CN103495180B

CN103495180B - 一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂

Info

Publication number: CN103495180B
Application number: CN201310426405.7A
Authority: CN
Inventors: 李阳; 闫艳丽; 刘雪; 王二先; 徐晓艳; 盛璐丝
Original assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: CN103495180A

Abstract

一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，属于冻干保护剂技术领域。该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素6～10g、法氏囊素2～16mg、明胶4～6g和蔗糖40～70g，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：生地、怀牛膝、桑白皮、茯苓、芦根、淫羊藿、生甘草和问荆。该冻干保护剂能够大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂

技术领域

本发明属于冻干保护剂技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂。

背景技术

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道症状的疾病。PRRS难以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬细胞为靶细胞，具有抗体依赖性增强作用（ADE）造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不断的发生着变异，并且PRRS没有有效的治疗药物，免疫接种是目前控制该病的最主要措施。

猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗具有免疫效果好，免疫期长等优点，而且弱毒疫苗还可以用来对母猪免疫接种而使幼仔获得被动免疫。研究表明，活疫苗的使用在临床疾病的发生和严重性、病毒血症持续期和排毒等情况都有积极的影响。活疫苗的免疫可以引起细胞免疫，可抵抗病毒血症，防止病毒在肺部繁殖并引起呼吸系统和繁殖系统损害。但是，弱毒疫苗所引起体液免疫的能力低下，产生中和抗体的水平低下，影响了机体抵御病毒攻击的能力。活疫苗免疫后，PRRSV抗体约在免疫2周后出现，在免疫后四周时达到高峰，但这些抗体没有中和活性。通常情况下，PRRSV特异性中和抗体产生大约出现在免疫后四周时，并且其滴度在整个免疫期内都呈现较低的滴度。

近年来，人们针对活疫苗冻干保护剂进行了大量研究，多为耐热保护剂，解决了疫苗在运输使用过程中的耐热问题，但对于提高活疫苗效果方面几乎没有提升。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力，同时多糖也具有很好的耐热效果，多种实验表明中药多糖可作为耐热保护剂添加于活疫苗冻干保护剂中。

维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。

黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。

法氏囊素(bursin，BS) 是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursa of fabricius) 中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。

基于上述背景技术，本发明提出一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用冻干保护剂。该保护剂主要由中药多糖、中药黄酮、维生素、法氏囊素等组成。本发明所制备的冻干保护剂一方面可以提供给活疫苗耐热保护，另一方面在疫苗使用过程中大大提高了疫苗的使用效果，同时还兼具了提高机体免疫力的功效。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂的技术方案，该冻干保护剂能够大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素6～10g、法氏囊素2～16mg、明胶4～6g和蔗糖40～70g，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：生地、怀牛膝、桑白皮、茯苓、芦根、淫羊藿、生甘草和问荆。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖50～80g、中药黄酮30～50g、维生素7～9g、法氏囊素4～12mg、明胶5～6g和蔗糖50～60g。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

a、按生地10～30份、怀牛膝20～40份、桑白皮10～20份，茯苓10～30份、芦根10～30份，淫羊藿10～30份、生甘草10～20份、问荆10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后经冷冻真空干燥制成中药黄酮。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的维生素含有维生素B1 15～35%、维生素C 40～70%和维生素E 10～30%。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， pH7.2灭菌冷PBS洗净；按1：1比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥制得法氏囊素冻干粉。

上述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，设计合理，与传统的冻干保护剂相比其具有以下优点：

1.本发明所制备的冻干保护剂，具有耐热效果，可提高疫苗运输、储藏等便利性。

2.采用本发明冻干保护剂所制备的疫苗在免疫注射时可以减少猪只疼痛感，降低猪只的应激反应。

3. 采用本发明冻干保护剂制备疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的产生中和抗体，减少免疫空档期，降低猪只发病几率，提高机体抵御疾病的能力。

4.采用本发明冻干保护剂制备的疫苗免疫机体后，能促进机体B淋巴细胞前体的分化、增殖，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强，从而可提高机体免疫力。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：中药多糖和中药黄酮的制备

a、按生地20份、怀牛膝30份、桑白皮15份、茯苓20份、芦根20份、淫羊藿20份、生甘草15份、问荆20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

该实施例中步骤a中可以称取生地10份、怀牛膝20份、桑白皮10份，茯苓10份、芦根10份，淫羊藿10份、生甘草10份、问荆10份进行加工，也可以称取生地30份、怀牛膝40份、桑白皮20份，茯苓30份、芦根30份，淫羊藿30份、生甘草20份、问荆30份进行加工。

实施例2：法氏囊素的制备

a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， PH7.2灭菌冷PBS洗净。

b、称量法氏囊重量，按1：1（W：V）比例加入PH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。

c、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。

d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。

e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥制成法氏囊素冻干粉。

实施例3：一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖80g、中药黄酮50g、维生素8g（维生素B1 2g、维生素C 4g和维生素E 2g）、法氏囊素12mg、明胶5g和蔗糖50g，即得到猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例4：一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖30g、中药黄酮20g、维生素6g（维生素B1 0.9g、维生素C 4.2g和维生素E 0.9g）、法氏囊素2mg、明胶4g和蔗糖40g，即得到猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例5：一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖100g、中药黄酮60g、维生素10g（维生素B1 3.5g、维生素C 4g和维生素E 2.5g）、法氏囊素16mg、明胶6g和蔗糖70g，即得到猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例6：冻干保护剂的使用方法

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒悬液制备

（1）生产用毒种制备

将已长成单层的Marc-145细胞，弃去生长液，按生长液1%量接种病毒，37℃吸附1小时，加入细胞维持液，置37℃继续培养，40小时后开始观察，当细胞病变达到80%时，收获细胞培养物，置-20℃保存。

（2）制苗材料的选择：选择生长良好的Marc-145单层细胞。

（3）制苗用细胞毒液的繁殖

将已长成良好单层的Marc-145细胞，弃去生长液，用pH 值7.2-7.6的MEM维持液将生产用毒种稀释3-4倍，按生长液量的1%接种稀释后的病毒，37℃吸附1小时，加细胞维持液，置37℃继续旋转培养。接毒后，每天观察细胞病变情况，病变细胞达80%时，即可收获细胞培养物，反复冻融3次，置-20℃以下冻结保存。

2.疫苗制备

将无菌检验和病毒含量检测合格的细胞毒液，混合于同一灭菌容器内，按1:1（V:V）比例加入实施例3、4或5中制备的冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冷冻真空干燥制成猪繁殖与呼吸综合征冻干活疫苗（实验），每头份病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。

同时将将无菌检验和病毒含量检测合格的细胞毒液，混合于同一灭菌容器内，按1:1（V:V）比例加入蔗糖牛奶保护剂，充分混匀后定量分装，经冷冻真空干燥制成猪繁殖与呼吸综合征冻干活疫苗（对照），每头份病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀。

3.疫苗检验

（1）随保存时间，各项指标检验结果

将上述制备的两批疫苗放置常温（25℃）进行保存，病每隔一个月进行病毒含量检测，检测结果见表1：

表1 保存期检测结果（25℃）

（2）疫苗免疫效果

取10头蓝耳病抗体阴性健康仔猪，分为两组，实验组和对照组。实验组免疫含本发明冻干保护剂疫苗，对照组免疫含蔗糖牛奶冻干保护剂疫苗，免疫后3天起采血检测其中和抗体效价，结果见表2。

表2 免疫比较结果

Claims

1.一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素6～10g、法氏囊素2～16mg、明胶4～6g和蔗糖40～70g；

所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

a、按生地10～30份、怀牛膝20～40份、桑白皮10～20份，茯苓10～30份、芦根10～30份、淫羊藿10～30份、生甘草10～20份、问荆10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

2.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖50～80g、中药黄酮30～50g、维生素7～9g、法氏囊素4～12mg、明胶5～6g和蔗糖50～60g。

3.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的维生素含有维生素B1 15～35%、维生素C 40～70%和维生素E 10～30%。

4.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， pH7.2灭菌冷PBS洗净；按1：1比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥制得法氏囊素冻干粉。