CN105497889A - 一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下工艺步骤：1）灭活病毒悬液制备；？2）鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备，将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成禽流感复合灭活疫苗。本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

Description

一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法。
背景技术
新城疫和禽流感是当今全球范围内最流行的家禽传染病，也是我国所有鸡病中危害最大的两种疾病。二联疫苗的制备，可以一针防治两种传染病，同时可以解决使用多种疫苗分次免疫，造成的鸡群的其它的不良反应，简化免疫程序，降低投入的成本。当前国内生产的新城疫、禽流感二联灭活疫苗基本都是采用鸡胚接种病毒后进行增殖，收获尿囊液制备而成。传统的二联疫苗均由单一疫苗分别生产后混合在一起制成二联疫苗，该工艺费时费力，生产成本较高。同胚培养是近年来兽用生物制品行业提出的生产工艺，即将两种病毒以合适的比例混合后同时接种到鸡胚中进行增殖，该工艺减少了生产工艺环节，缩短的生产周期，减少人力物力投入，大大降低了生产成本。但是截至到目前为止同胚培养的工艺仍存在缺陷，特别是鸡新城疫、禽流感的同胚培养，培养过程中由于病毒之间的互相干扰，两种病毒的含量均不稳定，批次间差异较大，困扰着该品种的生产，严重影响了后期疫苗的品质。
水包油包水乳化佐剂具有铝胶佐剂、水包油佐剂和油包水佐剂的特点，与油包水乳化佐剂相比，其制备疫苗所需要的抗原浓度大大降低，另外因其具有水包油佐剂的特性，使得其可以添加水溶性的免疫增强剂、中药多糖和镇痛剂（维生素），在疫苗免疫机体时可以缓解疼痛，减少动物应激，同时免疫增强剂、中药多糖还具有提高免疫效果，预防疾病等功能。
维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。
黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。
法氏囊素(bursin，BS)是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursaoffabricius)中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。
卵黄抗体（IgY）分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。卵黄抗体作为一种具有生物学活性的免疫球蛋白，在生产，加工，储存以及摄食及消化过程中，保持抗体的活性是关键的。多项实验表明鸡IgY具有良好的稳定性、耐酸、耐热。IgY在室温中保存6个月，其中和病毒能力无明显改变。李春晖等(2002)研究了胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响。结果表明IgY经胃蛋白酶酶解24h后仍保持中和抗原的作用，其酶解片段也具有抗体活性。卵黄抗体在生产上还具有无可比拟的优越性。首先，产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。其次，收集鸡蛋方便，无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则。欧洲替代方法验证中心(ECVAM)建议以IgY代替哺乳动物IgG作为实验和生产抗体的来源。第三，每个蛋大约含100mg以上的IgY，一个月可达3g相当于兔子的10-20倍；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯。第四，由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4℃条件下6个月，IgY活性损失很小。所以可待蛋收集到一定量时再进行大规模地提纯IgY。
本发明基于上述技术背景，提出一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，该疫苗由鸡新城疫、禽流感灭活抗原，加适量含免疫增强剂制成，剂型为水包油包水型。通过该方法制备的复合灭活疫苗，因其拥有水包油，油包水两种特性，使得水溶性的重要黄酮、法氏囊素、卵黄抗体等免疫增强剂与镇痛剂易于溶解，利于动物机体吸收，免疫时可降低动物应激，减少动物痛苦，可提高动物福利；同时免疫增强剂可大大提高灭活疫苗的细胞免疫，产生较高的中和抗体，大幅提高保护率。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法的技术方案，采用本方法制备疫苗，其特点是所制备的病毒滴度高，所制备的疫苗批间差异小，产品质量稳定高效，副反应小，可全面提高疫苗质量。
所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）灭活病毒悬液制备
采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液；
2）鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备
将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成禽流感复合灭活疫苗。
所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中每份免疫增强剂含有中药黄酮5～30g、法氏囊素8～16mg、维生素组合2～5g、亚硒酸钠2～10mg和卵黄抗体5～16g，优选为中药黄酮10～20g、法氏囊素10～14mg、维生素组合3～4g、亚硒酸钠4～6mg和卵黄抗体8～14g。
所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素组合中含有：维生素B215～35%、维生素B320～50%和维生素D20～50%，优选为维生素B220～30%、维生素B330～40%和维生素D35～45%。
所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药黄酮通过以下步骤制得：
a、按生地黄10～30份，白头翁10～30份，金银花20～40份，半枝莲10～20份，马齿苋10～30份，凤尾草20～30份，生甘草10～30份，地耳草10～20份和芦根10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。
所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的卵黄抗体采用鸡新城疫、禽流感二联高效浓缩灭活疫苗免疫蛋鸡，分离卵黄，酸化提取后经真空冷冻干燥制得。
所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤a中按生地黄16～26份，白头翁14～28份，金银花32～38份，半枝莲14～16份，马齿苋12～22份，凤尾草24～28份，生甘草15～25份，地耳草12～18份和芦根15～25份称取各中药原料。
本发明中桑米特家畜水包油包水佐剂由珠海国年生物科技有限公司生产销售。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用了新的疫苗佐剂，所制备的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、卵黄抗体等共同作用的优点。
2.本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1中药黄酮的制备
a、按生地黄16份，白头翁14份，金银花32份，半枝莲14份，马齿苋12份，凤尾草24份，生甘草15份，地耳草12份，芦根15份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
该实施例1中也可以按生地黄10份，白头翁10份，金银花20份，半枝莲10份，马齿苋10份，凤尾草20份，生甘草10份，地耳草10份，芦根10份称取各中药原料；或按生地黄30份，白头翁30份，金银花40份，半枝莲20份，马齿苋30份，凤尾草30份，生甘草30份，地耳草20份，芦根30份称取各中药原料。
实施例2法氏囊素的制备
a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净。
b、称量法氏囊重量，按1：1（W：V）比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。
c、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。
d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。
e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到法氏囊素。
实施例3鸡新城疫、禽流感二联卵黄抗体的制备
a、用鸡新城疫、禽流感二联高效浓缩灭活疫苗免疫健康蛋鸡。免疫程序为首次胸部肌肉免疫0.5ml/只；首免一周后进行二次免疫，胸部肌肉免疫1.0ml/只；二次免疫后两周进行三次免疫，胸部肌肉免疫1.0ml/只。
b、三次免疫后两周开始监测高免蛋抗体效价，当高免蛋中鸡新城疫、禽流感病毒卵黄抗体琼脂扩散效价达1:128时，采集合格高免蛋。
c、卵黄分离：将b中采集的无破损高免蛋用0.1%新洁尔灭清洗消毒，破壳分离卵黄，收集卵黄于卵黄储罐中，搅拌混匀。
d、酸化水提：按1:11将纯化水加至酸化提取罐中，将c中卵黄注入酸化提取罐中，搅拌均匀，测定卵黄稀释液pH，用1M稀盐酸或1M氢氧化钠调节pH至6.0，4℃静止孵育24小时。
e、浓缩超滤：吸取d中上清，经连续流离心机10000rpm离心，离心后上清经30kd密理博超滤浓缩装置进行60-80倍浓缩。
f、将e中卵黄抗体浓缩液经冷冻真空干燥制成卵黄抗体冻干粉。
实施例4免疫增强剂制备
称取中药黄酮5g、维生素组合3g（其中维生素B20.9g，维生素B31.2g，维生素D0.9g）、法氏囊素10mg、亚硒酸钠5mg、卵黄抗体6g；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药黄酮按照实施例1的步骤制得，法氏囊素按照实施例2的步骤制得、卵黄抗体按照实施例3的步骤制得。
实施例5免疫增强剂制备
称取中药黄酮15g、维生素组合4g（其中维生素B20.8g，维生素B31.2g，维生素D2g）、法氏囊素12mg、亚硒酸钠6mg、卵黄抗体10g；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药黄酮按照实施例1的步骤制得，法氏囊素按照实施例2的步骤制得、卵黄抗体按照实施例3的步骤制得。
实施例6免疫增强剂制备
称取中药黄酮30g、维生素组合5g（其中维生素B21.5g，维生素B32.0g，维生素D1.5g）、法氏囊素16mg、亚硒酸钠10mg、卵黄抗体16g；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药黄酮按照实施例1的步骤制得，法氏囊素按照实施例2的步骤制得、卵黄抗体按照实施例3的步骤制得。
实施例7一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法
a、灭活病毒悬液制备
采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液；该鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释为每1000ml磷酸缓冲液中含有：天冬氨酸0.9g、脯氨酸0.9g、谷氨酰胺1.2g、维生素B11.5g、维生素B31.75g、维生素B71.75g、复方中药多糖40g（由金银花20份，半枝莲20份、桑叶10份、牵牛子10份和丹参30份经常规水提、过滤、杀菌和冷冻干燥制得）、亚硒酸钠4mg，该稀释液pH为7.0；或采用市售的鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液。
b、无菌条件下，将鸡新城疫、禽流感二联病毒灭活后抗原液按每1000ml加入实施例4、5或6中制备的免疫增强剂1或2份，混合均匀，使免疫增强剂完全溶解。
c、将3份量的含免疫增强剂的鸡新城疫、禽流感二联病毒灭活后抗原液加入乳化器中，调节乳化器转子转速为1500rpm，将2份量的桑米特水油水佐剂缓缓加入搅拌中的抗原液。
d、当油相加完时，调节转子转速为3000rpm，继续搅拌3-5分钟。
e、乳化完全后，将乳化后疫苗无菌分装制成鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗。
f、成品检验
（1）检验结果
按照《中华人民共和国兽药典》（2010版）相关要求对成品进行相关检验，检验结果见表1：
表1成品检验结果
（2）疫苗免疫效果比较
取100只1月龄SPF鸡，分为两组，实验组和对照组。实验组免疫本发明复合灭活疫苗，对照组免疫不添加复合免疫增强剂的普通灭活疫苗，免疫后3天起采血检测其HI抗体效价。

Claims (7)

1.一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）灭活病毒悬液制备
采用鸡新城疫、禽流感特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液；
2）鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备
将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成禽流感复合灭活疫苗。
2.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中每份免疫增强剂含有中药黄酮5～30g、法氏囊素8～16mg、维生素组合2～5g、亚硒酸钠2～10mg和卵黄抗体5～16g，优选为中药黄酮10～20g、法氏囊素10～14mg、维生素组合3～4g、亚硒酸钠4～6mg和卵黄抗体8～14g。
3.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素组合中含有：维生素B215～35%、维生素B320～50%和维生素D20～50%，优选为维生素B220～30%、维生素B330～40%和维生素D35～45%。
4.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药黄酮通过以下步骤制得：
a、按生地黄10～30份，白头翁10～30份，金银花20～40份，半枝莲10～20份，马齿苋10～30份，凤尾草20～30份，生甘草10～30份，地耳草10～20份和芦根10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
5.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。
6.如权利要求2所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的卵黄抗体采用鸡新城疫、禽流感二联高效浓缩灭活疫苗免疫蛋鸡，分离卵黄，酸化提取后经真空冷冻干燥制得。
7.如权利要求4所述的一种鸡新城疫、禽流感二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤a中按生地黄16～26份，白头翁14～28份，金银花32～38份，半枝莲14～16份，马齿苋12～22份，凤尾草24～28份，生甘草15～25份，地耳草12～18份和芦根15～25份称取各中药原料。
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