KR100307187B1 - 알긴산올리고당유도체를이용한가축질병예방및치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알긴산 올리고당 유도체를 이용한 가축 질병 예방 및 치료제에 관한 것으로, 알긴산을 가수분해하여 제조된 알긴산 올리고당 유도체를 유효 성분으로하여 효과적인 가축의 질병치료와 축사등 사육 환경내 잠재하여 임상형 질병을 일으키는 가축 병원성 미생물의 박멸을 할 수 있게 된 가축 질병 예꼭 및 치료제를 제공한다.

Description

알긴산 올리고당 유도체를 이용한 가축 질병 예방 및 치료제

본 발명은 알긴산 올리고당 유도체를 이용한 가축 질병 예방 및 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알긴산 올리고당 유도체를 유효 성분으로하여 효과적인 가축의 질병치료와 축사등 사육 환경내 잠재하여 임상형 질병을 일으키는 가축 병원성 미생물의 박멸을 목적으로 하는 가축 질병 예방 및 치료제에 관한 것이다.

가축의 사육에 있어서 질병의 발생을 예방키 위해서는 숙주인 가축이 사육환경중 질병균에 대하여 최소한도로 노출되도록 되어 있어야 한다. 이보다 적극적인 질병에 대한 방역 법으로는 가축 체내외에서 감염을 일으킬 수 있는 병원체들의 성장 억제나 사멸에 있다. 이와 더불어 질병에 이환된 가축의 경우 체내 생체 대사를 통하여 빠른 시간내에 효과적으로 체내로 흡수되어 목표조직에 분포함으로써 그 병원체에 대한 성장 억제나 사멸 효과를 발휘할 수 있는 물질을 찾는데 노력을 경주하고 있다.

기존에 알려진 항미생물성 물질들은 단기간의 뚜렷한 효능에도 불구하고 내성의 발현과 장기간의 사용시 사람에 대한 안정성 문제를 유발한다는 커다란 단점을 안고 있는게 사실이다.

따라서 현재 사용중인 인공합성 항생물질을 대체가능한 물질의 개발은 시급한 현실적 과제이다. 이에 정상적인 가축 체내의 흡수경로 대사를 이용하도록 물성치를 조절하고 이 대사 이행 과정중에 체내 질병유발을 도모하는 병원균을 억압내지 죽일 수 있을 뿐만아니라 면역체계의 활성을 통해 내병성의 향상을 유도할 수 있고, 결국 가축의 사망률을 감소시키고, 증체율 등 생산성 지표의 제고를 가능케하는 천연 항균물질의 개발은 축산산업의 발전에 큰 의미가 있을 수 밖에 없다.

천연 항미생물질의 개발은 기본적으로 가축질병의 원인체의 파악을 비롯 사육환경 악화요인, 방어력 저하인자, 축종별 질병의 종류 및 발생양상이 구명되어 있어야 한다. 오늘날 가축에 감염되어 피해를 야기하는 주요한 병원체들인 세균, 곰팡이, 바이러스 및 기생충중 오로지 세균성 질병만을 대상으로 세티오퍼(ceftiofur), 시프록사신(ciprofloxacin), 독시싸이클린(doxycyline), 오플록사신(ofloxacine), 세파졸린(cefazoline), 아미카신(amikacin), 아목사시클린(amoxaicilline), 스트렙토마이신(streptomycin), 노르플록사신(norfloxacin), 세파졸린(cephalozolin), 노플록사신(norfloxacine), 네오마이신(neomycin), 티아물린(tiamulin), 린코마이신(lincomycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 설파제(sulfonamide)제제등 다양한 여러 계열의 합성 항균제가 사용중에 있다.

이들 약제들은 주로 경구투여나 근육주사를 통하여 돼지를 비롯 소, 닭 등 주요 가축의 설사를 일으키는 장염, 패혈증, 배꼽염, 복막염, 피부염, 기낭염(조류)등을 유발하며 인수공통 전염체인 0157:H7분리주를 포함한 “대장균(Escherichia coli)” 감염증등의 치료제로 쓰이고 있다. 또한 다음에 열거한 병원체들의 예방 및 치료제로 이들 합성 항균제들은 쓰이고 있는데, 소와 돼지의 호흡기병을 주로 일으켜 폐렴으로 피해를 주는가 하면 높은 이환율과 폐사율을 동반한 가금콜레라의 병원체인 “파스튜렐라(Pasteurella spry)”, 인수 공통 병원체로서 장염, 폐렴, 패혈증, 뇌염 등 다양한 전신성 질환을 보이는 “살모넬라(Salmonella spp)”, 원발성 혹은 속발성 병원체로서 장염뿐만아니라 관절염, 뇌염등을 일으키는 “연쇄상구균 (Streptococcus spp)”, 가축의 피부와 점막은 물론 축사 어디에서가 존재하며 균주에 따라서는 독소를 발생하여 인체에 감염시 식중독의 원인이 되는 “포도상구균(Staphyloccous spp)” 등이 있다.

또한, 젖소를 사육함에 있어 대장균성 설사와 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)균에 의해 유발되는 유방염으로 체세포의 증가와 이로 인한 축우농가의 피해는 심각하다.

이와 함께 사료 유입성 병원성 곰팡이로서 가축의 점막조직에 침입시 폐렴과 출혈소인이 되는 아플라톡신(aflatoxin)을 생산하여 다대한 피해를 야기하는 아스퍼질러스(Aspergilus spp)는 일단 감염되면 재채기, 호흡촉박, 호흡곤란 및 드물게는 설사, 식욕부진, 쇠약 등이 나타나고 뇌병변이 발생시 신경증상으로 경련, 보행 실조, 마비등의 증상을 보인다.

국내 축산업의 주요한 구성 가축인 축우, 양돈 및 양계산업에서는 앞서 열거한 세균성 및 곰팡이성 질병들이 만연되어 있으며, 이들 병원체들에 의한 질병 발생이 주로 어린 가축들에게서 중점적으로 나타나고 있다는 점에서 통상적인 축산생산액의 질병피해액인 약 20%(96년도기준) 6척억원의 대부분을 차지하고 있다고 판단된다.

그러나, 이들 현재 사용중인 합성 항균제가 근본적으로 안고있는 약점은 질병 발생 원인인 주요 병원체의 정확한 확진없이 이들 약제를 오남용하거나 예방을 위하여 소량을 장기적으로 투약할 경우 새로운 변원성 내성균의 출현을 초래하게 된다는 점이다.

더구나 이러한 내성균이 나타남으로써 이들 약제들의 사용량 증가가 절연적으로 초래되고 없고 생산 경비의 상승은 물론 가축체내 잔류문제까지 이어져 국민의 건강에 심각한 위험을 가져올 수 있다. 대부분의 가축 사육시 상기 열거한 인공합성 항균제들을 사용하고 있으며, 특별히 효율적인 대체수단이 현재까지 수립되고 있지 않은 상태이다.

이에 현재의 합성항균제의 대체가 가능한 천연물질인 “알긴산 올리고당 유도체 물질”을 사용하여 동물의약품으로서의 사용 부분은 1992년 젖소의 유방염 예방제(일본 특허 平 4-169529호) 이외에는 그 사용례가 없다.

단량체 글루유로나이드 및 만유로나이드계열의 중합체인 알긴산은 약알카리에서 음이온 중합체로서 해조류의 성분으로부터 추출한 중합체 산물이다. 이와같이 재생산이 가능한 천연물질인 알긴산은 일부 세균과 식물병원성 곰팡이 균주에 대하여 항균활성을 나타내고 있는 것으로 확인되고 있으며 항바이러스(Gross M, Speck J. Avian vitelline antibodies in diagnosis and reseach. 103(10). 417-472. 1996)와 항곰팡이성(Mayer SLF, Mayer RJ. Greenhouse studies comparring strains of the Fungus Verticillium lecanii for activity against the nematode Heterodera glycines. 19(3), 305-308, 1996, Diagle DJ, Cotty PJ. Formulating axoxigenic Aspergillus flavus for field release. 5(2), 175-184 1995], 농업항기생충 효과[Central Science Lab., Ministry of agriculture, Fisheries and Fool, London Road, Slough, Berk SL3 &Hj, UK. Mortalit) of immature houseflies(Musca domestica L.) in artifical diet and chicken manure after exposure to encapsulated entomopathogenic nematodes(Rhabditida:Steinernematidae, Heterorhabditidae). 19(3), 305-308, 1996]와 어류 넙치등에 경구투여시 면역증강효과(Skjermo J, Defoort T, Dehasque M, Espevik T, Olsen Y, Skjak BG, Sorgeloos P and Vadstein O. Immunostimulation of juvenile turbot(Scophtalmus maximus L.)using an alginate with high mannronoc acid content administered via 섣 live food organism Artemla. 5(7), 531-534, 1995)를 보유하고 있는 것으로 알려져 있다.

또한 알긴산은 동물체내에서 비특이적 탐식(phagocytosis)기능을 갖는 대식세포(macrophage)는 물론 인터루킨(interleukin-1)과 같은 사이토카인(cytoklnes)을 활성화시켜 병원체에 대한 방어기전을 일으키는 것으로 보고 있다.

알긴산의 또다른 기능은 조직친화성을 가지고 있어 손상된 조직의 신속한 재생에 중요한 역할을 한다. 즉 동물의 단구(monocyte) 유래 대식세포에서는 감마 인터페론(interferon-γ)에 의하여 알긴산을 단량체 단위로 해중합과정을 수행하도록 하는 분해산물인 단량체들이 인산화과정을 통하여 하이아루로니네이트(hyaluronate), 케라틴설페이트(keratinsulfate)와 콘드로이친설페이트(chondroitinsulfate)에 결합하는 것으로 추측하고 있으며 이러한 분자들이 조직재생에 도움을 주고 있는 것으로 알려지고 있다.

상술한 근거를 바탕으로 본원 발명의 목적은, 알긴산의 물성을 효과적으로 조절하여 항균성을 극대화함으로써 가축 질병 병원체의 직접적인 예방 및 치료는 물론 가축체내의 신속한 방어와 면역관련 물질의 증폭을 유도하여 항병력 증강과 생산성 향상을 꾀하여 합성항균제를 대체할 수 있도록 하는 것이다.

보다 상세하게는 돼지, 소, 닭등의 가금류등에서 발생하여 피해를 일으키는 가축질병 즉, (1)혈청형이 서로 다른 대장균속(Escherica coli) 26종, (2) 리스테리아속(Llsteria. monocytogenes HPB #410(serotype 1/2a),L. monocytogenes EGD, L. innocua #1103, L. ivanovii #322), (3)포도상구균(Staphylococcus. aureus ATCC 27213), (4) 연쇄상구균(Streptococcus agalactiae ATCC 13813), (5) 살모넬라속(Salmonella typhilnurium ATCC 14028, Sal. gallinarium, Sal. pullorum ATCC 9120), (6)크렙지엘라(Klebsiella pneumoniae ATCC 13883)와 곰팡이중 (7)아스퍼질러스속(Aspergillus. parasiticus KCCM 12699, A. parasitlcus 24690, A. parasiticlls ATCC 36531, A parasiticus 15517, A. nidurans 26751, A.)등에 의한 가축질병을 기존의 합성항균제를 쓰지 않고서도 이들의 감염을 억제하거나 발병시 치료와 예방 효과를 얻으며, 생체에 흡수가 용이토록하여 가축의 증체효과를 거두려는데 그 목적이 있다.

즉, 본 발명의 제 1 목적은 가축용 항균제를 제공하는데 있고, 제 2 목적은 가축용 항진균제를 제공하는데 있으며, 제 3 목적은 가축 증체율 증강제를 제공하는데 있다.

상기한 본 발명의 제 1 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 알긴산을 가수분해 시켜 제조된 알긴산 올린고당 유도체를 유효성분으로 하는 가축용 항균제를 제공한다.

상기한 본 발명의 제 2 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 알긴산을 가수분해시켜 제조된 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 가축용 항진균제를 제공한다.

상기한 본 발명의 제 3 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 알긴산을 가수분해시켜 제조된 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 가축 증체율 증강제를 제공한다.

상기 알긴산은 다시마로부터 추출하여 사용할 수 있고, 상기 알긴산 올리고 당 유도체의 당체가 1개∼16개로 구성된 분자량 분포도를 갖는 것이 바람직하고, 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균분자량이 8,000이하인 알긴산을 유효성분으로 하는 것이 더욱 바람직하다.

그리고, 상기 가축용 항균제로서, 상기 알긴산 올리고당 유도체를 최고 0.1mg∼10mg되게 혼합하여 경구투여함이 바람직하고, 상기 가축용 항진균제 및 가축 증체율 증강제로서는 1mg∼10mg을 혼합하여 경구투여함이 바람직하다.

그리고 상기 가축질병의 유발 균주는, 대장균속등과 리스테리아속, 포도상구 균, 연쇄상구균, 살모넬라속, 크렙지엘라등의 세균 및 아스퍼질러스속등의 곰팡이를 포함하는 것이다.

제1도는 알긴산 올리고당 유도체를 병원성 곰팡이인 아스퍼질러스 푸미가투스에 대한 처리 농도별 및 시간 경과에 따른 항곰팡이 효과를 나타낸 그래프.

제2도는 알긴산 올리고당 유도체를 병원성 곰팡이인 아스퍼질러스 플라부스에 대한 처리 농도별 및 시간 경과에 따른 항곰팡이 효과를 나타낸 그래프.

제3도는 알긴산 올리고당 유도체를 병원성 곰팡이인 아스퍼질러스 파라시티쿠스에 대한 처리 농도별 및 시간 경과에 따른 항곰팡이 효과를 나타낸 그래프.

제4도의 알긴산 올리고당 유도체를 경구 투여한 후 일정별 분변내(0.1g)의 대장균수의 변화를 나타낸 그래프.

제5도는 산란계에 일정별 알긴산 올리고당 유도체(AOH-3)를 산란계 개체당 5mg을 1일 1회 투여시 일정별 분변내(0.1g)의 살모넬라균수의 변화 그래프.

제6도는 자돈에 알긴산 올리고당 유도체를 21일간 투여한 경우의 일정별 자돈의 증체율 효과 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 실시예를 참조하여 상세하게 설명한다.

우선적으로, 아래에 기재된 전체 실시예에서 분자량의 감소 수치인 점도는 브룩필드(Brookfield)점도계(미국)를 사용하여 100rpm으로 측정하였고, 측정시 사용하는 알긴산 유도체 용액은 600ml가 되도록 3차 탈이온수 용액에 0.5%(W/W 알긴산을 완전 용해하여 기포가 제거된 후 25℃ 조건에서 측정하였으며, 측정간 측정스핀들은 1∼4번을 사용하여 측정하였다.

그리고, 최초 사용된 알긴산의 순도를 확인하기 위한 총 우로닌산(uronic acrid) 함량 측정은 하우그와 라르센(Haug와 Larsen, Haug, A and B. Larsen. Quantitative determination of the uronic acid composition of alginate. Acta. Chem. Scand., 16, 1908-1918, 1962)의 표준 가수 분해 방법에 의해 실시 하였다.

산가수분해 및 효소 분해에 의한 시간별 분자량의 변화에 대한 분자량 분포도 분석은 GPC(gel permeatation chromatography 분석시스템(JASCO, Model LC-90, Jasco Co., 일본)을 이용하였고 그 분석조건은 다음과 같은 조건으로 분석하였다.

1. 장치

System : JASCO GPC, Model(LCSS-905)

Pump : PU-980

Detector : R1-930

Injector : Rheodyne 7125

Oven : CO-965

2. 조건

Column : Asahipak GS-220 HQ+GS-320 HQ+ GS-520HQ+GS-620HQ(7.6m ID × 300mm L)

Moble phase : 탈이온수에 0.1M NaCl 첨가용액을 사용

Flow rate : 1㎖/min

Column Temp. : 40℃

Injection volumn : 200μL

3. 샘플분석

MW maker : Pullulan(MW 853000, 95400, 23700, 5800), chitosan-oligosaccharides(MW 322.32, 483, 706, 876)

알긴산 올리고유도체 : 0.1%(W/V) 용액(0.45μL membrane여과후 사용)

또한, 각 pH값은 100mL 탈이온수에 1g의 제조된 등급화별 알긴산 올리고당 유도체를 투여하고 교반한 다음 충분히 용해되면 pH미터로 측정하였으며, 전체 알긴산 계열 유도체의 pH범위는 6.94-7.5 범위였다.

[실시예 1]

[알긴산의 추출]

본원 발명과 관련한 알긴산 올리고 유도체를 제조하기 위하여 기초 물질로 사용되는 알긴산은 다음과 같이 추줄, 정제 하였다. 즉, 일반 채취되는 다시마를 이를 미세하게 분쇄한 후 이를 자연건조하였다. 건조된 다시마 분말을 다시마가 가지고 있는 요오드를 제거한 알긴산과 요오드가 제거되지 않은 알긴산을 제조하였다. 즉, 유기용매를 사용하여 속슬렛(Soxlet) 추출장치를 사용하여 아세톤등의 용매로 요오드를 춘출한 후, 잔류 다시마 분말을 NaHCO₃용액으로 추출하여 해조류가 보유하고 있는 알긴산류를 분리하였으며 메탄올을 이용하여 분말결정화 한 후 동결 건조하여 요오드가 제거된 고분자 알긴산 분말을 얻었다. 추출된 요오드는 알긴산을 가수분해한 후 적정량을 다시 투여하여 각 실시예에 적용하였다.

그러나, 요오드를 보유시킨 알긴산은 유기용매 추출법을 사용하지 않았다. 본원 발명에서 확인하고져하는 적조플랑크톤류, 어병 기생충 및 어병균의 항미생물 효과를 나타낼 수 있는 물성치의 조절을 위해 고불자 알긴산 분해를 위하여 사용한 효소로는 아르기나제(sigma사, Lot Ne : A2137)를 구입하여 사용하였으며, 사용한 효소의 역가치는 12,500 units/g였다.

[실시예 2]

[화학적 방법에 의한 알긴산 올리고유도체 제조]

0.5L 삼구 플라스크에 2N-HCI용액 0.3L 담거나 혹은 여과 해수 및 3차 탈이 온수를 다른 플라스크에 pH 12로 조절된 알카리 용액을 충진한 다음, 온도를 80∼100℃로 가온한 후 여기에 고분자 알긴산을 309을 투여한후 교반하여 가수분해 시킨다. 시간별로 가수반응을 정지시키기 위하여 1ON-NaOH와 3N-HCl 용액으로 pH를 5조 조절하여 가수분해 및 반응을 종결 및 여과하여 분말형태의 중간가수분해물인 알긴산을 분리 및 반응액을 제거한다. 그리고, 여과된 중간들을 넣은 후 추가적적으로 일반 여과 해수 및 3차 탈이온수로 1%용액(w/v)이 되게 하여 충분히 분산 시킨 후 다시 pH를 7∼9로 조절한다. 최종적으로 시간별 획득된 용액상의 저분자화 알긴산 및 알긴산 올리고당 유도체를 제조하였다.

[실시예 3]

[효소적 방법에 의한 알긴산올리고 유도체 제조]

3차 탈이온수를 3구 둥근 플라스크에 투입하고 온도를 37℃, pH는 9.5로 조절하여 여기에 고분자 알긴산중 교반하여 용해시키고, 아르기나제를 투입하여 효소 가수분해후 시간별로 효소반응을 정지시키기 위하여 121℃에서 15분동안 고압살균처리하여 효소의 활성을 정지시킨 후 침전된 효소를 원심분리하여 제거하고, 이를 농축하였다. 그리고, 최종적으로 시간별 획득된 용액상의 저분자화 알긴산 및 알긴산 올리고당 유도체를 제조하였다.

[실시예 4]

[알긴산 올리고 제조 및 당체별 분리]

항미생물성이 높은 분자량의 분포도를 갖는 알긴산 올리고당의 획득을 위하여 알긴산-올리고 혼합체를 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜 및 아세톤 등에 대한 용해도차이를 이용하여 분리를 실시하였다. 즉 일반수에 녹인 알긴산 올리고당 혼합용액을 교반하면서 0.5배부터 6배의 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜 및 아세톤 등의 용액을 점차적으로 투여하면서 이때 형성되는 침전물을 분리하여 이를 각각 분리하였다. 분리된 분자량이 다른 알긴산 올리고당은 표준물질과 박판그로마토그래피분석을 수행하여 정성적인 물성 분석을 실시하고, 분자량 분포도를 확인하기 위하여 GPC(gel permeatation chromatography) 분석시스템(JASCO, 일본)을 사용하여 분포도를 정량하였으며, 최종 획득된 알긴산 올리고당 함유 용액을 이를 동결건조하여 본원의 항균효과가 탁월한 물성치의 알긴산 올리고당 분말을 얻었다. 당체별로 분리된 알긴산 올리고당의 종류별 분자량 분포도는 하기 표 1에 나타내었다. 즉 알긴산올리고당유도체의 평균분자량은 2,000이하였으며, M/G비율은 3이상였다. 또한, 당체범위는 2∼16개당체가 60%∼100%가 혼합된 3종류와 대조로 사용하기 위해 일반 알간산을 준비하여 총 4종류를 본원 발명의 기초물질로서 적용하였다.

[실시예 5]

[항미생물성 검정을 위한 가축질병 유발 균주의 선택]

항미생물성 검정을 위한 가축질병 병원체 분리주는 가축 사육환경에서 가장 빈번히 분리되는 대표적인 병원세균 및 곰팡이균을 선발하였다. 병원균주는 전남대 학교 수의과대학 질병진단실험실에 부검이 의뢰된 가축의 소장 내용물, 분변, 병인 조직등에서 분리하였다. 기본적인 분리주 확보방법은 가검재료를 영양한천배지 및 McConkey 한천배지에 도말하여 분리한 다음 생화학적 검사를 통해 균을 동정하였으며, 혈청형 검사도 수행하였다. 본 발명에 적용된 병원 미생물 항목은 하기 표 2 및 표 3과 같다.

[실시예 6]

[항균성 결정을 위한 배지의 조제 및 항균 효과 확인]

영양육즙배지(NB)를 121℃에서 15분 동안 가압살균한 후 세균 및 곰팥이균의 배양을 위한 기본 배지로 사용하였다. 본 가축질병을 발생시키는 세균에 대한 본원 발명에서 개발된 제제의 항균성 효과를 측정하기 위한 배지 조제는 121℃에서 15분 동안 가압 살균한 2배 농도의 NB 백지(pH6.5)에 pH6.5로 조정 후 대조군으로서 알긴산 올리고당과 준비된 각각의 알긴산 올히고당 분리 당체를 첨가한 1% 용액과 살균증류수를 첨가하여 각 유도체 제제를 최종농도 0.5%(w/v), 0.1%(w/v), 0.01%(1v/v), 0.001% 및 0.0001%(w/v)가 되게 하였으며 비교 실험용 배지는 무첨가 NB 배지를 사용하였다. 본 배양은 하룻밤 배양한 종배양액을 0.1%(v/v) 접종하고 24 시간동안 회전 진탕 배양하였다.

하기 표 4에 기재된 바와 같이 그 결과로서, 알긴산 올린고당 유도체를 첨가한 경우에서는 최초 투여시의 균수에 비하여 5분이 경과한 이후부터 급격한 사멸이 이루어지고 있었으며, 균의 종별 차이에 의해 다소 차이는 있었으나, 12시간 이상 이 경과시에는 생존하는 콜로니는 나타나지 않아 완전히 사멸된 것으로 확인되었다. 그러나, 일반 고분자 알긴산을 첨가한 실험군에서는 항균 효과는 인정할수 없었다.

주) 1. - : 측정하지 않았음.

2. 유의성검토 : (P＜0.01)

3. 평균오차범위 : ±1∼±5

[실시예 7]

[병원성 곰팡이에대한 항곰팡이 효과 측정]

본원에서 확인하고자 하는 곰팡이의 항곰팡이성을 확인하기 위하여, 곰팡이 종류별로 올리고별 첨가농도별로 실시예 6과 동일한 조건에서 배양한 곰팡인균을 영양육즙배지 37℃에 배양시켰다.

이 배양액을 1 1mg/ml(건조중량 기준)으로 조정한 다음 알긴산-올리고 분리체 별에 따라 농도별(0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%)로 첨가한 4개 비교군을 설정하였고, 비교예로서는 각 제제를 첨가하지 않은 대조군을 두었다. 알긴산-올리고를 농도별로 첨가한 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 및 120시간에 각 처리군 별로 10㎕씩 채취하여 영양육즙 아가 배지에 페이퍼 디스크를 거치한 후 이 페이퍼에 곰팡이균액을 떨어뜨려 이를 37℃ 인큐베이터안에서 배양하였으며, 배양 24시간 후 성장하는 곰팡이의 성장환을 측정하여, 알긴산 올리고를 처리하지 않은 비교예에 대하여 성장억제를 비교하였다. 그 결과로서 알긴산-올기고를 첨가한 경우에서는 2시간이내에 곰팡이균의 사멸효과를 나타내었으며, 그 사멸과정에 대한 결과를 제1도 내지 제3도에 나타내었다.

그러나, 고분자 알긴산을 처리한 경우에서는 0.5%(w/v)이상의 농도 처리군에서도 항곰팡이 효과는 인정되지 많았다.

[실시예 8]

[가축설사유발 다종 혼합대장균의 알긴산 촐리고팡 첨가후 시간별 사멸 효과 검정]

본원에서 알긴산올리고당 유도체의 할균효과를 검정시 환경중에 존재하는 대장균이 다종의 대장균에 의해 가축의 설사를 야기함에 착안하여 본 실험에서는 전체균주별(표 2)로 NA배지에서 배양한 배양액 1㎖를 미세원심분리기로 15,000rpm에서 30초동안 원심분리하여 얻어진 세포침전물을 살균한 인산완충용액(pH 6.0)으로 2회 세척하고 최종적으로 인산완충용액 1㎖에 현탁시켰다. 대장균 배양액 현탁액을 골고루 1㎖씩혼합한 후, 이를 2×10⁷CFU세균수/㎖로 희석하여 이에 대해 알긴산올리고당의 항균성 효과를 검정하였다. 이의 검증을 위한 비교예와 실시예는 실시예 6과 동일하게 측정하였다. 이 결과를 생균수 감소수를 하기 표 5에 나타내었다. 즉, 세균의 사멸속도는 균주 및 종별로 차이가 있으나 동일하게 미생물과 알긴산올리고 제제와 접촉 후 1분이내에 급격한 감소가 이루어졌으며, 18시간이 경과하였을때는 콜로니가 전혀 나타나지 않아 완전 사멸된 것으로 확인되었다.

그러나, AOH를 투여하지 않은 대조군과 일반 초분자 키토산을 투여한 비교군은 실험농도별 및 시간별로 균들은 지속적으로 성장하고 있음을 확인할 수 있었다.

주) 1.- : 측정하지 않았음.

2. 유의성검토:(P＜0.01), 평균오차범위. ±3∼±12

이하 자연질병 감염 현장 돼지에 대한 질병 치료 효과를 시헝한 실시예이다.

[이유자돈에 대한 치료 효과]

[비교예 1]

본원 발명에서는 자연감염된 가축에서 치료 효과를 검정하기 위하여, 실험실적 항균 효과 검정중 가장 항균 효과가 탁월한 AOH-3만을 선정하여 설사를 일으키는 자돈을 대상으로 치료 효과를 검정하였다.

이를 위하여 치료 효과를 검정하기 위한 실험군은 다음과 같이 설정하였다. 즉, 비교예에서는 출생한지 1일령의 설사증상을 나타내는 동일 모돈에서 출생한 동일 자돈군과 조발성 설사를 나타내는 생후 7∼14일령을 선정하고 설사증상을 나타내는 새끼돼지들만을 대상으로 기존의 방법대로 일정별 생존률을 측정하여 실시예의 결과와 비교하였다.

본원 발명과 관련하여 대조군과 AOH-3출 투여하기전의 모돈 및 자돈에 대한 일반항생제의 투여조건은 다음과 같이 실시하였다. 모돈에 대해서는 세파졸린 항생제를 분만 3일전, 2일전에 주사하였으며, 분만시는 안티팬을 1회주사하였다. 또한 출생후 새끼돼지에게는 겐타마이신 [(주)대성미생물)]을 1cc씩 1일 1회 경구투여하였다. 이에 대한 자돈설사증상의 치료 결과는 우선 임상적인 증상으로 확인하으며, 2차적으로 자돈의 분변내 존재하는 세균수는 다음과 같이 확인하였다 최초 수양성 설사증상을 나타내는 자돈에 대하여 임상적인 증상을 확인한 후, 치부 균에 대하여 오염을 최소화하도록 설사증상을 나타내는 자돈의 항문을 알콜로 소독한 후 직장내의 분면을 강제 채취하였다. 그리고, 채취한 분변을 0.1g을 정확히 분취하여 이를 PBS완충용액 1,000㎕에 분산시키고, 이를 MacConkey 또는 mENDO(Difco)고체배지에 500배, 5,000배 및 500,000배로 단계 희석하여 나타나는 세균성 콜로니를 계수였다. 또한, AOH-3에 의한 치료효과를 확인과정도 역시 동일한 과정으로 수행하였다. 이 결과를 표 6과 제4도에 나타내었다.

[실시예 9]

본원 발명과 관련한 제제인 AOH-3의 투여조건은 다음과 같이 설정 실시하였다.

즉, 각각 AOH-3제제를 자돈 출산후, 1일∼2일령에 대하여 체중 Kg 당 0.1mg을 1일 1회씩 5일동안 강제 결구투여하였으며, 치료과정 별 임상적인 치료효과 및 세균수 감소결과는 상기 비교예 1과 동일하게 실시하였다.

[실시예 10]

실시예 10은 실시예 9와 동일조건으로 실시하였으나, 다만 투여조건을 2mg으로 달리하였다.

[실시예 11]

실시예 11은 실시예 9와 동일조건으로 실시하였으나, 다만 투여조건을 4mg 로 달리하였다.

[실시예 12]

실시예 12는 실시예 9와 동일조건으로 실시하였으나, 다만 투여조건을 7.5mg으로 달리하였다.

[실시예 13]

실시예 13은 실시예 9와 동일조건으로 실시하였으나, 다만 실험대상인 자돈의 출생연령을 7∼14일경에 나타나는 조발성 설사증상에 대하여 실시하였다.

[실시예 14]

실시예 14는, 각각의 ADH-3 제제를 자돈 7일∼14일령에 대하여 체를 Kg 당 0.1mg을 1일 1회씩 5일동안 강제 경구투여하였다.

[실시예 15]

실시예 15는 2mg을 투여하는 이외에는 실시예 14와 동일하게 처리하였다.

[실시예 16]

실시예 16은 4mg을 투여하는 이외에는 실시예 14와 동일하게 처리하였다.

[실시예 17]

실시예 17은 7.5mg을 투여하는 이외에는 실시예 14와 동일하게 처리하였다.

상기 비교예 1과 실시예 9 내지 17의 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

이하, 이하 젖 소설사증에 대한 치료 효과에 대한 실시예를 기재한다.

[비교예 2 및 실시예 18]

본원 발명에서는 자연감염된 가축에서 치료 효과를 검정하기 위하여, 실험실적 항균 효과 검정중 가장 항균 효과가 탁월한 AOH-3만을 선정하여 설사를 일으키는 송아지(체중 : 60kg)와 650kg의 체중을 나타내는 젖소를 대상으로 치료 효과를 검정하였다.

이를 위하여 치료 효과를 검정하기 위한 실헝군은 다음과 같이 설정하였다. 즉, 비교예는 성체 젖소를 6∼8개체를 비교 실험군으로 3개군을 설정하였으며, 실시예는 설사증상을 나타내는 송아지 설사군과 성체 젖소 실험군를 선정하여 AOH-3을 성체 젖소를 대상으로는 5일동안 마리당 3.2mg씩 5일동안투여한 군, 송아지를 대상으로로 5일동안 3.2mg씩 투여한 군 그리고, 성체 젖소를 대상으로 5일 동안 7.5mg씩 투여한 군으로 설정하여 비교하였다. 본원 발명과 관련하여 비교예로서는 설사증상을 일으키는 대상동물 일반항생제만을 투여하였다 즉, 비교예에 대해서는 세파졸린 항생제를 설사를 나타내는 5일동안 주사하였으며, 또한, 겐타마이신 [(주)대성미생물)]을 1cc씩 1일 1회 경구투여하였으나 설사증상이 호전되지 않은 젖소와 여기에, AOH-3만를 처리한 경우 설사증상의 치료 결과는 우선 임상적인 증상으 로 확인하였다. 하기 표 7에 결과를 나타내었다.

a : 설사유발, b : 성체 젖소를 대상으로 5일동안 3.2mg/head/day, c : 송아지를 대상으로 5일동안 3.2mg/head/day투여, d: 성체 젖소를 대상으로 5일 동안 7.5mg/head/day

이하, 젖소유방염 치료제로서의 효과를 검정하는 실시예를 기재한다.

[비교예 3 및 실시예 19 실험실내 항균효과]

본 비교예와 실시예에서는 젖소유방염에 대한 치료효과를 확77하기 위하여, 다음과 같이 실시하였다.

우선 젖소 유방염 유발균인 젖소유방염을 나타내는 병원균인 Staphylococus aeurs를 분변에서 Hagan and Bruner's의 Microbiology and Infectious Disease of Domestic Animals(8판, pp171-196, 1982)에 준하여 분리하여 실험실적 항균효과를 검정하였다.

즉, 본 발명에서 확인하고자 하는 유방염 유발세균 종류별로. 알긴산제제별 및 첨가농도별 항균성을 알아보기 위해 배양한 세균을 열양육즙배지 37℃에 배양시키었다. 이들 균 배양용액은 2 × 107 CFU/㎖로 조정한 다음), 표준균주와 야외분리 균주에 대하여, 항균효과를 실험실조건에서 실시하여 하기 표 8에 나타내었다. 즉, 알긴산-올리고유도체를 놀도별(0.5%, 0.1%, 0.01%, 0 001%, 0.0001%)로 첨가한 5개 처리군으로 설정하였고, 비교예로서는 첨가하지 않은 대조군을 두었다. 알긴산올리 고유도체를 첨가한 후 1시간, 4시간, 8시간 및 24시간에 각 처리군별로 10㎕씩 채취하여 990㎕의 인산완충액을 넣은 캡시험관에 잘 섞은 다음 이중 50㎕를 영양 한천배지에 도말하여 하루동안 배양시켜 나타난 집락수를 세었다. 그 결과로서 알긴 산올리고유도체을 첨가한 경우에서는 최초 투여시의 균수에 비하여 1시간이 경과한 이후부터 급격한 사멸이 이루어지고 있었으며, 균의 종별 차이에 의해 다소 차이는 있었다. AOH-1, 2, 3의 경우는 0.001%이상의 농도로 처리한 후 18시간 이상이 경과시에는 생존하는 콜로니는 나타나지 않아 완전히 사멸된 것으로 확인되었다. 그러나, 표준균주와 야외분리균주에 AOH-0를 처리한 경우에서는 대조군에 비하여 항균 효과는 인정되지 않았다. 또한, AOH-1의 경우는 0.1%이상의 농도로 첨가된 경우 항균효과는 급격히 저하 되었으나, 0.1% 이하의 농포 처리시는 항균효과는 급격히 증가되는 것으로 확인되었다. 이는 알긴산올리고 분리체의 경우 분자량이 큰경우에서는 먼저 섹균막 또는 벽에 코팅 됨으로써 항균성에 관련된 올리고당체의 항균 메카니즘을 억제하는 것으로 생각되었다. 그러나, 분자량이 적은 경우에서는 이와는 반대의 현상을 나타내었다.

*: 최초 AOH제제를 투여하기 전에 확인한 실험군별 균의수, × 10⁷CFU/ml

- 전체 실험간 표준편차범위 : :4 ∼18%

이하, 젖소 유방임 현장 치료 효과에 대한 실시예를 기재한다.

[실시예 20]

본 실시예는 Staphylococcus. aureus균에 의해 발생하는 젖소 유방염치료에 의한 체세포감소 효과를 검정한 결과로서, 우유를 채취하는 절소(평균 체중 : 650±30kg)를 대상으로 AOH-3만을 대상으로 체중 Kg당 7.5mg의 AOH-3을 1일 1회씩 7일간 경구로 강제 투여하면서 7일후 Fosomatic 체세포 검사기를 사용하여 채취우유내에 존재하는 체세포를 검사하였다. 분석 우유의 채취는 2∼3등급으로 체세포수가 존재하는 것으로 판정된 젖소만을 대상으로 하였으며, 채취간 시험 오차를 줄이기 위하여 동일 젖꼭지 만에서 5회 이상의 우유를 제거한 후 멸균 튜브에 50ml씩을 채취한후 냉장 상태로 즉시 운반하여 측정하였다. 결과는 AOH-3를 투여전의 체세포수에 대하여 처리후의 백분율로 환산하여 하기 표 9에 나타내었다.

[실시예 21]

실시예 21은 실시예 20과 동일하게 실시하였으나. 단지 투여량을 5mg으로 달리 하였다.

[실시예 22]

실시예 22는 실시예 20과 동일하게 실시하였으나, 단지 투여량을 3.5mg으로 달리 하였다.

이하, 가금류 질병 치료 효과에 대한 실시예를 기재한다.

[실시예 23]

실시예 23은 살모넬라균에 갇염된 산란계에 대한 치료 효과를 검정한 결과로서, 평균 2.5kg의 무게를 나타내는 산란계를 대상으로 본원 발명과 관련한 AOH-3의 항살모넬라제제로서 사용효과를 다음과 같이 판정하였다. 우선 실시예의 대상 육계 농장은 동일 농장에서 실시하였으며, 임상적으로 질병증상은 감보로와 전염성 기관지염, 전염성 우두기관지염, 복합 호흡기 증후군 및 대장균 설사로 추정되는 닭 3개체를 무작위로 선발하여, Hagan and Bruner's의 Microbiology and Infectious Disease of Domestic Animals(8판, pp74-87, 1982)에 준하여 임상 증상을 병리학적으로 확인한 바 전형적인 살모넬라감염으로 인한 질병임을 확인하였다. 이를 AOH-3를 투여하지 않은 비교예 10개체와 처리군은 20개체을 별도로 분리 및 격리하고 닭 Kg당 AOH-3 7.5mg을 1일당 1회씩 음용수에 혼합한후 강제 음수경구 투여를 5일동안 처리하였다. 결과는 임상적인 증상이 호전되며, 동시에 분변이 정상 소견을 나탄내는 시점을 치료된 것으로 결정하였다. 그리고, AOH-3을 투여후 일정별 산란계 장내 존재하는 세균수는 다음과 같이 확인하였다. 최초 산란계에 대하여 임상직인 증상을 확인한 후, 산란계의 직장내의 분변을 강제 채취하였다. 그리고, 채취한 분변을 0.1g을 정확히 분취하여 이를 PBS완충용액 1,000㎕에 분산시키고, 이를 55고체배지에 500배, 5,000배 및 500,000배로 단계 희석하여 나타나는 세균성 콜로니를 계수하였다. 하기 표 10 및 제5도에 그 결과를 나타내었다.

[실시예 24]

실시예 15는 실시예 14와 동일하게 실시하였으나, 단지 투여량을 5mg으로 달리 하였다.

[실시예 16]

실시예 16은 실시에 13과 동일하게 실시하였으나, 단지 투여량을 3.5mg으로 달리 하였다.

이하, 가축의 증체율 증진 효과에 대한 실시예를 기재한다.

[실시예 26]

본원에서 AOH-3을 투여한 새끼 돼지를 대상으로, 1일령부터 4일령까지는 1일당 1회, 7.5mg씩을 경구 투여하한 후 5일째부터는 일반수이 100 : 1(w/v)로 희석하고 이를 돼지에 무한정 섭취케 한 후, 최초 투여전의 돼지의 체중을 확인한 후 7일 간격으로 지속적으로 체중을 칭량하여 알긴산올리고당유도체를 투여하지 않은 돼지에 비하여 그 증체율을 확인 비교하였다. 본원에서는 가축의 증체율을 측정하기 위한 모든의 출산경험은 1산-4산사이로 비교적 출산 횟수가 적은 돼지로 선정하여 이 에서 출산한 새끼돼지를 실시예의 재료로 사용하였으며, AOH-3을 투여하지 않은 비교군과 실시예 동일 농장, 동일 모돈에서 출산한 평균 출산시 9∼12개체의 자돈군을 각각을 5복씩 선정하여 실시하였다. 이에 대한 결과는 제6도에 나타내었다.

천연고분자 물질인 알긴산을 항미생물 효과가 뛰어나도록 유도체로 제조하고, 종래의 항균제와 같이 지속적으로 내균성이 생기지 않으며, 가축내에 잔류하여도 소비자의 건강을 해치지 않으면서 가축짙병의 감염에 대한 사천예방, 항병력 강화 및 증체율 증진효과 및 치료효과에 아주 우수한 효과가 있다.

Claims (17)

1. 알긴산을 가수분해시켜 제조된 평균분자량 2,000이하의 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 가축동 항균제.
2. 제1항에 있어서, 상기 알긴산은 다시마로부터 추출된 것임을 특징으로 하는 가축용 항균제.
3. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 알리고당 유도체의 당체가 1개∼16개로 구성된 분자량 분포도를 갖는 것임을 특징으로 하는 가축용 항균제.
4. 제1항 내지 제3항중 하나의 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균분자량이 8,000이하인 알긴산을 유효성분으로 하는 것을 특징로 하는 가축용 항균제.
5. 제4항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당 유도체를 최고 0.1mg∼10mg되게 혼합하여 경구투여함을 특징으로 하는 가축용 항균제.
6. 제1항에 있어서, 상기 가축용 항균의 대상 균주는, 대장균속등과 리스테리아속, 포도상구균, 연쇄상구균, 살모넬라속, 크렙지엘라등의 세균을 포함하는 것을 특징으로 하는 가축용 항균제.
7. 알긴산을 가수분해시켜 제조된 평균분자량 2,000이하의 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 가축용 항진균제.
8. 제7항에 있어서, 상기 알긴산은 다시마로부터 추출한 것임을 특징으로 하는 가축용 항진균제.
9. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 알리고당 유도체의 당체가 1개-16개로 구성된 분자량 분포도를 갖는 것임을 특징으로 하는 가축용 항진균제.
10. 제7항 내지 제9항중 하나의 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균분자량이 8,000이하인 알긴산을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 가국용 항진균제.
11. 제10항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당 유도체 11mg∼10mg을 혼합하여 경구투여함을 특징으로 하는 가축용 항진균제.
12. 제7항에 있어서, 상기 가축용 항진균 대상 균주는 아스퍼질러스속등의 곰팡이를 포함하는 것을 특징으로 하는 가축용 항진균제.
13. 알긴산을 가수분해시켜 제조된 평균분자량 7,000이하의 알긴산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 가축 증체율 증강제.
14. 제13항에 있어서, 상기 알긴산은 다시마로부터 추출한 것임을 특징으로 하는 가축 증체율 증강제.
15. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 알리고당 유도체의 당체가 1개∼16개로 구성된 분자량 분포도를 갖는 것임을 특징으로 하는 가축 증체율 증강제.
16. 제13항 내지 제15항중 하나의 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당 유도체와 함께 평균분자량이 8,000이하인 알긴산을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 가축 증체율 증강제.
17. 제16항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당 유도체 1mg∼10mg을 혼합하여 경구투여함을 특징으로 하는 가축 증체율 증강제.