CN111569059B - 一种禽类用抗原-抗体复相疫苗及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物医学领域，公开了一种禽类用抗原‑抗体复相疫苗及制备方法，具有水包油包水的复相乳化体系，包括：第一水相，包括多种灭活病毒与乳化剂混合形成抗原相；第二水相，包括多种利用第一水相中包含的灭活病毒作为抗原得到的浓缩精制蛋黄抗体，并与乳化剂混合形成抗体相；油相，分散在第二水相中并将第一水相包裹形成抗原‑抗体复相。本发明采用抗原‑抗体复相疫苗制作技术制备的水包油包水型复相三联苗(W1/O/W2)中，较现有的传统精制蛋黄抗体浓度高，释放速度慢，没有传统油佐剂疫苗存在的免疫空白期问题，解决了传统精制卵黄抗体半衰期短的问题，实现一针长效，一针多效，为动物机体提供持续的被动免疫保护。

Description

一种禽类用抗原-抗体复相疫苗及制备方法
技术领域
本发明属于动物医学技术领域，具体涉及禽类疫苗和制备该疫苗的方法。
背景技术
以尿酸盐沉积为主要特征的“鹅痛风”综合征现已成为继“小鹅瘟”之后又一严重危害我国养鹅业的重要疫病。尽管一些研究机构或企业已研制出用于防治鹅细小病毒和星状病毒感染的抗体药物，但实际生产中“小鹅瘟”和“鹅痛风”的发生仍未能得到有效控制。加之二者感染鹅的日龄渐趋偏大，使得“小鹅瘟”和“鹅痛风”的发生颇具愈演愈烈之势，已成为严重制约我国养鹅业发展的重要障碍和瓶颈。究其原因，是现有的抗体药物存在一些缺点，这些缺点主要表现为：
(1)现有抗体药物的有效保护期短
抗体药物的有效保护期主要与两个因素有关：一是抗体的效价，二是抗体药物在动物体内的半衰期。通常情况下，抗体的效价越高，则在动物体内的半衰期越长，但能提供的最长有效保护期一般在5-7天左右。实际生产中防治“小鹅瘟”和“鹅痛风”常用做法是在雏鹅出壳后立即注射抗体，且常常通过加大抗体的使用剂量和增加使用次数来延长抗体药物在动物体内的半衰期，进而延长抗体药物的有效保护期。但由于“小鹅瘟”和“鹅痛风”的发生日龄偏大，这一做法无疑不仅增加了养鹅生产的饲养管理成本，还增加了疾病发生的风险。
(2)现有传统油佐剂疫苗存在免疫空白期
由于“小鹅瘟”和“鹅痛风”的发生日龄偏大，一些企业和研究机构也研制出了油佐剂疫苗，接种3-5日龄雏鹅，以刺激动物机体获得主动免疫保护。但是，这传统油佐剂疫苗在实际生产中的使用效果十分不理想，其应用并不广泛。其原因有两个：一是传统油佐剂疫苗刺激机体产生有效保护通常需要5-7天的时间；二是雏鹅免疫系统通常需要15-20天才能发育成熟。这使得油佐剂传统疫苗存在较长的免疫空白期。加之“小鹅瘟”和“鹅痛风”感染、发病周期偏长，使得传统疫苗的应用范围十分有限。
(3)现有抗体药物仅能防治星状病毒感染引发的“鹅痛风”
在临床工作中发现，我国江苏、安徽、山东、广东等地区的雏鹅在使用抗星状病毒感染引发的“鹅痛风”的抗体药物后仍大面积发生“鹅痛风”。经病原学研究发现，这些仍发生“鹅痛风”的病鹅实际是感染了鹅出血性多瘤病毒。鹅出血性多瘤病毒感染鹅主要表现为：皮下结缔组织水肿、胶冻样腹水和肾脏炎症，慢性死亡的雏鹅表现内脏痛风和关节尿酸盐沉积，在临床上与鹅星状病毒感染十分相似，常常发生混淆，且极易被忽视。以上研究结果表明，“鹅痛风”至少可由鹅星状病毒和鹅出血性多瘤病毒两种病毒感染引发，现有的仅针对鹅星状病毒感染的抗体药物不能有效防治“鹅痛风”这一多病因疫病。
发明内容
为了解决现有技术存在的有效抗体持续时间短、抗体抗原空白期和现有疫苗没有完全解决鹅痛风的问题，本发明提供一种具有多种病毒抗原和抗体形成的复相疫苗及其制备方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种禽类用抗原-抗体复相疫苗，具有水包油包水的复相乳化体系，包括：
第一水相，包括多种灭活病毒与乳化剂混合形成抗原相；
第二水相，包括多种利用第一水相中包含的灭活病毒作为抗原得到的浓缩精制蛋黄抗体，并与乳化剂混合形成抗体相；
油相，分散在第二水相中并将第一水相包裹形成抗原-抗体复相。
同时，还公开一种禽类用抗原-抗体复相疫苗，具有水包油包水的复相乳化体系，包括：
第一水相，包括多种灭活病毒和至少一种浓缩精制蛋白抗体，其中所述抗体与灭活病毒不同种，再加入乳化剂混合；
第二水相，包括多种利用灭活病毒作为抗原得到的浓缩精制蛋黄抗体，还包括不同种的灭活病毒并加入乳化剂混合；
油相，分散在第二水相中并将第一水相包裹形成复相乳化体系。
与上述方案相比，该限定范围内对第二水相中的抗体种类或第一水相中的抗原种类进行调整，也就是说，第一水相中的抗原与第二水相中的抗体并不完全对应，其中可采用其他种类的抗体或抗原，单独实现免疫效果。
但由于不同的抗体和抗原之间不会产生特异性结合，则采用上述复相体系相较于现有的两相或单相体系，其中包含的个别抗原无法快速释放，而原本没有对应的抗体也同样无法快速释放，更加具有灵活性，能够根据雏禽体征和该类疾病的特性进行调整。
进一步的，所述第一水相、油相和第二水相的混合比例为1：3：12。
进一步的，所述第一水相和第二水相中的灭活病毒包括鹅细小病毒、鹅星状病毒、鹅出血性多瘤病毒中的一种或多种。
其中，禽类疾病中常发的小鹅瘟是由鹅细小病毒引起的雏鹅急性败血性传染病。病雏鹅的临诊特点是精神委顿，食欲废绝，严重下痢，有时出现神经症状，死亡率高。具体来说，是小肠中后段黏膜坏死脱落与纤维素性渗出物凝固形成栓子，形如腊肠状为特征。常呈败血病状，发病率和死亡率很高，对养鹅业生产危害极大。
而常发病中还包括鹅痛风，鹅痛风主要包括两种致病因素，自身代谢障碍和由病毒引起代谢障碍。最主要的表征形式是血液中大量尿酸盐蓄积，并以盐的形式沉积在关节囊以及各个脏器表面，从而导致鹅出现一系列的病理变化，影响鹅的生长发育。
本发明中主要解决上述两个疾病，并提供相应的抗原和抗体。其中的小鹅瘟由添加的灭活鹅细小病毒刺激形成主动免疫能力，同时提供针对小鹅瘟的抗体直接形成被动免疫。
而鹅痛风的致病机理不完全明确，根据现有资料表明，引起鹅痛风的病毒主要为星状病毒，由于星状病毒除引起腹泻和生长不良外，还导致严重的致死性肝炎和肾炎等疾病，由于肝肾出现问题而影响正常代谢，致使组织脏器及腿部肌肉、关节覆盖大量尿酸盐沉积物，出现痛风症状。但在临床工作中发现采用现有的针对星状病毒的疫苗注射后的养殖场中还是大面积出现了鹅痛风，则进一步检测后判定其中出现鹅痛风症状的禽类主要是由鹅出血性多瘤病毒引起，该病毒引起的并发症由于症状与星状病毒引起的并发症极为相似，容易造成误判。
故本发明中为了解决鹅痛风给禽类带来的影响，通过选取星状病毒和鹅出血性多瘤病毒的灭活毒株作为抗原，相较于现有的单纯抵抗星状病毒的疫苗具有较好的免疫效果。
进一步的，所述第一水相中的灭活病毒采用接种病毒后死亡的鸭胚尿囊液作为原料，并以2‰甲醛溶液灭活。
一种疫苗制备方法，用于制备上述一种禽类用抗原-抗体复相疫苗，具体步骤如下：
G1.首先制备第一水相，选取多种病毒毒株以非免健康鸭胚生产种毒，并提取接种后死亡鸭胚的尿囊液中的部分成分灭活处理得到病毒液，将多种病毒液与乳化剂混合得到第一水相；
G2.然后制备第二水相，选取G1中的病毒液经浓缩处理后制成高免抗原，以待产蛋鸭为对象免疫接种，并将孵出的鸭蛋的蛋黄部分处理得到精制蛋黄抗体，通过加入乳化剂混合得到第二水相；
G3.将制备好的第一水相与选取的油相混合乳化得到油包水产物，将油包水产物与制备好的第二水相混合乳化得到疫苗成品。
进一步的，所述步骤G1具体如下：
(1.1)确定毒株种类，并选取确定的毒株稀释后以200-500ELD50/枚的剂量通过绒毛尿囊腔或卵黄囊接种方式接种10日龄非免健康鸭胚；
(1.2)采集接种24h后死亡鸭胚的尿囊液，加入三氯甲烷振荡混匀后静置处理20-40min用以纯化病毒；(应当说明的是，该步骤可采用其他试剂进行同等方式纯化病毒，只需达到相同技术效果即可)
(1.3)将静置后的混合液A通过离心机冷冻离心15-20min，收集上层液并测定鸭胚的ELD50；
(1.4)根据测定的ELD50调整病毒含量，并向调整后的混合液B中加入2‰的甲醛置于低温中灭活24h得到病毒液；
(1.5)将多种病毒液混合后加入乳化剂，待完全溶解后摇匀备用。
进一步的，所述步骤G2具体如下：
(2.1)取用步骤G1中制备好的病毒液作为原液，通过超滤浓缩处理得到浓缩12倍的浓缩液，并将等份的多种病毒的浓缩液混合，混合后加入乳化剂；
(2.2)待乳化剂完全溶解后将溶液与无菌油佐剂按照1：3的体积比混合，在充分摇匀后置于高压均质机中进行乳化得到油包水型高免抗原；
(2.3)取高免抗原液接种于待产蛋鸭，并做三次免疫接种后收集鸭蛋；
(2.4)将收集到的鸭蛋灭菌处理后去掉蛋清，并将蛋黄作为原料制作精制蛋黄抗体液；
(2.5)将得到的精制蛋黄抗体液经过微孔过滤除菌后进行4倍超滤浓缩，向浓缩液中加入乳化剂并待其完全溶解后备用。
进一步的，所述步骤(2.3)中，首先将高免抗原液在待产蛋鹅的腿背侧接种；
并在首次免疫接种15d后以同样的方式并加倍剂量在另一只腿背侧接种；
于第二次免疫接种15d后采用上次同样剂量于颈基部背侧皮下注射方式做第三次免疫接种；
在第三次免疫接种后7d开始收集鸭蛋。
进一步的，所述步骤G3中，第一水相与油相按照1：3的体积比混合乳化形成油佐剂疫苗，而将油佐剂疫苗与第二水相按照1：3的体积比混合乳化形成复相疫苗。
本发明的有益效果为：
(1)本发明采用抗原-抗体复相疫苗制作技术制备的水包油包水型复相三联苗(W1/O/W2)中，作为第二水相(W2)的鸭源精制蛋黄抗体是经浓缩、乳化而成，较现有的传统精制蛋黄抗体浓度高，释放速度慢，为动物机体提供持续的别动免疫保护。同时，W1可在W2释放后期刺激动物机体产生主动免疫保护。这种抗体缓释技术和被动免疫与主动免疫联合保护技术显著延长了药物得的最长保护期，弥补了现有蛋黄抗体药物有效保护期短的缺陷；
(2)本发明技术采用的抗原-抗体复合疫苗技术实际是综合利用了前期抗体的被动免疫保护和后期油佐剂疫苗的主动免疫保护机理，有效避免了免疫空白期的出现，实现雏鹅整个发育阶段的全程保护；
(3)本发明技术制备的复相疫苗为三联疫苗，可同时预防和治疗鹅细小病毒、鹅星状病毒和鹅出血性多瘤病毒感染。
附图说明
图1是本发明中整个疫苗乳化体系的概念图；
图2是本发明中实际疫苗的乳化体系结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
本申请的描述中若出现术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
实施例1：
多联疫苗是现在养殖业中常用的禽类疾病预防药剂，通过在单针中包含有多种病毒抗原从而使接种的雏禽能够针对多种病原产生抗体。但根据现有的研究资料表明，单纯的抗原疫苗在使用时由于产生抗体周期较长的特性，则导致雏禽早期患病几率增高，也就是雏禽已经患有相应疾病，无法等到产生有效抗体就会出现大面积患病或死亡的情况。
为了改善这一结果，现有技术通过抗体-抗原的复合疫苗从而相较于常规疫苗具有较高的安全性和免疫效果，尤其是接种的雏禽体内对应的抗体数量快速提高，对于已经患病或者可能患病的雏禽提供直接的保护。然后抗原又能够在本身接种的抗体有效期内刺激宿主自主产生抗体，从而长效保护。
从现有的抗体-抗原复合疫苗所公开的技术资料来看，大都直接调整比例和稀释倍数后直接混合，将混合后的制剂作为疫苗使用。但由于抗原、抗体会特异性结合，则简单的混合容易导致药剂失效。现有技术中普通的疫苗制剂均采用油佐剂的乳化体系作为承载将抗原或抗体注入对象身体中，但现有资料表明油佐剂会引起强副作用，致使生物体产生严重的脓肿和肉芽肿。
本实施例提供一种禽类用抗原-抗体复相疫苗，如图1和图2所示，主要为第一水相、第二水相和中间层的油相，其中的第一水相包括多种灭活病毒与乳化剂混合形成抗原相。
其中第二水相包括多种利用第一水相中包含的灭活病毒作为抗原得到的浓缩精制蛋黄抗体，并与乳化剂混合形成抗体相；
而油相是分散在第二水相中并将第一水相包裹形成抗原-抗体复相，如图2所示，其中的油相与第一水相均为第二水相的分散相。
本发明为了降低副作用，实现一针多效的效果，且能够适用于抗原-抗体复合药剂，通过水包油包水的乳化体系，通过两层水相携带不同的成分，并由油相分隔形成三相体系，从而将包含的有效成分成功注入生物体内并产生积极效果。
但不仅是有效分隔，与现有技术相比，通过W/O/W的体系能够增长免疫保护周期。第一水相中包含有抗原成分，均为灭活病毒，其被油相包裹，实际形成油相的分散相；而油相在第二水相中同样为分散相，当疫苗注入生物体后，第二水相中的抗体会快速持续释放入血液中，使得生物体快速获得被动免疫保护。此时第一水相中的抗原并未大规模向外释放，而是被延后释放，这种结构有效的延长了疫苗的有效周期，避免需要多次注射抗体或抗原，真正做到一针多效。
实施例2：
本实施例具体公开一种水包油包水型复相三联苗(W1/O/W2)，其中的第一水相(W1)中包含有鹅细小病毒、鹅出血性多瘤病毒和鹅星状病毒的灭活毒株作为抗原，添加有乳化剂进行溶解。而第二水相(W2)中包含有利用鹅细小病毒、鹅出血性多瘤病毒和鹅星状病毒的灭活毒株接种活体得到的包含有高浓度抗体溶液，同样添加乳化剂进行溶解。
该疫苗的制作和实验步骤如下：
一、病毒
鹅细小病毒(GPV)：CQ2007株，系从爆发病例中具有典型出血性纤维素性肠炎的死鹅，通过鹅胚分离病毒，经PCR检测证实为鹅细小病毒。经10日龄鸭胚连续传10代后的鸭胚适应株，其对鸭胚的ELD50为log104.5/0.3ml。
鹅星状病毒(GAstV)：XZ2019株，分离自徐州某鹅场发生的以“痛风”为典型病变特征的病死鹅，经10日龄鹅胚卵黄囊接种连续传15代，其对10日龄鹅胚ELD50为log104.0/0.3ml。
鹅出血性多瘤病毒(GHPV)：AH2019株，分离自安徽某养鹅场采用鹅星状病毒抗体治疗“痛风”无效的病死鹅，系经10日龄鸭胚连续15代后的鸭胚适应株,其ELD50为log105.5/0.2ml。
以上三株疫苗毒株均经毒种纯净性鉴定(支原体检验、外源病毒检验：禽淋白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、番鸭细小病毒、鹅呼肠孤病毒、腺病毒、黄病毒)合格。
二、实验动物
10日龄非免健康鸭胚、鹅胚，购自重庆荣昌某家禽养殖孵化场；1日龄非免健康四川麻鸭、四川白鹅购自重庆荣昌某家禽养殖孵化场。
三、制备过程
1、第一水相(W1)的制备
取鹅细小病毒(鹅星状病毒/鹅出血性多瘤病毒)生产种毒(鸭胚适应毒)，做适当稀释后以200-500ELD50/枚的剂量，行绒毛尿囊腔(GPV、GHPV)或卵黄囊(GAstV)方式接种10日龄非免健康鸭/鹅胚；采集接种24h后死亡胚的尿囊液，以适当比例加入三氯甲烷，用力振荡混匀后静置处理30min；取处理好的含病毒的尿囊液混合物置大容量水平离心机，以8000rpm的转速冷冻离心15min；收集上层液体并测定对鸭/鹅胚的ELD50，调整病毒含量后加入2‰甲醛，置低温灭活24h；将灭活的三种病毒液以适当比例混和，加入乳化剂，待完全溶解后摇匀备用。
2、第二水相(W2)的准备
(1)高免抗原制备
取1种灭活好的病毒液，采用密理博公司的超滤膜包(截流分子量20kDa)进行超滤浓缩12倍；取浓缩好的三种病毒液，按细小病毒：星状病毒：出血性多瘤病毒＝1：1：1的体积比混合，加入乳化剂；待乳化剂完全溶解，按水相：油相＝1：3的体积比将制备好的水相与无菌油佐剂混合，并充分摇匀；置高压均质机上进行乳化，制成油包水型(W/O)高免抗原。
(2)鸭源高免蛋的制备
取上步(1)中制备好的高免抗原，于初产蛋鸭产蛋前两周以腿部肌肉注射方式在左腿背侧接种待产蛋鸭(四川麻鸭)；首次免疫接种15天后，以同样的方式在另一侧腿部加倍剂量做第二次接种；于第二次接种15天后，以与上次相同的剂量行颈基部背侧皮下注射方式做第三次免疫接种。第三次免疫接种7天后开始收集鸭蛋。
(3)鸭源精制蛋黄抗体的制备
将上步(2)中收集的高免鸭蛋置新洁尔灭溶液(26℃)中浸泡5min，再转移至100℃水中浸泡2min，进行蛋壳表面的消毒；破除蛋壳，去掉蛋清，收集蛋黄；将收集的蛋黄置组织捣碎机下低速破除蛋黄膜，并将蛋黄充分捣匀，后按蛋黄液：醋酸缓冲液＝1：5的体积比与醋酸缓冲液混匀；按一定的体积比向蛋黄液中加入辛酸溶液，充分振荡混匀后静置30min；将处理好的蛋黄液置于定性滤纸上进行过滤，收集的滤液即为抗鹅细小病毒、鹅星状病毒、鹅出血性多瘤病毒的三联精制蛋黄抗体。
(4)精制蛋黄抗体的浓缩
将上步(3)中制备的精制蛋黄抗体采用微孔滤器(微孔直径0.25um)进行过滤除菌；将制备的无菌精制蛋黄抗体溶液置超滤装置上进行4倍超滤浓缩(超滤膜包截流分子量为50kDa)；向浓缩好的抗体溶液中加入乳化剂，待完全溶解后备用。
3、乳化
(1)第一水相的乳化(W1/O型)
取制备好的第一水相(W1)，按W1：O＝1：3的体积比与油相混合，充分振荡混匀后置高压均质机上进行高压乳化，制成W1/O型的油佐剂疫苗，并进行稳定性合格检验。
(2)第二水相的乳化(W1/O/W2型)
取上步(1)中制备好的W1/O油佐剂疫苗，按W1/O：W2＝1：3的体积比与已制备好的W2混合，置高压均质机上进行乳化，制成W1/O/W2型复相疫苗，并进行稳定性合格检验。
乳化后分别取样，进行疫苗的外观、剂型、粘度、稳定性检测。并进行复相疫苗的安全性检验，其中包括单剂量接种的安全性试验、单剂量重复接种的安全性试验和双倍剂量接种的安全性试验。
4、雏鹅接种复相疫苗抗体消长规律研究
(1)试验鹅及免疫
新生健康非免雏鹅，以0.5ml/只(1日龄)或1ml/只(7日龄、1月龄)的剂量行腿部肌肉注射方式接种经检验合格的复相疫苗；同时分别设立注射W1/O、W2、生理盐水的对照组。
(2)血清采集
按设计各组分别于免疫接种后第0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、15d、22d、29d、8w、16w、24w、32w、40w时，颈静脉或翅静脉采血分离血清，每组每次10份血清，并进行等量混合后置-30℃冰箱保存备测。
(3)琼扩抗体效价检测
琼脂板制备：称取琼脂糖1.2g，氯化钠1.6g，加入100ml蒸馏水中，加热融化，并调pH值至7.2-7.4，倒入平皿中，使琼脂板厚度为3mm制成平板，用外径3mm的打孔器，按梅花形图案打孔，中心孔与周围孔的孔距为3mm，并封底。
血清样品的稀释：将(2)中所采集的免疫雏鹅血清按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64倍稀释。
加样：中间孔加入鹅细小病毒抗原或鹅星状病毒或鹅出血性多瘤病毒抗原(标准琼扩抗原)，周围孔加入已稀释好的被检血清，分别检测免疫接种鹅血清中抗鹅细小病毒、鹅星状病毒、鹅出血性多瘤病毒抗体效价。同时设阳性血清和阴性血清(正常非免疫健康鹅血清)对照。平板放入湿盒中，于37℃恒温孵育，每12h观察一次结果，至48h判定结果。将所得数据进行分析，比较其抗体消长规律。
(4)中和抗体效价测定
采用固定病毒，稀释血清的方法。被检血清56℃水浴处理30min后，以0.85％生理盐水做10×、20×、40×、80×、160×稀释。将疫苗毒株致死的新鲜鹅胚尿囊液做适当稀释，与上述不同稀释度被检血清等量混合，置37℃中和1h。每一稀释度接种9日龄鹅胚11枚，接种剂量为0.4ml/枚(实际含毒量为200-500ELD50)。同时设立病毒对照组和血清对照组。检测鹅细小病毒和出血性多瘤病毒抗体采用接种绒毛尿囊腔方式，检测鹅星状病毒抗体采用接种卵黄囊方式。逐日观察鹅胚死亡情况，连续观察14天，24h内死亡的弃去不计，剖解观察死亡胚胎病理变化。最后按Reed-Muench算出被检血清的中和滴度。
5、雏鹅攻毒保护性试验
上述的实验鹅于免疫接种后第3d、7d采血之后进行随机分组，每组10只，分别用三个病毒的攻毒株(病毒含量分别为104.83ELD50/0.2ml)，每只雏鹅口服0.5ml，颈部皮下注射0.5ml；同时分别设立注射W1/O、W2的对照组。免疫组与各个对照组间分别隔离饲养14日，每日观察记录雏鹅临床症状，死亡鹅随时取出，并剖检观察病例变化。
对上述方法制作的抗原-抗体药物进行实验测试，其中包括雏鹅接种复相疫苗抗体消长规律研究和复相疫苗接种雏鹅血清中和抗体滴度检测，均是对1日龄、7日龄和一月龄的雏鹅抗体进行检测，具体结果如下：
A、1日龄雏鹅血清GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体检测
按设计将1日龄雏鹅免疫接种复相疫苗，于免疫接种后第12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、8d、15d、22d、29d、8w、16w、24w、32w、40w时，颈静脉/翅静脉无菌采血，分离血清，分别检测GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价。研究结果显示，1日龄雏鹅在接种水包油包水型(W1/O/W2)复相疫苗0.5d后，血清均出现抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体，1d琼扩抗体效价达到1：4，2d达到1：16的最高值，7d后降至1：4；免疫接种15d后，抗体效价小幅升高至1：8，并持续至16w；至32周时，抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体水平均降至1：2；至40周时，血清中抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体均转为阴性(结果见表1)。
表1 1日龄雏鹅免疫血清抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价
研究中还发现，W1/O对照组雏鹅在接种15d后血清中抗GPV、GAstV、GHPV三种抗体开始转为阳性，持续至32w时琼扩抗体水平转为阴性；W2对照组雏鹅在接种后0.5d抗体即转为阳性，3d时三种抗体的琼扩效价均达到1：32的最高值，至8d时抗GPV、GAstV、GHPV抗体转为极低水平或阴性(见表2)。
表2 1日龄雏鹅免疫血清抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价
B、7日龄雏鹅血清GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体检测
按设计将7日龄雏鹅免疫接种复相疫苗，并于免疫接种后第12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、8d、15d、22d、29d、8w、16w、24w、32w、40w时，翅静脉采血分离血清，分别检测GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价。研究结果显示，1日龄雏鹅在接种水包油包水型(W1/O/W2)复相疫苗0.5d后，血清抗GPV、GAstV、GHPV抗体转为阳性，4d达到1：16或1：32的最高值，7d后降至1：8；免疫接种15d后，抗体效价回升至1：16，并持续至16w左右；至24周时，抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体水平均降至1：2；至40周时，血清中抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体均转为阴性(结果见表3)。
表3 7日龄雏鹅免疫血清抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价
研究中还发现，W1/O对照组雏鹅在接种15d后抗体开始转为阳性，持续至32w时开始转为阳性；W2对照组雏鹅在接种后0.5d抗体即转为阳性，2-3d时三种抗体的琼扩效价均达到1：32的最高值，至8d时抗GPV、GAstV、GHPV抗体转为极低水平或阴性(见表4)。
表4 7日龄雏鹅免疫血清抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价
C、1月龄雏鹅血清GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体检测
按设计将1月龄雏鹅免疫接种复相疫苗，并于免疫接种后第12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、8d、15d、22d、29d、8w、16w、24w、32w时，翅静脉采血分离血清，分别检测GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价。研究结果显示，1日龄雏鹅在接种水包油包水型(W1/O/W2)复相疫苗0.5d后，血清抗GPV、GAstV、GHPV抗体转为阳性，3-4d达到1：8或1：16的最高值，并持续至疫接种16w；至24周时，抗体水平均降至1：2；至40周时，血清中抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体均转为阴性(结果见表5)。
表5 1月龄雏鹅免疫血清抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价
研究中还发现，W1/O对照组雏鹅在接种15d后抗体开始转为阳性，三种抗体的琼扩效价最高1：16或1：32，持续至40w时已为阴性；W2对照组雏鹅在接种后2d抗体即转为阳性，3-4d时三种抗体的琼扩效价达到1：8的最高值，至6d时三种抗体水平降至1：2，6d时完全转为阴性(见表6)。
表6 1月龄雏鹅免疫血清抗GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价
D、1日龄免疫接种鹅血清中和抗体滴度检测
采用固定病毒稀释血清的方法，被检血清56℃水浴30min，以0.75％的生理盐水稀释后与预先稀释好的病毒液等体积混匀，37℃孵育1h后接种鹅胚，连续观察14天，死亡胚胎进行剖解，观察病理变化。研究结果显示，1日龄雏鹅在免疫接种后3d血清抗GPV中和抗体滴度达到1：40-1：80之间，并持续16w；至32w时，中和抗体滴度下降至1：10-1：20之间；至40w时，中和抗体滴度已降至1：10以下(结果见表7)。
表7 1日龄雏鹅免疫血清GPV中和抗体滴度检测
研究中发现，免疫接种鹅血清中抗GAstV中和抗体滴度3d时最高为1：80-1：160之间，并持续至15d；29d短暂下降后回升至1：80-1：160之间；24w时中和抗体滴度降至1：20-1：40之间；32w时中和抗体滴度降至1：10以下(见表8)。
表8 1日龄雏鹅免疫血清GAstV中和抗体效价检测
研究中发现，免疫接种鹅血清中抗GHPV中和抗体滴度3d时最高达1：80-1：160之间，并持续至16w；24w时中和抗体滴度下降至1：20-1：40之间，32w时降至1：10以下。(见表9)
表9 1日龄雏鹅免疫血清GHPV中和抗体效价检测
研究中对死亡胚胎进行剖解发现，GPV病毒对照组死亡胚体出血、红染，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显；GAstV病毒对照组死亡胚体全身水肿、黄染，毛发极易剥离，肝脏有斑块状或片状坏死，肾脏肿大、出血，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显；GHPV病毒对照组死亡胚体全身水肿、黄染，毛发极易剥离，皮下有淡黄色胶冻样渗出，肝脏有斑块状或片状出血、坏死，肾脏肿大、出血，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显。
E、7日龄免疫接种鹅血清中和抗体滴度检测
采用固定病毒稀释血清的方法。被检血清56℃水浴30min，以0.75％的生理盐水稀释后与预先稀释好的病毒液等体积混匀，37℃孵育1h后接种鹅胚，连续观察14天，死亡胚胎进行剖解，观察病理变化。研究结果显示，7日龄雏鹅在免疫接种后3d血清抗GPV中和抗体滴度达到1：40-1：80之间，并持续至24w；至32w时，中和抗体滴度下降至1：20-1：40之间；至40w时，中和抗体滴度已降至1：10以下(结果见表10)。
表10 7日龄雏鹅免疫血清GPV中和抗体效价检测
研究中发现，免疫接种鹅血清中抗GAstV中和抗体滴度3d时最高为1：80-1：160之间，7d时中和抗体滴度在1：40-1：80之间；29d时中和抗体滴度升高到1：80-1：160之间；24w时中和抗体滴度降至1：20-1：40之间，40w降至1：10以下。(见表11)
表11 7日龄雏鹅免疫血清GAstV中和抗体效价检测
研究中发现，免疫接种鹅血清中抗GHPV中和抗体滴度3d-7d时最高达1：80-1：160之间；15d短暂下降后至29d时中和抗体滴度达到1：80-1：160，并持续至16w；24w时中和抗体滴度降至1：20-1：40之间，40w降至1：10以下。(见表12)
表12 7日龄雏鹅免疫血清GHPV中和抗体效价检测
研究中对死亡胚胎进行剖解发现，GPV病毒对照组死亡胚体出血、红染，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显；GAstV病毒对照组死亡胚体全身水肿、黄染，毛发极易剥离，肝脏有斑块状或片状坏死，肾脏肿大、出血，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显；GHPV病毒对照组死亡胚体全身水肿、黄染，毛发极易剥离，皮下有淡黄色胶冻样渗出，肝脏有斑块状或片状出血、坏死，肾脏肿大、出血，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显。
F、1月龄免疫接种鹅血清中和抗体滴度检测
采用固定病毒稀释血清的方法，被检血清56℃水浴30min，以0.75％的生理盐水稀释后与预先稀释好的病毒液等体积混匀，37℃孵育1h后接种鹅胚，连续观察14天，死亡胚胎进行剖解，观察病理变化。研究结果显示，1月龄鹅在免疫接种后3d血清抗GPV中和抗体滴度达到1：40-1：80之间，7d时降至1：20-1：40之间；至15d时中和抗体滴度回升至1：40-1：80之间，并持续至24w；至32w时，中和抗体滴度下降至1：10-1：20之间；至40w时，中和抗体滴度已降至1：10以下(结果见表13)。
表13 1月龄雏鹅免疫血清GPV中和抗体效价检测
研究中发现，免疫接种鹅血清中抗GAstV中和抗体滴度3d时最高为1：80-1：160之间，7d时中和抗体滴度降至1：40-1：80之间；29d时中和抗体滴度升高到1：80-1：160之间，并持续至16w；24w时中和抗体滴度降至1：20-1：40之间，40w降至1：10以下。(见表14)
表141月龄雏鹅免疫血清GAstV中和抗体效价检测
研究中发现，免疫接种鹅血清中抗GHPV中和抗体滴度3d-7d时最高达1：80-1：160之间；15d短暂下降后至29d时中和抗体滴度达到1：80-1：160，并持续至16w；24w时中和抗体滴度降至1：20-1：40之间，40w降至1：10以下。(见表15)
表15 1月龄雏鹅免疫血清GHPV中和抗体效价检测
研究中对死亡胚胎进行剖解发现，GPV病毒对照组死亡胚体出血、红染，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显；GAstV病毒对照组死亡胚体全身水肿、黄染，毛发极易剥离，肝脏有斑块状或片状坏死，肾脏肿大、出血，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显；GHPV病毒对照组死亡胚体全身水肿、黄染，毛发极易剥离，皮下有淡黄色胶冻样渗出，肝脏有斑块状或片状出血、坏死，肾脏肿大、出血，而抗体中和组死亡胚胎的肉眼病变不明显。
G、雏鹅攻毒保护试验
实验结果见表16、17，其中W1/O/W2免疫组雏鹅在接种后3、7、15天攻毒，其采食、饮水、精神状态均正常，无小鹅瘟或痛风临床症状发生，攻毒14日后各组均10/10健康存活。W1/O免疫组雏鹅在攻毒后第3天开始出现精神萎靡、站立不稳、采食、饮水减少等临床症状，第5天出现死亡，至攻毒后11日10只雏鹅出现死亡。W1/O免疫组雏鹅在接种后15天攻毒，出现精神萎靡、站立不稳、采食、饮水减少等临床症状，保护率在50％左右。W2免疫组雏鹅在接种后3天攻毒，其采食、饮水、精神状态均正常，无小鹅瘟或痛风临床症状发生，攻毒后14日后各组均10/10健康存活。但W2免疫组雏鹅在接种后第7、15天攻毒，均出现采食、饮水、精神状态均异常。
剖检GPV攻毒组病死鹅，心、肝、脾等实质器官肉眼病变不明显，小肠有部分肠管外观粗大，质地较硬，剖开可见小鹅瘟典型的淡灰色或黄色纤维素性栓塞，易剥离，表面光滑。GAstV、GHPV攻毒组病死鹅剖检可见：腹部皮下结缔组织水肿、胶冻样腹水和肝、肾炎症。慢性死亡的雏鹅表现内脏痛风和关节尿酸盐沉积。
表16 1日龄免疫接种鹅攻毒保护试验
表17 7日龄免疫接种鹅攻毒保护试验
四、分析讨论
1、复相疫苗可实现雏鹅生长期的全程保护
本技术发明是以鹅细小病毒、鹅星状病毒和出血性多瘤病毒三联抗原为第一水相(W1)，鸭源抗鹅细小病毒、鹅星状病毒和出血性多瘤病毒三联精制蛋黄抗体为第二水相(W2)，制成水包油包水型(W1/O/W2型)抗原-抗体复相疫苗，其保护雏鹅的机理是：复相三联疫苗经皮下或肌肉注射初生雏鹅后，其W2首先持续释放进入血液循环，雏鹅迅速获得被动免疫保护，最长保护期达7-10天；疫苗注射后第三天，W1开始缓慢释放，刺激雏鹅产生主动免疫，雏鹅获得终生保护。这种被动免疫保护加主动免疫保护的机制有效解决了抗体的被动免疫保护有效期短和抗原的主动免疫保护早期存在免疫空白期的缺陷，实现了“一针长效”，进而减少了传统蛋黄抗体的使用次数和使用剂量。研究结果证明，1日龄、7日龄雏鹅在免疫接种1天后的血清琼扩抗体效价可达到1：4，同时中和抗体滴度能够达到1：40-1：80之间，能够为雏鹅提供坚强的保护。
2、免疫接种鹅琼扩抗体效价与雏鹅被动免疫存在相关性
根据免疫接种鹅血清GPV、GAstV、GHPV琼扩抗体效价与对应雏鹅攻毒保护结果的相关性统计分析，结果表明，鹅血清琼扩抗体阴性时，攻毒对照组雏鹅的死亡率与对照组一致；随着免疫接种雏鹅血清抗体水平的升高，其健活率也升高；当鹅血清抗体效价在1:4时，其健活率可达100％。
本实施例是以鹅细小病毒、鹅星状病毒和出血性多瘤病毒三联抗原为第一水相(W1)，鸭源抗鹅细小病毒、鹅星状病毒和出血性多瘤病毒三联精制蛋黄抗体为第二水相(W2)，制成水包油包水型(W1/O/W2型)抗原-抗体复相疫苗，其保护雏鹅的机理是：复相三联疫苗经皮下或肌肉注射初生雏鹅后，其W2首先持续释放进入血液循环，雏鹅迅速获得被动免疫保护，最长保护期达7-10天；疫苗注射后第三天，W1开始缓慢释放，刺激雏鹅产生主动免疫，雏鹅获得终生保护。
该被动免疫保护加主动免疫保护的机制有效解决了抗体的被动免疫保护有效期短和抗原的主动免疫保护早期存在免疫空白期的缺陷，实现了“一针长效”，进而减少了传统蛋黄抗体的使用次数和使用剂量。
而采用三联混合技术，实现“一针多效”，有效防治“小鹅瘟”和“鹅痛风”综合征。本实施例中的技术制备的W1/O/W2型抗原抗体复相疫苗是三联苗，W1含有鹅细小病毒、鹅星状病毒、鹅出血性多瘤病毒，W2含抗鹅细小病毒、鹅星状病毒、鹅出血性多瘤病毒的鸭源精制蛋黄抗体，可为雏鹅提供抗细小病毒、星状病毒和出血性多瘤病毒单一或多重感染的被动免疫保护和主动免疫保护，有效实现了“一针多效”。
采用抗原超滤浓缩、纯化技术和抗体缓释技术，有效提高三联抗原纯度和含量，显著提升抗体效价。
常规多联疫苗或多联抗体通常存在免疫剂量大，抗原含量不足，抗体效价低等缺陷，给临床使用的便利性和有效性带来很多不利。本发明技术采用超滤浓缩、纯化技术制作W1三联抗原，显著减少免疫抗原中的杂蛋白含量，有效提高免疫抗原的纯度和含量。作为W2的鸭源三联精制蛋黄抗体，不是将三种抗体简单混合，而是针对三联高免抗原产生的多克隆抗体，同时在制成复相苗之前进行了超滤浓缩，显著提升了抗体的效价。
综上所述，本实施例中的技术制作的抗“小鹅瘟”、“鹅痛风”综合征抗原-抗体复相三联疫苗是一种以鹅细小病毒、鹅星状病毒和出血性多瘤病毒为第一水相(W1)，以抗鹅细小病毒、鹅星状病毒和出血性多瘤病毒的鸭源精制浓缩蛋黄抗体为第二水相(W2)的水包油包水(W1/O/W2)抗原-抗体复相苗，利用了前期靠被动免疫保护，后期靠主动免疫保护的免疫机理，实现了“一针长效”、“一针多效”，弥补了现有传统油佐剂疫苗和抗体药物存在的缺陷。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (7)

1.一种禽类用抗原-抗体复相疫苗，其特征在于：具有水包油包水的复相乳化体系，包括：
第一水相，包括三种灭活病毒与乳化剂混合形成抗原相；
第二水相，包括三种利用第一水相中包含的灭活病毒作为抗原得到的浓缩精制鸭源蛋黄抗体，并与乳化剂混合形成抗体相；
油相，分散在第二水相中并将第一水相包裹形成抗原-抗体复相；
所述第一水相、油相和第二水相的混合比例为1：3：12；
所述第一水相和第二水相中的灭活病毒为鹅细小病毒、鹅星状病毒和鹅出血性多瘤病毒这三种。
2.根据权利要求1所述的一种禽类用抗原-抗体复相疫苗，其特征在于：所述第一水相中的灭活病毒采用接种病毒后死亡的鸭胚尿囊液作为原料，并以2‰甲醛溶液灭活。
3.一种疫苗制备方法，其特征在于：用于制备上述权利要求1或2所述的一种禽类用抗原-抗体复相疫苗，具体步骤如下：
G1.首先制备第一水相，选取三种病毒毒株以非免健康鸭胚生产种毒，并提取接种后死亡鸭胚的尿囊液中的部分成分灭活处理得到病毒液，将三种病毒液与乳化剂混合得到第一水相；
G2.然后制备第二水相，选取G1中的病毒液经浓缩处理后制成高免抗原，以待产蛋鸭为对象免疫接种，并将孵出的鸭蛋的蛋黄部分处理得到精制蛋黄抗体，通过加入乳化剂混合得到第二水相；
G3.将制备好的第一水相与选取的油相混合乳化得到油包水产物，将油包水产物与制备好的第二水相混合乳化得到疫苗成品。
4.根据权利要求3中的一种疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤G1具体如下：
（1.1）确定毒株种类，并选取确定的毒株稀释后以200-500ELD50/枚的剂量通过绒毛尿囊腔或卵黄囊方式接种10日龄非免健康鸭胚；
（1.2）采集接种24h后死亡鸭胚的尿囊液，加入三氯甲烷振荡混匀后静置处理20-40min；
（1.3）将静置后的混合液A通过离心机冷冻离心15-20min，收集上层液并测定鸭胚的ELD50；
（1.4）根据测定的ELD50调整病毒含量，并向调整后的混合液B中加入2‰的甲醛置于低温中灭活24h得到病毒液；
（1.5）将三种病毒液混合后加入乳化剂，待完全溶解后摇匀备用。
5.根据权利要求4中的一种疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤G2具体如下：
（2.1）取用步骤G1中制备好的病毒液作为原液，通过超滤浓缩处理得到浓缩12倍的浓缩液，并将等份的三种病毒的浓缩液混合，混合后加入乳化剂；
（2.2）待乳化剂完全溶解后将溶液与无菌油佐剂按照1：3的体积比混合，在充分摇匀后置于高压均质机中进行乳化得到油包水型高免抗原；
（2.3）取高免抗原液接种于待产蛋鸭，并做三次免疫接种后收集鸭蛋；
（2.4）将收集到的鸭蛋灭菌处理后去掉蛋清，并将蛋黄作为原料制作精制蛋黄抗体液；
（2.5）将得到的精制蛋黄抗体液经过微孔过滤除菌后进行4倍超滤浓缩，向浓缩液中加入乳化剂并待其完全溶解后备用。
6.根据权利要求5中的一种疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤（2.3）中，首先将高免抗原液在待产蛋鸭的腿背侧接种；
并在首次免疫接种15d后以同样的方式并加倍剂量在另一只腿背侧接种；
于第二次免疫接种15d后采用上次同样剂量与颈基部背侧皮下注射方式做第三次免疫接种；
在第三次免疫接种后7d开始收集鸭蛋。
7.根据权利要求3中的一种疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤G3中，第一水相与油相按照1：3的体积比混合乳化形成油佐剂疫苗，而将油佐剂疫苗与第二水相按照1：3的体积比混合乳化形成复相疫苗。
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