CN107602663B - 一种苦荞麦活性肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种苦荞麦活性肽的制备方法，将苦荞种子经干燥、粉碎、脱脂得到苦荞粉；以苦荞粉为原料，用硫酸铵盐析法提取苦荞水溶性蛋白，得到苦荞蛋白提取物；将苦荞蛋白提取物经胃蛋白酶和胰蛋白酶依次酶解制备得到多肽酶解片段；将多肽酶解片段经过凝胶过滤进行分离纯化，紫外检测仪280nm检测，并收集分离峰，即可得到苦荞麦活性肽。本发明通过上述的方法获得了两种新的苦荞麦活性肽。本发明还提供了上述的两种苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。本发明的生物活性肽不仅能调节仔猪肠道菌群平衡、降低仔猪腹泻率和死亡率，还能促进仔猪生长、提高饲料转化利用率，同时降低血液胆固醇甘油三酯，改善仔猪血液生化指标，提高免疫力和抗病能力。

Description

一种苦荞麦活性肽及其应用

本申请是申请号为“2015101162614”、申请日为“2015年03月17日”、发明名称为“一种苦荞麦活性肽的制备方法和应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于动物食品领域，尤其涉及一种添加剂，具体来说是一种苦荞麦活性肽的制备方法和应用。

背景技术

现代养猪生产中，由于养殖环境和养殖技术水平滞后，使得动物在繁殖生长过程中很难发挥它应有的遗传潜能。为发挥母猪最佳生产性能、减少乳猪疾病感染几率并提高乳猪生产性能，常采用早期隔离断奶技术。早期断奶乳猪的消化系统尚未发育完善，难以承受由液体母乳向谷物性固体饲料变换带来的营养应激；乳猪与母畜骤然分离引起的心理应激；以及重新建群和等级地位确定过程中乳猪个体之间的争斗引起的环境应激。营养、心理和环境三重应激不可避免地增加断奶后乳猪对环境中潜在病原微生物的敏感性，导致断奶后乳猪腹泻、采食量下降、烦躁不安、攻击性加强、生长停滞、并发水肿病和抗病力下降等综合应激，更容易发生消化道菌群失调，引起消化道正常微生物区系被破坏，大肠杆菌、沙门氏杆菌等致病菌株大量繁殖引发细菌性肠炎。研究表明，猪是最容易应激的动物种类，而在集约化养殖过程中，断奶又是最易诱发乳猪应激的关键环节。断奶乳猪的应激往往伴随乳猪生长的停滞，情况严重时产生僵猪，甚至造成乳猪死亡，给养猪生产业造成巨大经济损失。

长期以来，抗生素在保证动物健康、促进生长、节省饲料和提高经济效益方面起着非常重要的作用，但长期大量滥用抗生素会带来诸多问题，如病原菌产生耐药性，限制了动物免疫机能的发挥，降低了动物的免疫力和抗病力，抑制动物肠道有益菌的生长，破坏肠道微生态平衡，限制动物的生长。很多研究表明，如果人类长期食用抗生素过量残留的肉类食品，将会使人类产生对抗生素的耐药性，这不但会产生所谓的‘耐药宝宝’、‘超级细菌’，而且给人类健康生存带来严重威胁，因此，世界上很多国家纷纷禁止或限制饲用抗生素的使用。欧盟自2006年1月1日起，全面禁止在动物饲料中使用抗生素，日本从2008年就开始禁止所有抗生素动物饲料中使用，韩国政府从2011年7月1日全面禁止在动物饲料中添加抗生素，而我国在饲料行业中，乳猪饲料添加剂中大量添加抗生素现象仍然比较普遍，造成动物产生耐药性或抗药性、免疫功能降低、抗病能力下降、猪肉中有抗生素残留等问题，给人们生活带来了恐慌。另外，由于微量元素在动物生长和肠道健康控制中起到非常关键的作用，在饲料行业中过量添加现象也普遍存在，尤其是铜和锌。而且由于传统的无机微量元素消化利用率低，过量添加必然产生过量排放，这不但造成浪费，而且给环境造成污染，近年来出现的海水赤潮和毒粮食现象都跟畜牧业有关联。因此，提供一种腹泻率低、消化利用率高、采食量和生长发育较为良好适用于集约化养殖模式下非抗生素类环保饲料或环保饲料添加剂显得尤为重要。

荞麦全植株含有多种营养化学成分，包括丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维、矿物元素以及植物甾醇、黄酮类物质等稀有化合物，尤其是苦荞优质的氨基酸组成比例平衡，营养价值明显比小麦、玉米等其他谷类作物高得多。从荞麦种子种分离得到的活性肽具有抗菌、抗氧化、降胆固醇和抗肿瘤等作用。荞麦种子蛋白含量丰富，种类较多，包括清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白四种类型，研究表明将荞麦蛋白提取物水解成小的多肽片段后，能显著增强抗氧化等生理活性。

CN 101701036 A提供了一种抗真菌肽，是从苦荞种子水溶性提取物中纯化得到的，分子量为3.909kDa的多肽。该抗真菌肽的制备方法是取苦荞种子粉碎，脱脂，使用缓冲液抽提，经抽提获得粗蛋白后，经过热处理，蛋白质层析分离即Resource S阳离子交换和Superdex peptide凝胶排阻层析纯化而获得。该抗真菌肽对白腐菌，绿色木霉和链格孢霉的生长有显著的抑制作用。该抗真菌肽可作为食品防腐添加剂，农作物抗真菌侵害的药物等，在食品防腐以及农作物防病、抗病方面具有实用价值。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种苦荞麦活性肽的制备方法和应用，通过本发明的方法获得的苦荞麦活性肽具有抗菌、抗氧化和吸附胆酸盐活性，饲喂仔猪后能提高生长性能，降低腹泻率、死亡率。

本发明还提供了一种苦荞麦活性肽的制备方法，包括如下步骤：

1)一个制备苦荞蛋白提取物的步骤，苦荞种子经干燥、粉碎、脱脂得到苦荞粉；以苦荞粉为原料，用硫酸铵盐析法提取苦荞水溶性蛋白，得到苦荞蛋白提取物；

2)一个酶解苦荞蛋白提取物的步骤，将步骤1)制备得到的苦荞蛋白提取物分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶依次酶解制备得到多肽酶解片段；

3)一个制备苦荞麦活性肽的步骤，将多肽酶解片段经过凝胶过滤进行分离纯化，紫外检测仪280nm检测，并收集分离峰，即可得到苦荞麦活性肽。

进一步的，在所述的一个制备苦荞蛋白提取物的步骤中，采用硫酸铵盐析法制备苦荞蛋白提取物，苦荞籽粒经干燥后粉碎制备得苦荞粉，采用石油醚脱脂，将脱脂后的苦荞粉采用pH7.0磷酸盐缓冲液室温下搅拌提取1～4小时，然后1～6℃离心分离收集上清液，其中离心转速为3000～7000r/min，离心时间为20～60min；向上清液中加入硫酸铵使饱和度达到80％以上，搅拌0.5～2小时，1～6℃离心，离心转速为3000～7000r/min，离心时间为20～40min，收集沉淀得苦荞蛋白提取物。

进一步的，在一个酶解苦荞蛋白提取物的步骤中，将苦荞蛋白提取物复溶得苦荞蛋白水溶液，向苦荞蛋白水溶液加入质量百分比浓度为3～5％的胃蛋白酶酶解液，调节pH至2.0，30～40℃水浴震荡酶解0.5～1.5小时；然后加入质量百分比浓度为3～5％的胰蛋白酶酶解液，调节pH至7.5，30～40℃水浴继续酶解1～3小时，接着将水解液加热至90～98℃煮3～6分钟终止酶解，冻干保存。

进一步的，在一个制备苦荞麦活性肽的步骤中，将苦荞蛋白酶解产物的冻干粉溶解后经凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液以0.5～1.2mL/min流速进行洗脱，每18～22分钟收集一管，紫外检测仪280nm检测吸光值，收集主要分离峰，过夜透析，冻干保存。

进一步的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M,pH为7.4。

本发明还提供了一种苦荞麦活性肽，其氨基酸序列为丝氨酸-谷氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-色氨酸。(如SEQ ID NO:1所示。)

本发明还提供了另外一种苦荞麦活性肽，其氨基酸序列为天冬氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸。(如SEQ ID NO:2所示。)

本发明还提供了上述的苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。

本发明还提供了上述的苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。

本发明通过采用硫酸铵盐析法提取苦荞水溶性蛋白，经过1小时胃蛋白酶酶解和2小时胰蛋白酶酶解制备多肽酶解片段，经过G-25凝胶过滤进行分离纯化，得到生理活性较强的分离峰用LC-MS-MS液相色谱气质联用仪鉴定活性肽的一级结构。

本发明采用活性检测平台测试各组分的生理活性。抗氧化能力采用羟基自由基(OH·)清除率评价，抗菌活性采用纸平板扩散法检测对金黄色葡萄球菌的抑制作用，降胆固醇效应采用体外吸附胆酸盐的方法进行评价。

本发明将上述活性强的组分用LC-MS-MS液相色谱气质联用法测定活性肽的氨基酸序列，得到了两个多功能生物活性小肽，经鉴定其一级结构分别是TBPD4(丝氨酸-谷氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-色氨酸)和TBPD5(天冬氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸)。

本发明所述苦荞麦生物肽作为饲料添加剂时，其添加比例为基础日粮的1％。本发明的生物活性肽不仅能调节仔猪肠道菌群平衡、降低仔猪腹泻率和死亡率，还能促进仔猪生长、提高饲料转化利用率，同时降低血液胆固醇甘油三酯，改善仔猪血液生化指标，提高免疫力和抗病能力，因此具有较好的市场开发利用前景。

本发明所述的苦荞麦生物肽及其制备方法与应用，与现有技术相比具有如下技术优势：

1、采用了两步消化酶酶解方法，得到了荞麦生物活性肽；

2、采用G25分离和LC-MS-MS液相色谱气质联用法确定了活性肽的氨基酸序列；

3、所获得的活性肽具有多种功能，如抗菌、抗氧化和降胆固醇。

本发明的生物活性肽

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本领域技术人员应该知晓，所述实施例并不以任何方式限定本发明的保护范围。

实施例1 一种苦荞蛋白提取物酶解产生的抗菌肽的制备方法

苦荞种子粉碎后制得1000g苦荞粉，脱脂后的用pH7.0磷酸盐缓冲液溶解，室温下搅拌提取2小时，4℃离心分离(5000r/min，30min)，取上清液。加入硫酸铵使饱和度达到80％，搅拌1小时，4℃离心(5000r/min，30min)，收集沉淀后复溶，透析48小时候，冻干备用。将4％胃蛋白酶酶解液加入到苦荞蛋白水溶液，调节pH至2.0，37℃水浴震荡酶解1小时。然后加入4％的胰蛋白酶酶解液，调节pH至7.5，37℃水浴继续酶解2小时。接着将水解液加热至96℃煮5分钟终止酶解，将苦荞蛋白酶解产物的冻干粉溶解后经Sephadex G-25凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液(0.02M,pH7.4)以0.9mL/min流速进行洗脱，紫外检测仪280nm检测吸光值，收集主要分离峰。过夜透析，冻干保存。将菌种接种于Luria-Bertani(LB)固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落均匀涂布于LB固体培养基表面，将经过灭菌的直径为0.5cm的小滤纸片粘贴于培养基表面，取10μL待测样品滴加于滤纸片上。37℃培养箱中倒置培养18-20h，观察抑菌圈的形成，采用倍半稀释法计算最小抑菌浓度(MIC)。所得试验结果如下：

实施例2 一种苦荞蛋白提取物酶解产生的抗氧化肽的制备方法

苦荞种子粉碎后制得1000g苦荞粉，脱脂后的用pH7.0磷酸盐缓冲液溶解，室温下搅拌提取2小时，4℃离心分离(5000r/min，30min)，取上清液。加入硫酸铵使饱和度达到80％，搅拌1小时，4℃离心(5000r/min，30min)，收集沉淀后复溶，透析48小时候，冻干备用。将4％胃蛋白酶酶解液加入到苦荞蛋白水溶液，调节pH至2.0，37℃水浴震荡酶解1小时。然后加入4％的胰蛋白酶酶解液，调节pH至7.5，37℃水浴继续酶解2小时。接着将水解液加热至96℃煮5分钟终止酶解，将苦荞蛋白酶解产物的冻干粉溶解后经Sephadex G-25凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液(0.02M,pH7.4)以0.9mL/min流速进行洗脱，紫外检测仪280nm检测吸光值，收集主要分离峰。过夜透析，冻干保存。采用固定反应时间法(6mmol/L H₂O₂ 2mL，6mmol/LFe²⁺2mL，6mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL)中加入一系列不同浓度的苦荞多肽样品2mL，最后加H₂O₂启动反应，37℃0.5小时，在510nm处测量吸光度，空白吸光值为A0，样品吸光值为As，清除率计算公式:清除率(％)＝(A0－As)/A0×100％。

实施例3 一种苦荞蛋白提取物酶解产生的降胆固醇多肽的制备方法

苦荞种子粉碎后制得1000g苦荞粉，脱脂后的用pH7.0磷酸盐缓冲液溶解，室温下搅拌提取2小时，4℃离心分离(5000r/min，30min)，取上清液。加入硫酸铵使饱和度达到80％，搅拌1小时，4℃离心(5000r/min，30min)，收集沉淀后复溶，透析48小时候，冻干备用。将4％胃蛋白酶酶解液加入到苦荞蛋白水溶液，调节pH至2.0，37℃水浴震荡酶解1小时。然后加入4％的胰蛋白酶酶解液，调节pH至7.5，37℃水浴继续酶解2小时。接着将水解液加热至96℃煮5分钟终止酶解，将苦荞蛋白酶解产物的冻干粉溶解后经Sephadex G-25凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液(0.02M,pH7.4)以0.9mL/min流速进行洗脱，紫外检测仪280nm检测吸光值，收集主要分离峰。过夜透析，冻干保存。分别配制4mg/mL胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠溶液，加入苦荞活性肽，于37℃恒温下反应1小时后，5000r/min离心分离10min。准确移取1mL上清液，于620nm处测吸光度，由标准曲线确定其胆酸盐的浓度。再根据反应前后溶液中胆酸盐的浓度差计算样品对胆酸盐的吸附率。

实施例4 本发明饲料添加剂不同混合比对断奶仔猪生长性能的影响

1、实验方法

以实施例3所对应的饲料添加剂为研究对象，确定饲料添加剂不同混合比对乳猪生长性能的影响。采用单因子完全随机试验设计，选取32头健康断奶后乳猪，随机分成4组，每组8头。各组分别饲喂下列饲料：

饲喂1组：实施例3饲料添加剂与常规饲料混合，饲料添加剂与常规饲料的混合比为1：50；

饲喂2组：实施例3饲料添加剂与常规饲料混合，饲料添加剂与常规饲料的混合比为1：100；

饲喂3组：实施例3饲料添加剂与常规饲料混合，饲料添加剂与常规饲料的混合比为1：200；

对照组：常规饲料；

在试验14天龄饲前，进行空腹称重，计算增重和料肉比。料肉比为饲喂饲料总重与乳猪增重的比值。本实施例常规饲料的组分构成如下：玉米40％，膨化玉米20％，全脂大豆10％，鱼粉5％，乳清粉5％，代乳粉4％，发酵豆粕6％，豆粕4％，预混料6％。

2、饲养管理：

按照常规对猪舍进行消毒，对猪采用高床漏缝饲养，使其自由采食、饮水。

3、样品采集及检测指标

增重和料肉比的测定：在试验期的第14天早晨对猪只进行空腹称重，计算猪增重和料肉比。

记录试验期内每天每组乳猪的采食量和腹泻率。

4、试验结果及讨论

表1饲料添加剂不同混合比对乳猪断奶后0-14天生长性能的影响

与对照组比较,^#P＜0.05，^##P＜0.01；

由表1可以看出，采用本发明饲料添加剂饲喂的1组-3组乳猪，在断奶后14天阶段内的采食量、增重和腹泻控制率都显著优于对照组。这表明本发明饲料添加剂可以显著改善断奶乳猪的肠道发育和健康，可以缓解乳猪断奶应激，有效提高乳猪断奶后采食量和增重。饲喂1组、饲喂2组和饲喂3组相比，饲喂2组所对应的断奶后14天阶段内的采食量、增重和腹泻控制率较佳。这表明采用实施例3所述的饲料添加剂，添加比例为1：100时，本发明饲料添加剂的对乳猪的生长性能的改善效果更为优异。

实施例5 本发明饲料添加剂对乳猪生长性能的影响

本实验采用单因子完全随机试验设计，选取32头健康断奶后乳猪，随机分成4组，每组8头。各组分别饲喂下列饲料：

饲喂1组：实施例1饲料添加剂与常规饲料混合，饲料添加剂与饲料的混合比为1：100；

饲喂2组：实施例2饲料添加剂与常规饲料混合，饲料添加剂与饲料的混合比为1：100；

饲喂3组：实施例3饲料添加剂与常规饲料混合，饲料添加剂与饲料的混合比为1：100；对照组：常规饲料；

所述的常规饲料、饲养管理以及样品采集检测指标与本发明实施例4相同。

表2饲料添加剂对乳猪断奶后0-14天生长性能的影响

与对照组比较,^#P＜0.05，^##P＜0.01；

由表2可以看出，采用本发明饲料添加剂饲喂的1组-3组乳猪，在断奶后14天阶段内的采食量、增重和腹泻控制率都显著优于对照组。这表明本发明饲料添加剂可以显著改善断奶乳猪的肠道发育和健康，可以缓解乳猪断奶应激，有效提高乳猪断奶后采食量和增重。在饲喂1组-3组中，饲喂3组在各阶段采食量、增重和控腹泻方面相比其他组更为优异，为本发明的最佳实施例。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种苦荞麦活性肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 苦荞麦活性肽(Tartary buckwheat)

<400> 1

Ser Glu Ala Gly Val Thr Glu Ile Trp

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 苦荞麦活性肽(Tartary buckwheat)

<400> 2

Asp Ala Ile Ile Gly Pro Arg

1 5

Claims (2)

1.一种苦荞麦活性肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。