CN102600469A - 一种猪瘟活疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪瘟活疫苗及其生产方法。该疫苗是在普通商品化猪瘟活疫苗中加入了适量的草分枝杆菌菌体，注射后通过提高宿主自身的免疫应答能力，并与猪瘟病毒兔化弱毒株抗原协同作用，达到增强疫苗免疫力的作用，安全可靠。由于草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，可应用于高效猪瘟活疫苗的生产中。本发明提高了猪瘟活疫苗的免疫效果，能够更加有效的预防猪瘟的发生，具有直接的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪瘟活疫苗，尤其是一种含有适量灭活草分枝杆菌菌体的猪瘟活疫苗。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病。该病唯一的自然宿主是猪，是危害养猪业最严重的传染病之一，死亡率能够达到90％以上(殷震，刘景华，动物病毒学(第一版)fMl，北京，科学出版社，1997，652-653)。
20世纪50年代，在各国研制出较为理想的灭活苗(Dalsgaard K，Overby E.Vaccination ofpigs against hog cholera(classical swine fever)with a detergent split vaccine[J].Acta VetScand.1976，17：465-474)的同时，我国学者周泰冲等研究的中国系(C系)猪瘟兔化弱毒疫苗、日本的细胞弱毒疫苗、和法国的Thiverval株等都获得成功并在猪瘟控制中起了得重要的作用。这三大品系疫苗的广泛应用，改变了全世界猪瘟防制的窘迫局面。
目前，国内普遍使用的猪瘟活疫苗是1954年培育出猪瘟病毒兔化弱毒株(Hog CholeraLapinized Virus，HCLV)制备而成的。该疫苗具有免疫力快、免疫谱宽、遗传稳定、无残毒、不引起胎儿畸变等优点。随着畜牧业的不断发展，对疫苗品质的要求也在不断提高，高效的猪瘟疫苗更是大势所趋。其中，使用免疫增强剂是一种常用的提高疫苗效力的方法。
草分枝杆菌是分枝杆菌中的一种，由于分枝杆菌胞壁酰二肽(MDP)具有很强的免疫治疗作用，草分枝杆菌多糖MPS在免疫调节、抑制病毒复制方面有很好的效果(周莉婷、赵晶晶等，分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展[J]，药物生物技术，2011，18(2)：176-179)，因而草分枝杆菌是一种优秀的免疫增强剂。草分枝杆菌可用于猪瘟活疫苗中，通过提高宿主自身的免疫应答能力来提增强疫苗免疫力，安全可靠。由于草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，便于临床大面积推广使用。
草分枝杆菌菌体在添加到猪瘟活疫苗半成品之前需要灭活。由于普通的甲醛灭活剂有残留的风险，能对猪瘟病毒产生影响，我们考虑使用β-丙内酯对草分枝杆菌菌体进行灭活。由于β-丙内酯水溶液半衰期短(10℃时仅为18hr，25℃时为3.5hr，50℃时为20min，75℃时为5min)，能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留，灭活的草分枝杆菌菌体中无灭活剂残留，能够有效保护猪瘟病毒的免疫原性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种更加高效的猪瘟活疫苗，从而在将猪瘟活疫苗的免疫水平提高到一个新的高度，更加有效的预防免疫猪群猪瘟的发生。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
将编号为CGMCC AS 4.1180的草分枝杆菌菌株，制备成草分枝杆菌菌体；
按常规方法用猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成兔源抗原后，按每头份疫苗中含0.01～0.1mg，优选量为0.06mg加入草分枝杆菌草分枝杆菌(CGMCC AS 4.1180菌株)菌体后，再经过混匀、冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(兔源)；
按常规方法用猪瘟病毒兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成细胞源抗原后，按每头份疫苗中含0.01～0.1mg，优选量为0.06mg加入草分枝杆菌菌体后，再经过混匀、冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(细胞源)。
具体实施方式
1.草分枝杆菌菌株来源
本发明涉及到的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4.1180菌株购于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国普通微生物保藏管理中心，编号：CGMCC AS 4.1180(中国微生物菌种保藏管理委员会，中国菌种目录，机械工业出版社，1992，p285)。
2.草分枝杆菌菌体的制备
(1)种子培养
将草分枝杆菌CGMCC AS 4.1180株置于种子罐中进行培养，37℃通气培养，pH值为7.0，培养时间为3～4天，得到发酵用种子液；
种子罐中的培养基配方：酵母提取粉1.0g～5.0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)2.0g～10.0g，葡萄糖5.0g～50g，磷酸氢二铵1.0g～4.0g，磷酸氢二钾0.5g～1.0g，注射用水加至1000ml。
(2)草分枝杆菌发酵培养
将配制好的液体培养基与所培养的种子液一起放入种子罐进行发酵培养，37℃通气培养，pH值为7.0，培养时间为5天；
发酵罐中培养基配方：酵母提取粉5.0g～10.0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)5.0g～20g，葡萄糖20g～100g，磷酸氢二铵1.0g～4.0g，磷酸氢二钾0.5g～1.0g，注射用水加至1000ml。
(3)后处理
将发酵液用的β-丙内酯(V/V终浓度为1/5000～1/3000，优选1/4000)灭活，4℃灭活24h，然后再于37℃水解2h，离心浓缩，弃去上清液，取下层菌体用适量生理盐水重悬浮3次，离心除去杂质，测定水分，计算干菌体重量，即得灭活的草分枝杆菌菌体。
3.猪瘟活疫苗的制备
本发明的猪瘟活疫苗用的毒种为猪瘟病毒兔化弱毒株，购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，编号为CVCC AV1412(中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，中国兽医菌种目录，第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p145)。
(1)半成品制备
工艺一：
1)生产用毒种的制备(兔源脾毒)
选择营养良好的家兔，将冻干的猪瘟兔化弱毒株毒种用灭菌生理盐水制成50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1ml。
选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀。无菌采取脾脏冷冻或冻干保存，作为生产用毒种。
2)制苗用病毒的制备
①将生产用毒种用无菌生理盐水稀释50倍后每兔耳静脉注射1ml。
②选定定型热和轻热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，无菌采取脾脏和淋巴结，得到高效猪瘟活疫苗半成品，立即配苗或迅速冻结保存后配苗。
工艺二：
1)生产用毒种的制备(细胞毒)
用细胞维持液将脾毒制成0.3％～0.5％的病毒悬液，接种生长良好的牛睾丸或羊肾单层细胞，置36～37℃继续培养。每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。
2)细胞的制备
①无菌采取牛睾丸，并去除被膜、附睾、肾盂、肾盏，将组织剪成1～2mm小块，用Hank’s液冲洗至上清液清亮。
②将组织块放入消化瓶中，加入5～8倍的0.25％胰酶溶液，37℃水浴消化。
③弃去胰酶溶液后，脱酶1～3次，再加入营养液，以玻璃珠振摇法分散细胞后，用纱布滤过，收取细胞悬液，分装于培养瓶中，置36～37℃进行旋转培养，转速为10～12r/h，3～5日长成单层。
④原代细胞长成单层后，以(1∶3)～(1∶5)制成次代细胞悬液，继续旋转培养至形成良好单层。
3)制苗毒液的制备
①取形成良好单层的牛睾丸次代细胞，弃去培养液，接种含3％～5％生产用细胞毒种，置36～37℃继续培养。
②接毒后5日做第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，得半成品，置于-15℃以下保存。
(2)配苗
按照每头份疫苗加入0.01～0.1mg(优选0.06mg)菌体的量，在猪瘟活疫苗半成品中加入草分枝杆菌菌体，并且按照比例加入5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂或其他冻干保护剂，搅拌均匀后分装，最后进行冷冻真空干燥，根据抗原的不同分别制成猪瘟活疫苗(兔源)和猪瘟活疫苗(细胞源)。
4.对比试验
(1)分别制备不添加草分枝杆菌菌体的猪瘟活疫苗(细胞源)、猪瘟活疫苗(兔源)和每头份添加0.06mg草分枝杆菌菌体的猪瘟活疫苗(细胞源)、猪瘟活疫苗(兔源)，备用。
(2)取四种猪瘟活疫苗，用生理盐水稀释成1头份/ml，分别肌肉注射无猪瘟中和抗体的猪20头。
(3)免疫后15日采集免疫猪血清，采用阻断ELISA方法检测猪瘟抗体水平。
(4)诊断试剂
猪瘟抗体ELISA试剂盒为法国LSI猪瘟抗体检测试剂盒，购自北京天之泰生物科技有限公司，生产批号为5-VETPPC-002。
(5)判定标准
阻断率(％)：≤30阴性；≤40而＞30为可疑；＞40为阳性。
(6)试验结果
对比试验结果表明，猪瘟活疫苗(每头份添加0.06mg草分枝杆菌菌体)免疫的试验猪，抗体水平明显高于猪瘟活疫苗(未添加草分枝杆菌菌体)。
本发明涉及的微生物菌种
本发明涉及到的草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4.1180菌株购于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国普通微生物保藏管理中心，编号：CGMCC AS 4.1180(中国微生物菌种保藏管理委员会，中国菌种目录，机械工业出版社，1992，p285)。
制备本发明的猪瘟活疫苗用的毒种为猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)兔化弱毒株，又称猪瘟病毒C株，购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，编号为CVCC AV1412(中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，中国兽医菌种目录，第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p145)。
本发明的优点
本发明提供一种猪瘟活疫苗，该疫苗是在猪瘟活疫苗中加入了适量的草分枝杆菌菌体，注射后通过提高宿主自身的免疫应答能力，并与猪瘟病毒兔化弱毒株抗原协同作用，达到提增强疫苗免疫力的作用，安全可靠。由于草分枝杆菌发酵方便、成本低廉，可应用于高效猪瘟活疫苗的生产中。本发明增加了猪瘟活疫苗的免疫效果，能够更加有效的预防猪瘟的发生，具有直接的经济效益和社会效益。
实施例
以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
——草分枝杆菌菌体制备
(1)种子培养
将草分枝杆菌CGMCC AS 4.1180置于种子罐中进行培养，37℃通气培养，pH值为7.0，培养时间为3天，得到发酵用种子液；
种子罐中的培养基配方：酵母提取粉3.0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)5.0g，葡萄糖7.0g，磷酸氢二铵3.0g，磷酸氢二钾0.8g，注射用水加至1000ml。
(2)草分枝杆菌发酵培养
将配制好的液体培养基与所培养的种子液一起放入种子罐进行发酵培养，37℃通气培养，pH值为7.0，培养时间为5天；
发酵罐中培养基配方：酵母提取粉8.0g，浓缩麦芽汁(购自济南双麦啤酒物资有限公司)8.0g，葡萄糖50.0g，磷酸氢二铵3.0g，磷酸氢二钾0.8g，注射用水加至1000ml。
(3)后处理
将发酵液用β-丙内酯(V/V终浓度1/4000)灭活，4℃灭活24h，然后再于37℃水解2h，离心浓缩，弃去上清液，取下层菌体用适量生理盐水重悬浮3次，离心除去杂质，测定水分，计算干菌体重量，即得灭活的草分枝杆菌菌体。
实施例2
——猪瘟活疫苗(兔源)
(1)半成品制备
1)生产用毒种的制备(脾毒)
选择营养良好的家兔，将冻干的猪瘟兔化弱毒株(CVCC AV1412)毒种用灭菌生理盐水制成50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1ml。
选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀。无菌采取脾脏冷冻或冻干保存，作为生产用毒种。
2)制苗用病毒的制备
①将生产用毒种用无菌生理盐水稀释50后每兔耳静脉注射1ml。
②选定定型热和轻热反应兔(见附录1)，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，无菌采取脾脏和淋巴结，得到高效猪瘟活疫苗半成品，立即配苗或迅速冻结保存后配苗。
(2)配苗
按照每头份疫苗加入0.01～0.1mg(优选0.06mg)菌体的量，在猪瘟活疫苗半成品中加入草分枝杆菌菌体，并且按照比例加入5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂或其它冻干保护剂，搅拌均匀后分装，最后进行冷冻真空干燥。
实施例3
——猪瘟活疫苗(细胞源)
(1)半成品制备
1)生产用毒种的制备(细胞毒)
用细胞维持液将脾毒制成0.3％～0.5％的病毒悬液，接种生长良好的牛睾丸或羊肾单层细胞，置36～37℃继续培养。每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。
2)细胞的制备(见附录2)
①无菌采取牛睾丸，并去除被膜、附睾、肾盂、肾盏，将组织剪成1～2mm小块，用Hank’s液冲洗至上清液清亮。
②将组织块放入消化瓶中，加入5～8倍的0.25％胰酶溶液，37℃水浴消化。
③弃去胰酶溶液后，脱酶1～3次，再加入营养液，以玻璃珠振摇法分散细胞后，用纱布滤过，收取细胞悬液，分装于培养瓶中，置36～37℃进行旋转培养，转速为10～12r/h，3～5日长成单层。
④原代细胞长成单层后，按(V/V)比1∶3～1∶5制成次代细胞悬液，继续旋转培养至形成良好单层。
3)制苗毒液的制备
①取形成良好单层的牛睾丸次代细胞，弃去培养液，接种含3％～5％生产用细胞毒种，置36～37℃继续培养。
②接毒后5日做第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，得半成品，置于-15℃以下保存。
(2)配苗
按照每头份疫苗按加入0.01～0.1mg(优选0.06mg)菌体的量，在猪瘟活疫苗半成品中加入草分枝杆菌菌体，并且按照比例加入5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂，利用均质机进行均质后分装，最后进行冷冻真空干燥。
附录
附录1猪瘟活疫苗生产用毒种CVCC AV1412株猪瘟病毒的制备
1向中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心申请购买猪瘟病毒兔化弱毒(CVCC AV1412)冻干毒种。
2家兔选择选用营养好，体重1.5～3kg健康家兔，购入家兔应隔离饲养30天以上，接种前应测温观察3天以上，每天上、下午各测温一次，选用温差不大，常温不超过40℃的健康家兔。
3接种将冻干毒用灭菌生理盐水做50倍稀释，每兔耳静脉注射1ml。
4测温观察接种后上、下午各测温一次，24小时后每6小时测温一次，填入体温记录表上划成曲线。
5热型判断
5.1定型热反应(++)：潜伏期24～48小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，至少3个温次，并稽留18～36小时。
5.2轻热反应(+)：潜伏期24～72小时，体温上升有一定曲线，超过常温0.5℃以上，至少2个温次，并稽留12～36小时。
5.3可疑反应(±)：潜伏期不超过24小时或超过72小时，体温曲线起伏不定，或稽留不到12小时或稽留超过36小时而不降。
5.4无反应(-)：体温正常，体温曲线平稳。
注：“常温”：家兔接种前所测体温的平均值。
“潜伏期”：由接种时算起至体温上升超过常温0.5℃以上的间隔时间。
“稽留期”：由体温上升超过常温0.5℃算起，到体温下降到常温或接近常温的间隔时间。
6毒种的收获选择定型热反应兔，从体温下降及其以后24小时内剖杀，以无菌操作采取脾脏冷冻(-15℃以下)，同时作无菌检验，并作好记录。
7毒种的复壮选择定型热反应的兔，在体温下降后的24小时内剖杀。以无菌操作取出脾脏，用灭菌生理盐水磨制30倍稀释悬液，即复壮一代悬液。取复壮一代悬液，每只家兔接种1ml，取定型热的兔脾脏作2代，如此反复。
8毒种的冻存取3代后定型热反应的兔脾脏，加灭菌生理盐水研磨，加入保护剂和抗生素，分装小瓶冻干，每瓶做好标记，写上组织量、代数、冻干日期，冷冻保存。
9细胞毒的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3～0.5％的病毒悬液，接种生长良好的牛睾丸细胞，置36～37℃继续培养。每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。
10毒种保存：-15℃以下保存，脾毒不超过25日，继代不超过5代；细胞毒不超过6个月，继代不超过3代。
11生产用毒种标准
11.1对细胞的感染性：将生产用毒种用乳汉液稀释或不稀释直接接种于生长良好的牛睾丸方瓶细胞中(接毒时需换液)，接完继续放入36～37℃温室静止培养(细胞面朝下)。观察7～10天，方瓶细胞不出现病变，则可判该毒种对细胞无感染性，否则，该毒种应废弃不用。
11.2对家兔的感染性：将需鉴定的生产毒种用灭菌生理盐水作50倍稀释，耳静脉接种健康成年家兔4只，每只1ml，接种后测温观察96小时，仅使家兔产生热反应，而不致死家兔，则表明该毒种合格，否则应废弃不用。
11.3病毒含量
11.3.1将待鉴定的毒种用生理盐水稀释105倍，取稀释的毒液接种健康敏感成年的家兔4只，每兔耳静脉注射1ml，接种后上、下午各测温一次，48h后每6小时测温一次，若4只兔全部有定型热反应，则该毒种合格，若4只兔中有轻热或无热反应、可疑反应时，可以向该兔攻毒。
11.3.2攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为50～100倍乳剂(脾毒)，每兔耳静脉注射1ml。
11.3.3攻毒时，对照组兔呈定型热反应(++)或1只呈(++)另一支为轻热反应(+)，而实验组中的兔均无热反应，则该毒种也判为合格。
11.3.4若对照组2只家兔均为(++)或(+)，而实验组的兔也有(+)或(++)，则该毒种不合格应废弃不用。
11.4安全性
11.4.1准备4头无猪瘟中和抗体的健康易感猪。猪前腔静脉采血，用检验用猪瘟毒种做中和试验。试验检测血清中无猪瘟抗体即可作安检。
11.4.2将待检毒种用灭菌的生理盐水稀释成10倍乳剂，接种无猪瘟中和抗体的健康易感猪4头，每头肌肉注射5ml，接种后每日上、下午各测温观察一次，观察21日，体温、精神、食欲均正常，则被检毒种安检合格，否则，为不合格弃之不用。
11.4.3特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释成为每毫升含有100个兔的最小感染量的病毒悬液即稀释到100×10-5＝10-3倍，与等量的抗猪病毒特异性血清充分混合，置10～15℃中和1小时，其间振摇2～3次，同时设立阳性参照(病毒对照)和阴性对照(生理盐水)，中和结束后，分别接种家兔2只，每兔耳静脉注射1ml，接种后上、下午各测温一次，48小时后，每6小时测温一次。除阳性对照组出现热反应外，试验组和阴性对照在接种120小时内不引起热反应，则证明该毒种特异性检验符合要求，否则弃之不用。
11.4.4纯净性：毒种应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
附录2牛睾丸细胞的制备
1牛睾丸的采集
1.1犊牛睾丸的来源非猪瘟疫区，无口蹄疫、牛腹泻粘膜病等传染病地区。将符合规定的犊牛采血完后，立即将牛体仰卧，两后肢分开固定好。
1.2用消毒液冲洗阴囊处。
1.3擦干后，用5％碘酒消毒(由里向外转圈消毒)。
1.45～10分钟后，用75％的酒精棉球脱碘。
1.5手紧固牛睾丸，用酒精棉球大火控制，无菌手术刀切下，立即挤入盛有汉克氏液的容器内
1.6工作结束后，将盛有牛睾丸的容器消毒后通过传递窗进入无菌室万级区备用。
2牛睾丸的处理：将采集来牛睾丸的容器用75％酒精棉球或70％乙丙醇擦拭瓶壁，彻底消毒后移入百级层流罩下的工作台上，倒出容器内的液体，用洗液将牛睾丸洗两遍，然后将牛睾丸移入平皿中。除去附属物，用手术剪剪成1～2mm小块。然后用含400单位/ml双抗的汉克氏液反复冲洗至上清液清亮为止。
3消化：将以上沉淀好的组织倒入消化瓶中(无菌操作)，加入50倍左右的0.25％的胰酶，放37℃水浴消化25～30min，中间隔10分钟轻摇一次。消化完毕后取出。
4分散细胞：将消化好的组织块弃去上清液，加入适量洗液冲洗组织块，静止后弃去上清液，如此冲洗两次。用吸管轻轻吹打组织块5～6下，加入乳汉液，将上清液经4层纱布漏斗过滤，滤到收集瓶中，再用吸管用力吹打组织块10～15下，加入乳汉液，将上清液经4层纱布漏斗过滤，滤到收集瓶中。如此反复吹打，根据牛睾丸的重量决定吹打的次数，一般平均每1～1.2g牛睾丸吹打一次即做一个转瓶。
5分装转瓶：将收集瓶内的滤过液加乳汉液稀释，使细胞含量为80～100万细胞/ml。将细胞悬液中加入小牛血清(含量为细胞悬液的10％)、双抗(200u/ml)、7.5％的NaHCO3溶液(调pH值为7.0～7.2)，摇匀后，取样做无检和中间检测，分装到细胞培养瓶内，加上胶塞，包扎好，移入36～37℃的温室内，放到9～11r/h的转瓶培养机上转动培养(48小时后才可取下转瓶观察)。
6单层细胞培养与观察：细胞上转瓶后，48小时内严禁人工转动。48小时后，可抽样观察细胞生长情况。72～96小时，逐瓶观察细胞生长情况并做好记录，判断细胞生长情况。
“-”细胞不贴壁不生长；
“+”细胞贴壁伸展，呈稀疏孤立的岛状，覆盖面仅占瓶壁的25％以上者；
“++”细胞繁殖分裂成岛状，覆盖面占瓶壁的50％以上者；
“+++”细胞覆盖瓶壁占75％以上者；
“++++”细胞覆盖整个瓶壁，并成致密单层。
Claims (4)
1.一种猪瘟活疫苗，其特征是该疫苗含有猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)和灭活的草分枝杆菌菌体。
2.一种如权利要求1所述一种猪瘟活疫苗，其特征在于其中灭活的草分枝杆菌菌体是利用草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4.1180菌株发酵培养后，使用β-丙内酯进行灭活的产物。
3.一种制备权利要求1所述的猪瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常规方法用猪瘟病毒(Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成兔源抗原后，按每头份疫苗中含0.01～0.1mg，优选量为0.06mg加入灭活的草分枝杆菌菌体，再经过混匀、冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(兔源)。
4.一种权利要求1所述的猪瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常规方法用猪瘟病毒(Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制备成细胞源抗原后，按每头份疫苗中含0.01～0.1mg，优选量为0.06mg加入灭活的草分枝杆菌菌体后，再经过冻干等步骤，制成猪瘟活疫苗(细胞源)。
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2012
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