CN103432158B

CN103432158B - 一种防治猪腹泻的多糖复合剂及用途

Info

Publication number: CN103432158B
Application number: CN201310376633.8A
Authority: CN
Inventors: 刘翼翔; 吴永沛; 谢荔朋
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Fujian nine Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103432158A

Abstract

本发明提出了一种防治猪腹泻的多糖复合剂及用途。所述多糖复合剂是由50‑90质量%的低聚岩藻聚糖和10‑50质量%的PZ‑1细菌胞外多糖组成，所述PZ‑1细菌胞外多糖为彭氏变形菌PZ‑1发酵后，经提取纯化得到的细菌胞外多糖。低聚岩藻聚糖是从海带粉中提取，水解，超滤膜分离后所得；将低聚岩藻聚糖和PZ‑1细菌胞外多糖按照比例逐级混合法粗混，最后混合均匀得到本发明的多糖复合剂。本发明的多糖复合剂可减少抗生素药物在猪饲养过程中的使用，为消费者提供安全、绿色的猪肉产品，有效防治猪腹泻。同时可作为治疗猪腹泻抗生素药物的替代品。效果比单独使用低聚岩藻聚糖或PZ‑1细菌胞外多糖好，更优于两者的简单相加。

Description

一种防治猪腹泻的多糖复合剂及用途

技术领域

本发明涉及本发明属于生物制剂领域，涉及利用低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖制备防治猪腹泻药物的应用。

背景技术

腹泻是猪的一种常见病和多发病。近年来猪腹泻病的发病率不断上升，特别是仔猪由于抵抗力差，发病率更高。据报道，2012 年初猪腹泻病大面积暴发，存栏200 头以下基础母猪的中小猪场发病率达到20％-40％；产后1 周的母猪和仔猪腹泻尤为严重，部分猪场仔猪死亡率高达100％，给养猪业造成了不可估量的损失。

导致猪腹泻的主要原因是致病性细菌及病毒感染。例如，致病性大肠杆菌是导致仔猪黄痢和白痢的主要原因。另外，猪感染魏氏梭菌、猪痢疾杆菌、弯曲杆菌、副伤寒、内劳森氏菌和密螺旋体等病菌后，在一定条件下都会引起腹泻的发生。病毒性感染是导致猪腹泻的另一主要原因，常见病毒传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、腺病毒和疱疹病毒等，这些病毒都导致猪腹泻的发生。

目前用于防治猪腹泻的药物主要是抗生素类药物，饲养户为了减少猪在饲养过程中的患病，常在饲料中添加过量的抗生素，使猪肉产品中抗生素残留严重超标，直接危害消费者的健康安全。研究表明，某些特定结构的多糖具有良好的抗病毒、抗菌等生理活性，而部分多糖的生物活性则主要以免疫调节功能为主，因此将某些具有良好抗病毒、抗菌活性的多糖与具有调节免疫功能的多糖组合来代替抗生素或作为抗生素增效剂，能有效减少抗生素药物在防治猪腹泻过程的使用，从而生产出安全、绿色的猪肉产品。

岩藻聚糖（Fucoidan）是存在于褐藻（例如海带、马尾藻等）细胞壁基质中的一种水溶性硫酸多糖，含量高达2-3%，是海带中的主要生物活性成分之一（Holdt & Kraan,2011）。研究发现，只有低分子量的硫酸多糖才具有良好的抗菌和抗病毒活性。郭凌等（2002）通过对麒麟菜硫酸多糖及其酸解产物的抑菌活性的研究发现，未水解的硫酸多糖无抑菌活性。在抗病毒活性方面，低分子岩藻聚糖的活性也明显好于大分子岩藻聚糖（Schaeffer & Kryolv, 2000; Koyanagi et al., 2003; Pielesz et al., 2011），且5000—20000 Da分子量的低聚岩藻聚糖的抗病毒活性最高，估计这一分子量的多糖能够折叠成为与病毒具有高度亲和力的高级结构，从而使病毒失去感染活力。

多糖的免疫调节功能是其重要的生理活性。通过大量对多糖调节免疫系统的作用机理的研究，发现多糖可以与淋巴细胞表面的受体CR3结合，通过影响胞内Ca²⁺，cAMP，cGMP等信息分子的浓度而参与淋巴细胞的活化、增殖，促进细胞因子和抗体的产生。PZ-1胞外多糖是由彭氏变形杆菌表达产生的一种细菌胞外多糖，研究发现，PZ-1具有良好的免疫活性（Klink et al., 1999; Kondakova et al., 2004），可用于免疫调节剂的开发和应用。

因此开发一种多糖复合剂就显得很必要。

发明内容

本发明的目的在于为防治猪腹泻提供一种安全、绿色、高效、成本低廉的多糖复合剂，减少抗生素药物在猪饲养过程中的使用，从而为消费者提供安全、绿色的猪肉产品。

为实现上述目的，本发明提供一种防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：是由50-90质量%的低聚岩藻聚糖和10-50质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成，所述PZ-1细菌胞外多糖为彭氏变形菌PZ-1发酵后，经提取纯化得到的细菌胞外多糖。将所述低聚岩藻聚糖不断加入的同时也不断加入所述PZ-1细菌胞外多糖得到多糖粗混料，粗混料再用搅拌机以800r/min的搅拌速度混合20 min，使两种多糖混合均匀即可。

优选是由60-80质量%的低聚岩藻聚糖和40-20质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成；更优选是由70-80质量%的低聚岩藻聚糖和30-20质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成。更优选是由70质量%的低聚岩藻聚糖和30质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成。

所述低聚岩藻聚糖分子量为5000-20000 Da。

所述低聚岩藻聚糖的制备方法为提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，优选搅拌速度为2000 r/min，离心，优选3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L 的HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，优选3000 r/min, 5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，优选5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，优选3000 r/min, 5 min，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉；

水解：将所述岩藻聚糖干粉与酶活力为50 万U/g的果胶酶按重量比1000:0.5的比例混合均匀，加入去离子水配成3%的糖溶液，加入HCl，优选4.0 mol/L的HCl调节pH值至3.8，水解3 h 后继续加入HCl，调节pH值至2.0，继续水解3 h；再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液；

分离：不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液经过分子截留量为5000 Da和20000Da的超滤膜分离，并收集5000-20000 Da的组分，喷雾干燥即可；优选为将100 L含有不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离；蠕动泵以50 L/h的流量输送到分子截留量为20000 Da 中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力0.06 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到多糖溶液体积浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤20000 Da的多糖溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤20000 Da的多糖溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000-20000 Da的低聚岩藻聚糖组分；该浓缩液经喷雾干燥即可。

所述PZ-1细菌胞外多糖的制备方法为，将彭氏变形菌PZ-1接种于培养基进行发酵，发酵温度为30℃，发酵过程中进行搅拌，优选搅拌速度为3000 r/min, 发酵72 h后得发酵培养液，所述培养基为蛋白胨0.5重量%，KH₂PO₄0.2重量%，MgSO₄0.02重量%，MnSO₄0.02重量%，FeSO₄·7H₂O0.005重量%，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0;

将发酵培养液冷却后离心，优选离心条件为8000 r/min，10 min，去彭氏变形菌PZ-1菌体, 取上清液;

将离心去菌体后的上清液加入无水乙醇，使之终浓度为70体积%，静置24 h，取沉淀液;

将沉淀液离心，优选离心条件为3000 r/min, 10 min，取沉淀物，经真空干燥后得粗多糖干粉;

将粗多糖溶解于去离子水中，配成2 重量%的糖溶液，然后用分子截留量为50000Da的超滤膜纯化，收集分子截留量大于50000 Da的组分，经喷雾干燥即可。

本发明还保护所述防治猪腹泻的多糖复合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，低聚岩藻聚糖制备：

提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，优选搅拌速度为2000 r/min，离心，优选3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，优选3000 r/min,5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，优选5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，优选3000 r/min, 5 min，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉。

水解：将岩藻聚糖干粉与酶活力为50 万U/g的果胶酶按重量比为1000:0.5的比例混合均匀，加入去离子水配成3重量%的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl调节pH值至3.8，水解3h 后继续加入HCl，调节pH值至2.0，继续水解3 h；再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液。

分离：不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液经过分子截留量为5000 Da和20000Da的超滤膜分离，并收集5000-20000 Da的组分，喷雾干燥即可；优选将100 L含有不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离；蠕动泵以50 L/h的流量输送到分子截留量为20000 Da 中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力0.06 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到多糖溶液体积浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤20000 Da的多糖溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤20000 Da的多糖溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000-20000 Da的低聚岩藻聚糖组分；该浓缩液经喷雾干燥后得到低聚岩藻聚糖干燥粉状物。

PZ-1细菌胞外多糖制备：

配制培养基：按质量百分比,培养基的配方如下：蛋白胨为0.5重量%，KH₂PO₄为0.2重量%，MgSO₄为0.02重量%，MnSO₄为0.02重量%，FeSO₄·7H₂O为0.005重量%，配好后用4.0mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，得培养基;

将彭氏变形菌PZ-1接种于培养基进行发酵，发酵温度为30℃，发酵过程中进行搅拌，搅拌速度为3000 r/min, 发酵72 h后得发酵培养液;

将发酵培养液冷却后离心，优选8000 r/min，10 min，去彭氏变形菌PZ-1菌体, 取上清液;

将离心去菌体后的上清液加入乙醇，使之终浓度为70体积%，静置24 h，取沉淀液;

将沉淀液离心，优选3000 r/min, 10 min，取沉淀物，经真空干燥后得粗多糖干粉;

将粗多糖干粉溶解于去离子水中，配成2重量 %的糖溶液，然后用分子截留量为50000 Da的超滤膜纯化，收集分子截留量﹥50000 Da的组分，经喷雾干燥即得PZ-1细菌胞外多糖干燥粉状物。

多糖复合剂的制备：将所述低聚岩藻聚糖干燥粉状物和PZ-1细菌胞外多糖干燥粉状物按照上述比例进行配比，将所述低聚岩藻聚糖不断加入的同时也不断加入所述PZ-1细菌胞外多糖得到多糖粗混料，粗混料再用搅拌机以800 r/min的搅拌速度混合20 min，使两种多糖混合均匀即可。

本发明还保护所述多糖复合剂用于防治猪腹泻的用途。

本发明还保护所述多糖复合剂用于猪饲料添加剂的用途。

所述彭氏变形菌PZ-1胞外多糖的单糖组成特征为：该多糖以甘露糖、阿拉伯糖和葡萄糖为主，以及少量的肌醇、鼠李糖、木糖和半乳糖，各单糖的组成比例依次为37.2%、26.5%、15.9%、7.4%、5.5%、4.5%和3.0%。所述PZ-1胞外多糖单糖组成采用糖醇乙酸酯衍生-气相色谱法进行定性与定量分析，结果见附图1。其中1为鼠李糖，2为阿拉伯糖，3为木糖，4为肌醇，5为甘露糖，6为葡萄糖，7为半乳糖。

鉴于猪腹泻与细菌、病毒性感染密切相关，并且猪免疫下降是细菌、病毒易感性的主要原因，因此将具有抗菌、抗病毒活性的低聚岩藻聚糖与具有调节免疫活性的PZ-1细菌胞外多糖制备成复合剂，能有效防治猪腹泻，达到标本兼治。

本发明的优点是，能有效防治猪腹泻，达到标本兼治。该复合剂是一种安全、绿色、高效的产品，可作为治疗猪腹泻抗生素药物的替代品。同时其效果比单独使用低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖均好，也优于两者的简单相加。

通过实施例可知，单独使用低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖对改善仔猪腹泻状况都有一定的作用，有效率分别达到了43.8%和25.0%，但效果都并不理想。且单独使用上述2种多糖，都出现了仔猪死亡的情况，PZ-1细菌胞外多糖组仔猪的死亡率高达18.8%。将低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖制备成复合剂使用，实验分别对比了实施例1（50%低聚岩藻聚糖+50%PZ-1细菌胞外多糖）、实施例2（60%低聚岩藻聚糖+40%PZ-1细菌胞外多糖）、实施例3（70%低聚岩藻聚糖+30%PZ-1细菌胞外多糖）、实施例4（80%低聚岩藻聚糖+20%PZ-1细菌胞外多糖）和实施例5（90%低聚岩藻聚糖+10%PZ-1细菌胞外多糖）所制备的复合剂在改善猪仔腹泻方面的治疗效果，所采用的5种组合都能有效避免仔猪的死亡，但在改善仔猪腹泻的效果方面差异较大。实验结果发现，在将复合剂中低聚岩藻聚糖的比例从50%提高到70%时，治疗仔猪腹泻的有效率从68.8%提高到了87.5%，接近药物组的93.8%，且无死亡现象出现；然而，进一步将复合剂中低聚岩藻聚糖的比例分别提高到80%和90%时，治疗仔猪腹泻的有效率反而分别降到了68.8%和56.3%。这说明，实施例3中低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖的比例较为合适，在此比例下，低聚岩藻聚糖的抗菌、抗病毒活性与PZ-1细菌胞外多糖的调节免疫活性产生了协同增效的功能，从而对治疗仔猪腹泻产生了较好的效果。因此，由低聚岩藻聚糖与PZ-1细菌胞外多糖组成的多糖复合剂可作为防治猪腹泻的药物使用，且实施例3所制备的低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖复合剂效果最佳。

附图说明

图1是本发明所涉及的PZ-1细菌胞外多糖的单糖组成气相色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

表1 各实施例的用量成分

实施例1

按照表1的配比，进行制备。

低聚岩藻聚糖制备方法为：

提取： 80 目海带粉按1:25（w/v）比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，搅拌速度为2000 r/min，离心（3000 r/min, 10 min），取上清液，加入HCl（12mol/L）使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心（3000 r/min, 5 min），去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30%（v/v），过夜；离心（5000 r/min, 10 min），取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60%（v/v），过夜；离心（3000 r/min, 5 min），取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉。

水解：将岩藻聚糖干粉与果胶酶（酶活力为50 万U/g）（湖州礼来生物技术有限公司，型号：L1988）按1000:0.5(w/w)的比例混合均匀，加入去离子水配成3%(w/w)的糖溶液，加入HCl（4.0 mol/L）调节pH值至3.8，水解3 h 后继续加入HCl，调节pH值至2.0，继续水解3h；再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液。

分离：将100 L含有不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置（北京众益中和生物技术有限公司）进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离；蠕动泵以50L/h的流量输送到分子截留量为20000 Da 中空改性聚氯乙烯膜进行分离（压力0.06 MPa），当多糖溶液体积浓缩至1/5时浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到多糖溶液体积浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤20000 Da的多糖溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤20000 Da的多糖溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000-20000 Da的低聚岩藻聚糖组分；该浓缩液经喷雾干燥后得到低聚岩藻聚糖干燥粉状物（分子量为5000-20000 Da，硫酸根含量为20.8%）。

PZ-1细菌胞外多糖制备方法为：

l) 配制培养基：按质量百分比,培养基的配方如下：蛋白胨为0.5%，KH₂PO₄为0.2%，MgSO₄为0.02%，MnSO₄为0.02%，FeSO₄·7H₂O为0.005%，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，得培养基;

2)将彭氏变形菌PZ-1(proteuspenneri)（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏提供，菌种编号为CGMCCNo.3224，保藏日期为2009年8月12日）接种于培养基进行发酵，发酵温度为30℃，发酵过程中进行搅拌，搅拌速度为3000 r/min, 发酵72 h后得发酵培养液;

3)将发酵培养液冷却后离心（8000 r/min，10 min）去彭氏变形菌PZ-1菌体, 取上清液;

4)将离心去菌体后的上清液加入乙醇，使之终浓度为70%（v/v），静置24 h，取沉淀液;

5)将沉淀液离心（3000 r/min, 10 min），取沉淀物，经真空干燥后得粗多糖干粉;

6)将粗多糖溶解于去离子水中，配成2 %（w/w）的糖溶液，然后用分子截留量为50000 Da的超滤膜纯化，收集分子截留量﹥50000 Da的组分，经喷雾干燥即得PZ-1细菌胞外多糖干燥粉状物。

多糖复合剂的制备：将上述低聚岩藻聚糖干燥粉状物和PZ-1细菌胞外多糖干燥粉状物按照上述比例进行配比，用逐级混合法粗混，在加入低聚岩藻聚糖干粉的同时不断加入PZ-1细菌胞外多糖干粉得到多糖粗混料，粗混料再用搅拌机以800 r/min的搅拌速度混合20 min，使两种多糖混合均匀，即制成一种防治猪腹泻的多糖复合剂。

实施例2

按照表1的配比，进行制备。

制备方法同实施例1的制备方法。

实施例3

按照表1的配比，进行制备。

制备方法同实施例1的制备方法。

实施例4

按照表1的配比，进行制备。

制备方法同实施例1的制备方法。

实施例5

按照表1的配比，进行制备。

制备方法同实施例1的制备方法。

实施例6

多糖复合剂在防治猪腹泻功效中的应用试验

2012年8月, 彭州市金猪农业开发有限公司猪场10-50日龄仔猪腹泻，在发病时间不超过24 h内用药物治疗，连续观察3天并记录试验结果。

1 试验方法

1.1动物选择与分组

选择本场母猪所产，30日龄左右、体重基本一致的仔猪144头，随机分成9组，分别为空白组、药物对照组、试验组1、试验组2、试验组3、试验组4、试验组5、试验组6和试验组7；每组16头，一组一圈，饲养在相邻的9个小猪圈舍中，经过5天的用药观察试验效果。空白组不给药，药物对照组为皮下注射丙环沙星，试验组1为100%的低聚岩藻聚糖干粉；试验组2为100%的PZ-1细菌胞外多糖干粉；试验组3为实施例1所得的复合剂；实验组4为实施例2所得的复合剂；试验组5为实施例3所得的复合剂，试验组6为实施例4所得的复合剂，试验组7为实施例5所得的复合剂；

1.2 给药方式和剂量

除药物对照组采用皮下注射外，其余8组均为自由采食；各试验组的剂量为50 mg/Kg；

1.3 饲养管理

7组仔猪都饲养在同幢相邻的猪舍中，水泥地面、自动饮水装置、通风良好，日喂三次，干料饲喂，随意采食，以吃饱不剩为原则；

1.4主要记录指标

试验期内每日记录投料量，观察猪只健康，并记录腹泻头数和天数与猪只发病死亡状况；

1.5测定指标和方法

试验期间，每天早晚仔细观察各组病猪的精神状态、食欲、大便状况。

治愈：治疗2-3 天粪便呈条状，且颜色、气味正常，仔猪精神，吃料正常，腹泻症状完全消失。

好转：治疗3-5 天粪便性状转好，水分明显减少，腹泻症状缓解或基本消失。

无效：治疗5天后，粪便次数与性状无好转，甚至病情加重。

治愈数和好转数合计为总有效数，无效数包括死亡数。

2 结果与讨论

经过5天的正式试验，仔猪腹泻及死亡观察结果如表1所示。

表1 试验仔猪腹泻及死亡数量统计

从以上试验结果可以看出，仔猪腹泻在没有药物治疗的情况下，5天内的死亡率可达25%，而且这种趋势会逐渐加强。单独使用低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖对改善仔猪腹泻状况都有一定的作用，有效率分别达到了43.8%和25.0%，但效果都并不理想。且单独使用上述2种多糖，都出现了仔猪死亡的情况，PZ-1细菌胞外多糖组仔猪的死亡率高达18.8%。将低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖制备成复合剂使用，实验分别对比了实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5所制备的复合剂在改善猪仔腹泻方面的治疗效果，所采用的5种组合都能有效避免仔猪的死亡，但在改善仔猪腹泻的效果方面差异较大。实验结果发现，在将复合剂中低聚岩藻聚糖的比例从50%提高到70%时，治疗仔猪腹泻的有效率从68.8%提高到了87.5%，接近药物组的93.8%，且无死亡现象出现；然而，进一步将复合剂中低聚岩藻聚糖的比例提高到80%和90%时，治疗仔猪腹泻的有效率反而分别降到了68.8%和56.3%。这说明，实施例3中低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖的比例较为合适，在此比例下，低聚岩藻聚糖的抗菌、抗病毒活性与PZ-1细菌胞外多糖的调节免疫活性产生了协同增效的功能，从而对治疗仔猪腹泻产生了较好的效果。因此，由低聚岩藻聚糖与PZ-1细菌胞外多糖组成的多糖复合剂可作为防治猪腹泻的药物使用，且实施例3所制备的低聚岩藻聚糖和PZ-1细菌胞外多糖复合剂效果最佳。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：是由50-90质量%的低聚岩藻聚糖和10-50质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成，所述PZ-1细菌胞外多糖为彭氏变形菌PZ-1发酵后，经提取纯化得到的细菌胞外多糖；

所述低聚岩藻聚糖的制备方法为提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，离心，取上清液，加入12 mol/L 的HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉；

水解：将所述岩藻聚糖干粉与酶活力为50 万U/g的果胶酶按重量比1000:0.5的比例混合均匀，加入去离子水配成3%的糖溶液，加入HCl调节pH值至3.8，水解3 h 后继续加入HCl，调节pH值至2.0，继续水解3 h；再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液；

分离：不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液经过分子截留量为5000 Da和20000 Da的超滤膜分离，并收集5000-20000 Da的组分，喷雾干燥即可。

2.权利要求1所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：是由60-80质量%的低聚岩藻聚糖和40-20质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成。

3.权利要求1所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：是由70-80质量%的低聚岩藻聚糖和30-20质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成。

4.权利要求3所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：是由70质量%的低聚岩藻聚糖和30质量%的PZ-1细菌胞外多糖组成。

5.权利要求1所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：所述低聚岩藻聚糖分子量为5000-20000 Da。

6.权利要求1-5任一所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：所述低聚岩藻聚糖的制备方法为提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，搅拌速度为2000 r/min，离心，3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L 的HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，3000 r/min, 5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，3000 r/min, 5 min，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉；

水解：将所述岩藻聚糖干粉与酶活力为50 万U/g的果胶酶按重量比1000:0.5的比例混合均匀，加入去离子水配成3%的糖溶液，加入4.0 mol/L的HCl调节pH值至3.8，水解3 h 后继续加入HCl，调节pH值至2.0，继续水解3 h；再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液；

分离：将100 L含有不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离；蠕动泵以50 L/h的流量输送到分子截留量为20000 Da中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力0.06 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到多糖溶液体积浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤20000 Da的多糖溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤20000 Da的多糖溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000-20000 Da的低聚岩藻聚糖组分；该浓缩液经喷雾干燥即可。

7.权利要求1-5任一所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：所述PZ-1细菌胞外多糖的制备方法为，将彭氏变形菌PZ-1接种于培养基进行发酵，发酵温度为30℃，发酵过程中进行搅拌，发酵72 h后得发酵培养液，所述培养基为蛋白胨0.5重量%，KH₂PO₄0.2重量%，MgSO₄0.02重量%，MnSO₄0.02重量%，FeSO₄·7H₂O0.005重量%，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0；

将发酵培养液冷却后离心，去彭氏变形菌PZ-1菌体, 取上清液；

将沉淀液离心，取沉淀物，经真空干燥后得粗多糖干粉；

将粗多糖溶解于去离子水中，配成2 重量%的糖溶液，然后用分子截留量为50000 Da的超滤膜纯化，收集分子截留量大于50000 Da的组分，经喷雾干燥即可。

8.权利要求7所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：所述PZ-1细菌胞外多糖的制备方法为，将彭氏变形菌PZ-1接种于培养基进行发酵，发酵温度为30℃，发酵过程中进行搅拌，3000 r/min, 发酵72 h后得发酵培养液，所述培养基为蛋白胨0.5重量%，KH₂PO₄0.2重量%，MgSO₄0.02重量%，MnSO₄0.02重量%，FeSO₄·7H₂O0.005重量%，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0；

将发酵培养液冷却后离心，8000 r/min，10 min，去彭氏变形菌PZ-1菌体, 取上清液；

将沉淀液离心， 3000 r/min, 10 min，取沉淀物，经真空干燥后得粗多糖干粉；

9.权利要求1所述防治猪腹泻的多糖复合剂，其特征在于：将所述低聚岩藻聚糖不断加入的同时也不断加入所述PZ-1细菌胞外多糖得到多糖粗混料，粗混料再用搅拌机以800 r/min的搅拌速度混合20 min，使两种多糖混合均匀即可。

10.权利要求1所述防治猪腹泻的多糖复合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，低聚岩藻聚糖制备：

提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，离心，取上清液，加入12 mol/L HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉；

水解：将岩藻聚糖干粉与酶活力为50 万U/g的果胶酶按重量比为1000:0.5的比例混合均匀，加入去离子水配成3重量%的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl调节pH值至3.8，水解3 h 后继续加入HCl，调节pH值至2.0，继续水解3 h；再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液；

分离：不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液经过分子截留量为5000 Da和20000 Da的超滤膜分离，并收集5000-20000 Da的组分，喷雾干燥即可；

PZ-1细菌胞外多糖制备：

配制培养基：按质量百分比,培养基的配方如下：蛋白胨为0.5重量%，KH₂PO₄为0.2重量%，MgSO₄为0.02重量%，MnSO₄为0.02重量%，FeSO₄·7H₂O为0.005重量%，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，得培养基；

将彭氏变形菌PZ-1接种于培养基进行发酵，发酵温度为30℃，发酵过程中进行搅拌，搅拌速度为3000 r/min, 发酵72 h后得发酵培养液；

将离心去菌体后的上清液加入乙醇，使之终浓度为70体积%，静置24 h，取沉淀液；

将沉淀液离心，取沉淀物，经真空干燥后得粗多糖干粉；

将粗多糖干粉溶解于去离子水中，配成2重量 %的糖溶液，然后用分子截留量为50000Da的超滤膜纯化，收集分子截留量﹥50000 Da的组分，经喷雾干燥即得PZ-1细菌胞外多糖干燥粉状物；

11.权利要求10所述防治猪腹泻的多糖复合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，低聚岩藻聚糖制备：

提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，2000 r/min，离心，3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，3000 r/min,5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，3000 r/min, 5 min，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉；

分离：将100 L含有不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离；蠕动泵以50 L/h的流量输送到分子截留量为20000 Da中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力0.06 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到多糖溶液体积浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤20000 Da的多糖溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤20000 Da的多糖溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000-20000 Da的低聚岩藻聚糖组分；该浓缩液经喷雾干燥后得到低聚岩藻聚糖干燥粉状物；

PZ-1细菌胞外多糖制备：

将发酵培养液冷却后离心，8000 r/min，10 min，去彭氏变形菌PZ-1菌体, 取上清液;

将沉淀液离心，3000 r/min, 10 min，取沉淀物，经真空干燥后得粗多糖干粉；

12.权利要求1的多糖复合剂或权利要求10制备方法所得的多糖复合剂在制备防治猪腹泻的药物中的应用。

13.权利要求1的多糖复合剂或权利要求10制备方法所得的多糖复合剂在制备猪饲料添加剂的应用用途。