CN107889939B - 一种甘氨酸葡萄糖胞外多糖复配饲料添加剂 - Google Patents
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Abstract
一种甘氨酸葡萄糖胞外多糖复配饲料添加剂，涉及饲料添加剂。原料组成按质量百分比为甘氨酸0.01％～50.0％，葡萄糖0.01％～50.0％，胞外多糖0.01％～50.0％，余量为载体，总量为100％。所述甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配饲料添加剂在饲料中的添加量按质量百分比可为0.05％～5％。通过添加甘氨酸后，迟缓爱德华氏耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明可以提高对卡那霉素的敏感性。通过添加葡萄糖和甘氨酸后，迟缓爱德华氏耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明这两种物质具有协同性，并且具有甘氨酸浓度梯度效应。
Description
技术领域
本发明涉及饲料添加剂，尤其是涉及一种甘氨酸葡萄糖胞外多糖复配饲料添加剂。
背景技术
虽然抗生素的使用对人类健康和生命的保护以及动物集约化养殖起到必不可少的作用，但由于抗生素的滥用和其误用，又成为威胁人类健康、畜禽养殖和水产养殖以及生态环境的关键因素。因此控制细菌抗生素耐药十分重要。
目前，抗生素在畜牧养殖业方面大量使用。一方面，一些抗生素作为兽药控制细菌性感染必不可少；另一方面，一些抗生素作为饲料药物添加剂可以促进动物生长。抗生素的大量使用使敏感菌大量死亡，耐药菌得以大量繁殖，促进和增强了细菌的耐药性。不同种类抗生素的使用，促进了多重耐药菌的产生，即产生可以耐药3种以上抗生素的菌株。控制这些多重耐药菌的感染往往需要更换新抗生素和增加抗生素剂量。然而，这样的防治方法往往使残存的多重耐药菌的耐药谱更宽，耐药能力更强。因此发明少用或不用抗生素的新方法具有重要意义。
20世纪50年代，由于多糖显著免疫活性的发现，各国学者逐渐从真菌、海藻、高等植物等生物体中获得的多糖中发现其具有独特的生物活性，其中以多糖的促进和恢复机体免疫功能作用尤为突出。多糖作为一种免疫促进和调节剂，具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功用。活性多糖以来源广泛、价格低廉、效果确切、纯天然，而受到人们的普遍重视和研究。其应用范围日益扩大。
已有研究发现，利用植物提取物、中药、免洗消毒剂等在体外对多重耐药菌具有较好的抑制作用。但这些都是复合成分，无法知道具体哪种物质起关键作用。新近有研究发现，利用小分子物质如葡萄糖、果糖、丙氨酸，能提高氨基糖苷类抗生素对革兰氏阴性(大肠杆菌)和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)持久性耐药菌(persistence)以及耐药菌的敏感性。这些研究表明了以代谢物为基础的小分子来清除耐药菌的可行性。目前，甘氨酸主要作为畜禽特别是宠物等食用的饲料增加氨基酸的营养性添加剂与引诱剂，迄今为止，无甘氨酸促进抗生素抑制耐药菌生长以及甘氨酸和葡萄糖联用促进抗生素作用的报道，也无甘氨酸、葡萄糖与胞外多糖联用作为饲料添加剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配饲料添加剂。
本发明的原料组成按质量百分比为甘氨酸0.01％～50.0％，葡萄糖0.01％～50.0％，胞外多糖0.01％～50.0％，余量为载体，总量为100％。
所述甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配饲料添加剂在饲料中的添加量按质量百分比可为0.05％～5％；所述甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配饲料添加剂在畜禽水产养殖动物饲料不同阶段中的添加量不同。
所述甘氨酸的纯度≥99％。所述葡萄糖可采用一水葡萄糖，葡萄糖的纯度≥99.8％；所述胞外多糖为具有免疫增强作用的糖类，胞外多糖可选自微生物胞外多糖、植物胞外多糖等中的至少一种；所述载体可选自玉米芯、谷糠、二氧化硅等中的至少一种。
本发明通过添加甘氨酸后，迟缓爱德华氏耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明可以提高对卡那霉素的敏感性。
本发明通过添加葡萄糖和甘氨酸后，迟缓爱德华氏耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明这两种物质具有协同性，并且具有甘氨酸浓度梯度效应。
本发明通过添加甘氨酸和葡萄糖复配的制剂后，其他细菌包括金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌临床耐药菌和溶藻弧菌用其卡那霉素处理时生存率显著下降，说明甘氨酸和葡萄糖复配可以提高其他细菌对卡那霉素的敏感性。
本发明通过添加甘氨酸和葡萄糖后，迟缓爱德华氏菌用其他抗生素处理时生存率显著下降，说明甘氨酸和葡萄糖可以提高细菌对其他抗生素的敏感性。
本发明测定了添加甘氨酸和葡萄糖复配制剂后进入细菌体内抗生素含量，发现这两种小分子物质可促进抗生素进入细菌体内，协同使用时，细菌体内抗生素含量增加更显著。
本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，迟缓爱德华氏耐药菌在用土霉素处理时生存率明显下降，说明这两种物质可以提高迟缓爱德华氏耐药菌对土霉素的敏感性，且具有协同作用。
本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，大肠杆菌在用土霉素处理时生存率明显下降，说明这两种物质可以提高大肠杆菌对土霉素的敏感性，且具有协同作用。
本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，大肠杆菌临床耐药菌在用土霉素处理时生存率明显下降，说明这两种物质可以提高大肠杆菌临床耐药菌对土霉素的敏感性，且具有协同作用。
本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，多种细菌包括迟缓爱德华菌、大肠杆菌以及大肠杆菌临床耐药菌在用强力霉素处理时生存率明显下降，说明这两种物质可以提高这些细菌对强力霉素的敏感性，且具有协同作用。
本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，迟缓爱德华氏菌用阿莫西林处理时生存率显著下降，说明甘氨酸和/或葡萄糖可以提高迟缓爱德华氏菌对阿莫西林的敏感性。
本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，大肠杆菌用阿莫西林处理时生存率显著下降，说明甘氨酸和/或葡萄糖可以提高大肠杆菌对阿莫西林的敏感性。
本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，大肠杆菌临床耐药菌用阿莫西林处理时生存率显著下降，说明甘氨酸和/或葡萄糖可以提高大肠杆菌临床耐药菌对阿莫西林的敏感性。
结果表明，在饲料中添加甘氨酸和葡萄糖而提高细菌对抗生素敏感性的方法，达到预防细菌包括耐药菌危害的目的。
本发明提供甘氨酸和葡萄糖作为提高细菌对抗生素敏感的小分子物质，达到抑制耐药菌的目的的技术解决方法。通过甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖联用制成的饲料添加剂的使用，提升养殖动物机体免疫力和机体机能。
综上所述，通过甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖按一定比例复配制成饲料添加剂，在畜禽水产养殖动物饲料中添加使用，能够明显提高养殖动物体内耐药菌对抗生素的敏感性，能够提升养殖动物机体免疫力和机体机能，为细菌包括耐药菌的预防和治疗提供了一种崭新的技术方法。
附图说明
图1为添加甘氨酸可提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性的结果。
图2为葡萄糖协同甘氨酸提高细菌敏感性结果。
图3为在添加葡萄糖前提下不同浓度甘氨酸提高敏感性结果。
图4为添加甘氨酸和葡萄糖可促进进入细菌体内抗生素含量的研究结果。
图5为甘氨酸和/或葡萄糖对提高多种抗生素敏感性的研究结果。
图6为甘氨酸和/或葡萄糖对提高金黄色葡萄球菌对卡那霉素敏感性的研究结果
图7为甘氨酸和/或葡萄糖对提高铜绿假单胞菌对卡那霉素敏感性的研究结果。
图8为甘氨酸和/或葡萄糖对提高大肠杆菌临床耐药菌对卡那霉素敏感性的研究结果。
图9为甘氨酸和/或葡萄糖对提高溶藻弧菌对卡那霉素敏感性的研究结果。
图10为添加甘氨酸和/或葡萄糖可提高迟缓爱德华氏菌对土霉素的敏感性的结果。
图11为添加甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌对土霉素的敏感性的结果。
图12为大肠杆菌临床菌耐药性测定结果。
图13为添加甘氨酸和/或葡萄糖可协同提高大肠杆菌临床菌对土霉素的敏感性的结果。
图14为添加甘氨酸和/或葡萄糖可提高迟缓爱德华菌对强力霉素敏感性的研究结果。
图15为添加甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌对强力霉素敏感性的研究结果。
图16为添加甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌临床菌对强力霉素敏感性的研究结果。
图17为添加甘氨酸和/或葡萄糖可提高迟缓爱德华氏菌对阿莫西林的敏感性的结果。
图18为添加甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌对阿莫西林的敏感性的结果。
图19甘氨酸和葡萄糖可提高大肠杆菌临床多重耐药菌对阿莫西林的敏感性研究结果。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
迟缓爱德华菌EIB202的耐药性测定
迟钝爱德华氏菌为革兰氏阴性短杆菌。它是由Hoshina(1 96 2a)首次报道,与日本鳗鲡红病(reddisease)有关。从第一次报道到现在该菌已经在20多种鱼类中引起了病害，如鳗鲡，牙鲆，罗非鱼，中华鳖，鲤鱼等，给水产养殖造成了巨大损失。迟钝爱德华氏菌也是一种人、鱼共患病原菌，直接对人类健康造成了威胁。
首先测定迟缓爱德华菌对多种抗生素的最低抑菌浓度。结果表明迟钝爱德华氏菌EIB202对卡那霉素的最低抑菌浓度为12.5μg/mg，对四环素的最低抑菌浓度为125μg/mg，对氯霉素的最低抑菌浓度为50μg/mg，表明迟钝爱德华氏菌EIB202是一个多重耐药菌。
实施例2
甘氨酸可提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性
1.试验样本的准备：从LB平板上挑取迟缓爱德华菌EIB202单菌落接种于5mgLB培养基中，30℃200rpm振荡培养24h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD值至0.2，然后分别分装5mL于试管中备用。
2.甘氨酸可提高迟缓爱德华氏菌EIB202对卡那霉素的敏感性
为了解甘氨酸是否有助于细菌的杀菌作用，进行了在加入卡那霉素前提下，添加甘氨酸实验。在上述制备好的细菌样本中，先添加40μg/mL卡那霉素，再分别添加0，1.25，2.5，5，10和20mM甘氨酸，30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行TSB琼脂平板菌落计数。结果(图1)发现，添加甘氨酸后，可以提高EIB202对卡那霉素的敏感性，且在卡那霉素存在的前提下，随着加入甘氨酸浓度的升高，其对细菌的杀菌效率也逐渐增加，当加入20mM甘氨酸时，可提高近150倍的杀菌率。具体情况是：在40μg/mL卡那霉素情况下，1.25mM甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率75倍(生存率由未添加的108％下降到添加后的0.99％)，2.5mM甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率86倍(生存率由未添加的113％下降到添加后的0.88％)，5mM甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率110倍(生存率由未添加的119％下降到添加后的0.68％)，10mM甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率122倍(生存率由未添加的117％下降到添加后的0.61％)，20mM甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率145倍(生存率由未添加的118％下降到添加后的0.61％)。
实施例3
葡萄糖协同甘氨酸提高迟缓爱德华氏菌的敏感性
已有文献报道，葡萄糖能提高氨基糖苷类对革兰氏阴性(大肠杆菌)和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)持久性耐药菌(persistence)的敏感性，并证明这种现象是氨基糖甙类抗生素所特有的。因此我们也对葡萄糖，以及甘氨酸和葡萄糖对细菌对卡那霉素敏感性进行了研究。
1.葡萄糖和甘氨酸可协同提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性
为研究葡萄糖以及葡萄糖是否可协同甘氨酸提高细菌对卡那霉素的敏感性，将实验分为三组：一组在制备好的样品中仅仅加入40μg/mL卡那霉素作为对照，另两组在加入40μg/mL卡那霉素的基础上，分别添加10mM葡萄糖、10mM葡萄糖和20mM甘氨酸作为实验组。30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数。结果(图2)发现，当加入葡萄糖后，细菌的敏感性得到了提高，细菌敏感性提高了42倍。而在加入葡萄糖基础上，再加入甘氨酸，细菌的敏感性得到了大幅度的提高，其敏感性达到671倍。
2甘氨酸提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性具有甘氨酸浓度梯度效应
为了解在甘氨酸和葡萄糖协同提高细菌敏感性是否具有浓度梯度依赖性，在加入10mM葡萄糖前提下，分别加入1.25，2.5，5，10，20mM的甘氨酸，孵育6h后分别进行活菌计数，结果(图3)发现，在加入葡萄糖前提下，随着加入甘氨酸浓度的升高，其对耐药菌杀菌效率的提高越显著，当加入20mM甘氨酸时，可提高近700倍的杀菌率。具体情况是：添加葡萄糖后，在1.25mM甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了106倍(生存率由仅添加葡萄糖的2.57％下降到再添加甘氨酸后的0.97％)，在2.5mM甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了170倍(生存率下降到添加后的0.6％)，在5mM甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了216倍(生存率下降到添加后的0.47％)，在10mM甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了400倍(生存率下降到添加后的0.259％)，在20mM甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了659倍(生存率下降到添加后的0.157％)。
实施例4
甘氨酸和葡萄糖可增加抗生素进入细菌体内的数量
细菌死亡与进入细菌内部的抗生素数量有关。为研究甘氨酸和葡萄糖对促进抗生素进入细菌内部的作用，从LB平板上挑取迟缓爱德华菌EIB202单菌落接种于5mLLB培养基中，30℃200rpm振荡培养24h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD值至0.2，然后分别分装5mL于试管中备用。将实验分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加抗生素；另3组为实验组，在添加抗生素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖和甘氨酸与葡萄糖混合物。30℃200rpm摇床中孵育6h后。离心清洗菌体，超声波破碎，用卡那霉素ELISA检测试剂盒(北京中检维康技术有限公司，Clover Technology Group Inc)测定卡那霉素含量。结果见图4。添加甘氨酸后，比只加抗生素时进入细菌体内抗生素增加了6.57倍，添加葡萄糖后，体内抗生素含量增加了4.74倍，而添加了葡萄糖和甘氨酸后，进入抗生素含量大幅度提高，增加了13.21倍。说明甘氨酸和葡萄糖可以显著提高进入细菌体内的抗生素含量。
实施例5
甘氨酸和葡萄糖可提高迟缓爱德华菌对其他抗生素的敏感性
为研究添加葡萄糖和甘氨酸后，细菌对其他抗生素敏感性是否也可以提高，研究了氨苄青霉素和巴洛沙星对迟缓爱德华菌的杀菌效果，将实验分为4组：不添加物质组为对照，分别添加10mM葡萄糖、20mM甘氨酸、10mM葡萄糖和20mM甘氨酸为实验组。每组分别设定3个条件，不加抗生素、添加12.5μg/mg氨苄青霉素和2μg/mg巴洛沙星。结果(图5)表明，葡萄糖和甘氨酸分别都可以提高细菌对氨苄青霉素和巴洛沙星的敏感性，协同后效果更显著。具体情况如下：仅添加葡萄糖时，可提高细菌对氨苄青霉素的敏感性15.56倍(生存率由单加氨苄青霉素的74.78％下降为加抗生素基础上添加葡萄糖后的4.8％)，可提高细菌对巴洛沙星的敏感性1.85倍(生存率由单加巴洛沙星的71.46％下降为加抗生素基础上添加葡萄糖后的38.86％)；仅添加甘氨酸时，可提高细菌对氨苄青霉素的敏感性12.8倍(生存率由单加氨苄青霉素的74.78％下降为加抗生素基础上添加甘氨酸后的5.84％)，可提高细菌对巴洛沙星的敏感性1.55倍(生存率由单加巴洛沙星的71.46％下降为加抗生素基础上添加甘氨酸后的16.45％)；当添加甘氨酸和葡萄糖时，可提高细菌对氨苄青霉素的敏感性49.87倍(生存率由单加氨苄青霉素的74.78％下降为加抗生素基础上添加甘氨酸和葡萄糖后的1.499％)，可提高细菌对巴洛沙星的敏感性12倍(生存率由单加巴洛沙星的71.46％下降为加抗生素基础上添加甘氨酸和葡萄糖后的5.97％)。
实施例6
甘氨酸和葡萄糖可提高多种细菌对卡那霉素抗生素的敏感性
挑取多种细菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)，绿脓杆菌(铜绿假单胞菌，P.aeruginosa)，大肠杆菌临床耐药菌(Y15)，溶藻弧菌(V.alginolyticus)单g隆到100mlLB液体培养基中，37℃或30℃200rpm培养16h达饱和状态。收集20ml菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以等体积0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD至0.2，然后分别分装5mL于试管中，以添加卡那霉素为对照组，再分别添加20mM甘氨酸、10mM葡萄糖、20mM甘氨酸和10mM葡萄糖为实验组，37℃或30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图6～9。由这些结果可以看出，对于金黄色葡萄球菌(图6)，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了16.38倍和32.75倍，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了327.5倍；对于铜绿假单胞菌(图7)，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.97倍和1.71倍，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了20.99倍；对于大肠杆菌临床耐药菌(图8)，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.05倍和34.86倍，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了305倍；对于溶藻弧菌(图9)，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.3倍和72.75倍，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了646.67倍。这些结果表明分别添加了甘氨酸和葡萄糖后，细菌包括耐药菌的杀菌效率都有提高，而同时添加了甘氨酸和葡萄糖后，杀菌效率得到了显著提高。
实施例7
甘氨酸和/或葡萄糖提高迟缓爱德华菌对土霉素的敏感性
从LB平板上挑取迟缓爱德华菌EIB202单菌落接种于5mgLB培养基中，30℃200rpm振荡培养24h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD值至0.2，然后分别分装5mL于试管中备用。将准备好的样本分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加土霉素；另3组为实验组，在添加土霉素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图10。由结果可以看出，与只添加土霉素比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了10.55倍(生存率由只添加土霉素的98.3％下降为添加土霉素和甘氨酸后的9.32％)和10.84(生存率下降为添加土霉素和葡萄糖后的9.06％)倍，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了19.31倍(生存率下降为添加土霉素以及葡萄糖和甘氨酸后的5.09％)。
实施例8
甘氨酸和/或葡萄糖提高大肠杆菌及其临床耐药菌菌对土霉素的敏感性
(一)甘氨酸和/或葡萄糖提高大肠杆菌对土霉素的敏感性
大肠杆菌试验样本的准备：从LB平板上挑取大肠杆菌单菌落接种于5mgLB培养基中，37℃200rpm振荡培养16h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD值至0.2，然后分别分装5mL于试管中备用。
将准备好的样本分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加土霉素；另3组为实验组，在添加土霉素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。37℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图11。由结果可以看出，与只添加土霉素比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了3.78倍(生存率由只添加土霉素的16.38％下降为添加土霉素和甘氨酸后的4.33％)和4.85倍(生存率下降为添加土霉素和葡萄糖后的3.38％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了11.18倍(生存率下降为添加土霉素及葡萄糖和甘氨酸后的1.47％)。
(二)甘氨酸和/或葡萄糖提高大肠杆菌临床耐药菌对土霉素的敏感性
大肠杆菌临床耐药菌耐药性的测定：大肠杆菌是动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，目前从临床上分离得到的多为多重耐药菌。从猪场分离获得了一株大肠杆菌，并对其耐药性进行了测定。结果(图12)表明此株菌对罗红霉素的最低抑菌浓度为625μg/mg，对四环素的最低抑菌浓度为6250μg/mg，对庆大霉素的最低抑菌浓度为2500μg/mg，对g林霉素的最低抑菌浓度为25000μg/mg，对头孢他啶的最低抑菌浓度为0.488μg/mg，对巴洛沙星的最低抑菌浓度为62.5μg/mg，对氨苄青霉素的最低抑菌浓度为6250μg/mg，对阿米卡星的最低抑菌浓度为2500μg/mg，表明大肠杆菌临床菌是一个多重耐药菌。
甘氨酸和/或葡萄糖提高大肠杆菌临床耐药菌对土霉素的敏感性研究：将准备好的样本(按照上述大肠杆菌的方法制备实验样本)分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加土霉素；另3组为实验组，在添加土霉素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。37℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图13。由结果可以看出，与只添加土霉素比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.32倍(生存率由只添加土霉素的72.95％下降为添加土霉素和甘氨酸的55.22％)和1.6倍(生存率下降为添加土霉素和葡萄糖的45.68％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了2.73倍(生存率下降为添加土霉素以及甘氨酸和葡萄糖的26.58％)。
实施例9
甘氨酸和/或葡萄糖提高细菌对强力霉素的敏感性
(一)甘氨酸和/或葡萄糖可提高迟缓爱德华菌对强力霉素的敏感性
将准备好的样本分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加强力霉素；另3组为实验组，在添加强力霉素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图14。由结果可以看出，与只添加强力霉素比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了5.97倍(生存率由只添加强力霉素的96.61％下降为添加强力霉素和甘氨酸的16.19％)和7.08倍(生存率下降为添加强力霉素和葡萄糖的13.64％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了11.18倍(生存率下降为添加强力霉素以及葡萄糖和甘氨酸的8.64％)。
(二)甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌对强力霉素的敏感性
将准备好的样本分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加强力霉素；另3组为实验组，在添加强力霉素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。37℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图15。由结果可以看出，与只添加强力霉素比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.49倍(生存率由只添加强力霉素的99.71％下降为添加强力霉素和甘氨酸后的67.24％)和2.96倍(生存率下降为添加强力霉素和葡萄糖后的33.62％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了4.09倍(生存率下降为添加强力霉素以及甘氨酸和葡萄糖后的24.42％)。
(三)甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌临床菌对强力霉素的敏感性
将准备好的样本分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加强力霉素；另3组为实验组，在添加强力霉素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。37℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图16。由结果可以看出，与只添加强力霉素比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.35倍(生存率由只添加强力霉素的96.59％下降为添加强力霉素和甘氨酸后的71.59％)和1.41倍(生存率下降为添加强力霉素和葡萄糖后的68.4％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了2.33倍(生存率下降为添加强力霉素以及甘氨酸和葡萄糖后的41.4％)。
实施例10
甘氨酸和/或葡萄糖可提高迟缓爱德华氏菌对阿莫西林的敏感性
试验样本的准备：从LB平板上挑取迟缓爱德华菌EIB202单菌落接种于5mLLB培养基中，30℃200rpm振荡培养24h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD值至0.2，然后分别分装5mL于试管中备用。
将准备好的样本分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加阿莫西林；另3组为实验组，在添加阿莫西林情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图17。由结果可以看出，与只添加阿莫西林比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.98倍(生存率由只添加阿莫西林的95.76％下降为添加阿莫西林和甘氨酸的48.47％)和7.06倍(生存率下降为添加阿莫西林和葡萄糖的13.56％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了8.21倍(生存率下降为添加阿莫西林以及葡萄糖和甘氨酸的11.67％)。
实施例11
甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌及其大肠杆菌临床菌对阿莫西林的敏感性
(一)甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌对阿莫西林的敏感性
试验样本的准备：从LB平板上挑取大肠杆菌单菌落接种于5mLLB培养基中，37℃200rpm振荡培养16h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD值至0.2，然后分别分装5mL于试管中备用。
将准备好的样本分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加阿莫西林；另3组为实验组，在添加阿莫西林情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。37℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图18。由结果可以看出，与只添加阿莫西林比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了9.36倍(生存率由只加阿莫西林的25.29％下降为添加阿莫西林和甘氨酸的2.7％)和9.56倍(生存率下降为添加阿莫西林和葡萄糖的2.64％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了18.55倍(生存率下降为添加阿莫西林以及甘氨酸和葡萄糖的1.36％)。
(二)甘氨酸和/或葡萄糖可提高大肠杆菌临床菌对阿莫西林的敏感性
大肠杆菌临床耐药菌耐药性的测定：大肠杆菌是动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，目前从临床上分离得到的多为多重耐药菌。从猪场分离获得了一株大肠杆菌，并对其耐药性进行了测定。结果(图12)表明此株菌对罗红霉素的最低抑菌浓度为625μg/mL，对四环素的最低抑菌浓度为6250μg/mL，对庆大霉素的最低抑菌浓度为2500μg/mL，对g林霉素的最低抑菌浓度为25000μg/mL，对头孢他啶的最低抑菌浓度为0.488μg/mL，对巴洛沙星的最低抑菌浓度为62.5μg/mL，对氨苄青霉素的最低抑菌浓度为6250μg/mL，对阿米卡星的最低抑菌浓度为2500μg/mL，表明大肠杆菌临床菌是一个多重耐药菌。
甘氨酸和葡萄糖可提高大肠杆菌临床多重耐药菌对阿莫西林的敏感性研究：将准备好的样本(采用上述大肠杆菌同样的样本制备方法)分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加阿莫西林；另3组为实验组，在添加阿莫西林情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。37℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μL菌液进行菌落计数，结果见图19。由结果可以看出，与只添加阿莫西林比较，分别添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率分别提高了5.06倍(生存率由只加阿莫西林的89.32％下降为添加阿莫西林和甘氨酸的17.64％)和7.55倍(生存率下降为添加阿莫西林和葡萄糖的11.82％)，而同时添加20mM甘氨酸和10mM葡萄糖后，杀菌效率提高了13.64倍(生存率下降为添加阿莫西林以及葡萄糖和甘氨酸的6.55％)。
实施例12
甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂与土霉素、阿莫西林分别联用在罗非鱼饲养中的应用
某一水产养殖小区相邻10多个池塘养殖的罗非鱼，都出现迟钝爱德华氏菌感染所致症状，为防治迟钝爱德华氏菌感染所致的疾病，进行以下甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配饲料添加剂防治效果对比验证。
1.试验分组及方法
随机选择以上迟钝爱德华氏菌感染的池塘6个，编号为试验1组、试验2组、试验3组、试验4组、对照1组和对照2组。
1.1对照1组按以下常规防治方法进行防治。
A每个对照组池塘估算按每公斤罗非鱼用盐酸土霉素100mg拌罗非鱼料投喂，每天投药一次，连续用药5天；
B每个对照组池塘以25～30ppm浓度全塘泼洒福尔马林，每个池塘浓度都保持8h以上；
C每个对照组池塘估算用20mg氟哌酸/kg鱼体重拌罗非鱼料投喂，每天投药一次，连续用药3天；
D每个对照组池塘全池按1.5ppm浓度泼洒漂白粉一次。
1.2对照2组按以下常规防治方法进行防治。
A每个对照组池塘估算按kg罗非鱼用羟氨苄青霉素(阿莫西林)100mg拌罗非鱼料投喂，每天投药一次，连续用药5天；
B每个对照组池塘以25～30ppm浓度全塘泼洒福尔马林，每个池塘浓度都保持8h以上；
C每个对照组池塘估算用20mg链霉素/kg鱼体重拌罗非鱼料投喂，每天投药一次，连续用药3天；
D每个对照组池塘全池按1.5ppm浓度泼洒漂白粉。
1.3试验1组和试验2组在以上对照1组的常规防治方法的A部分，在估算用盐酸土霉素100mg/kg鱼体重基础上，增加估算使用甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂(含甘氨酸25％、葡萄糖30％、胞外多糖20％、玉米芯载体25％)分别为：试验1组400mg/kg鱼体重，试验2组1600mg/kg鱼体重，拌罗非鱼料投喂,每天投药一次，连续用药3天。
1.4试验3组和试验4组在以上对照2组的常规防治方法的A部分，在估算用阿莫西林100mg/kg鱼体重基础上，增加估算使用甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂(含甘氨酸25％、葡萄糖30％、胞外多糖20％、玉米芯载体25％)分别为：试验3组100mg/kg鱼体重，试验4组4000mg/kg鱼体重，拌罗非鱼料投喂,每天投药一次，连续用药3天。
3.结果与讨论
从第一次第1天投药起的第11天，每个池塘随机捞起每条罗非鱼体重分别为200g以下，200～400g，400g以上的罗非鱼各50kg，罗非鱼体重与病况统计如表1。
表1
从表1可以看到：
试验后各组的得病率下降情况：对照1组下降20.5％，对照2组下降25.6％，试验1组下降37.8％，试验2组下降40.5％，试验3组下降45.8％，试验4组下降34.7％。
由此效果验证试验证明，试验结束后，试验组各组比对照组各组的总得病率有不同比例的下降,通过以甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂与盐酸土霉素、阿莫西林分别联用，经一个疗程用药后，试验1组和试验2组甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂添加量分别为400mg/次/kg鱼体重和1600mg/次/kg鱼体重，与盐酸土霉素联用，对迟钝爱德华氏菌感染罗非鱼具有一定的杀菌效率提升的效果；试验3组和试验4组甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂添加量分别为100mg/次/kg鱼体重和4000mg/次/kg鱼体重，与阿莫西林联用，对迟钝爱德华氏菌感染罗非鱼具有明显的杀菌效率提升的效果。
实施例13
甘氨酸、葡萄糖与胞外多糖复配的饲料添加剂在母猪阶段和乳猪教槽阶段的使用试验
试验目的
为验证甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂在母猪阶段和乳猪教槽阶段的使用效果，选择存栏600头母猪的规模猪场，通过在母猪阶段和乳猪教槽阶段饲料中添加甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂进行饲养试验，对母猪的各项生产指标及乳猪的生长指标进行比较分析。
试验方法
1、动物选择与分组：选择猪场自繁经产第三胎、第四胎同期发情配种的母猪30头，随机分成3组，每组10头，编号记录。
2、试验处理及日粮组成：母猪试验分3个处理组：试验组1、试验组2和对照组。母猪配上种妊娠第86天开始试验，试验周期为55天。各组母猪的营养均参照“瘦肉型母猪饲养标准”怀孕后期阶段和哺乳阶段的营养需求及福建省的实际情况制定。试验组1、试验组2使用添加不同数量比例的甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂的母猪配合饲料，试验组母猪所生的乳猪也饲喂使用甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂。对照组使用的母猪饲料仅比试验组少加了甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂，其他原料配比与试验组相同。每头母猪对应生产的乳猪归为对应的母猪组，乳猪也对应为3个处理组：试验组1、试验组2和对照组。试验乳猪用的教槽配合饲料，均系参照“断奶前乳猪饲养标准”的营养需求和试验设计要求制定。
试验组1使用的母猪配合饲料日粮组成：含甘氨酸20％、葡萄糖20％、胞外多糖20％和载体玉米芯40％的饲料添加剂0.2％、甘氨酸铜制剂0.08％、甘氨酸铁制剂0.05％、甘氨酸锌制剂0.04％、甘氨酸锰制剂0.01％、有机碘硒钴预制剂0.2％、磷酸二氢钙0.2％、磷酸氢钙1.0％、石粉1.5％、食盐0.4％、胆碱0.1％、多维0.05％、赖氨酸0.22％、蛋氨酸0.06％、苏氨酸0.11％、甜味剂0.015％、抗氧化剂0.1％、防霉剂0.1％、优质玉米62.0％、43％豆粕25.0％、进口鱼粉3.0％、豆皮3.0％、油脂粉2.0％、陈皮粉0.565％，合计100％。
试验组2使用的母猪配合饲料日粮组成：含甘氨酸60％、葡萄糖5％、胞外多糖5％和载体玉米芯30％的饲料添加剂0.2％、甘氨酸铜制剂0.08％、甘氨酸铁制剂0.05％、甘氨酸锌制剂0.04％、甘氨酸锰制剂0.01％、有机碘硒钴预制剂0.2％、磷酸二氢钙0.2％、磷酸氢钙1.0％、石粉1.5％、食盐0.4％、胆碱0.1％、多维0.05％、赖氨酸0.22％、蛋氨酸0.06％、苏氨酸0.11％、甜味剂0.015％、抗氧化剂0.1％、防霉剂0.1％、优质玉米62.0％、43％豆粕25.0％、进口鱼粉3.0％、豆皮3.0％、油脂粉2.0％、陈皮粉0.565％，合计100％。
对照组使用的母猪配合饲料日粮组成：甘氨酸铜制剂0.08％、甘氨酸铁制剂0.05％、甘氨酸锌制剂0.04％、甘氨酸锰制剂0.01％、有机碘硒钴预制剂0.2％、磷酸二氢钙0.2％、磷酸氢钙1.0％、石粉1.5％、食盐0.4％、胆碱0.1％、多维0.05％、赖氨酸0.22％、蛋氨酸0.06％、苏氨酸0.11％、甜味剂0.015％、抗氧化剂0.1％、防霉剂0.1％、优质玉米62.2％、43％豆粕25.0％、进口鱼粉3.0％、豆皮3.0％、油脂粉2.0％、陈皮粉0.565％，合计100％。
3.饲养管理：3组母猪饲养在同一幢猪舍相邻的定位栏中，水泥地面、自动饮水装置、通风良好，日喂二次，拌料湿喂，采食量按同等水平做增减。其间所有的防疫工作同时进行。产床亦选择相近的产床，教槽乳猪补料等均采取相同的饲喂方式。
4、观察、记录：试验期间注意观察、记录猪只情况，观察大肠杆菌引起乳猪腹泻的状况，异常猪只及时处理。
结果与讨论
经过55天的正式试验，试验结果统计如表2所示。
表2
从表2可以看到：
试验组1、试验组2死胎头数低于对照组分别为1，0，4(头)；
乳猪出生10天时发生腹泻病头数试验组1、试验组2和对照组分别为31，25，69(头)；
试验组1、试验组2乳猪断奶时发生腹泻病头数低于对照组分别为2，0，21(头)；
试验组1、试验组2平均25天断奶窝重高于对照组分别为69.6，68.3，57.6(kg)；
试验组1、试验组2断奶前死亡数低于对照组分别为1，0，8(头)；
试验组1、试验组2活产猪断奶前死亡率低于对照组分别为0.89，0，7.77，(％)。
由此效果验证试验证明，将含有甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂的哺乳母猪配合饲料在试验组母猪使用，不仅可以满足母猪生长、繁殖的需要，与不添加使用甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配的饲料添加剂的对照组母猪相比，还提升母猪的基本生产水平。同时，各试验组断奶时乳猪腹泻病猪头数远低于对照组，各试验组比对照组降低活产猪断奶前总死亡率6％以上。
Claims (7)
1.一种甘氨酸和葡萄糖联用在制备提高细菌对土霉素敏感性饲料添加剂中的应用，其特征在于其原料组成按质量百分比为甘氨酸0.01%～50.0%，葡萄糖0.01%～50.0%，胞外多糖0.01%～50.0%，余量为载体，总量为100%；所述胞外多糖为具有免疫增强作用的糖类；所述细菌为迟缓爱德华氏菌、大肠杆菌及其临床耐药菌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配饲料添加剂在饲料中的添加量按质量百分比为0.05%～5%。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述甘氨酸、葡萄糖和胞外多糖复配饲料添加剂在畜禽水产养殖动物饲料不同阶段中的添加量不同。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述甘氨酸的纯度≥99%。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述葡萄糖采用一水葡萄糖。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述葡萄糖的纯度≥99.8%。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述载体选自玉米芯、谷糠、二氧化硅中的至少一种。
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