CN105535966A - 一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下工艺步骤：1）灭活病毒悬液制备；2）禽流感复合灭活疫苗制备。本发明所制备的稀释液接种鸡胚后，可提高鸡胚耐受病毒的能力，延长死亡时间，即延长了病毒增殖时间，与现有技术相比提高了病毒滴度8倍以上。本发明采用了新的疫苗佐剂，所制备的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、卵黄抗体等共同作用的优点。本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

Description

一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法。
背景技术
禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)属于正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒。AIV感染禽类后可引起一种以呼吸系统乃至全身性败血症为特征的传染性疾病,即禽流感(Avianinfluenza，AI)。AI不仅可以在家禽中传播，严重影响畜牧养殖业的生存和发展；而且还可以由家禽传给人类，直接威胁人类的健康，对人类造成极大危害。在20世纪，人类历史上共暴发了4次世界性流感大流行，其中以1918年暴发的“西班牙流感”对人类社会的危害最大。据不完全统计，那次世界性流感大流行至少夺去了2000多万人的生命，被感染者多达2亿。禽流感之所以能多次大流行与禽流感病毒表面抗原成份频发的变异有很大关系，抗原的变异使得禽流感病毒可以逃逸机体的免疫防御，而且使许多应用中的疫苗失去防御效果。随着分子生物学的发展，人们对禽流感病毒分子结构、免疫原性及抗原变异的分子基础都有了较深入的认识，并且随着对禽流感病毒分子生物学特性的了解及深入，相应的开发出了一些更加安全有效的疫苗，由于禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异频繁，使得机体不能有效防御病毒的侵袭，同时这也为疫苗的研究开发提出了严峻的考验。目前虽然已有多种疫苗应用于禽流感的防治，但他们的防御效果距离人们的期望水平还有差距，所以人们还在不断研发更加行之有效的产品。但无论那种疫苗都有其自身的优缺点。
目前商品化禽流感疫苗大都为灭活疫苗，该种疫苗具有制备工艺简单、免疫效果确实、免疫持续时间较长等特点，已被许多国家地区使用，并且在预防和控制禽流感暴发中起到一定的积极作用。
到目前为止我国对家禽疫病的预防措施仍然是以疫苗接种为主，辅以其它方法但是所用的疫苗以常规疫苗占主导，包括灭活苗和弱毒或无毒活苗，而且多为单苗，在规定的免疫程序中需进行多次免疫接种，这不仅浪费人力物力，而且易引起家禽的应激反应，造成生产力的下降和抗病力降低。
水包油包水乳化佐剂具有铝胶佐剂、水包油佐剂和油包水佐剂的特点，与油包水乳化佐剂相比，其制备疫苗所需要的抗原浓度大大降低，另外因其具有水包油佐剂的特性，使得其可以添加水溶性的免疫增强剂、中药多糖和镇痛剂（维生素），在疫苗免疫机体时可以缓解疼痛，减少动物应激，同时免疫增强剂、中药多糖还具有提高免疫效果，预防疾病等功能。
卵黄抗体（IgY）分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。卵黄抗体作为一种具有生物学活性的免疫球蛋白，在生产，加工，储存以及摄食及消化过程中，保持抗体的活性是关键的。多项实验表明鸡IgY具有良好的稳定性、耐酸、耐热。IgY在室温中保存6个月，其中和病毒能力无明显改变。李春晖等(2002)研究了胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响。结果表明IgY经胃蛋白酶酶解24h后仍保持中和抗原的作用，其酶解片段也具有抗体活性。卵黄抗体在生产上还具有无可比拟的优越性。首先，产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。其次，收集鸡蛋方便，无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则。欧洲替代方法验证中心(ECVAM)建议以IgY代替哺乳动物IgG作为实验和生产抗体的来源。第三，每个蛋大约含100mg以上的IgY，一个月可达3g相当于兔子的10-20倍；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯。第四，由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4℃条件下6个月，IgY活性损失很小。所以可待蛋收集到一定量时再进行大规模地提纯IgY。
黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。
法氏囊素(bursin，BS)是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursaoffabricius)中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。
本发明基于上述技术背景，提出一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，该疫苗由禽流感灭活抗原，加适量含免疫增强剂制成，剂型为水包油包水型。通过该方法制备的复合灭活疫苗，因其拥有水包油，油包水两种特性，使得水溶性的卵黄抗体、法氏囊素、中药黄酮等免疫增强剂与镇痛剂易于溶解，利于动物机体吸收，免疫时可降低动物应激，减少动物痛苦，可提高动物福利；同时免疫增强剂可大大提高活疫苗的细胞免疫，迅速提高机体抗体水平，产生较高的中和抗体，大幅提高保护率。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法的技术方案，采用本方法制备疫苗，可提高疫苗质量，大幅度提高疫苗。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）灭活病毒悬液制备
采用禽流感病毒稀释液稀释禽流感病毒至5000-10000倍，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得禽流感病毒混合病毒液；
2）禽流感复合灭活疫苗制备
将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的禽流感病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成禽流感复合灭活疫苗。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中禽流感病毒稀释液为每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合5～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g，所述的氨基酸组合包括甘氨酸、烟酰胺、亮氨酸和抗坏血酸，所述的复方中药黄酮由黄连、苦参、椿白皮、白薇、龙胆草和夏枯草提取得到。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中每份免疫增强剂含有中药黄酮10～30g、卵黄抗体6～10g和法氏囊素5～15mg。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的氨基酸组合含有以下重量百分比含量的氨基酸：甘氨酸10～40%、烟酰胺20～40%、亮氨酸30～60%和抗坏血酸10～30%。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的复方中药黄酮按以下步骤制得：
a、按黄连20～40份、苦参5～20份、椿白皮10～30份、白薇5～20份、龙胆草10～30份和夏枯草10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到复方中药黄酮。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和0.1m/l的枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药黄酮通过以下步骤制得：
a、按金钱草10～30份，穿心莲10～30份，地锦草20～40份，金银花10～20份，白头翁10～30份，半边莲10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的卵黄抗体采用禽流感高效浓缩灭活疫苗免疫蛋鸡，分离卵黄，酸化提取后经真空冷冻干燥制得。
所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的每份免疫增强剂含有中药黄酮16～24g、卵黄抗体7～9g和法氏囊素8～12mg。
本发明中桑米特家畜水包油包水佐剂由珠海国年生物科技有限公司生产销售。
本发明具有以下有益效果：
1．本发明所制备的稀释液接种鸡胚后，可提高鸡胚耐受病毒的能力，延长死亡时间，即延长了病毒增殖时间，与现有技术相比提高了病毒滴度8倍以上。
2.本发明采用了新的疫苗佐剂，所制备的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、卵黄抗体等共同作用的优点。
3.本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1
一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有：氨基酸组合6g（甘氨酸0.6g、烟酰胺1.8g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸1.2g）、复方中药黄酮15g、脂质体15g，该稀释液pH为6.9。
一种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤是：
（1）磷酸缓冲溶液的配制：按上述磷酸盐缓冲液配方准确称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钙0.1g，含6个结晶水的氯化镁0.1g溶于1000ml双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用。
（2）复方中药黄酮的制备
a、按黄连30份、苦参20份、椿白皮10份、白薇20份、龙胆草10份和夏枯草20份称取所述中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次。
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清。
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
（3）脂质体制备
按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
（4）病毒稀释液配制
按上述优选稀释液组分数准确称取甘氨酸0.6g、烟酰胺1.8g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸1.2g、复方中药黄酮15g、脂质体15g，按比例溶解于步骤（1）中的1000ml磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至6.9，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用。
实施例2
一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有：氨基酸组合8g（甘氨酸1.6g、烟酰胺1.6g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸2.4g）、复方中药黄酮18g（从黄连20份、苦参15份、椿白皮10份、白薇25份、龙胆草15份和夏枯草15份中提取得到）、脂质体20g（按实施例1制得），该稀释液pH为7.2。
一种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。
实施例3
一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有:氨基酸组合10g（甘氨酸2.5g、烟酰胺3.0g、亮氨酸3.0g、抗坏血酸1.5g）、复方中药黄酮5g（从黄连35份、苦参5份、椿白皮15份、白薇10份、龙胆草20份和夏枯草15份中提取得到）、脂质体10g（按实施例1制得），该稀释液pH为7.5。
一种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。
实施例4：采用上述稀释液稀释病毒接种鸡胚与常用稀释液稀释病毒接种鸡胚各项指标的比较。
1）取实施例2得到的禽流感病毒稀释液。
2）常用病毒稀释液及其配制，即生理盐水，按常规技术进行配制。
3）鸡胚接种与培养繁殖
（1）接种鸡胚的选择：选择发育良好的9日龄SPF鸡胚，2000枚；
（2）接种：将本例（1）中的2000枚9日龄SPF鸡胚分为2组，第一组采用本发明病毒稀释液进行操作接种，第二组采用常规技术配制的病毒稀释液进行病毒稀释和接种，两组稀释倍数相同。
（3）孵育和观察、收获、病毒悬液检验。
4）两组方法接种鸡胚后死亡集中时间与数量，见表1。
第一组：为本发明组，采用9日龄鸡胚接种。
第二组：为常规技术稀释液组，采用9日龄鸡胚接种。
5）两组方法接种鸡胚后病毒收获量及其病毒含量，见表2。
综上所述，与传统技术相比，采用本发明方法可提高病毒含量8倍以上，同时还提高了鸡胚液收获量30%～40%。
实施例1和3中得到的稀释液进行实施例4相同的试验，其最终结果也能够达到与实施例4相同的技术效果，可提高病毒含量8倍以上，同时还提高了鸡胚液收获量30%～40%。
实施例5中药黄酮的制备
a、按金钱草10～30份，穿心莲10～30份，地锦草20～40份，金银花10～20份，白头翁10～30份，半边莲10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中上清进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
实施例6法氏囊素的制备
a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净。
b、称量法氏囊重量，按1：1（W：V）比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。
c、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。
d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。
e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到法氏囊素。
实施例7卵黄抗体制备
a、用禽流感高效浓缩灭活疫苗免疫健康蛋鸡。免疫程序为首次胸部肌肉免疫0.5ml/只；首免一周后进行二次免疫，胸部肌肉免疫1.0ml/只；二次免疫后两周进行三次免疫，胸部肌肉免疫1.0ml/只。
b、三次免疫后两周开始监测高免蛋抗体效价，当高免蛋中抗猪繁殖与呼吸综合征病毒卵黄抗体琼脂扩散效价达1:128时，采集合格高免蛋。
c、卵黄分离：将b中采集的无破损高免蛋用0.1%新洁尔灭清洗消毒，破壳分离卵黄，收集卵黄于卵黄储罐中，搅拌混匀。
d、酸化水提：按1:11将纯化水加至酸化提取罐中，将c中卵黄注入酸化提取罐中，搅拌均匀，测定卵黄稀释液pH，用1M稀盐酸或1M氢氧化钠调节pH至6.0，4℃静止孵育24小时。
e、浓缩超滤：吸取d中上清，经连续流离心机10000rpm离心，离心后上清经30kd密理博超滤浓缩装置进行60-80倍浓缩。
f、将e中卵黄抗体浓缩液经冷冻真空干燥制成卵黄抗体冻干粉。
实施例8免疫增强剂制备
称取中药黄酮20g、法氏囊素8mg和卵黄抗体6g；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药黄酮按照实施例5的步骤制得，法氏囊素按照实施例6的步骤制得，卵黄抗体按实施例7的步骤制得。
实施例9免疫增强剂制备
称取中药黄酮30g、法氏囊素5mg和卵黄抗体10g；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药黄酮按照实施例5的步骤制得，法氏囊素按照实施例6的步骤制得，卵黄抗体按实施例7的步骤制得。
实施例10免疫增强剂制备
称取中药黄酮10g、法氏囊素15mg和卵黄抗体8g；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药黄酮按照实施例5的步骤制得，法氏囊素按照实施例6的步骤制得，卵黄抗体按实施例7的步骤制得。
实施例11一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法
a、采用实施例2得到的禽流感病毒稀释液稀释禽流感病毒至5000-10000倍，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得禽流感病毒混合病毒液；
b、无菌条件下，将禽流感病毒混合病毒液灭活后抗原液按每1000ml加入实施例8、9或10中制备的免疫增强剂1或2份，混合均匀，使免疫增强剂完全溶解。
c、将3份量的含免疫增强剂的禽流感病毒灭活抗原液加入乳化器中，调节乳化器转子转速为1500rpm，将2份量的桑米特水油水佐剂缓缓加入搅拌中的抗原液。
d、当油相加完时，调节转子转速为3000rpm，继续搅拌3-5分钟。
e、乳化完全后，将乳化后疫苗无菌分装制成禽流感复合灭活疫苗。
f、成品检验
（1）检验结果
按照《中华人民共和国兽药典》（2010版）相关要求对成品进行相关检验，检验结果见表3：
表3成品检验结果
（2）疫苗免疫效果比较
取100只1月龄SPF鸡，分为两组，实验组和对照组。实验组免疫本发明复合灭活疫苗，对照组免疫不添加复合免疫增强剂的普通灭活疫苗，免疫后3天起采血检测其中和抗体效价。

Claims (10)

1.一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）灭活病毒悬液制备
采用禽流感病毒稀释液稀释禽流感病毒至5000-10000倍，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得禽流感病毒混合病毒液；
2）禽流感复合灭活疫苗制备
将步骤1）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的禽流感病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成禽流感复合灭活疫苗。
2.如权利要求1所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中禽流感病毒稀释液为每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合5～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g，所述的氨基酸组合包括甘氨酸、烟酰胺、亮氨酸和抗坏血酸，所述的复方中药黄酮由黄连、苦参、椿白皮、白薇、龙胆草和夏枯草提取得到。
3.如权利要求1所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中每份免疫增强剂含有中药黄酮10～30g、卵黄抗体6～10g和法氏囊素5～15mg。
4.如权利要求2所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的氨基酸组合含有以下重量百分比含量的氨基酸：甘氨酸10～40%、烟酰胺20～40%、亮氨酸30～60%和抗坏血酸10～30%。
5.如权利要求2所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的复方中药黄酮按以下步骤制得：
a、按黄连20～40份、苦参5～20份、椿白皮10～30份、白薇5～20份、龙胆草10～30份和夏枯草10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到复方中药黄酮。
6.如权利要求2所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
7.如权利要求3所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药黄酮通过以下步骤制得：
a、按金钱草10～30份，穿心莲10～30份，地锦草20～40份，金银花10～20份，白头翁10～30份，半边莲10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；
d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
8.如权利要求3所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。
9.如权利要求3所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的卵黄抗体采用禽流感高效浓缩灭活疫苗免疫蛋鸡，分离卵黄，酸化提取后经真空冷冻干燥制得。
10.如权利要求3所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的每份免疫增强剂含有中药黄酮16～24g、卵黄抗体7～9g和法氏囊素8～12mg。
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