CN103585626B - 一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括鸡新城疫抗原液制备；鸡传染性法氏囊病抗原液制备；鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备。本发明的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、中药多糖、镇痛剂等共同作用的优点；本发明大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力；本发明解决使用多种疫苗分次免疫造成鸡群不良反应，简化免疫程序，降低投入成本；本发明所制备的疫苗适用于全年龄段鸡，免疫1日龄雏鸡可避免活苗免疫受母源抗干扰导致的免疫失败或因毒力过强引起的免疫抑制，使用安全有效。

Description

一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND) 是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 引起的一种烈性病毒性传染病，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，也是我国所有鸡病中危害最大的一种，被国际兽医局(OIE) 列为A 类传染病。目前，新城疫在我国全国范围内发病仍然比较普遍，它制约着我国养禽业的发展及禽产品的出口，也对食品安全及人类健康存在潜在的危害。对于该病的控制，在发达国家以捕杀强毒感染群为主，同时结合疫苗接种；而对于广大发展中国家，疫苗接种仍是控制该病的主要手段。随着我国养禽业的迅猛发展，对新城疫的防治越来越重要。

鸡传染性法氏囊病(Infection bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infection bursal disease virus，IBDV) 引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，主要感染3～12周龄的青年鸡，该病毒主要在法氏囊的淋巴细胞内增殖，并且对其它免疫器官造成不同程度的损伤，最终导致鸡的法氏囊萎缩而引起鸡的免疫抑制。本病在临床上可以导致体重减轻、生长缓慢和骨骼肌出血等症状，小于3周龄的鸡则不会表现出明显的临床特征。但是，在亚临床感染的鸡法氏囊上也会有一些镜检病理变化和免疫抑制现象，给养鸡业带来了巨大的经济损失。本病可以导致鸡本身对其他疾病的抵抗力减弱，并且干扰如新城疫、马立克氏病和传染性支气管炎等病的疫苗的免疫效果。目前，IBDV疫苗的种类主要包括活疫苗、灭活疫苗、抗原抗体复合物疫苗、基因工程疫苗等。根据国内外活疫苗的临床使用情况来看，活疫苗虽然可以起到一部分保护作用，但是存在自身法氏囊萎缩的情况，从而导致自身免疫系统的紊乱，另外基因工程疫苗、抗原抗体复合物疫苗同样存在保护率偏低的情况。灭活疫苗免疫鸡只后可以产生较高的抗体，能够有效的保护机体，但是目前国内的法氏囊灭活疫因其免疫效果差或生产成本高，没有得到广泛推广，各大种鸡场使用的大多还是价格昂贵的进口疫苗。新城疫、鸡传染性法氏囊病是造成雏鸡高死亡率的两种重大传染病，严重制约着养鸡业的健康成长。做好这两种疾病的防疫工作，特别是1日龄雏鸡的防疫工作，是保证养鸡业健康发展的前提。因此，开发一种即能用于成鸡又能用于雏鸡免疫预防这两种疾病的安全、有效的疫苗已刻不容缓。针对养鸡业上述问题，本项目的提出可以解决养鸡业中成鸡与雏鸡新城疫、传染性法氏囊病的免疫预防难题，降低行业内疾病的流行，增加出栏率，为我国的养鸡业保驾护航。

水包油包水乳化佐剂具有铝胶佐剂、水包油佐剂和油包水佐剂的特点，与油包水乳化佐剂相比，其制备疫苗所需要的抗原浓度大大降低，另外因其具有水包油佐剂的特性，使得其可以添加水溶性的免疫增强剂、中药多糖和镇痛剂（维生素），在疫苗免疫机体时可以缓解疼痛，减少动物应激，同时免疫增强剂、中药多糖还具有提高免疫效果，预防疾病等功能。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。

维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。

黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。

法氏囊素(bursin，BS) 是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursa of fabricius) 中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。

本发明基于上述技术背景，提出一种鸡传染性法氏囊、鸡传染性法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，该疫苗主要由鸡传染性法氏囊、鸡新城疫灭活抗原，加适量含免疫增强剂制成，剂型为水包油包水型。通过该方法制备的复合灭活疫苗，因其拥有水包油，油包水两种特性，使得水溶性的维生素、中药多糖、法氏囊素、中药黄酮等免疫增强剂与镇痛剂易于溶解，利于动物机体吸收，免疫时可降低动物应激，减少动物痛苦，可提高动物福利；同时免疫增强剂可大大提高活疫苗的体液免疫，产生较高的中和抗体，大幅提高保护率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法的技术方案。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）鸡新城疫抗原液制备；

2）鸡传染性法氏囊病抗原液制备；

3）鸡新城疫、传染性法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备：

将步骤1）得到的鸡新城疫抗原液与步骤2）得到的鸡传染性法氏囊病抗原液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，将两种灭活抗原液按体积比1:1混合均匀，得到抗原混合液，在每1000ml抗原混合液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比6:4进行乳化分装制成鸡新城疫、传染性法氏囊病二联复合灭活疫苗。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中鸡新城疫抗原液制备包括以下步骤：

（1）种细胞的传代与培养：鸡胚传代细胞系DF-1细胞系经胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞适应毒种的繁殖：取细胞适应的新城疫病毒La Sota株毒种，接种于步骤（1）中已长成单层的鸡胚传代细胞中，置37～38℃继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；

（3）制苗用细胞的大规模培养：将步骤（1）培养得到的种细胞悬浮液接种至转瓶或细胞工厂中，加入细胞生长液置37～38℃进行培养；

（4）制苗用毒液的制备：取步骤（3）中已形成良好单层的鸡胚传代细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种步骤（2）得到的新城疫细胞适应毒病毒悬液，吸附后加入维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存，得到鸡新城疫抗原液。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中鸡传染性法氏囊病抗原液制备包括以下步骤：

（1）制苗用细胞的传代与培养：取鸡胚成纤维传代细胞系DF-1细胞系经胰酶细胞分散液消化传代，在培养瓶中以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞毒种的繁殖：取生产用传染性法氏囊病毒HQ株，按维持液体积量的1%接种于已长成良好单层的鸡胚成纤维传代细胞中，置37～38℃在维持液中继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；

（3）制苗用毒液的繁殖：取步骤1）中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种步骤2）得到的含1%法氏囊细胞适应毒HQ株的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存，得到鸡传染性法氏囊病抗原液。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中每份免疫增强剂含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素6～10g和法氏囊素2～16mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：牛膝、茯苓、穿心莲、黄芪、板蓝根、生地、当归、甘草和大黄。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.2～7.4，DO为30%～60%，含糖4.0g/L；所述的维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH为7.4～7.6，DO为30%～50%，含糖4.0g/L。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素中含有维生素B2 15～35%、维生素C 20～40%、维生素D3 10～30%和维生素E 10～30%。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药组合物由以下重量份的原料组成：牛膝10～30份、茯苓10～20份、穿心莲20～30份、黄芪20～40份、板蓝根10～30份、生地10～30份、当归10～30份、甘草10～20份和大黄10～30份。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

a、按牛膝10～30份，茯苓10～20份，穿心莲20～30份，黄芪20～40份，板蓝根10～30份，生地10～30份，当归10～30份，甘草10～20份，大黄10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即得粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：

将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。

本发明中新城疫病毒La Sota株毒种购自中国兽医药品监察所，传染性法氏囊病毒HQ株为现有病毒，已于2011 年6 月13 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，病毒的保藏编号为CGMCC NO.4935，现可在河南农业大学禽病研究所购得，桑米特家畜水包油包水佐剂由珠海国年生物科技有限公司生产销售。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明采用了新的疫苗佐剂，所制备的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、中药多糖、镇痛剂等共同作用的优点。

2.本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

3.本发明采用了联苗技术，一针可防治两种传染病，解决使用多种疫苗分次免疫造成鸡群的不良反应，简化免疫程序，降低投入成本。

4. 本发明所制备的疫苗适用于全年龄段鸡，免疫1日龄雏鸡可避免活苗免疫受母源抗干扰导致的免疫失败或因毒力过强引起的免疫抑制，使用安全有效。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：用DF-1细胞系培养鸡传染性法氏囊病毒制备鸡传染性法氏囊病抗原液

（1）制苗用细胞的传代与培养：取鸡胚成纤维传代细胞系DF-1细胞系经胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞毒种的繁殖：取生产用传染性法氏囊病毒HQ株毒种，按维持液体积量的1%接种于已长成良好单层的鸡胚成纤维传代细胞中，置37～38℃在维持液中继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；

（3）制苗用毒液的繁殖：取步骤（1）中已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种步骤（2）得到的含1%法氏囊细胞适应毒HQ株的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存。

所述的细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.2～7.4，DO为30%～60%，含糖4.0g/L；所述的维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH为7.4～7.6，DO为30%～50%，含糖4.0g/L。

实施例2用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养制备鸡新城疫抗原液

（1）生物反应器的选择：激流式反应器AP-20，体积为7L。

（2）细胞的选择：鸡胚传代细胞系DF-1，适合鸡新城疫病毒生长的传代细胞系，无致癌性，购于美国菌种保藏中心；

（3）病毒毒株的选择：选用鸡新城疫病毒La sota株，可在中国兽医药品监察所购得。

（4）种细胞的培养：利用方瓶进行DF-1细胞的培养，一般按1:3～1:5传代，待细胞长满单层后消化、计数，用于细胞的大规模培养。

（5）细胞适应毒种的繁殖：取细胞适应的新城疫病毒毒种，接种于步骤（4）中已长成单层的鸡胚传代细胞DF-1中，置37～38℃继续培养，细胞病变率达75%以上时收获病毒悬液。

（6）繁殖病毒用细胞的悬浮培养：首先准备生物反应器：检漏激流袋和灌注袋；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌；组装生物反应器，注入细胞生长液，循环24小时进行系统的无菌检验。验证合格后，步骤（4）培养得到的细胞悬浮液经酶消化后接种反应器进行悬浮培养，悬浮培养条件为：温度37～38℃，pH7.0～7.6，溶解氧30%～60%，接种量为4～8×109个细胞。每天监测培养液中葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗。控制培养液中含糖量，当残糖低于1g/L时，全部换液一次。

（7）所述步骤（6）细胞生长液含90% DMEM/F12、10%胎牛血清，细胞生长液的pH为7.2～7.4，DO为30%～60%，含糖4.0g/L。

（8）病毒的培养与收获：当细胞的葡萄糖消耗量最大时，视为细胞长至最大密度，按0.5%新城疫细胞适应病毒悬液接种，换用维持液进行培养，培养条件为温度37～38℃，pH7.4～7.6，溶解氧30%～50%。种毒在灌注袋中的细胞上吸附1h后开始循环。培养12h开始取样，每2h取一次样，测定葡萄糖消耗和病毒滴度，并及时补充培养基和葡萄糖。当糖耗为0时，视细胞绝大多数已病变，收获病毒，冻融灌注袋内细胞2次（裂解细胞），测定病毒毒价，得到鸡新城疫抗原液。

（9）所述步骤（8）中的细胞维持液含98% DMEM/F12、2%胎牛血清，维持液的pH为7.4～7.6，DO为30%～50%，含糖4.0g/L。

实施例3 中药多糖和中药黄酮的制备

a、按牛膝20份，茯苓15份，穿心莲25份，黄芪30份，板蓝根20份，生地20份，当归20份，甘草15份，大黄20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即得粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

该实施例步骤1）中也可以按牛膝10份，茯苓10份，穿心莲20份，黄芪20份，板蓝根10份，生地10份，当归10份，甘草10份，大黄10份称取各中药原料，或按牛膝30份，茯苓20份，穿心莲30份，黄芪40份，板蓝根30份，生地30份，当归30份，甘草30份，大黄30份称取各中药原料。

实施例4：法氏囊素的制备

a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净。

b、称量法氏囊重量，按1：1（W：V）比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。

c、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。

d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。

e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到法氏囊素。

实施例5：免疫增强剂制备

称取中药多糖60g、中药黄酮50g、维生素组合10g（其中维生B2 2.4g、维生素C 3.2g、维生素D3 1.8g和维生素E 2.6g）、法氏囊素14mg；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例3的步骤制得，法氏囊素按照实施例4的步骤制得。

该实施例中也可以按照中药多糖30g、中药黄酮60g、维生素组合8g（其中维生B2 1.2g、维生素C 3.2g、维生素D3 2.4g和维生素E 1.2g）、法氏囊素2mg称取各原料，或按照中药多糖100g、中药黄酮20g、维生素组合7g（其中维生B2 3.1g、维生素C 1.2g、维生素D3 1.8g和维生素E 0.9g）、法氏囊素16mg称取各原料。

实施例6：一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备

a、无菌条件下，将实施例2制得的鸡新城疫灭活后抗原液与实施例1制得的鸡传染性法氏囊灭活后看原液按1:1混合均匀，取混合后抗原按每1000ml加入实施例5中制备的免疫增强剂1或2份，混合均匀，使免疫增强剂完全溶解。

b、将6份量的含免疫增强剂的混合后的鸡新城疫、鸡传染性法氏囊灭活抗原液加入乳化器中，调节乳化器转子转速为1500rpm，将4份量的桑米特水油水佐剂缓缓加入搅拌中的抗原液。

c、当油相加完时，调节转子转速为3000rpm，继续搅拌3-5分钟。

d、乳化完全后，将乳化后疫苗无菌分装制成鸡新城疫、传染性法氏囊病二联复合灭活疫苗。

f、成品检验

按照《中华人民共和国兽药典》（2010版）相关要求对成品进行相关检验，检验结果见表1：

表1 成品检验结果

试验例1 鸡新城疫、传染性法氏囊病二联复合灭活疫苗的免疫效果

1 材料与方法

1.1 试验用疫苗

按实施例6制备三批（XF001、XF002、XF003）鸡新城疫、法氏囊二联复合灭活疫苗。

1.2 试验用鸡

1日龄SPF雏鸡80只，7日龄SPF雏鸡80只，各组分别于1、7日龄免疫鸡新城疫、法氏囊二联复合灭活疫苗1羽份（0.2ml），均肌肉注射。整个实验过程均在负压隔离器内喂养。

110日龄SPF种鸡80只，用鸡新城疫、法氏囊二联复合灭活疫苗进行免疫，每只鸡肌肉注射1羽份(0.5ml) ，每月采血测定抗体。

120日龄开产海兰蛋种鸡，400只。这些鸡在雏鸡阶段用过ND和IBD活苗多次饮水，在青年鸡时免疫过ND油苗，试验前ND HI为7.6～8.2(log2)，IBD中和抗体13(log2)，琼扩抗体为2²，免疫后每月采血测定抗体。

1.3 抗体测定方法 免疫后按实验方案定期采血测定抗体。ND HI抗体测定按“中国兽药典”附录进行；IBD微量中和试验参照“中国兽药典”附录，在96孔微量细胞培养板上进行，采用固定抗原稀释血清的β微量法，抗原用200个TCID₅₀/0.1ml，对照组鸡几何平均效价应≤1׃8。IBD定量琼扩试验按常规方法进行，中央孔加抗原，周边孔加倍比稀释的血清，血清原液为2⁰，血清1׃2稀释为2¹。为了提高HI试验、中和试验或琼扩试验在不同实验条件下测定结果的可比性，使之逐步标准化，测定时一律采用了ND和IBD定量参照血清。

1.4 攻毒试验 1、7 日龄免疫组于免疫后45天攻毒， ND攻毒时，免疫组各取10只，对照组5只，每只鸡分别肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCC AV1611株）10^5.0ELD50，连续观察14日。

IBD攻毒试验时，免疫组各取10只采血测定中和抗体，连同条件相同的对照鸡10只，经口接种鸡传染性法氏囊病病毒BC6-85株强毒，每只0.2ml（含2×10⁴BID50），72小时后全部剖杀，检查免疫组和对照组法氏囊病的病变。

2 结果

2.1 1日龄、7日龄SPF雏鸡免疫鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活苗的免疫结果，见表2。

表2 1日龄、7日龄SPF雏鸡免疫结果

2.2 110日龄SPF种鸡80只，用鸡新城疫、法氏囊二联复合灭活疫苗进行免疫，每只鸡肌肉注射1羽份(0.5ml) ，每月采血测定抗体，结果见表3。

表3 110日龄SPF种鸡免疫结果

2.3 120日龄海兰蛋种鸡400只，用鸡新城疫、法氏囊二联复合灭活疫苗进行免疫，每只鸡肌肉注射1羽份(0.5ml) ，每月采血测定抗体，结果见表4。

表4 120日龄海兰蛋种鸡免疫结果

Claims (7)

1.一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）鸡新城疫抗原液制备；

2）鸡传染性法氏囊病抗原液制备；

3）鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备：

将步骤1）得到的鸡新城疫抗原液与步骤2）得到的鸡传染性法氏囊病抗原液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，将两种灭活抗原液按体积比1:1混合均匀，得到抗原混合液，在每1000ml抗原混合液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比6:4进行乳化分装制成鸡新城疫、传染性法氏囊病二联复合灭活疫苗；

上述的每份免疫增强剂含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素6～10g和法氏囊素2～16mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：牛膝10～30份、茯苓10～20份、穿心莲20～30份、黄芪20～40份、板蓝根10～30份、生地10～30份、当归10～30份、甘草10～20份和大黄10～30份。

2.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中鸡新城疫抗原液制备包括以下步骤：

（1）种细胞的传代与培养：鸡胚传代细胞系DF-1细胞系经胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞适应毒种的繁殖：取细胞适应的新城疫病毒La Sota株毒种，接种于步骤（1）中已长成单层的鸡胚传代细胞中，置37～38℃继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；

（3）制苗用细胞的大规模培养：将步骤（1）培养得到的种细胞悬浮液接种至转瓶或细胞工厂中，加入细胞生长液置37～38℃进行培养；

（4）制苗用毒液的制备：取步骤（3）中已形成良好单层的鸡胚传代细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种步骤（2）得到的新城疫细胞适应毒病毒悬液，吸附后加入维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存，得到鸡新城疫抗原液。

3.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中鸡传染性法氏囊病抗原液制备包括以下步骤：

（1）制苗用细胞的传代与培养：取鸡胚成纤维传代细胞系DF-1细胞系经胰酶细胞分散液消化传代，在培养瓶中以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

（2）细胞毒种的繁殖：取生产用传染性法氏囊病毒HQ株，按维持液体积量的1%接种于已长成良好单层的鸡胚成纤维传代细胞中，置37～38℃在维持液中继续培养，细胞病变率达75%以上时收获细胞液；

（3）制苗用毒液的繁殖：取步骤1）中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种步骤2）得到的含1%法氏囊细胞适应毒HQ株的维持液，置37～38℃继续培养，当细胞病变达75%以上时收获毒液，-15℃以下保存，得到鸡传染性法氏囊病抗原液。

4.如权利要求2或3所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.2～7.4，DO为30%～60%，含糖4.0g/L；所述的维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH为7.4～7.6，DO为30%～50%，含糖4.0g/L。

5.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素中含有维生素B2 15～35%、维生素C 20～40%、维生素D3 10～30%和维生素E 10～30%。

6.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

a、按牛膝10～30份，茯苓10～20份，穿心莲20～30份，黄芪20～40份，板蓝根10～30份，生地10～30份，当归10～30份，甘草10～20份，大黄10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即得粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

7.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：

将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。