CN101704889A - 一种鸡法氏囊抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体地，本发明涉及一种鸡法氏囊抗体的制备方法。根据本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法，包括以下步骤：1)用杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡，用量为每只鸡每天0.08～0.1g，饲喂20～30天后，对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫，采集鸡血清测定抗DHV中和抗体效价，合格者，收集该鸡群产的蛋；2)无菌条件下分离蛋清，捣碎蛋黄，将卵黄液和无菌生理盐水混匀，制备卵黄抗体。通过本发明的方法不仅具有制作简单方便，性质稳定等特点，其产生的传染性法氏囊抗体效价可比常规方法制得的卵黄抗体提高2倍以上，在紧急预防与治疗鸡传染性法氏囊病方面具有显著的效果。

Description

一种鸡法氏囊抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地，本发明涉及一种鸡法氏囊抗体的制备方法。

背景技术

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，简称为IgY。卵黄抗体的研究始于19世纪末，1893年Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年Jukes的实验证明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patters等的试验证实，相对别的血浆蛋白，IgG被选择性的转运到卵泡中。1969年，Leslie和Clem将这种抗体命名为IgY。

卵黄抗体的形成过程是：当机体受到外界特异性抗原(尤其是灭活抗原)的刺激后诱发一系列的免疫应答反应，激发B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。同时在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体IgG(所有亚群)由卵巢IgG受体的介导逐步进入到卵巢滤泡和输卵管中，并在卵黄中蓄积起来，也正是由于这种卵黄累积作用，使卵黄中的IgG明显地高于血清中的含量，而血清中的其他抗体(主要是IgM，IgA)与输卵管中的卵白白蛋白一起混入到鸡蛋白中。

卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性，在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在pH＜4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4-12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH＞12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。由于具有这些稳定的理化性质，所以其开发应用备受人们所关注。

除上述理化特性外，卵黄抗体还有其他重要的生物学特性。卵黄抗体浓度高于血清IgG，单个卵黄(约15mL)含200mg左右的卵黄抗体，自卵黄中获得卵黄抗体较实验动物血清方便。且卵黄抗体不与哺乳动物补体、Fc受体结合，也不与葡萄球菌蛋白A(SPA)或链球菌蛋白G(SPG)结合，卵黄抗体还不与血清中的类风湿因子(RF)结合，可提高免疫学检测的准确性。因而可用卵黄抗体检测粪便中的病毒，因为粪便中经常含有大量SPA，用卵黄抗体检测可避免假阳性结果。卵黄抗体是独特的IgG同种型抗体，同时哺乳动物组织结构较禽类组织具有高度免疫性，卵黄抗体用于哺乳动物检测具有明显的优势，许多高度保守的抗原，在步入动物中仅产生极小的免疫原性，却可用卵黄抗体进行区分，因此卵黄抗体可用于兽医和人类免疫学的检测。

杨树皮类脂(Poplar Bark Lipid，PBL)是从杨树皮中提取的一种橙黄色脂溶性物质，富含大量的多糖、有机酸、甾醇、磷脂、甙类及维生素等物质.多糖类具有促胸腺体液反应、刺激网状内皮系统，提高机体特异性免疫反应能力；有机酸具有增强机体免疫功能的作用，能够刺激和促进单核吞噬细胞功能，对抗免疫抑制对免疫器官的抑制作用；甙类能够加速抗体的产生、促进淋巴细胞转化和增强网状内皮系统功能等作用.这些物质在动物体内协调统一，大大提高动物体的免疫机能.

作为杨树皮的提取物，杨树皮类脂与大多数的中草药一样，也存在着双向性，当使用剂量过大时，不但不能起到正向促进作用，相反免疫器官会出现免疫抑制作用，因此，合适的剂量是发挥杨树皮类脂免疫增强作用的关键所在。

法氏囊作为最重要的禽的中枢免疫器官，其发育的状况、淋巴细胞发育程度、分化成熟程度将直接影响到制备法氏囊抗体水平。适量的杨树皮类脂对法氏囊发育具有明显的促进作用。由于杨树皮类脂成分中含有大量的必需氨基酸、维生素、甾醇等，这些营养物质正是免疫器官发育过程中不可或缺的组分，通过饲喂适量的杨树皮类脂，可以很好的促进法氏囊等免疫器官的发育，刺激并促进各淋巴细胞的分裂与增值，使法氏囊淋巴组织与淋巴细胞具有较强的生物学活性，从而整体提高法氏囊产生免疫应答，分泌抗体的水平，高水平表达的抗体可通过体液循环到达卵巢，并在卵黄形成阶段被收集，经过卵的各个形成过程，最终以卵黄抗体的形式得到保存。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡法氏囊抗体的制备方法。

根据本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)用杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡，用量为每只鸡每天0.08～0.1g，饲喂20～30天后，对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫，采集鸡血清测定抗DHV中和抗体效价，合格者，收集该鸡群产的蛋；

2)无菌条件下分离蛋清，捣碎蛋黄，将卵黄液和无菌生理盐水混匀，制备卵黄抗体。

根据本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法，其中，对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫的过程为：首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1ml油乳剂灭活苗。

根据本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法，其中，在制备卵黄抗体过程中，向所述卵黄和生理盐水的混合液中添加泊罗沙姆188，使其终浓度达到0.5-2.0％。

根据本发明的具体实施例，本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法具体包括以下步骤：

1)杨树皮类脂(购自山东省莒县林产化工厂)饲喂健康产蛋鸡，每只鸡每天0.08～0.1g，每天一次，一个月后对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫，

其中，法氏囊灭活疫苗强化免疫方法如下：

利用法氏囊B87毒株(购自中国兽医药品监察所)接种SPF鸡胚(购自山东省SPF试验鸡场)，收集60～96h死亡胚胚体、绒毛膜和尿囊液混合捣碎，冻融三次，离心，取上清液，加0.1％甲醛灭活，然后与油佐剂(购自杭州炼油厂10号轻质白油)充分乳化制成油乳剂灭活疫苗，用于经杨树皮类脂饲喂一个月的健康产蛋鸡的免疫，首次免疫每只鸡胸部肌肉注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1ml油乳剂灭活苗；

2)卵黄抗体的制备：

第4次免疫后14d，采集鸡血清测定抗DHV中和抗体效价(按2008版农业部兽用生物制品标准)，合格者，收集该鸡群产的蛋，自来水清洗污物后用0.05％百毒杀浸泡3-5min，纱布擦干后，再用75％酒精擦一遍，晾干，无菌条件下分离蛋清，把蛋黄倒人消毒好的组织捣碎机中；

3)按照1∶4的比例混合卵黄液和无菌生理盐水，进行匀浆1～2min，在上述混合液中添加泊罗沙姆188，使其终浓度达到0.5-2.0％，4-8℃冷浸过滤，120目纱网第一次过滤，然后将滤液依次转入100μm、50μm的微孔滤袋中，压力过滤，滤液经巴氏消毒后加入万分之一的硫柳汞，分装，无菌检验合格备用。

本发明提供了一种新型抗鸡传染性法氏囊病的精致抗体制备方法，利用杨树皮类脂的免疫增强功能先提高蛋鸡中枢免疫器官的成熟程度，激活机体免疫系统，通过机体对疫苗注射产生的特殊免疫应答使注射过杨树皮类脂的蛋鸡所产的鸡蛋中含有高滴度的抗鸡传染性法氏囊病的抗体。通过本发明的方法不仅具有制作简单方便，性质稳定等特点，其产生的传染性法氏囊抗体效价可比常规方法制得的卵黄抗体提高2倍以上，在紧急预防与治疗鸡传染性法氏囊病方面具有显著的效果。

具体实施方式

实施例1鸡传染性法氏囊抗体的制备

利用杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡，每只鸡每天饲喂0.08g。

利用法氏囊B87毒株接种SPF鸡胚，收集60～96h死亡胚胚体、绒毛膜和尿囊液混合捣碎，冻融三次，离心，取上清液，加0.1％甲醛灭活。然后与油佐剂充分乳化制成油乳剂灭活疫苗，用于经杨树皮类脂(购自山东省莒县林产化工厂)饲喂一个月的健康产蛋鸡的免疫。首次免疫每只鸡胸部肌肉注射0.5ml弱毒疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗，21天时进行第3次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗，28天时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1ml油乳剂灭活苗。

第四次免疫后14天，采集鸡血清测定抗DHV中和抗体效价(按2008版农业部兽用生物制品标准)，合格者，收集该鸡群产的蛋，自来水清洗污物后用0.05％百毒杀浸泡3-5min，纱布擦干后，再用75％酒精擦一遍，晾干。无菌条件下分离蛋清，把卵黄倒入消毒好的组织捣碎机中，按照1∶4的比例混合卵黄液和无菌生理盐水，进行匀浆1～2min。在上述混合液中添加泊罗沙姆188，使其终浓度达到0.5％。4-8℃冷浸过滤，120目纱网第一次过滤，然后将滤液依次转入100μm、50μm的微孔滤袋中，压力过滤。滤液经巴氏消毒后加入万分之一的硫柳汞，分装，无菌检验合格备用(无菌检验、安全检验根据2008版农业部兽用生物制品质量标准进行)。

经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价不低于1∶256，其安全性为100％、无菌性检测结果为阴性

治疗用量：对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射2.0ml/只，7天以后再次注射2.0ml/只。

实施例2

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天0.1g、向卵黄和生理盐水的混合液中添加泊罗沙姆188的终浓度为2.0％外，其余步骤同实施例1。

经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价不低于1∶256，其安全性、无菌性检测结果阴性为

治疗用量：对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射2.0ml/只，7天以后再次注射2.0ml/只。

实施例3

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天0.09g、向卵黄和生理盐水的混合液中添加泊罗沙姆188的终浓度为1.5％外，其余步骤同实施例1。

经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价不低于1∶256，其安全性100％、无菌性检测结果为阴性。

治疗用量：对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射2.0ml/只，7天以后再次注射2.0ml/只。

对比实施例1

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天0.05g外，其余步骤同实施例1。

经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价一般在1∶128.

治疗用量需要对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射3-4.0.ml/只，7天以后再次注射3-4.0ml/只。

对比实施例2

除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天0.12g外，其余步骤同实施例2。

经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价低于1∶128，

治疗时，即使超过4.0ml/只注射，保护率也较低。

Claims (4)

1.一种鸡法氏囊抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)用杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡，用量为每只鸡每天0.08～0.1g，饲喂20～30天后，对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫，采集鸡血清测定抗DHV中和抗体效价，合格者，收集该鸡群产的蛋；

2)无菌条件下分离蛋清，捣碎蛋黄，将卵黄液和无菌生理盐水混匀，制备卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述鸡法氏囊抗体的制备方法，其特征在于，对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫的过程如下：

首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1ml油乳剂灭活苗。

3.根据权利要求1所述鸡法氏囊抗体的制备方法，其特征在于，在制备卵黄抗体过程中，向所述卵黄和生理盐水的混合液中添加泊罗沙姆188，使其终浓度达到0.5-2.0％。

4.根据权利要求1所述鸡法氏囊抗体的制备方法，其特征在于，卵黄液和无菌生理盐水以1∶4混合。