CN110179975B

CN110179975B - 植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途

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Publication number: CN110179975B
Application number: CN201910518452.1A
Authority: CN
Inventors: 胡松华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-06-15
Filing date: 2019-06-15
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-06-15
Also published as: CN110179975A

Abstract

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途。植物油疫苗佐剂的制备方法为：制备组分A，组分A由植物油、司班‑80、吐温‑80、维生素E、人参皂苷组成；制备组分B，组分B由甘油和1,2‑丙二醇组成；将组分A和组分B混合均匀，获得植物油疫苗佐剂。该植物油疫苗佐剂能用于制备疫苗。

Description

植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途。

背景技术

中国是世界第一动物养殖大国，畜禽数量庞大，每年出栏的生猪约7亿头，肉鸡113亿只(1,2)。动物疫病种类繁多，在规模化养殖，由于动物高密度饲养，疫病容易传播。给动物注射疫苗，提高动物对疫病的抵抗力，可减少疫病的发生，降低由疫病给养殖户造成的经济损失，是预防动物疫病发生的一项重要措施。以偶蹄类动物猪的传染病口蹄疫为例，我国实施强制免疫的控制政策，每年需接种口蹄疫疫苗2～3次，年用口蹄疫疫苗总量约35亿毫升；禽类以肉鸡禽流感疫苗为例，按照每只鸡接种疫苗0.25毫升计，年用禽流感疫苗数量约28亿毫升。为了提高疫苗的免疫效果，需要在疫苗中添加佐剂，以增强疫苗诱导的免疫反应强度和延长免疫反应的持续时间。我国目前采用的口蹄疫等灭活疫苗和禽流感疫苗的佐剂的主要成分几乎都是矿物油，也称白油(3～5)。在疫苗制备中，油佐剂约占成品疫苗量的50％。即，全国每年用于生产猪口蹄疫疫苗和禽流感疫苗两种疫苗需用油佐剂约31.5亿毫升，约3000吨。白油的主要成分是C16～C31的正异构烷烃的混合物，在机体内难以被代谢(6)，其中多环芳烃对机体有致癌作用，这已经在小鼠上得到证实(7～8)。因此，使用以矿物油为主要成分的油佐剂对食品安全构成潜在威胁(9,10)。此外，用矿物油制备的疫苗乳剂给动物注射后不易吸收，可在注射部位长时间滞留，引起局部组织炎症、化脓、坏死等副作用(5,10)。因此，一些发达国家对油佐剂疫苗的使用进行了限制，例如早在20多年以前美国政府就已经严禁动物上市前42天之内注射油佐剂疫苗(6)。

现有疫苗的油佐剂存在以下不足：

1、油佐剂以矿物油为原料，不可避免地会造成佐剂产品中残留稠环芳香烃类成分，该成分有致癌作用，采用该佐剂制成疫苗免疫注射动物后可对食品安全构成潜在威胁；

2、传统矿物油佐剂制备的疫苗引起的注射部位局部刺激反应大；

3、传统矿物油佐剂需要在高剪切力下才能和抗原溶液混合形成乳剂；

综上，需要对现有技术做进一步改进。

参考文献：

(1)中国饲料行业信息网.2012年全年生猪出栏量预计为7.1亿头；

(2)文杰.我国肉鸡产业现状与鸡肉安全.今日畜牧兽医，2013，05，40-42；

(3)李建军，熊良铨，王登峰，等.不同白油佐剂制备新城疫、禽流感疫苗免疫效果的比较研究.第三届中国兽药大会论文集.2010：34-39.

(4)李立权.白油及白油生产技术.润滑油，2003，18(4)：1-6.

(5)何海蓉，姜平，梅忠，宋立芹，岳建新.不同来源白油佐剂质量分析及其制备的禽流感疫苗安全生与免疫效力研究.中国家禽，2009，31：15-18；

(6)陈世豪，郝同杨，施祖灏，等.油乳佐剂及其安全性研究进展.中国家禽，2013，35(16)：44-46.

(7)曾明.疫苗佐剂的设计和选择：动物模型和人体试验.国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册)，2003，26(2)：67-70.

(8)白满英，张金诚.掺伪粮油食品鉴别检验.北京：中国标准出版社，1996.

(9)秦玉明,赵耘,李宇,王栋.国外疫苗佐剂的评价.中国兽药杂志，2005,36：34-36

(10)河牧牧业.养鸡业走出疫病困扰的重要出路；

(11)Stone HD.Efficacy of Experimental Animal and Vegetable Oil-Emulsion Vaccines for Newcastle Disease and Avian Influenza.Avian Diseases，1993,37(2)：399-405；

201310754903.4的发明《一种含人参皂苷的植物油佐剂及其制备方法和应用》告知了植物油佐剂的制备方法：将人参皂苷加入二甲基亚砜中进行溶解，混匀得到人参皂苷溶液；将所述人参皂苷溶液加入植物油中直接混合均匀；或植物油加热至20～40℃后，在植物油中加入去水山梨醇单油酸酯和所述人参皂苷溶液，混合均匀。但是该植物油佐剂存在的不足之处是制备乳剂的条件要求高，佐剂油相和含抗原的水相需要在高剪切力(18000rpm)下才能形成稳定的乳剂。且，佐剂作用较弱。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提出一种植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途；

为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物油疫苗佐剂的制备方法：

S1、制备组分A：

1.1、在搅拌状态下向20～60℃的植物油中加入司班-80和吐温-80，均匀混合(使植物油、司班-80和吐温-80三者完全混合)，获得混合物Ⅰ；

所述植物油、司班-80和吐温-80的体积比为60:24～27:4～6；

1.2、按照5～100mg维生素E/100ml混合物Ⅰ的用量比，向步骤1.1所得的混合物Ⅰ中加入维生素E，维生素E充分溶解后，获得混合物Ⅱ；

1.3、按照人参皂苷6～12mg/100ml混合物Ⅱ的用量比，向步骤1.2所得的混合物Ⅱ加入人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌(过0.22微米的滤膜除菌)，获得组分A；

S2、制备组分B：

将甘油和1,2-丙二醇以体积比10:3.3混合均匀后过滤除菌(过0.22微米的滤膜除菌)，获

得组分B；

S3、制备植物油疫苗佐剂：

将组分A和组分B以体积比45:11混合均匀(实际使用前，才将组分A和组分B混合)，获得植物油疫苗佐剂。

作为本发明的植物油疫苗佐剂的制备方法的改进：步骤1.3中人参皂苷溶液的制备方法为：

按照5～15mg/ml的料液比，向人参皂苷中加入二甲基亚砜，均匀混合，获得人参皂苷溶液。

作为本发明的植物油疫苗佐剂的制备方法的进一步改进：

所述植物油为菜籽油、大豆油、芝麻油、棉籽油、橄榄油、葵花籽油、玉米油、花生油、山茶油或米糠油。

本发明还同时提供了利用上述方法制备所得的植物油疫苗佐剂的用途：用于制备疫苗。

作为本发明的植物油疫苗佐剂的用途的改进：将植物油疫苗佐剂与含抗原的水相混合乳化2～10分钟，获得疫苗乳剂；所述植物油疫苗佐剂与含抗原水相的体积比为56:44。

注：植物油疫苗佐剂中的组分A和B平时不混在一起。在制备疫苗时，组分A和B按体积比45:11混合均匀，得C，再将C和含抗原的水相按体积比56:44混合乳化2～10分钟，获疫苗乳剂。

本发明制备所得的疫苗乳剂，可按照常规的用量及常规的注射方式。

针对现有技术，本发明的技术优势是：

(1)用本发明的植物油佐剂制备疫苗，使疫苗的安全性大幅度提高，克服了传统矿物油佐剂对食品卫生的潜在危害；

(2)采用本发明的油佐剂制备的疫苗注射动物局部刺激性小，克服了传统矿物油佐剂疫苗造成的动物痛苦；

(3)本发明的油佐剂和含抗原的抗原溶液在低剪切力(剪切速度为2500～4500转/分)下就可完成乳化过程(如实验10)，克服了常规矿物油佐剂制备疫苗高剪切力、对乳化设备要求高的缺陷；

(4)植物油佐剂(E515-C)具有以下技术优势：

可促进疫苗免疫抗体提前产生；

可促进小剂量抗原疫苗产生抗体。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为OVA加植物油佐剂(组3～12)和不加植物油佐剂(组2)诱导抗体IgG的比较。

图2为植物油佐剂(E515-C)在促进疫苗免疫后抗体早期产生和ISA206的比较。同一时间点上标字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

图3为植物油佐剂(E515-C)和ISA206在促进小剂量抗原诱导抗体水平的比较。同一时间点上标字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、植物油疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备组分A：

1.1、取600ml菜籽油置铝锅中加热至油温升至20℃；在搅拌状态下，向菜籽油中加入240ml司班-80(上海富畦工贸有限公司产品)和40ml吐温-80(国药集团化学试剂有限公司产品)，使菜籽油、司班-80和吐温-80三者完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入44mg维生素E(Sigma公司产品)，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入7.1ml质量浓度为15mg/mL人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌(过0.22微米的滤膜除菌)、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

人参皂苷溶液的制备方法为：

按照15mg：1ml的质量体积比，将人参皂苷(吉林宏久药业产品)加入至二甲基亚砜(陈分化工有限公司)，获得人参皂苷溶液。

即，本实施例中每100ml组分A约含人参皂苷12mg和维生素E 5mg。

S2、制备组分B：

将甘油和1,2-丙二醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品)按体积比以10:3.3混合，过滤除菌(过0.22微米的滤膜除菌)，获得组分B。

S3、组分A和B平时分离，不混在一起。在制备疫苗时，将组分A和组分B以体积比45:11混合均匀，所得的混合物为植物油疫苗佐剂。

该混合物再和含抗原的水相以体积比56:44混合，乳化获得疫苗乳剂。

实施例2、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml大豆油置铝锅中加热至油温升至25℃；在搅拌状态下，向大豆油中加入240ml司班-80和50ml吐温，使大豆油、司班-80和吐温三者完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入445mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入5ml浓度为15mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分A约含人参皂苷8.4mg和维生素E 50mg；

其余均等同于实施例1。

实施例3、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml芝麻油置铝锅中加热至油温升至30℃；在搅拌状态下，向芝麻油中加入240ml司班-80和60ml吐温-80，使芝麻油、司班-80和吐温-80三者完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入900mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ中加入5.4ml浓度为10mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分A含人参皂苷6mg和维生素E 100mg；

其余均等同于实施例1。

实施例4、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml棉籽油置铝锅中加热至油温升至35℃；在搅拌状态下，向棉籽油中加入260ml司班-80和40ml吐温-80，使棉籽油、司班-80和吐温80完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入45mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入7.2ml浓度为15mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分约A含人参皂苷12mg和维生素E 5mg；

其余均等同于实施例1。

实施例5、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml橄榄油置铝锅中加热至油温升至40℃；在搅拌状态下，向橄榄油中加入260ml司班-80和50ml吐温-80，使橄榄油、司班-80和吐温-80完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入550mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入8ml浓度为10mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分A约含人参皂苷8.8mg和维生素E 60mg；

其余均等同于实施例1。

实施例6、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml葵花籽油置铝锅中加热至油温升至45℃；在搅拌状态下，向葵花籽油中加入260ml司班-80和60ml吐温-80，使葵花籽油、司班-80和吐温-80完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入920mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入6ml浓度为10mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分A约含人参皂苷6.5mg和维生素E 100mg；

其余均等同于实施例1。

实施例7、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml玉米油置铝锅中加热至油温升至50℃；在搅拌状态下，向玉米油中加入270ml司班-80和40ml吐温-80，使玉米油、司班-80和吐温-80完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入50mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入10ml浓度为10.5mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分A约含人参皂苷11.5mg和维生素E 5.5mg；

其余均等同于实施例1。

实施例8、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml山茶油置铝锅中加热至油温升至55℃；在搅拌状态下，向山茶油中加入270ml司班-80和50ml吐温-80，使山茶油、司班-80和吐温-80完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入8.5ml浓度为10mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分A约含人参皂苷9.2mg和维生素E 60mg；

其余均等同于实施例1。

实施例9、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml米糠油置铝锅中加热至油温升至60℃；在搅拌状态下，向米糠油中加入270ml司班-80和60ml吐温-80，使米糠油、司班-80和吐温-80完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入930mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

其余均等同于实施例1。

实施例10、将实施例1步骤S1制备组分A更改为以下步骤：

1.1、取600ml花生油置铝锅中加热至油温升至60℃；在搅拌状态下，向花生油中加入240ml司班-80和40ml吐温-80，使花生油、司班-80和吐温-80完全混合，获得混合物Ⅰ。

1.2、向步骤1.1所得混合物Ⅰ中加入44mg维生素E，维生素E充分溶解后获得混合物Ⅱ；

1.3、向步骤1.2所得混合物Ⅱ加入10ml浓度为10mg/mL的人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌、并将所得滤液冷却至室温(25℃)，获得组分A；

即，本实施例中每100ml组分A约含人参皂苷11.4mg和维生素E 5mg；

其余均等同于实施例1。

实验1：山茶油(CO)型植物油疫苗佐剂中的VE和GS对模式抗原OVA有协同佐剂作用

1.材料和方法

1.1.实验动物：雌性ICR小鼠(18～22g)购自上海斯莱克实验动物有限公司。饲养于IVC独立送风饲养笼具。饲喂无菌饲料和水，室内温度为25±1℃，湿度为50％±10％。动物适应饲养1周后，开始试验。

1.2.抗原溶液：将模式抗原卵清白蛋白(OVA)(Sigma公司产品)加入到生理盐水中，OVA的终浓度为100μg/ml，即得。

1.3.植物油佐剂：

(1)CO+VE+GS:实施例8制得的组分A。

(2)CO+VE：实施例8制得的组分A去除GS。

(3)CO+GS：实施例8制得的组分A去除VE。

1.4.组分B

按实施例1，步骤S1制备组分B。

1.5.乳化方法

将步骤1.3中各植物油佐剂组分A与组分B按体积比45:11混合，再将该混合液与抗原溶液按体积比56:44的比例混合，用乳化机(北京卓川电子科技有限公司，型号：FF-ESB-300)乳化6分钟(3000转/分)，制成相应的乳白色疫苗乳剂。

1.6.动物分组和处理

将36只小白鼠随机分成6组。每组动物按表1肌肉注射疫苗二次，间隔二周。

表1

1.7.采血

二免后1、2周采血，制备血清，供抗体IgG检测。

1.8.抗体检测方法

用ELISA方法检测抗OVA的血清特异性IgG水平，方法如下：

(1)抗原包被：取96孔酶标板，按100μL/孔加入OVA溶液(5μg/mL，溶于碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)，振荡混匀，封板，于4℃过夜。

(2)洗涤：弃去酶标板内液体，按300μL/孔加入PBST洗涤液洗涤3次。拍干。

(3)封闭：按300μL/孔加入5％以PBS稀释的胎牛血清，置于37℃环境下孵育2h。

(4)洗涤同上，按100μL/孔加入胎牛血清稀释液稀释的待检血清，于37℃环境下孵育2h。

(5)洗涤同上，按100μL/孔加入HRP标记的羊抗鼠抗体，于37℃孵育2h。

(6)洗涤同上，按100μL/孔加入现配的TMB底物工作液(避光)，于室温孵育10min。

(7)按50μL/孔加入2M H2SO4终止液，轻轻振荡混匀，在15min内用酶标板测得其在450nm波长下的OD值。

2.结果

表2结果说明，植物油中添加VE时(CO+VE)，抗体水平和植物油(CO)组比较无显著变化；植物油中添加GS时(CO+GS)，抗体水平显著升高；植物油中同时添加VE和GS时(CO+VE+GS)，抗体水平显著高于添加VE(CO+VE)或GS(CO+GS)的植物油组，说明将VE和GS同时添加到植物油时，抗体水平最高，佐剂作用最强，两者有协同佐剂作用。

表2

注：同一列数据标注字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

实验2：山茶油型植物油疫苗佐剂中的VE和GS对FMDV疫苗有协同佐剂作用

1、材料和方法

1.1.将实验1中的抗原由“OVA”更改为“FMDV”，即，将猪O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活抗原加入到生理盐水中，146s抗原终浓度为3μg/ml，即得抗原溶液。动物分组和处理按表3肉注射疫苗二次，间隔二周。

表3

1.2.采血

同实验1。

1.3.抗体检测方法

检测血清中抗FMDV特异性抗体及其亚类，步骤如下：

(1)包被：将兔抗O型FMDV血清按1:8加入碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，混匀后在96孔酶标板中每孔加入50μL包被，放置于4℃孵育过夜；

(2)洗板：用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)清洗96孔板3～5次，每孔300μL，每次2分钟(以下同)；

(3)封闭：每孔加入300μL含5％(w/v)脱脂乳的PBS封闭液，37℃孵育2h；

(4)洗板，每孔加入50μL 1:8稀释的O型FMDV抗原，4℃孵育2h；

(5)洗板，每孔加入50μL经1:200稀释待检血清和阴性血清，37℃孵育1h；

(6)洗板，加入1:1000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体，50μL/孔，37℃孵育1h；

(7)洗板，加入TMB底物溶液显色，50μL/孔，37℃孵育10min；

(8)洗板，加入50μL/孔2M H₂SO₄终止反应；

(9)酶标仪测定OD 450nm值。

2.结果

表4结果说明，植物油中添加VE时(CO+VE)，抗体水平和植物油(CO)组比较无显著变化；植物油中添加GS时(CO+GS)，抗体水平显著升高；植物油中同时添加VE和GS时(CO+VE+GS)，抗体水平显著高于添加VE(CO+VE)或GS(CO+GS)的植物油组，说明将VE和GS同时添加到植物油时，抗体水平最高，佐剂作用最强，两者有协同佐剂作用。

表4

注：同一列数据标注字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

实验3：菜籽油型植物油疫苗佐剂中的VE和GS对模式抗原OVA有协同佐剂作用

1、材料和方法

1.1、将实验1中的山茶油更改为菜籽油

(1)BO+VE+GS：实施例1制备所得的植物油抗原佐剂，组分A；

(2)BO+VE：取消实施例1中人参皂苷(GS)成分；

(3)BO+GS：取消实施例1中维生素E(VE)成分；

1.2、组分B

按实施例1，步骤S1制备组分B。

1.3、将上述各植物油疫苗佐剂组分A与组分B按体积比45:11混合，再将该混合物和抗原溶液按体积比以56:44的比例混合，用乳化机(北京卓川电子科技有限公司，型号：FF-ESB-300)乳化6分钟(4000转/分)，制成乳白色疫苗乳剂。

1.4、将36只小白鼠随机分成6组。每组动物按表5肌肉注射疫苗二次，间隔二周。

表5

1.5、采血

二免后1、2周采血，制备血清，供抗体IgG检测。

1.6.抗体检测方法

同实验1。

2.结果

表6结果说明，植物油中添加VE时(CO+VE)，抗体水平和植物油(CO)组比较无显著变化；植物油中添加GS时(CO+GS)，抗体水平显著升高；植物油中同时添加VE和GS时(CO+VE+GS)，抗体水平显著高于添加VE(CO+VE)或GS(CO+GS)的植物油组，说明将VE和GS同时添加到植物油时，抗体水平最高，佐剂作用最强，两者有协同佐剂作用。

表6

注：同一列数据标注字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

实验4：菜籽油型植物油疫苗佐剂的VE和GS对FMDV疫苗有协同佐剂作用

1、材料和方法

1.1.将实验3中的抗原由“OVA”更改为“FMDV”，即，将猪O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活抗原加入到生理盐水中，146s抗原终浓度为3μg/ml，即得抗原溶液。动物分组和处理按表3肉注射疫苗二次，间隔二周。

表7

1.2.采血

同实验1。

1.3.抗体检测方法

同实验2。

2.结果

表8结果说明，植物油中添加VE时(CO+VE)，抗体水平和植物油(CO)组比较无显著变化；植物油中添加GS时(CO+GS)，抗体水平显著升高；植物油中同时添加VE和GS时(CO+VE+GS)，抗体水平显著高于添加VE(CO+VE)或GS(CO+GS)的植物油组，说明将VE和GS同时添加到植物油时，抗体水平最高，佐剂作用最强，两者有协同佐剂作用。

表8

注：同一列数据标注字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

实验5：大豆油(SO)型植物油疫苗佐剂中的VE和GS对模式抗原OVA有协同佐剂作用

1、材料和方法

1.1、将实验1中的山茶油更改为大豆油：

(1)SO+VE+GS：实施例1制备所得的植物油佐剂，组分A；

(2)SO+VE：取消实施例1中人参皂苷(GS)成分；

(3)SO+GS：取消实施例1中维生素E(VE)成分；

1.2、组分B

按实施例1，步骤S1制备组分B。

1.4、将36只小白鼠随机分成6组。每组动物按表9肌肉注射疫苗二次，间隔二周。

表9

2.结果

表10结果说明，植物油中添加VE时(SO+VE)，抗体水平和植物油(SO)组比较无显著变化；植物油中添加GS时(SO+GS)，抗体水平显著升高；植物油中同时添加VE和GS时(SO+VE+GS)，抗体水平显著高于添加VE(SO+VE)或GS(SO+GS)的植物油组，说明将VE和GS同时添加到植物油时，抗体水平最高，佐剂作用最强，两者有协同佐剂作用。

表10

注：同一列数据标注字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

实验6：大豆油(SO)型植物油疫苗佐剂中的VE和GS对FMDV疫苗有协同佐剂作用

1、材料和方法

1.1.将实验3中的抗原由“OVA”更改为“FMDV”，即，将猪O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活抗原加入到生理盐水中，146s抗原终浓度为3μg/ml，即得抗原溶液。动物分组和处理按表11肉注射疫苗二次，间隔二周。

1.2.采血

同实验1。

1.3.抗体检测方法

同实验2。

表11

2.结果

表12结果说明，植物油中添加VE时(SO+VE)，抗体水平和植物油(SO)组比较无显著变化；植物油中添加GS时(SO+GS)，抗体水平显著升高；植物油中同时添加VE和GS时(SO+VE+GS)，抗体水平显著高于添加VE(SO+VE)或GS(SO+GS)的植物油组，说明将VE和GS同时添加到植物油时，抗体水平最高，佐剂作用最强，两者有协同佐剂作用。

表12

注：同一列数据标注字母不同表示有显著差异(P<0.05)。

实验7：植物油组分A+组分B对模式抗原OVA的佐剂作用

1、材料和方法

1.1、组分A：按实施例1～10方法分别制备含植物油菜籽油、大豆油、芝麻油、棉籽油、橄榄油、葵花籽油、玉米油、花生油、山茶油或米糠油型的组分A；

1.2、组分B：按实施例1，步骤S1制备组分B。

1.3、将上述各型植物油的A组分分别与组分B按体积比45:11混合，再将该混合物和抗原溶液按体积比以56:44的比例混合，用乳化机(北京卓川电子科技有限公司，型号：FF-ESB-300)乳化6分钟(3000转/分)，制成乳白色疫苗乳剂。

1.4、将72只小白鼠随机分成6组。每组动物按表13肌肉注射疫苗二次，间隔二周。

表13

1.5、采血

同实验1。

1.6.抗体检测方法

同实验1。

2.结果

结果如图1，说明，模式抗原OVA配伍植物油佐剂(组3～12)诱导的抗体水平显著高于不配伍植物油佐剂的对照组(组2)。

实验8：本发明植物油佐剂(E515-C)促进疫苗免疫抗体提前产生

1.材料和方法

1.1.含本发明佐剂的口蹄疫疫苗：同实验6；

1.2.含ISA 206佐剂和口蹄疫疫苗：按体积比56:44将ISA206佐剂(法国Seppic公司出品)和FMDV抗原溶液(按实验2)用乳化机(北京卓川电子科技有限公司，型号：FF-ESB-300)乳化6分钟(4000转/分)，制成乳白疫苗乳剂。

1.3.动物分组和处理：将18只小白鼠随机分成3组。每组动物按表15肌肉注射疫苗二次，间隔二周。

表14

1.4.采血：二免前1周，二免后3天、1～6周采血，制备血清，供抗体IgG检测。

1.5.抗体检测方法：同实验2。

2.结果

结果如图2，表明，植物油佐剂(E515-C)和ISA206均有佐剂作用。但在二免后14周之内E515-C组的抗体水平显著高于ISA 206组，说明植物油佐剂(E515-C)在促进免疫早期抗体的产生效果优于ISA206。

实验9：植物佐剂(E515-C)可促进小剂量抗原诱导的抗体产生

1.材料和方法

1.1.水相：将猪O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活抗原加入到生理盐水中，146s抗原终浓度调节到2μg/ml和1μg/ml两种。

1.3.组分A：同实验2。

1.4.组分B：按实施例1，步骤S1制备组分B。

1.5.乳化方法：同实验2，制备抗原含量0.45μg/ml和0.9μg/ml两种疫苗。

1.6.动物分组和处理：将36只小白鼠随机分成6组。每组动物按表15肌肉注射疫苗二次，间隔二周。

表15

1.7.采血

二免后1、2周采血，制备血清，供抗体IgG检测。

1.8.抗体检测方法

同上。

2.结果

如图3表示，植物油佐剂(E515-C)和ISA 206不能促进较小剂量抗原诱导机体产生抗体；抗原用量增加1倍时，E515-C显示佐剂作用，显著促进抗体水平的升高，而ISA206则不显示佐剂作用，不能促进抗体水平的升高。

实验10、植物油佐剂E515-C在低剪切力下和水相形成稳定的乳剂

1.材料和方法

1.1.10号白油佐剂：用量筒量取100ml 10号白油(杭州炼油厂产品)，置铝锅中。用电炉加热白油至60℃，在白油中加入2g硬脂酸铝，边加，边搅拌，使其完全溶解，待白油温度降至50℃时，加入6ml司班-80，搅拌均匀，用多层无菌医用纱布过滤，得清亮的白油佐剂。

1.2.植物油佐剂E515-C：按实施例1制备组分A和组分B。

1.3.抗原溶液：按实验2制备O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活抗原溶液。

1.4.E515-C佐剂FMDV疫苗乳剂制备：取E515-C的组分A和组分B，按体积比45:11混合，再将该混合液按体积比56:44和FMDV抗原溶液混合，用乳化机在3000rpm时乳化6分钟，即得乳白色疫苗乳剂。

1.5.白油佐剂FMDV疫苗乳剂制备：将1.1制备的白油佐剂按体积比56:44和FMDV抗原溶液混合，用乳化机分别在3000rpm和18000rpm两种剪切力下乳化6分钟制备两种疫苗乳剂。

1.6.疫苗乳剂稳定性检测：吸取乳剂10ml加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相大于0.5ml者判为分层。

2.结果与分析

检测结果见表16。白油佐剂需要在高剪切力下才能和水相形成稳定的疫苗乳剂，在低剪切力下形成的乳剂不稳定；而植物油佐剂E515-C在低剪切力下就能和水相形成稳定的疫苗乳剂。

表16

实验11、植物油佐剂E515-C疫苗较矿物佐剂疫苗乳剂在注射部位容易吸收

1、材料和方法

1.1、10号白油佐剂：同实验10。

1.2、植物油佐剂E515-C：同实验10。

1.3、抗原溶液：同实验10。

1.4、E515-C佐剂FMDV疫苗乳剂制备：同实验10。

1.5、白油佐剂FMDV疫苗乳剂制备：将1.1制备的白油佐剂按体积比56:44和FMDV抗原溶液混合，用乳化机在18000rpm时乳化6分钟，即得乳白色疫苗乳剂。

1.6、疫苗注射和结果观察：将6只ICR小鼠中的3只每只皮下注射0.2ml的E515-C佐剂FMDV疫苗乳剂，其余3只皮下注射0.2ml的白油佐剂FMDV疫苗乳剂。观察注射部位局部肿胀，以及注射后三周处死动物，检出注射部位疫苗乳剂吸收情况。

2.结果和分析

注射了E515-C佐剂FMDV疫苗的小鼠，未见注射部位有肿胀和疫苗乳剂残留；而注射了白油佐剂FMDV疫苗的小鼠，在注射部位有局部肿胀，可见疫苗乳剂残留。结果说明，植物油佐剂制备的疫苗在注射部位吸收良好，而用矿物油制备的疫苗在注射部位吸收不良。

Claims

1.植物油疫苗佐剂的制备方法，其特征是：

S1、制备组分A：

1.1、在搅拌状态下向20～60℃的植物油中加入司班-80和吐温-80，均匀混合，获得混合物Ⅰ；

所述植物油、司班-80和吐温-80的体积比为60:24～27:4～6；

所述植物油为菜籽油、大豆油、芝麻油、棉籽油、橄榄油、葵花籽油、玉米油、花生油、山茶油或米糠油；

1.3、按照人参皂苷6～12mg/100ml混合物Ⅱ的用量比，向步骤1.2所得的混合物Ⅱ加入人参皂苷溶液，搅拌均匀后过滤除菌，获得组分A；

S2、制备组分B：

将甘油和1,2-丙二醇以体积比10:3.3混合均匀后过滤除菌，获得组分B；

S3、制备植物油疫苗佐剂：

将组分A和组分B以体积比45:11混合均匀，获得植物油疫苗佐剂。

2.根据权利要求1所述植物油疫苗佐剂的制备方法，其特征是：

所述步骤1.3中人参皂苷溶液的制备方法为：

3.利用权利要求1或2所述方法制备所得的植物油疫苗佐剂的用途，其特征是：用于制备疫苗：将植物油疫苗佐剂与含抗原的水相于2500～4500转/分的剪切速度下混合乳化2～10分钟，获得疫苗乳剂；所述植物油疫苗佐剂与含抗原水相的体积比为56:44。