扰，可诱导产生较强的粘膜免疫应答，提高保护率。

2.卵黄抗体替代了血清抗体制备抗原抗体复合物疫苗，抗体获得途径简单，可提高动物福利，节省人力物力，大幅度降低生产成本。

3.本发明采用了有效的中药提取物，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1 用DF-1细胞系培养鸡传染性法氏囊病毒制备鸡传染性法氏囊病毒悬液，包括以下步骤：

（1）制苗用细胞的传代与培养：取鸡胚成纤维传代细胞系DF-1细胞系经胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞毒种的繁殖：取生产用传染性法氏囊病毒B87株（购自中国兽医药品监察所）毒种，按维持液体积量的1%接种于已长成良好单层的鸡胚成纤维传代细胞中，置37～38℃在维持液中继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；

（3）制苗用毒液的繁殖：取步骤（1）中已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种步骤2）得到的含1%法氏囊细胞适应毒B87株的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存。

所述的细胞生长液含90%DMEM/F12、10%胎牛血清、90～110U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～60%，维持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、90～100U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～50%。

实施例2 鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的制备，包括以下步骤：

a、用鸡传染性法氏囊灭活疫苗免疫健康蛋鸡。免疫程序为首次胸部肌肉免疫0.5ml/只；首免一周后进行二次免疫，胸部肌肉免疫1.0ml/只；二次免疫后两周进行三次免疫，胸部肌肉免疫1.0ml/只。

b、三次免疫后两周开始监测高免蛋抗体效价，当高免蛋中抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体琼脂扩散效价达1:128时，采集合格高免蛋。

c、卵黄分离：将b中采集的无破损高免蛋用0.1%新洁尔灭清洗消毒，破壳分离卵黄，收集卵黄于卵黄储罐中，搅拌混匀。

d、酸化水提：按1:11将纯化水加至酸化提取罐中，将c中卵黄注入酸化提取罐中，搅拌均匀，测定卵黄稀释液pH，用1M稀盐酸或1M氢氧化钠调节pH至6.0，4℃静止孵育24小时。

e、浓缩超滤：吸取d中上清，经连续流离心机10000rpm离心，离心后上清经30kd密理博超滤浓缩装置进行60-80倍浓缩。

f、将e中卵黄抗体浓缩液经冷冻真空干燥制成卵黄抗体冻干粉。

实施例3 中药多糖的制备，包括以下步骤：

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到复合中药多糖冻干粉。

实施例4 中药黄酮的制备，包括以下步骤：

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗体中药黄酮；

d、将c中上清进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

实施例5 含免疫增强剂的冻干保护剂，每1000ml磷酸缓冲液包含以下组分：中药多糖60g、中药黄酮40g、维生素组合8g（其中维生素B1 1.6g，维生素C 4.6g，维生素E 1.8g）、明胶5g、蔗糖50g；

制备方法：精确称取各组分，溶解于1000ml的磷酸缓冲溶液，无菌条件下经0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例6 含免疫增强剂的冻干保护剂，每1000ml磷酸缓冲液包含以下组分：中药多糖30g、中药黄酮60g、维生素组合10g（其中维生素B1 2g，维生素C 6g，维生素E 2g）、明胶4g、蔗糖40g；

实施例7 含免疫增强剂的冻干保护剂，每1000ml磷酸缓冲液包含以下组分：中药多糖100g、中药黄酮20g、维生素组合6g（其中维生素B1 2.1g，维生素C 2.4g，维生素E 1.5g）、明胶6g、蔗糖70g；

实施例8 一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法

a、将鸡传染性法氏囊病毒悬液用灭菌PBS调至病毒含量为10^7.5TCID₅₀/1ml。

b、将鸡传染性法氏囊病卵黄抗体用灭菌PBS调至每毫升抗体效价为1:2048。

c、将a中鸡传染性法氏囊病毒悬液与b中的鸡抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体按体积比1:1在2、4或6℃下进行混合吸附12、16或20小时。

d、将吸附后的抗原抗体复合物按1:1（V:V）比例加入含实施例5、6或7制得的免疫增强剂的冻干保护剂，分装后经冷冻真空干燥制成鸡传染性法氏囊病复合活疫苗。

e、成品检验

按照“鸡传染性法氏囊病复合活疫苗制造及检验试行规程”和《中华人民共和国兽药典》（2010版）相关要求对成品进行相关检验，检验结果见表1：

表1 成品检验结果

比较例1 本发明复合活疫苗与毒株同源普通活疫苗的比较试验

1材料

1.1 疫苗

疫苗一：本发明疫苗，按实施例6制备得到；

疫苗二：鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株），由实施例6中鸡传染性法氏囊病毒悬液与5%的蔗糖牛奶保护剂混合，经冷冻真空干燥制备得到。

1.2 试验用鸡 1日龄三黄肉鸡90只；30日龄SPF鸡30只。

2 方法

2.1 将90只1日龄三黄肉鸡分为三组，每组30只，1日龄时，第一组免疫本发明复合活疫苗1羽份，第二组免疫普通活疫苗1羽份，第三组不免疫作为对照。免疫后在28日龄和50日龄时分别对各组进行采血，检测琼脂扩散效价和中和效价，同时各取10只鸡进行剖检，50日龄时，各取10只进行攻毒试验。

2.2 将30只SPF鸡分为3组，每组10只。第一组免疫本发明复合活疫苗，第二组免疫普通活疫苗1羽份，第三组不免疫作为对照。免疫后一个月进行法氏囊免疫效力比较，包括采血测定抗体和用强毒作攻毒试验。

3 结果

3.1 1日龄三黄鸡试验结果，免疫后在28日龄和50日龄时分别对各组进行采血，检测琼脂扩散效价和中和效价，同时各取10只鸡进行剖检，50日龄时，各取10只进行攻毒试验，剖检结果表明，普通活疫苗组一共有6只鸡的法氏囊出现了萎缩的症状，表明在活疫苗免疫的过程中由于毒力的影响，导致法氏囊发病，而本发明复合活疫苗在剖检结果表明，所有剖检鸡法氏囊均健康未见病变。抗体检测结果见表2。

表2 1日龄三黄鸡免疫试验结果

3.2 30日龄SPF鸡试验结果，见表3。

表3 30日龄SPF鸡免疫试验结果

4 结论

综上所述，本发明复合活疫苗无论是用于1日龄雏鸡，还是用于30日龄SPF鸡，其免疫效果均明显优于普通活疫苗。

Claims

1.一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

4）抗原抗体复合物的制备：将步骤3）中病毒悬液进行无菌检验、病毒含量测定，将步骤3）中检验合格病毒悬液与鸡传染性法氏囊病卵黄抗体混合吸附，病毒悬液与卵黄抗体体积比例为1:1，其中每毫升病毒悬液含病毒10^7.0-7.5TCID₅₀，每毫升鸡传染性卵黄抗体抗体效价为1:1024-2048；

5）成品制备：将步骤4）中抗原抗体复合物与冻干保护剂按体积比1:1混合，分装后经冷冻真空干燥制成传染性法氏囊病复合活疫苗，冻干保护剂为每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素组合6～10g、明胶4～6g和蔗糖40～70g；所述的中药多糖和中药黄酮按以下步骤制得：

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮；

所述的维生素组合中含有维生素B1 15～35%、维生素C 40～70%和维生素E 10～30%。

2.如权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中吸附时间为12～20小时。

3.如权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中吸附温度为2～6℃。

4.如权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM/F12、10%胎牛血清、90～110U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～60%，维持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、90～100U/ml抗菌素，pH 7.2～7.3、DO 30～50%。