CN101948537A - 一种提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，采用低温酸化处理和氯化钠处理，结合三次过滤，得到鸡卵黄抗体。本发明的提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，分别采用低温酸化处理和氯化钠处理，使卵黄抗体在自然状态下沉淀，而且氯化钠对机体的刺激性小，降低了卵黄抗体的生产成本和生产步骤，提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，属于疾病免疫技术领域。
背景技术
鸡传染性法氏囊病是养鸡业中常见的疾病，容易大面积爆发从而造成严重的经济损失。目前主要的防止方法包括抗生素、中西药及其制剂、卵黄抗体及其生物制剂等，其中卵黄抗体是采用鸡传染性法氏囊病抗原免疫健康鸡，从免疫鸡蛋的卵黄中提取鸡传染性法氏囊病抗体，这种通过鸡免疫后卵黄抗体对鸡传染性法氏囊病见效快、疗效显著，而且针对性强，对鸡传染性法氏囊病具有很好的预防效果。目前卵黄抗体的制备及生产工艺在现在生产中已经成熟，主要采用的是离心沉淀法提取抗体，这样效率比较高，但是在高速离心的情况下会造成抗体的损失，从而影响卵黄抗体生产率。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，以提高提取的效率，降低提取的成本。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，具体步骤如下：
1）将免疫鸡蛋进行清理、消毒，晾干备用；
2）从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入等体积的无菌蒸馏水，然后放入62-65℃的水浴中，不断搅拌使其混合均匀，得到卵黄液；
3）取pH为4.0-5.0的盐酸酸化的无菌注射用水加入到步骤2）得到的卵黄液中稀释，加入量为卵黄液体积的6-8倍，再加入抗生素青霉素和链霉素，4-6℃静置6-8小时，取上清液；
4）将步骤3）得到的上清液用400目滤布进行初步过滤，再用0.22μm滤膜过滤得到初提液；
5）按照步骤4）得到初提液体积0.7-0.9%加入氯化钠，充分搅拌，用100KD滤膜进行抽滤，得到沉淀，用0.8-1.0%PBS重悬沉淀得到卵黄抗体。
步骤3）所述酸化的无菌注射用水在加入前进行4-6℃预冷。
将得到的卵黄抗体按照其体积0.1%加入甲醛进行灭活，防止其它病毒或细菌的存活。
步骤3）所述抗生素青霉素和链霉素的加入量分别为每毫升稀释液2000-4000U。
本发明的提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，分别采用低温酸化处理和氯化钠处理，使卵黄抗体在自然状态下沉淀，而且氯化钠对机体的刺激性小，降低了卵黄抗体的生产成本和生产步骤，提高了生产效率。
具体实施方式
实施例1
本实施例的提取鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的方法，步骤如下：
1）将收集的高免鸡蛋先进行初步的清理，无菌生理盐水清洗，晾干，接着用消毒液进行42℃浸泡20min，晾干，用95%的酒精喷洒消毒，晾干备用；
2）采用手工分离蛋黄，先将蛋黄打碎，用打蛋器充分搅拌，加入等体积的无菌蒸馏水，然后放入62℃的水浴中，不断搅拌使其混合均匀，得到卵黄液；
3）采用盐酸酸化无菌注射用水至pH为4.0，放入4℃预冷，然后加入到步骤2）得到的卵黄液中稀释，加入量为卵黄液体积的6倍，再加入抗生素青霉素和链霉素，加入量为每毫升稀释液2000U，然后于4℃静置6小时，取上清液；
4）将步骤3）得到的上清液用400目滤布进行初步过滤，再用0.22μm滤膜过滤得到初提液；
5）按照步骤4）得到初提液体积0.0.7%加入氯化钠，可以使初提液澄清，透明度增加，充分搅拌，用100KD（型号MWCO）滤膜进行抽滤，得到沉淀，用0.8%PBS重悬沉淀得到卵黄抗体；
6）将得到的卵黄抗体按照其体积0.1%加入甲醛进行灭活，防止其它病毒或细菌的存活。
实施例2
本实施例的提取鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的方法，步骤如下：
1）将收集的高免鸡蛋先进行初步的清理，无菌生理盐水清洗，晾干，接着用消毒液进行42℃浸泡20min，晾干，用95%的酒精喷洒消毒，晾干备用；
2）采用手工分离蛋黄，先将蛋黄打碎，用打蛋器充分搅拌，加入等体积的无菌蒸馏水，然后放入64℃的水浴中，不断搅拌使其混合均匀，得到卵黄液；
3）采用盐酸酸化无菌注射用水至pH为4.5，放入5℃预冷，然后加入到步骤2）得到的卵黄液中稀释，加入量为卵黄液体积的7倍，再加入抗生素青霉素和链霉素，加入量为每毫升稀释液3000U，然后于5℃静置7小时，取上清液；
4）将步骤3）得到的上清液用400目滤布进行初步过滤，再用0.22μm滤膜过滤得到初提液；
5）按照步骤4）得到初提液体积0.8%加入氯化钠，可以使初提液澄清，透明度增加，充分搅拌，用100KD（型号MWCO）滤膜进行抽滤，得到沉淀，用0.9%PBS重悬沉淀得到卵黄抗体。
6）将得到的卵黄抗体按照其体积0.1%加入甲醛进行灭活，防止其它病毒或细菌的存活。
实施例3
本实施例的提取鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的方法，步骤如下：
1）将收集的高免鸡蛋先进行初步的清理，无菌生理盐水清洗，晾干，接着用消毒液进行42℃浸泡20min，晾干，用95%的酒精喷洒消毒，晾干备用；
2）采用手工分离蛋黄，先将蛋黄打碎，用打蛋器充分搅拌，加入等体积的无菌蒸馏水，然后放入65℃的水浴中，不断搅拌使其混合均匀，得到卵黄液；
3）采用盐酸酸化无菌注射用水至pH为5.0，放入6℃预冷，然后加入到步骤2）得到的卵黄液中稀释，加入量为卵黄液体积的8倍，再加入抗生素青霉素和链霉素，加入量为每毫升稀释液4000U，然后于6℃静置8小时，取上清液；
4）将步骤3）得到的上清液用400目滤布进行初步过滤，再用0.22μm滤膜过滤得到初提液；
5）按照步骤4）得到初提液体积0.9%加入氯化钠，可以使初提液澄清，透明度增加，充分搅拌，用100KD（型号MWCO）滤膜进行抽滤，得到沉淀，用1.0%PBS重悬沉淀得到卵黄抗体。
6）将得到的卵黄抗体按照其体积0.1%加入甲醛进行灭活，防止其它病毒或细菌的存活。
实验例
1、效价的测定：利用琼脂扩散凝胶法对实施例1-3的卵黄抗体和常规提取方法进行试验，琼脂为1%，氯化钠为8%，配制成平板，要求平板厚度为5mm，孔距为4 mm，孔径为5mm，加入量约35μl，37℃培养过夜，观察结果。结果见表1。
表1 各实施例效价试验结果
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 常规提取抗体 |
| 效价 | 1:16 | 1:32 | 1:32 | 1:16 |
2、安全性检验：将40只四日龄SPF试验鸡，分两组，一组接种所提卵黄抗体溶液2ml，另一组接种生理盐水2ml。观察两周，结果这两组试验动物均无异常现象发生，饮食欲正常。
3、保护性试验：用80只四日龄SPF试验鸡分四组进行攻强毒保护性试验，一组至三组分别接种实施例1-3卵黄抗2ml，另一组接种生理水2 ml，5天后攻强毒，采用完全自由饮食，观察效果。见表2：
表2 保护性试验数据表
 |
一组 | 二组 | 三组 | 四组 |
| 发病只数 | 3 | 2 | 3 | 19 |
| 死亡只数 | 2 | 0 | 1 | 17 |
Claims (4)
1.一种提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，其特征在于：具体步骤如下：
1）将免疫鸡蛋进行清理、消毒，晾干备用；
2）从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入等体积的无菌蒸馏水，然后放入62-65℃的水浴中，不断搅拌使其混合均匀，得到卵黄液；
3）取pH为4.0-5.0的盐酸酸化的无菌注射用水加入到步骤2）得到的卵黄液中稀释，加入量为卵黄液体积的6-8倍，再加入抗生素青霉素和链霉素，4-6℃静置6-8小时，取上清液；
4）将步骤3）得到的上清液用400目滤布进行初步过滤，再用0.22μm滤膜过滤得到初提液；
5）按照步骤4）得到初提液体积0.7-0.9%加入氯化钠，充分搅拌，用100KD滤膜进行抽滤，得到沉淀，用0.8-1.0%PBS重悬沉淀得到卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，其特征在于：步骤3）所述酸化的无菌注射用水在加入前进行4-6℃预冷。
3.根据权利要求1所述的提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，其特征在于：将得到的卵黄抗体按照其体积0.1%加入甲醛进行灭活，防止其它病毒或细菌的存活。
4.根据权利要求1所述的提取鸡传染性法氏囊病鸡卵黄抗体的方法，其特征在于：步骤3）所述抗生素青霉素和链霉素的加入量分别为每毫升稀释液2000-4000U。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wu Hongyun Inventor after: Guo Junqing Inventor after: Xu Jin Inventor after: Xu Rongjun Inventor after: Liu Wei Inventor after: Li Jianzheng Inventor before: Wu Hongyun Inventor before: Guo Junqing Inventor before: Li Jianzheng |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WU HONGYUN GUO JUNQING LI JIANZHENG TO: WU HONGYUN GUO JUNQING XU JIN XU RONGJUN LIU WEI LI JIANZHENG |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160222 Address after: 450061 Xingang Avenue, Xinzheng port, Henan, Zhengzhou Patentee after: Henan Hou Yi bioengineering Limited by Share Ltd Address before: 451161, Henan, Zhengzhou, Xingang airport east side of the road Patentee before: Zhengzhou Houyi Pharmaceutical Co., Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121219 Termination date: 20171021 |