CN106397597A - 一种抗f2卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种抗f2卵黄抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗F2卵黄抗体的制备方法，包括：将含有F2毒素和甲醛的溶液加入到含有牛血清白蛋白BSA、pH为7.5～8.0的溶液中，在室温反应，使F2与BSA偶联，制备免疫抗原F2‑BSA；将制备的F2‑BSA对蛋鸡免疫接种，然后收集鸡蛋；从鸡蛋中提取纯化抗F2卵黄抗体。在一个具体实施例中，将含有F2毒素和甲醛的甲醇溶液滴加到含有BSA的醋酸钾溶液中，室温反应。本发明所提供的抗F2卵黄抗体的制备方法能够产生活性高的特异性抗体，抗体吸附F2毒素的能力强，抗体效价高，产量大，方法简易，成本低，可替代现有的鼠源性单克隆抗体。

Description

一种抗F2卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种抗F2卵黄抗体的制备方法。
背景技术
F2毒素又称玉米赤霉烯酮，是由多种镰刀菌产生的一种类雌激素样的真菌毒素。谷物(如玉米、小麦等)是F2产生的最好基质，其次为豆类及其制品。近年来的调查显示，中国饲料和原料污染霉菌毒素超标的比例高达95％以上，主要污染物为F2和呕吐毒素。近十年来，人们广泛认识到水环境中内分泌物失衡对人类的危害，其中F2污染可能是其中因素之一，相关学者对波兰地表水、地下水及废水检测发现，F2浓度范围在0-43.7ng/L。
F2具有较强生殖毒性及致畸作用，可引起动物不孕或流产，对畜牧业造成较大经济损失，此外，F2还具有免疫毒性、细胞毒性、肝毒性、促进肿瘤的发生等，严重威胁人畜健康。我国饲料卫生标准规定饲料中F2检出量≤500ppb，而粮食卫生标准规定F2检出量≤60ppb。因此，建立快速、准确、简便适合大面积样品筛选的检测F2的方法非常重要。同时，目前针对畜禽霉菌毒素中毒，通常采用脱霉剂，是否可利用抗原抗体反应，将霉菌毒素进行中和，还未见有相应报道。所以，本发明也将为解决霉菌毒素中毒症提供参考方向。
目前检测F2的主要方法有薄层色谱法(Thin-layer chromatography,TLC)、高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法(High performance liquid chromatography-mass spectrum,HPLC-MS)、气相色谱法(Gas chromatography,GC)、气相色谱-质谱联用法(Gas chromatography-mass spectrum,GC-MS)、毛细管电泳法(Capillary electrophoresis,CE)、酶联免疫吸附法(Enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)等。这些检测方法有些需要昂贵的仪器设备、专业的操作人员，样品需进行复杂的处理过程，而有些如ELSIA，操作虽然简单，但其检测的关键技术需要人工制备针对F2的单克隆抗体，而单克隆抗体的制备复杂、生产成本高，因而很大程度上限制了F2ELISA检测体系的建立。
卵黄抗体(IgY)是从产蛋鸡中提取的针对特异性抗原的免疫球蛋白，在鸡蛋的形成过程中，血清IgY通过卵黄囊膜上特殊受体选择性的从循环系统经卵膜运至成熟卵母细胞。IgY结构与哺乳动物IgG类似，其已用于生物诊断试剂盒、治疗制剂的制备，其与IgG相比，主要优势有以下：①抗体收集无需屠宰动物，只要每天收集鸡蛋即可；②鸡与哺乳动物亲缘性较远，异种物质刺激能产生更强的免疫应答反应；③抗体产量高，一只鸡每年大概产300只蛋，而每只蛋含50-100mg IgY，其中2-10％的为特异抗体，相比40ml血液含200mgIgG，产量大大提高；④成本低。
但在F2的检测技术范围内，还未见有抗F2卵黄抗体的应用，本发明将提供一种抗F2卵黄抗体的制备方法，为开发快速检测且实惠的试剂盒如胶体金、ELISA方法等提供支撑，同时为研究F2毒理机制及预防霉菌毒素中毒提供参考。
发明内容
本发明的目的在于促进F2快速检测反应体系的构建，提供一种抗F2毒素卵黄抗体的制备方法。
本发明采用的技术方案如下：一种抗F2卵黄抗体的制备方法，包括：
将含有F2毒素和甲醛的溶液加入到含有牛血清白蛋白BSA、pH为7.5～8.0的溶液中，在室温反应，使F2与BSA偶联，制备免疫抗原F2-BSA；
将制备的F2-BSA对蛋鸡免疫接种，然后收集鸡蛋；
从鸡蛋中提取纯化抗F2卵黄抗体。
在一个具体实施例中，将含有F2毒素和甲醛的甲醇溶液滴加到含有BSA的醋酸钾溶液中，室温反应。
在一个具体实施例中，含有F2毒素和甲醛的甲醇溶液采用F2、甲醇和甲醛水溶液配成，甲醇与甲醛水溶液体积比0.8～1.2:1，配成后F2浓度为0.4～0.6mg/mL；醋酸钾溶液浓度0.8～1.2mol/L，BSA浓度为2～3mg/mL。
在一个具体实施例中，所述室温反应是15～35℃反应20～30h。
在一个具体实施例中，偶联产物用PBS进行透析。
在一个具体实施例中，将F2-BSA与佐剂乳化，制备成油乳剂疫苗，用于免疫接种。
在一个具体实施例中，将F2-BSA免疫接种蛋鸡三次，收集第三次免疫一周后所产的鸡蛋。
在一个具体实施例中，采用浓盐水法提纯卵黄抗体。
在一个具体实施例中，所述浓盐水法是蛋黄与水搅拌均匀后，调整pH至5.0～5.5，-15℃以下预冻，融化后抽滤，在抽滤液体中加入1.2～1.8mol/L氯化钠，使之终浓度为8.5～9.0％，调整pH至4.0～4.5，室温沉淀，离心弃上清，PBS悬浮沉淀。
在一个具体实施例中，采用与制备F2-BSA同样的方法将F2毒素与卵清白蛋白OVA进行偶联，制备检测抗原F2-OVA，用于后续抗体滴度检测。
本发明所提供的抗F2卵黄抗体的制备方法能够产生活性高的特异性抗体，抗体吸附F2毒素的能力强，抗体效价高，产量大，方法简易，成本低，可替代现有的鼠源性单克隆抗体。所提供的偶联方法相对于其他方法要简便，无需对F2进行修饰。该方法利于F2快速反应检测体系的建立，在农产品及食品中对F2的监测具有积极的应用意义。同时可利用抗原抗体反应原理，用于F2毒素毒理机制的研究，及临床F2毒素中毒的防控。
附图说明
图1为F2-BSA偶联产物SDS-PAGE电泳图(1、F2-BSA；2、BSA；3、F2-OVA；4、OVA；M为marker)；
图2为F2-BSA偶联后紫外扫描光谱图；
图3为F2-OVA偶联后紫外扫描光谱图；
图4为抗F2卵黄抗体SDS-PAGE电泳图(1、2为抗F2卵黄抗体，M为marker)；
图5为F2毒素浓度评测标准曲线。
具体实施方式
本发明的抗F2卵黄抗体的制备工艺流程为：
1)抗原的制备：采用醛缩法，将F2毒素与牛血清白蛋白(BSA)及卵清白蛋白(OVA)进行偶联，制备免疫抗原(F2-BSA)及检测抗原(F2-OVA)；其中F2-OVA用于后续抗体滴度检测。
2)免疫产蛋鸡：将F2-BSA与佐剂乳化制备成疫苗，免疫产蛋鸡。
3)卵黄抗体提取：免疫3次后收集鸡蛋，提取纯化出高滴度的抗F2卵黄抗体。
抗F2卵黄抗体的纯度、滴度、特异性检测方法为SDS-PAGE、ELISA。
以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步解释说明。
本发明所述“室温”是指15-35℃，优选20-30℃，更优选20-25℃。
实施例1
本实施例为抗F2卵黄抗体的制备方法，具体步骤如下：
1、F2完全抗原的制备
1mg F2(美国Sigma公司)溶入1ml甲醇中，加入1ml 37％甲醛水溶液，混匀为A液；5mg BSA(或5mg OVA)溶于2ml 1mol/L醋酸钾溶液中，为B液；将F2溶液缓慢加入蛋白质溶液中，室温反应24h。
对偶联产物进行SDS-PAGE电泳及紫外分光光度扫描，结果见图1至图3，当蛋白偶联上一定数量的F2后，分子量会增大，在电泳图上会产生滞后现象；在紫外分光扫描下，偶联产物需既具备F2特征吸收峰又具备BSA/OVA吸收峰(F2吸收峰为314nm，BSA/OVA为278nm)，结果表明偶联成功。
然后偶联产物用0.01mol/L pH7.4PBS进行透析，透析72h后，离心，-20℃保存备用。
2、免疫产蛋鸡
①疫苗制备：将F2-BSA与佐剂(法国Seppic公司，MONTANIDETM ISA71VG)按质量比4:6混合乳化10min，制备成油乳剂疫苗，并加入体积浓度1％叠氮钠溶液使之终浓度为万分之一，摇匀备用。
②免疫接种：将上述所得疫苗，以腿部肌肉注射处于产蛋高峰期的20羽健康蛋鸡，首免剂量为150μg/羽，每隔三周加强免疫一次，共两次，剂量调整为100μg/羽，第三次免疫后一周开始收集鸡蛋；此后当抗体滴度低于104时加强免疫，剂量为100μg/羽。同时采用相同程序对相同数量的鸡接种PBS，作为阴性对照。
3、卵黄抗体提取
收集第三次免疫一周后所产的鸡蛋，用10％聚维酮碘浸泡20min对蛋壳进行消毒，待蛋壳表面干燥后，打蛋收集蛋黄；
采用浓盐水法提纯卵黄抗体，具体为：蛋黄与水按体积比1:7搅拌均匀后，调整pH至5.0，-20℃预冻72h，融化后采用布氏漏斗进行抽滤，在抽滤液体中加入1.5mol/L氯化钠，使之终浓度为8.8％，调整pH至4.0，室温沉淀2h，5000rpm离心20min，弃上清，PBS悬浮沉淀，即为抗F2卵黄抗体。冷冻干燥后将抗体干粉冻存。
实施例2
本实施例为实施例1得到的抗F2卵黄抗体的检测：
1、卵黄抗体纯度分析
取10μl实施例1中纯化的抗F2卵黄抗体，加入含有β巯基乙醇的蛋白电泳上样缓冲液，通过12％SDS-PAGE电泳检测其纯度；凝胶用考马斯亮蓝染色。结果：显示68kD和27kD两条主带，说明抗体纯度高(图3)。
2、卵黄抗体蛋白浓度测定
用Bradford蛋白浓度测定法测定实施例1中得到的抗F2卵黄抗体的浓度。结果：卵黄抗体含量为6mg/ml。
3、抗体滴度检测(间接酶联免疫实验ELISA)
将F2-OVA用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至2μg/ml，加100μl/孔到酶标反应板，4℃包被24h。将包被好的酶标板甩去孔内液体，加PBST洗涤液250μl/孔，重复洗涤2次，在吸水纸上拍干，加入含5％脱脂奶粉的PBST封闭液，250μl/孔，放入温箱内37℃封闭2h。重复洗涤步骤4次(下同)，洗涤后，用含5％脱脂奶粉的PBST将实施例1中得到的抗F2卵黄抗体进行不同倍数稀释(1:5000、1:10000、1:20000、1:40000)，l00μl/孔，37℃作用1h，洗涤后，每孔加入用PBST稀释好的酶标二抗(l:10000)100μl，37℃作用30min，洗涤后，加入底物50μl/孔，避光显色10min，加1mol/L的硫酸50μl/孔终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，每个样品每次平行做3孔，取平均值。判定标准：C＝AV阴性+3SD阴性，样品值大于C即判为阳性。结果见表1，由表可见本发明抗F2毒素卵黄抗体平均效价高达1:40000，表明用醛缩法制备的免疫抗原能够产生活性高的特异性抗体。
表1抗F2毒素IgY效价的检测结果
4、抗体特异性评估
将F2毒素与卵黄抗体进行互作，然后评估F2毒素的含量，通过评测毒素含量判定抗体的有效吸附性能。
将F2毒素标准液(5mg/ml，美国Sigma公司)稀释至1000ppb，取50μl毒素标准液，加入50μl实施例1中提取的IgY，对照为50μl毒素标准液，加50μlPBS，在25℃互作1h，然后采用Romer公司提供的检测F2毒素试剂盒(AgraQuant Zearalenone Test Kit)检测F2浓度，毒素标准曲线见图5，检测结果见表2，从表中可看出，与IgY互作后，样品中毒素浓度大大下降，下降94.26％，表明抗体的特异性非常好，可为临床饲料或食品中用于毒素防控提供参考。
表2 F2毒素与IgY互作后浓度评测
结合上述实验结果，本发明方法与碳二亚胺法相比，优势有：
1)采用醛缩法制备抗原产生的抗体效价高，F2毒素卵黄抗体平均效价高达1:40000，表明用醛缩法制备的免疫抗原能够产生活性高的特异性抗体；
2)所产生的抗体吸附F2毒素的能力强，样品中毒素浓度大大下降，下降94.26％，表明抗体的特异性非常好，可为临床饲料或食品中用于毒素防控；
3)蛋黄中抗体水平高而且稳定，持续监测抗体水平，两个月不免疫都能保持较高的的抗体水平，抗体效价达到1:40000。

Claims (10)

1.一种抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括：
将含有F2毒素和甲醛的溶液加入到含有牛血清白蛋白BSA、pH为7.5～8.0的溶液中，在室温反应，使F2与BSA偶联，制备免疫抗原F2-BSA；
将制备的F2-BSA对蛋鸡免疫接种，然后收集鸡蛋；
从鸡蛋中提取纯化抗F2卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于将含有F2毒素和甲醛的甲醇溶液滴加到含有BSA的醋酸钾溶液中，室温反应。
3.根据权利要求2所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于含有F2毒素和甲醛的甲醇溶液采用F2、甲醇和甲醛水溶液配成，甲醇与甲醛水溶液体积比0.8～1.2:1，配成后F2浓度为0.4～0.6mg/mL；醋酸钾溶液浓度0.8～1.2mol/L，BSA浓度为2～3mg/mL。
4.根据权利要求1～3之一所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述室温反应是15～35℃反应20～30h。
5.根据权利要求1～3之一所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于偶联产物用PBS进行透析。
6.根据权利要求1～3之一所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于将F2-BSA与佐剂乳化，制备成油乳剂疫苗，用于免疫接种。
7.根据权利要求1～3之一所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于将F2-BSA免疫接种蛋鸡三次，收集第三次免疫一周后所产的鸡蛋。
8.根据权利要求1～3之一所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于采用浓盐水法提纯卵黄抗体。
9.根据权利要求8所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述浓盐水法是蛋黄与水搅拌均匀后，调整pH至5.0～5.5，-15℃以下预冻，融化后抽滤，在抽滤液体中加入1.2～1.8mol/L氯化钠，使之终浓度为8.5～9.0％，调整pH至4.0～4.5，室温沉淀，离心弃上清，PBS悬浮沉淀。
10.根据权利要求1～3之一所述的抗F2卵黄抗体的制备方法，其特征在于采用与制备F2-BSA同样的方法将F2毒素与卵清白蛋白OVA进行偶联，制备检测抗原F2-OVA，用于后续抗体滴度检测。
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