KR100654427B1

KR100654427B1 - 악취생성방지 및 탈취활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸ｃｕ03 ｋａｃｃ 91103

Info

Publication number: KR100654427B1
Application number: KR1020050088628A
Authority: KR
Inventors: 심명식; 윤영호
Original assignee: 심명식
Priority date: 2005-09-23
Filing date: 2005-09-23
Publication date: 2006-12-06

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타룸 CU03 (lactobacillus plantarum CU 03) KACC 91103 및 이를 유효성분으로 함유한 생균 활성제에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CU03은 내산성, 내담즙성 및 유산생성능력을 가져 생균 활성제로서 조건을 충분히 갖추고 있을 뿐만 아니라, 분변의 부패시에 발생되는 악취생성과정에 관여하는 미생물의 수를 억제함과 동시에 악취생성의 주요 성분이 되는 암모니아 생성량을 현저하게 저하시키는 특성을 가지고 있음과 동시에 항산화 활성 및 IgM의 활성을 증대시켜 가축의 면역력을 증대시키는 활성을 가지고 있어 본 발명의 생균 활성제를 사료에 첨가시켜 가축을 사육할 경우 악취발생이 없으면서도 건강한 가축 사육이 가능해져 결론적으로는 농가소득에 이바지할 수 있으므로 본 발명은 축산산업에 유용한 발명이다.

lactobacillus plantarum CU03 KACC 91103, 악취생성방지, 탈취활성, 생균제

Description

악취생성방지 및 탈취활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 ＣＵ03 ＫＡＣＣ 91103{lactobacillus plantarum CU03 KACC 91103 having provention of formating a foul odor and a deodorizing acitivy}

도 1은 락토바실러스 플란타룸 CU03의 내산성 측정 결과를 나타낸 도이며,

도 2는 락토바실러스 플란타룸 CU03의 내담즙산 측정 결과를 나타낸 도이며,

도 3은 락토바실러스 플란타룸 CU03의 유당배지에서 산생성능력을 나타낸 도이며,

도 4는 생균제를 첨가한 식이를 급여시킨 쥐의 간 세포의 GSH 수준을 측정한 도이며,

도 5는 생균제를 첨가한 식이를 급여시킨 쥐의 비장 세포의 GSH 수준을 측정한 도이며,

도 6은 생균제를 첨가한 식이를 급여시킨 쥐의 비장세포의 플라크 형성 세포(plaque forming cell)의 수준을 측정한 도이다.

본 발명은 가축 분변의 악취 생성을 방지하고 탈취활성이 강한 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) CU 03 KACC 91103 및 이를 유효성분으로 함유한 생균 활성제에 관한 것이다.

락토바실러스 속 균주는 정상적으로 사람을 포함한 동물의 장관에 일정한 균총을 생성하고 면역증진작용, 유희병원균의 성장억제, 유해독소의 중화 및 합성차단, 영양분의 소화흡수의 증대 그리고 여러 유익한 생리활성을 나타내는 것으로 이미 잘 알려져 있어 사람은 물론 동물에게도 많이 투여하고 있다.

최근에는 동물 및 어류에게 예방학적 차원에서 사용하고 있는 항생제를 환경보호차원에서 그 사용을 규제하고 있고, 또한 일부 이에 대해 법적 규제를 행하고 있다. 실제 항생제를 대신하여 프로바이오틱스(Probiotics)로서 동물 및 어류에 이러한 유산균을 투여했을 때, 그 효과가 우수한 것으로 보고된 바도 있다.

프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 생균제로서, 사람 및 동물에 투여된 생균이 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해균이 정착하지 못하도록 한다. 또한, 투여된 생균제는 박테리오신(bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와준다. 이 밖에도, 생균제는 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성하고, 사료요구율을 개선시키며, 병원균이 생성하는 독성물질을 중화하는 물질을 생성하기도 한다. 생균제는 대체로 동물 또는 어류가 스트레스로 인한 소화관의 유용균 감소를 억제할 목적으로 이용되며, 항생물질을 경구투여하고 난 후 병원균보다 먼저 세균이 없는 소호관 벽에 부착하여 병원균이 정착하는 것을 방지한다.

날씨가 불순하거나 사료가 바뀌는 경우 또는 가축이 이동하는 경우, 대장균, 살모넬라균, 포도상구균 등의 유해 미생물은 비정상적으로 증식하여 장내 미생물의 균형이 깨어지게 되며, 이때 발생되는 설사는 경우에 따라 가축에 치명적일 수 있다. 이를 예방하기 위하여 사전에 항새제를 사용한다. 따라서 생균 활성제로 사용될 미생물은 강산인 위액을 통과해야 하므로 내산성과 위를 통과한 뒤 담즙과 만나게 되므로 내담즙성을 가져야 한다.

이에 따라 본 발명자들은 내산성 및 내담즙성을 가지면서도, 가축 분변의 악취생성을 방지, 탈취활성을 가지면서도 장내의 미생물의 균형, 세포내 GSH 농도를 증가시키며, IgM 활성을 증대시키는 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 CU03을 동정하여 이의 생균제로서 이용가능함을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 가축 분변의 악취 생성을 방지하고 탈취활성이 강한 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) CU 03 KACC 91103 및 이를 유효성분으로 함유한 가축용 생균 활성제에 관한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 악취생성을 방지, 탈취활성을 가지면서도 장내의 미생물의 균형, 세포 내 GSH 농도를 증가시키며, IgM 활성을 증대시키는 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) CU03 KACC 91103을 제공한다.

상기 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) CU03 KACC 91103를 유효성분으로 함유하여 가축 분변의 악취생성방지, 탈취활성, 항산화 활성 또는 면 역력 증가 활성을 가진 가축용 생균 활성제를 제공한다.

상기 가축이라 함은 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 잉어, 금붕어 등의 어류 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.

또한, 본 발명의 생균 활성제는 유산균 제제, 발효 사료제 또는 사일레지에 첨가되어 사용된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) CU03 KACC 91103은 환경정화제(이지픽스)로 부터 균주를 분리하여 락토바실러스 선택배지를 이용하여 배양한 후, 그람 염색 및 MRS 배양액으로 계대배양을 통해 배양하여 1차적으로 선발할 수 있다. 이 균주들을 API 키트를 이용하여 락토바실러스 플란타룸 CU 03을 동정할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CU03은 pH 7 내지 pH 2.5의 범위에서 내산성을 나타내며, 옥스갈(oxgall) 0.1%(w/v)의 조건에서 생육할 수 있는 내담즙성 및 유산생성능력을 가지고 있다.

또한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CU03은 분변의 부패시에 발생되는 악취생성과정에 관여하는 미생물의 수를 억제함과 동시에 악취생성의 주요 성분이 되는 암모니아 생성량을 현저하게 저하시키는 특성을 가지고 있음과 동시에 항산화 활성 및 IgM의 활성을 증대시켜 가축의 면역력을 증대시키는 활성을 가지고 있다.

따라서 본 발명은 상기 활성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 CU03을 유효성분 으로 포함하는 가축 분변의 악취생성방지, 탈취활성, 항산화 활성 또는 면역력 증가 활성을 가진 가축용 생균 활성제를 제공한다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물 (예: 랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐 등), 모피 소유 동물 (예: 밍크 및 여우 등), 및 동물원 동물 (예: 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이 등), 뿐만 아니라 가축 (예: 고양이 및 개 등)에게 사용할 수 있다. 또한, 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기등의 가금류가 포함된다.

이하, 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 한정하지는 않는다.

실시예 1. 락토바실러스 플란타룸 CU03 (lactobacillus plantarum CU03 )의 동정

환경정화제(이지픽스)로부터 균주를 분리하였고 하기와 같은 방법으로 동정하였다.

액상시료 1㎖를 멸균된 생리식염수로 10배 계단 희석하여 10⁶-10⁷ cfu/㎖로 희석한 후 락토바실러스 선택배지인 Rogosa SL agar(pH 5.4, DIFCO)에 도말하여 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 이 때 분리한 집락을 락토바실러스 주(lactobacillus sp.)는 현미경으로 관찰한 후, 그람 염색으로 확인한 후 30 균주정도를 선발하였다. MRS 배양액을 이용하여 계대배양하여 균주의 생장이 상대적으로 너무 느리거나, 배양 시 균체가 너무 적은 경우에는 선발균에서 제외시켜, 1차적으로 균주를 선발하였다.

상기 선발된 균주를 대상으로 당발효실험을 위한 단일집락을 취하여 MRS 배양액에서 계대배양한 후, 배양한 균체를 멸균 증류수로 2회 세척한 후, API 50 CHL 키트(API, France)를 이용하여 37℃에서 48시간동안 배양하면서 당의 이용성을 확인하였다. 그 후 하기 표 1과 같은 특성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum)을 동정하였고, 락토바실러스 플란타룸 CU03(lactobacillus plantarum CU03)으로 명명하고, 2004년 6월 17일자에 농업생명공학연구원에 이를 기탁하였고, 기탁번호는 KACC 91103이다.

락토바실러스 플란타룸 CU03의 당분해 활성 및 생화학적 특성

Morphology	Shape	rod
Morphology	Gram	+
Physiological Charicteristic	Ammonia from arginine	+
	Gas from glucose	+
	Growth at 15℃	_
	Growth at 45℃	+
Fermentation	Raffinose	+
	melibiose	+
	Arabinose	+
	Cellobiose	+
	Gluconate	+
	Lactose	+
	Salicin	+
	Adonitol	-
	Fructose	+
	Mannose	+
	Glucose	+
	Eslucine	+
	N-acetyl glusoamine amidon	+

(+ : positive, - : negative)

실험예 1. 락토바실러스 플란타룸 CU03 의 장내환경에 대한 적응특성 및 유당 분해능력의 검증

1-1. 내산성 측정

상기 실시예 1에서 동정한 락토바실러스 플란타룸 CU03을 MRS 배양액에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후 0.05M NAPB를 HCl로 보정하여 만든 pH 7.0, 3.0, 2.5, 2.3, 2.0 완충용액 속에 각각 10⁷ cfu/㎖ 정도의 초기 접종농도로 접종하였다. 상기 용액을 37℃에서 2시간 동안 정치 배양한 후, 각 농도별로 standard plate count method에 따라 MRS 배지에 도말하고 37℃, 48시간 동안 배양한 후 나타난 콜로니 수를 계수함으로서 각각의 산성 pH에 대한 내성을 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 pH 7 내지 pH 2.5까지는 내산성을 나타내나, pH 2.3부터는 콜로니 수가 급격히 감소하는 것으로 보아 내산성을 갖지 못함을 확인할 수 있었다.

1-2. 내담즙성 측정

락토바실러스 플란타룸 CU03을 MRS 배양액에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후, standard plate count method에 따라 옥스갈(oxgall, Difco, USA)이 각각 0%, 0.05%, 0.01%, 0.3%, 0.5%가 함유된 MRS 배지에 도말하고 37℃, 48시간 동안 배양하였다. 그 후에 나타난 콜리니 수를 계수함으로서 각각의 담즙산 농도에 따른 내담즙산성을 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 담즙산의 농도가 0.1%까지는 내답즘성을 나타내나, 담즙산의 농도가 0.3%, 0.5%의 경우에는 콜로니의 수가 감소함으로 보아 이 농도에서는 내담즙성을 갖지 못함을 확인할 수 있었다.

1-3. 유당 함유 배지에서의 산 생성 능력

락토바실러스 플란타룸 CU03를 10% skim milk에서 37℃, 24시간동안 배양한 것을 3% d-글루코스를 함유한 10% skim milk에 접종하였다. 이후 매 12시간마다 7일간 적정산도를 측정하여 산생성 능력을 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 시간이 흐름에 따라 산의 농도가 증가하는 것으로 보아 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CU03은 유산생성능력을 가짐을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 실험수행의 결과를 종합하여 보면, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CU03은 내산성, 내담즙성 뿐만 아니라 유산생성능력을 갖추고 있어 장내 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로 생균 활성제로서 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

참조예 1. 실험동물의 준비

실험동물은 체중 200g 내외의 SD(Sparague-Dawley)계 수컷 랫트를 사용하였고, 사료(Harlan, teklan. USA)와 음수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21~24℃, 상대습도는 60% 내외로 유지하였다. 또한 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장내 빛을 조절하였다.

실험예 2. 분변 내에서의 암모니아농도 저하활성

상기 참조예 1에서 준비한 실험동물을 하기 표 2에서와 같은 식이를 1일 1회 15g을 3주 동안 급여한 후 상기 그룹들에서 채취한 분변시료 1g을 12㎖의 증류수에 희석한 후 각각의 테스트 튜브에 1㎖ 페놀 칼라 시약(phenol color reagent)과 1㎖의 알칼리-치아염소산염 시약(alkali-hypochlorite reagent)을 첨가 후 볼텍싱하였다. 25℃ water bath에서 20분 동안 발색시킨 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 630nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험그룹의 식이

대조군	기본식이(Rat diet, Powder form)
EF1	기본식이(Rat diet, Powder form) + 동결건조된 생균제(10⁸ cfu/g)
EF2	기본식이 + 동결건조된 생균제(10⁸ cfu/g) + 락토바실러스 플란타럼 CU03(10⁸ cfu/g)
EF3	기본식이 + 동결건조된 생균제(10⁸ cfu/g) + 락토바실러스 스프로제네스 CU815(10⁸ cfu/g)

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이 생균제를 급여한 경우는 대조군에 비하여 현저히 암모니아 농도가 감소되었음을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 CU03을 급여한 군이 암모니아의 농도가 0.02로 가장 탁월하게 암모니아의 농도가 저하되었음을 확인할 수 있었다. 이는 생균제 급여에 의해 변내의 악취를 발생하는 성분의 농도가 현저하게 감소된 것으로 판단되므로 이는 탈취작용의 결과로 해석된다.

생균제 급여와 변의 암모니아 농도변화와의 관계

그룹	대조군	EF3	EF2	EF1
암모니아 (mg/분변g)	0.95^a	0.3^b	0.02^b	0.25^b

실험예 3. 간과 비장세포 내의 GSH 농도변화

상기 표 2의 사료를 3주 동안 급여하여 사육한 후, PBS로 2회 세척하여 농축한 5×10⁶ 양의 적혈구 세포(RBC)를 상기 쥐 꼬리의 미정맥에 주사하였다. 상기 RBC는 양의 피(주식회사 코메드)에서 RBC만을 분리하여 사용하였다. 면역화 5일 이후에, 경추탈구법으로 쥐를 사멸시킨 후, 비장 및 간을 적출하여 ice-cold 0.9% NaCl용액에 채집한 후 세척하였다. 그 후 5% 메타인산(Metaphosphoric acid)용액에 담근 후(5%w/v) 호모지나이저로 균질화하고, 3,000×g, 10분 동안 4℃에서 원심분리한 뒤 상층액(50-100㎕)를 취하여 시료로 사용하였다.

세포내의 글루타치온 농도는 글루타치온 분석 키트(calbiochem, Cat. No.354102, USA)를 이용하여 측정하였으며, 측정값은 tissue/g/μmol로 나타내었다.

상기 실험 수행의 결과, 도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 대조군에 비하여 생균제를 투여한 군에서는 간(도 4) 및 비장(도 5) 내의 GSH 농도가 현저히 상승되었음을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 CU03을 첨가한 EF2 그룹에서의 항산화 활성이 가장 현저히 상승하였음을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 플라크 카운트(plaque count)에 의한 IgM 생성 상승 효과

상기 표 2의 사료를 3주 동안 급여하여 사육한 후, PBS로 2회 세척하여 농축한 5×10⁶ 양의 적혈구 세포(RBC)를 상기 쥐 꼬리의 미정맥에 주사하였다. 상기 RBC는 양의 피(주식회사 코메드)에서 RBC만을 분리하여 사용하였다. IgM 플라크 형성세포는 Cunningham(1968)의 방법을 응용하여 실시하였다. 면역화 5일째, 마우스로부터 비장을 적출한 후 pastle로 50-메스 스테인레스 스틸 스크린을 이용하여 세포를 BSS(balanced salt solution)에 채집을 하였다. 10% heat-inactivated calf serum을 함께 첨가하여 비장세포를 세척한 후 BSS와 함께 15㎖로 만들었다. 양의 적혈구세포는 PBS로 2회 세척하여 20%로 농축하였다. 보체성분으로서 BSS에 1/10로 희석한 Guinea pig serum을 사용하였다. 실험 전까지 모든 용액은 얼음물에 보관하였다.

0.05㎖ 비장세포 용액과 0.15㎖의 양 적혈구 세포, 0.75㎖의 보체용액을 혼합하였다. 미리 준비한 챔버에 혼합액을 넣고 파라핀 왁스(parapin wax) 또는 바세린(vaselin)으로 실링(sealing) 하였다. 37℃에서 45-60분 동안 배양시킨 다음, 각각의 시료에서 플라크가 형성되면 이를 카운트하였다.

비장에 대한 총 플라크 형성 세포에 대한 측정은 각 시료에 형성된 플라크 형성 세포에 PFC를 측정하기 위해 만든 혼합액과 실제 챔버에 들어간 양만큼 비율을 곱하고, 여기에 300을 곱하여 나타내었다(Cunningham and Szenberg, 1968).

상기 실험 수행의 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 대조군에 비하여 생균제를 첨가한 시료를 섭취한 마우스의 경우에 높은 수준의 IgM 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다(P<0.05).

EF 1과 EF 2및 3간의 IgM 생성 상승효과의 차이도 나타났으며 그 중에서도 EF 2의 경우 가장 탁월한 IgM 생성을 보였다.

실험예 5. 쥐에서 장내 미생물 균형에 미치는 영향

상기 표 2에서와 같은 식이를 3주 동안 급여한 후, 분변 샘플을 채취하여 -20℃에서 보관하였다.

상기 분변 샘플 1g을 채취한 후 펩톤 워터 9㎖에 희석하고, 유산균수의 측정시에는 MRS 아가에 십진희석한 후 도말하였다. 그 후 37℃ 에서 48시간동안 배양한 후에 나타나는 집락수를 계수하여 유산균 수를 측정하였다. 또한 대장균군 측정을 위해, 상기 분변 샘플 1g을 채취한 후 펩톤 워터 9㎖에 희석한 후 Desoxycholate agar에 십진희석한 후 도말하였다. 37℃ 에서 24시간 동안 배양한 후 나타나는 집락수를 계수하여 대장균군 수를 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이 3주 동안 생균제와 대조사료를 급여한 동물의 평균 유산균수의 변화에 가장 크게 영향을 미친 생균제는 EF2임을 확인할 수 있었고, 대조군의 경우에는 대장균군의 수가 가장 높았다. 생균제를 급여한 군에서는 대장균군의 수가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다.

분변 내의 유산균 및 대장균군 수(log cfu/g)

	대조군	EF3	EF2	EF1
coliform	9.23	4.6	5.12	5.52
lactic acid	6.3	7.79	9.87	9.5
bacteria SPC (Viable count)	6.23	7.98	10.08	9.87

Claims

악취생성을 방지, 탈취활성을 가지면서도 장내의 미생물의 균형, 세포 내 GSH 농도를 증가시키며, IgM 활성을 증대시키는 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) CU03 KACC 91103.
제1항의 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) CU03 KACC 91103를 유효성분으로 함유하여 가축 분변의 악취생성방지, 탈취활성, 항산화 활성 또는 면역력 증가 활성을 가진 가축용 생균 활성제.