CN107073097A - 双佐剂疫苗组合物、制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗，并涉及其制备方法和用途，所述疫苗包含在水包油包水(WOW)乳液中的有效量的至少一种抗原和另外的佐剂。

Description

双佐剂疫苗组合物、制备和用途
本发明涉及疫苗、它们的制备和用途。本发明更具体涉及双佐剂疫苗，其包含在水包油包水(WOW)乳液中的至少一种抗原和另外的佐剂。本发明的疫苗可包含任何类型的抗原(优选细菌抗原)，并且特别适宜兽医用途，例如用于给鸡(chicken)接种疫苗。
发明背景
疫苗通常与佐剂一起配制，以增强并改善免疫反应，尤其延长抗体反应。例如弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)(Proceedings of The Society for Experimental Biologyand Medicine,1942,49,548-553)，其对应于乳化于矿物油中的抗原溶液，首先被用作免疫增强剂或用作免疫加强剂(immunobooster)。弗氏佐剂形成油包水(WO)乳液，并本质上通过抗原的持续释放来展现佐剂效果。
已经评估了各种各样的其它佐剂系统，以便提供有效的疫苗。这些包括例如壳聚糖、细胞因子、寡核苷酸、脂质、毒素、半抗原载体或氢氧化铝。在这方面，Matsumoto等人(Avian diseases,1971,15,109-117)已经测试了铝衍生物(例如氢氧化铝凝胶和铬铝)在疫苗中的功效。Blackall等人(Avian Diseases,1992,36,632-636)已经比较了氢氧化铝佐剂和WO乳液。角鲨烯、皂苷、Quil A、类脂胺、聚糖或阿夫立定也已经作为佐剂被添加到疫苗中，以改善它们的功效。
EP 0 640 348涉及包含WO乳液和免疫刺激性聚糖的疫苗。US 2014/0099358提议包含油包水乳液以及铝或铝的化合物或TiterMax(角鲨烯)的疫苗。然而，组合的乳液-佐剂系统的设计因为可能的副作用而产生安全性问题(Reid和Blackall,Avian Diseases,1987,31,59-63)。此外，传统的WO乳液经常具有高粘度并且难以配制或注射。
基于WOW乳液的疫苗已经在禽类胚胎的卵内免疫中测试(US 5,817,320)，并针对(against)具体的病毒例如纽卡斯尔病病毒、传染性支气管炎病毒(Cajavec等人,ActaVeterinaria Hungarica,1998,46,25-34)和传染性鼻炎(Blackall,World’s PoultryScience Journal,1995,51,17-26)进行测试。
根据用于制备WOW乳液的表面活性剂的性质和比例，已经在稳定性方面使此类在WOW乳液中的疫苗得到了改善。关于这一点，Hunter和Bennet已经研究了在低于2的亲水-亲脂平衡(HLB)下的式HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)b的聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(US 5,622,649)。他们还已经在用于乙型肝炎感染的接种疫苗方法中测试了此类WOW乳液，并已提及它们对抗破伤风、疟疾、艾滋病、流感和肺炎球菌性肺炎的效力。
Jiao和Burgess(AAPS Pharm.Sci.,2003,5,1-12)已经关于两种具体的表面活性剂(司盘83(Span 83)和吐温80(Tween 80))的浓度评估了WOW多相乳液的长期稳定性，并且已确定，20％司盘83和0.1％吐温80的浓度比率提供了WOW乳液的最佳长期稳定性。然而，WOW乳液不总是产生令人满意的免疫反应。此外，WOW可能涉及许多潜在的缺点，包括它们缺乏均一性(例如在颗粒的尺寸分布轮廓(profile)中)和不均匀的制剂的可能的粘性。此外，尚未确立此类系统用于配制大的对象(例如细胞)的合适性。
因此，本领域对替代的、安全的和改善的疫苗，尤其用于动物中的疫苗存在着需求。
发明概述
本发明提供具有改善的功效的新颖疫苗。本发明特别公开了将WOW乳液与佐剂化合物组合的双佐剂系统疫苗。本发明源自发明人的意料不到的以下发现：此类双佐剂系统是安全的并且在体内产生改善的免疫反应。尤其，本发明显示，此类疫苗在非人动物中诱导有效的保护性免疫反应，并且特别适合于细菌抗原，优选包括全细胞细菌。
因此，本发明的一个目的涉及疫苗，其包含有效量的在水包油包水(WOW)乳液中的至少一种抗原和另外的佐剂。
本发明的另一个目的涉及疫苗，其在水包油包水(WOW)乳液中包含有效量的至少一种抗原和佐剂化合物。
本发明的另一个目的是如上所定义的疫苗，其用于在非人动物中诱导针对所述抗原的免疫反应。
本发明的进一步目的涉及在非人动物中诱导针对抗原的免疫反应的方法，其包括对所述动物施用组合物，所述组合物包含有效量的在WOW乳液中的所述至少一种抗原和另外的佐剂。
本发明的另一个目的是制备疫苗的方法，其包括：
a)将至少一种抗原的溶液在油基(oil base)中乳化，由此形成WO乳液，
b)将所述WO乳液加入到分散相中，由此形成WOW乳液，并且任选地，进一步乳化所述WOW乳液，和
c)将所述WOW乳液与另外的佐剂混合，所述另外的佐剂优选与额外量的所述至少一种抗原组合。
在特别的实施方式中，另外的佐剂是氢氧化铝。
在另一个特别的实施方式中，至少一种抗原是细菌抗原，优选为活细菌、减毒细菌或灭活细菌。
在本发明的特别方面，如上所定义的疫苗包含包埋在油性颗粒中的所述抗原，所述油性颗粒优选具有1至40μm的尺寸。
如将进一步公开的，本发明组合物特别适合给非人动物，特别是家禽(例如鸡(chicken)、水禽)或鸟类接种。
附图说明
图1：WOW乳液的说明。
图2A-2B：通过皮下途径(SQ,图2A)和肌内途径(IM,图2B)用疫苗A处理的鸡中针对肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)(SE)的保护百分率。
图3A-3B：通过皮下途径(SQ,图3A)和肌内途径(IM,图3B)用疫苗A处理的鸡中针对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)(ST)的保护百分率。
图4：通过皮下和肌内途径用疫苗A处理的鸡中针对肯塔基沙门氏菌(SalmonellaKentucky)(SK)的保护百分率。
图5A-5B：通过皮下途径(SQ,图5A)和肌内途径(IM,图5B)用疫苗A处理的鸡中针对海德尔堡沙门氏菌(Salmonella Heidelberg)(SH)的保护百分率。
图6：小母鸡中对于疫苗A的肌内注射位点反应。
发明详述
本发明提供新颖且改善的疫苗组合物、其制备方法和它们的用途。本发明尤其公开了新颖的疫苗，其包含在WOW乳液中的有效量的至少一种抗原，并进一步包含佐剂。本发明源自发明人的意料不到的以下发现：此类双佐剂系统可容易注射、是安全的，并且提供比使用其它佐剂系统的现有技术疫苗更大的功效(保护性免疫)。尤其，发明人已经证明了关于包含至少一种抗原和双佐剂系统的本发明的疫苗的协同效应。发明人也已经证明了此类疫苗在体内针对沙门氏菌感染的改善的保护功效以及它们的安全性。
因此，本发明的一个目的涉及疫苗或组合物，其包含有效量的在WOW乳液中的至少一种抗原和另外的佐剂。
本发明的另一个目的是疫苗或免疫原性组合物，其在WOW乳液中包含抗原和另外的佐剂，其中所述抗原包括在包含内水相和油相的油性颗粒中，并且其中所述另外的佐剂包括在外水相中，所述另外的佐剂优选与所述抗原复合。
本发明的另一个目的是疫苗或免疫原性组合物，其在WOW乳液中包含全细胞，其中WOW乳液中的至少90％的油性颗粒具有低于20μm的尺寸，所述组合物具有优于4的OD600/ml，且所述组合物中的至少60％的细胞包含在所述油性颗粒中。
本发明的进一步的目的是在非人动物中诱导针对至少一种抗原的免疫反应的方法，其包括对所述动物施用疫苗或组合物，该疫苗或组合物在WOW乳液中包含有效量的所述至少一种抗原和佐剂化合物。
本发明的进一步的目的是针对病原体给非人动物接种疫苗的方法，其包括对所述动物施用疫苗或组合物，该疫苗或组合物在WOW乳液中包含有效量的至少一种病原体抗原和佐剂化合物。
本发明的进一步的目的是组合物，其在WOW乳液中包含有效量的至少一种抗原和佐剂化合物，用于在非人动物中诱导针对所述至少一种抗原的免疫反应。
抗原
术语“抗原”指在被引入动物中时可被该动物的免疫系统识别，并引起免疫反应的试剂。在施用于动物时，抗原通常与免疫系统的抗原识别分子(例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体(TCR)发生特异性相互作用，以引起免疫反应，所述免疫反应导致细胞反应(例如记忆细胞(例如记忆B-细胞和T-细胞)或细胞毒性细胞)和/或体液(抗体)反应的产生。
本发明可以使用任何类型的抗原，非限制性地例如为完整的病原体(例如细胞、病毒)或其片段(fragments)或部分(fractions)(例如蛋白质、多肽、肽、核酸、脂质等)。病原体可以是能够感染动物(例如人、禽类(例如鸡、火鸡、鸭子、鸽子等)、犬、猫、牛、猪或马)的任何试剂。优选地，抗原是禽类(更优选鸡)病原性试剂。抗原可以是例如完整的病原体、天然表达在例如病原体或感染的或患病的(例如肿瘤)细胞的表面上的“表面抗原”。
更尤其，抗原可以是任何病原性微生物或非病原性微生物，例如病毒、细菌、任何其它寄生虫或抗原。这些可以是活的、减毒的、灭活的或杀死的微生物(或者是完整的微生物或者是微生物的亚单位)、灭活的嵌合微生物或重组微生物、破裂的微生物、突变微生物、有缺陷的微生物或它们的组合。抗原还可以是或包括完整的微生物结构(例如病毒、细菌或寄生虫)的一个或更多个表位或抗原性部分，例如来自病原体的抗原性蛋白、重组蛋白，优选病毒抗原例如病毒衣壳蛋白、细胞壁蛋白、肽或细菌或寄生虫结构的部分例如多糖、脂多糖和糖蛋白的制剂。抗原还可以是DNA或重组DNA。可以以纯化的形式或未纯化的形式提供抗原。
当抗原是减毒的微生物(例如病毒、细菌或其它病原体)时，该减毒病原体保留免疫原性性质并且基本上没有致病性质。减毒(作用)可来自天然或人工的减毒方法，例如在活的动物或各种各样的天然培养基(包括器官、细胞、含胚卵等)中传代。还可以通过化学处理、干燥、老化、对低温或特别的培养条件的适应、遗传缺失(genetic deletion)等来获得人工减毒。
抗原还可以包括杀死的灭活微生物。通常经由化学方法或物理方法来实现用于接种的灭活病毒的制备。可通过例如用酶、甲醛、(β-丙内酯、二元吖丙啶或其衍生物来实现化学灭活。然后可使如此得到的灭活病毒中和或稳定。可通过使病毒经受高能辐射(例如紫外光、X-辐射或(γ-辐射)来实施物理灭活。
可例如通过热、压力和/或经常称为杀菌剂的化学试剂的使用来将细菌(包括孢子)灭活。例如，腐蚀性组合物(例如甲醛和次氯酸钠(漂白剂))已经用于将细菌灭活。或者，可以通过环氧乙烷暴露、伽马辐照、蒸汽杀菌、或通过使用近临界二氧化碳处理和超临界二氧化碳处理来获得细菌的灭活。还可以通过对致病性中所涉及的一种或数种基因的基因修饰来灭活细菌或使其无毒性。此类基因修饰的实例公开在例如WO2012/092226中。
还可以从商业来源购买此类减毒的或灭活的微生物(例如病毒、细菌或其它禽类寄生虫)。
抗原可以是同种(例如鸡病毒来保护鸡)类型或异种(例如火鸡病毒来保护鸡)类型。
本发明的疫苗或组合物可包含活抗原、合成抗原、其片段或部分片段(fragments)或部分(fractions)的组合。所述组合物还可包含来自各种各样病原体的抗原，以提供广泛的免疫反应。
根据本发明，抗原可以是(源自)导致常见疾病的病毒，所述常见疾病如由G.D.Butcher、J.P.Jacob和F.B.Mather(PS47,Veterinary Medicine-Large AnimalClinical Sciences Department,Florida Cooperative Extension Service,InstituteofFood and Agricultural Sciences,University of Florida；1999年5月)所描述的，例如为禽痘、纽卡斯尔病、传染性支气管炎、鹌鹑支气管炎、造淋巴细胞组织增生、马雷克病、传染性粘液囊病、传染性喉气管炎、产蛋下降综合征、Reovirosis、传染性腱鞘炎、禽脑脊髓炎、肿头综合征、火鸡鼻气管炎或禽流感；源自导致支原体病、巴斯德氏菌病、沙门氏菌病、鲍特杆菌病等的细菌；和/或源自导致球虫病、弯曲杆菌病的其它禽类寄生虫。在本发明的疫苗组合物中使用的优选疫苗包括完整的减毒活病毒株。
优选的抗原是细胞病原体或源自细胞病原体，尤其源自细菌或真菌，例如胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、耶尔森菌属(Yersinia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、弧菌属(Vibrio)和贾第虫属(Giardia)、内阿米巴属(Entamoeba)和隐孢子虫属(Cryptosporidium)。
在特别的实施方式中，至少一种抗原包含细菌细胞，优选活细菌、减毒细菌或灭活细菌。在本发明的上下文中，细菌细胞可包括全细胞、细胞亚部分(sub-fractions)或碎片或其团块(pellets)。
在优选的实施方式中，细菌细胞是沙门氏菌属细菌，优选选自以下菌株：肠炎沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌或其组合。更尤其，抗原包含数种不同的细菌细胞的组合，更优选沙门氏菌属的不同菌株的组合，和/或其亚部分。在优选的实施方式中，抗原包含选自以下的至少两种不同的沙门氏菌细胞：肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肯塔基沙门氏菌。
佐剂
如所指出的，本发明将WOW制剂与佐剂化合物组合。WOW制剂和佐剂均发挥佐剂活性，当WOW制剂和佐剂根据本发明组合时，其令人惊讶地提供协同效应。
在本发明的上下文中，另外的佐剂是可促进或刺激对抗原的免疫反应的任何化合物。
佐剂的非限制性实例包括蛋白质、多肽、肽、核酸(例如寡核苷酸)、糖、毒素、脂质、合成分子或盐(例如铝盐)。佐剂的更具体的实例包括增强免疫系统对抗原的反应的化学和多肽免疫刺激剂。此类佐剂可包括例如氢氧化铝、磷酸铝、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、细菌毒素、几丁质衍生物和壳聚糖等。
目前，铝盐与抗原作为铝沉淀的疫苗和作为铝吸附的疫苗使用。作为铝盐的实例，可引用氢氧化铝。
在优选的实施方式中，另外的佐剂是铝盐，优选氢氧化铝。
在特别的实施方式中，佐剂是抗原-佐剂复合物，优选与额外量的如上定义的至少一种抗原组合。更优选地，佐剂是抗原-氢氧化铝复合物。
WOW乳液
术语“WOW”指水包油包水乳液。水包油包水(WOW)乳液是其中小的水滴或水泡(内水相)包埋在油性颗粒(油相)内，所述油性颗粒分散在连续水相(外水相)中的乳液。WOW乳液产生自其中水相被加入到油相中的初级乳液，随后其中油相分散在水相中的至少一种二级乳液。如图1中所阐述的，本发明的特别WOW乳液或组合物通常包含对应于由第一表面活性剂膜包围的水泡或小水滴的内水相、由第二表面活性剂膜包围的油相、和外水相。
典型的WOW组合物是颗粒组合物，其包含包埋在油性颗粒中的水泡，所述油性颗粒分散在外水相中。
优选地，抗原或其部分(fraction)含于包埋或封装在油性泡中的内水相中，且另外的佐剂化合物在外水相中。在优选的实施方式中，外水相包含一小部分(a fraction of)所述至少一种抗原和所述另外的佐剂，优选处于抗原-佐剂复合物的形式。根据优选的实施方式，组合物中抗原总量的约75％在油性泡中，且组合物中抗原总量的约25％在外水相中，其任选地与佐剂化合物复合。
WOW乳液可具有各种各样的尺寸/分布特性。然而，在优选的实施方式中，油性颗粒的尺寸在1至40μm、更优选3至30μm、甚至更优选3至20μm、最优选5至20μm。颗粒的尺寸通常指其直径。本发明的确显示，此类尺寸范围一经体内施用提供最佳的免疫效力。
更尤其，在本发明的优选WOW组合物中，至少80％的油性颗粒具有小于20μm的尺寸，更优选至少85％、甚至更优选至少90％的油性颗粒具有小于20μm的尺寸。另外，在优选的实施方式中，至少5％、优选约10％的油性颗粒具有等于或小于10μm的尺寸，优选5至10μm的尺寸。本发明的最优选组合物具有这样的油性颗粒的分布轮廓：至少90％的油性颗粒具有小于或等于20μm的尺寸并且至少10％具有小于10μm的尺寸(例如D10≤10μm且D90≤20μm)。本发明显示，具有此类尺寸和分布轮廓，可产生针对细菌抗原的特别强的免疫反应。
油
用于本发明的WOW乳液中的合适的油非限制性地包括植物油、动物油和矿物油、或它们的混合物。
植物油的实例非限制性地包括椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、低芥酸菜子油、红花油、芝麻油、大豆油(soybean oil)、葵花油、芥子油、羊毛脂油、杏仁油、摩洛哥坚果油、蓖麻油、澳洲坚果油、腰果油、榛子油、蒙刚果(mongogo nut)、胡桃油、开心果、核桃油、红厚壳油(calophyllum oil)、鳄梨油、大豆油(soya oil)、荷荷巴油、或其混合物。
动物油的实例非限制性地包括鱼油、海龟油、貂油、鸡脂肪油、鲸油、抹香鲸油、海豹油、鳕鱼肝油、鸸鹋油、氢化角鲨烯(或全氢角鲨烯)、或其一种或更多种混合物。
矿物油的实例非限制性地包括石蜡油例如石蜡和异链烷烃、凡士林油、Drakeol或轻质矿物油5号。
在特别的实施方式中，本发明的WOW乳液和油性颗粒包含一种或数种油，其优选选自植物油、动物油和矿物油、或其混合物。优选地，WOW乳液和油性颗粒包含至少一种矿物油。
表面活性剂
在优选的实施方式中，本发明的WOW乳液进一步含有至少一种表面活性剂。通常，在为制剂提供适当的亲水-亲脂平衡(HLB)的条件下选择、或组合或使用一种或更多种表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合的HLB是其亲水或亲脂的程度的度量，如Griffin所述的(Journal of the Society of Cosmetic Chemists,1949,1(5),311-26和Journalof the Society of Cosmetic Chemists,1954,5(4),249-56)，通过计算分子的不同区域的值来确定。
最优选地，在第一乳液中使用的表面活性剂或表面活性剂的组合具有低的HLB值(通常在4至7、优选为约6.0)，且在第二乳液中使用的表面活性剂或表面活性剂的组合具有高的HLB值(通常在7至15，优选为约10.5)。
在乳液疫苗中使用的表面活性剂的实例非限制性地包括失水山梨糖醇单油酸酯(司盘80)、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)、失水山梨糖醇倍半油酸酯(司盘83)、卵磷脂和失水甘露糖醇单油酸酯(mannide monooleate)、或它们的混合物。
优选地，本发明的WOW乳液包含至少一种选自聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯和失水山梨糖醇单油酸酯的表面活性剂。更优选地，在第一WO乳液中使用的表面活性剂是司盘80和吐温80的组合，并且在第二OW乳液中使用的表面活性剂是吐温80。
盐
本发明的疫苗和组合物任选进一步包含一种或数种盐。盐的加入可抑制水渗透进入油性颗粒中并且进一步使油性颗粒稳定。
此类盐的实例非限制性地包括氯化钠、氯化镁、硫酸钠或硫酸镁。在特别的实施方式中，所述盐是氯化钠。
防腐剂
本发明的组合物可进一步包含一种或更多种兽医领域中可接受的防腐剂。合适的防腐剂的实例非限制性地包括：
-酸，例如苯甲酸、山梨酸、和其钠盐或钾盐；
-酯，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯；
-醇，例如氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、苯氧基乙醇、苯酚，例如氯甲酚和邻苯基苯酚；
-含汞化合物，例如硫柳汞、硝甲酚汞、硝酸苯汞和乙酸苯汞；
-季铵化合物，例如苯扎氯铵和氯化十六烷基吡啶鎓。
在优选的实施方式中，防腐剂是硫柳汞溶液，通常为10％硫柳汞溶液。
制备的方法
可使用本领域中本身通常已知的技术来生产本发明的组合物。然而优选地，该方法包括形成WOW乳液的第一步骤和将所述WOW乳液与另外的佐剂化合物混合的第二步骤。
更尤其，本发明的疫苗可通过包括以下步骤的方法得到：
a)将所述至少一种抗原的溶液在油基中乳化，由此形成油包水(WO)乳液，
b)将所述WO乳液加入到分散相中，由此形成WOW乳液，并乳化所述WOW乳液，和
c)将所述WOW乳液与另外的佐剂混合，所述另外的佐剂优选与额外量的所述至少一种抗原组合。
因此，本发明的进一步的目的在于用于制备包含至少一种抗原和另外的佐剂的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述至少一种抗原的溶液在油基中乳化，由此形成油包水(WO)乳液，
b)将所述WO乳液加入到分散相中，由此形成WOW乳液，并乳化所述WOW乳液，和
c)将所述WOW乳液与另外的佐剂混合，所述另外的佐剂优选与额外量的所述至少一种抗原组合。
在特别的实施方式中，步骤a)的油基包含如上定义的一种或数种油和至少一种表面活性剂。优选地，油基包含矿物油、以及司盘80和吐温80的组合。更优选地，表面活性剂或表面活性剂的混合物提供4至7、优选约6.0的HLB。
在另一个特别的实施方式中，步骤b)的分散相包含去离子水和至少一种表面活性剂(优选吐温80)。在特别的实施方式中，分散相进一步包含如上定义的盐和/或防腐剂。优选地，分散相包含去离子水、氯化钠、吐温80和硫柳汞溶液。尤其，表面活性剂(例如吐温80)或表面活性剂的混合物提供7至15(优选约10.5)的HLB。
在另一个特别的实施方式中，步骤c)中的另外的佐剂例如为如上定义的。优选地，另外的佐剂是或包含氢氧化铝，其优选与额外量的所述至少一种抗原组合。
乳化步骤可通过多级乳化剂组(multistage emulsifier set)来运行，在所述多级乳化剂组中确定循环的参数，以获得具有预定的尺寸的油性颗粒。
在特别的实施方式中，以非常高的每分钟转数(rpm)(优选15000至30000rpm，更优选20000至25000rpm，通常约22000rpm)持续至少一个循环，优选持续三个循环将所述至少一种抗原的溶液在油基中乳化。然后将乳液加入到所述分散相中，并在低的rpm(优选1000至6000rpm，更优选2000至5000rpm，通常约3000rpm)下乳化，持续至少一个循环，优选持续两个循环，更优选持续三个循环。任选地，在中等的rpm(优选5000至15000rpm，更优选8000至12000rpm，通常约10000rpm)下实施另外的循环。
此类特别的工艺条件允许获得负载有至少一种抗原的油性颗粒，所述油性颗粒具有如上定义的尺寸分布轮廓(distribution profile)，优选约10％的颗粒(D10)具有<10μm(优选5至10μm)的尺寸，并且约90％的颗粒(D90)具有<20μm的尺寸。
负载有至少一种所述抗原的油性颗粒的此类尺寸分布轮廓提供了稳定的WOW乳液，其粘性小于传统的油包水乳液，容易注射并且是高度免疫原性的。
在乳化步骤a)和b)之后，通过混合一种或数种另外的佐剂化合物与WOW乳液，优选与额外量的所述至少一种抗原组合来获得本发明的组合物。
因此，制备本发明的组合物的优选方法包括：
a)通过多级乳化剂组以约22000rpm，持续三个循环将所述至少一种抗原的溶液在油基中乳化，由此形成油包水(WO)乳液，
b)通过多级乳化剂组以约3000rpm，持续三个循环和以约10000rpm，持续另外的一个循环将所述WO乳液乳化在分散相中，由此形成WOW乳液，和
c)将另外的佐剂(优选氢氧化铝)与所述WOW乳液混合，优选与额外量的所述至少一种抗原组合。
在更优选的实施方式中，约6.0的HLB下进行步骤a)，并且中在约10.5的HLB下进行步骤b)。
优选的组合物
以下描述本发明的优选的组合物和疫苗。这些组合物可诱导体内(包括在内脏器官内)强且持久的免疫保护，允许有效保护例如非人动物对抗各种各样的疾病。
本发明的特别组合物在具有1至30μm的粒度的WOW乳液中包含与佐剂化合物组合的细菌抗原。
本发明的另一个特别组合物在具有1至30μm的粒度的WOW乳液中包含与佐剂化合物组合的细菌抗原，其中所述细菌抗原包含减毒的全细胞。
本发明的另一个特别组合物在具有1至30μm的粒度的WOW乳液中包含与佐剂化合物组合的沙门氏菌抗原。
本发明的另一个特别组合物在具有1至30μm的粒度的WOW乳液中包含与佐剂化合物组合的沙门氏菌抗原，所述沙门氏菌抗原包含沙门氏菌全细胞，其任选是减毒的，优选为选自ST、SE和SK的至少两类沙门氏菌细胞的混合物。
本发明的组合物优选包含有效量的抗原，例如足以(一经单次施用或重复施用)在动物中诱导免疫反应的量的抗原。取决于抗原、配制物和预期的用途，可由本领域技术人员调节抗原的有效量。可通过各种各样的方法例如重量、生物活性和/或密度来评估组合物中的抗原的量。在典型的实施方式中，有效量是一个量，在该量下组合物的总OD600/ml为优于4，优选优于5，通常为4至12，优选为5至8，更优选为5至6.5。另外，由于抗原可含于油性颗粒中以及含于外水相中，因此优选的是，本发明组合物中的抗原的总量的至少60％含于油性颗粒中，最优选约60-75％含于油性颗粒中，其余的40-25％位于外水相中。
在这方面，本发明的另一个特别目的是疫苗或免疫原性组合物，其在WOW乳液中包含细菌全细胞，其中WOW乳液中的至少90％的油性颗粒具有小于20μm的尺寸，该组合物具有优于4的OD600/ml，并且该组合物中的至少60％的细胞含于所述油性颗粒中。在另外的优选实施方式中，本发明组合物在WOW乳液中包含灭活的或减毒的细菌全细胞，其中WOW乳液中的至少90％的油性颗粒具有小于20μm的尺寸，并且至少5％具有小于10μm的尺寸，该组合物具有优于5的OD600/ml，并且该组合物中的60-75％的细胞含于所述油性颗粒中。在优选的实施方式中，这些组合物进一步含有另外的佐剂化合物，其通常在外水相中。
本发明的优选组合物进一步包含表面活性剂、盐和防腐剂。
应用
本发明的疫苗和组合物可用于在动物中递送有效量的所述至少一种抗原。
更尤其，本发明疫苗可用于在动物中诱导针对如上定义的至少一种抗原的免疫反应。
如实施例中阐述的，包含双佐剂系统的本发明疫苗在数种器官(例如肝、脾和盲肠)中引起改善的保护来对抗致病性感染。此外，如所说明的，该效果比用现有技术疫苗观察到的效果强得多，这说明WOW和佐剂化合物的协同效应。
因此，本发明的进一步目的涉及如上定义的疫苗或组合物用于治疗和/或预防动物中的感染(优选细菌感染)的用途。
本发明的进一步目的是用于治疗和/或预防动物中的感染(优选细菌感染)的方法，其包括对该动物施用如上定义的疫苗或组合物。
在特别的实施方式中，细菌感染是沙门氏菌感染，优选肠炎沙门氏菌感染、肯塔基沙门氏菌感染、鼠伤寒沙门氏菌感染或海德尔堡沙门氏菌感染。
可通过任何常规的途径施用本发明的组合物和疫苗，例如通过全身施用，优选通过肌内施用、皮下施用、静脉内施用、腹膜内施用、经鼻施用、经眼施用，更优选通过注射。
本发明特别适合用于治疗非人动物，尤其家禽(例如鸡)、牛、绵羊或猪。尤其，所述动物是鸡。
在特别的实施方式中，将本发明疫苗施用于对在油包水(WO)乳液中的常规疫苗具有低耐受性的动物。
本发明的其它方面和优点将公开在随后的实验部分中，实验部分对要求保护的发明进行阐述。
实施例
A、包含细菌抗原的疫苗A的生产
细菌抗原是以最小抗原浓度生产的肠炎沙门氏菌-肯塔基沙门氏菌-鼠伤寒沙门氏菌菌苗产品的组合。利用与该疫苗相同的方法生产安慰剂，其含有所有的佐剂和其它组分，不添加沙门氏菌抗原。在下表1中阐述了各0.50ml剂量的肠炎沙门氏菌-肯塔基沙门氏菌-鼠伤寒沙门氏菌菌苗和安慰剂的抗原配制。
表1:
按以下方式生产疫苗：
步骤I：
通过将942ml氢氧化铝与206ml汇集的抗原(25％的汇集的抗原)组合来制备氢氧化铝-抗原复合物。将该复合物在室温下混合至少4小时，然后在2-7℃下储存直到使用。
步骤II：
在每分钟约22000转(rpm)下使3222ml油基(oil base)循环通过乳化剂，恰好在乳化剂进入之前缓慢加入620ml汇集的抗原(75％的汇集的抗原)。在加入抗原之后，在22000rpm下将该溶液乳化三个循环。这产生油包水(WO)乳液。
步骤III：
然后在剧烈混合下，将WO乳液缓慢加入到5008ml分散相(0.85％氯化钠、吐温80和硫柳汞)中，并允许混合一个小时。这产生水包油包水(WOW)乳液。
步骤IV：
通过在3000rpm下乳化三个循环，随后在10000rpm下乳化一个循环来减小WOW乳液的粒度。D10和D90粒度范围分别是8.6和12.2微米。
步骤V：
然后将1148ml氢氧化铝-抗原复合物混合入WOW乳液中，并允许在填充之前，在室温下混合至少一个小时。
B.包含细菌抗原的疫苗B的生产
细菌抗原是在最小的抗原浓度下生产的肠炎沙门氏菌-肯塔基沙门氏菌-鼠伤寒沙门氏菌菌苗产品的组合。采用与该疫苗相同的方法来生产安慰剂，其含有所有的佐剂和其它组分，不添加沙门氏菌抗原。在下表2中阐述了各0.50ml剂量的肠炎沙门氏菌-肯塔基沙门氏菌-鼠伤寒沙门氏菌菌苗和安慰剂的抗原配制。
表2：
按以下方式生产疫苗：
步骤I：
通过将943ml氢氧化铝与360ml汇集的抗原(25％的汇集的抗原)组合来制备氢氧化铝-抗原复合物。将该复合物在室温下混合至少4小时，然后在2-7℃下储存直到使用。
步骤II：
在每分钟约22000转(rpm)下，使3223ml油基循环通过乳化剂，恰好在乳化剂进入之前缓慢加入1079ml汇集的抗原(75％的汇集的抗原)。在加入抗原之后，在22000rpm下将该溶液乳化三个循环。这产生油包水(WO)乳液。
步骤III：
然后在剧烈混合下，将WO乳液缓慢加入到4394ml分散相(0.85％氯化钠、吐温80和硫柳汞)中，并允许混合一个小时。这产生水包油包水(WOW)乳液。
步骤IV：
通过在3000rpm下乳化三个循环，随后在10000rpm下乳化一个循环来减小WOW乳液的粒度。D10和D90粒度范围分别是9.3和12.6微米。
步骤V：
然后将1300ml氢氧化铝-抗原复合物混合入WOW乳液中，并允许在填充之前，在室温下混合至少两个小时。
C.针对沙门氏菌细菌的有效保护
材料
制备疫苗1-4用于比较评估。
本发明的疫苗1包含双佐剂系统(WOW+Ag-Al(OH)3)。
疫苗2包含Ag-Al(OH)3佐剂，但不是WOW。
疫苗3包含WOW乳液，但是没有另外的佐剂化合物。
疫苗4包含WOW乳液和Al(OH)3并且没有抗原(安慰剂)。
通过标准程序制备疫苗No.2-4，用于比较试验。所有疫苗(但非安慰剂)含有相同量的抗原。
方法
在4周龄和8周龄对鸡接种疫苗，并在12周龄进行攻击。在攻击之后7天，在13周龄实施尸体剖检。
结果
结果呈现于下表3中。如从右端栏可看出的，尽管疫苗1预防沙门氏菌感染(0.002)，但是疫苗2-4的效力非常低并且基本上不预防细菌感染。
表3
1对于来自组织的攻击菌株的再分离物呈阳性的对照物的百分率。
如可看到的，包含本发明双佐剂系统的疫苗1在所有被测试的靶组织中给出显著的保护。
疫苗2(简单的OW乳液)尤其在肝内是无效的(再分离＝100％)；并且疫苗3(没有佐剂化合物)对所有组织也是无效的(再分离＝100％)。
因此，发明人令人惊讶地显示了本发明疫苗用于预防细菌感染的改进的功效。该效果在所有被测试的组织中是显著的，并且是协同的，因为其比单佐剂的比较疫苗2和3要有效得多。
D:本发明疫苗有效地保护对抗体内的细菌感染
材料和方法
动物
本研究中使用来自查尔斯河(Charles River)的无具体病原体的鸡。在一日龄时，将鸡运输至位于南达科他州立大学(South Dakota State University)(南达科他布鲁金斯(Brookings,South Dakota))中的农村技术公司(Rural Technologies,Inc.)研究室(facility)。在研究期间将所有的鸡留在同一室中(混合的)。为了确认鸡的阴性沙门氏菌状态，在12周龄和24周龄时从个体鸡中收集泄殖腔拭子，并测试沙门氏菌的再分离。
攻击有机体
用异种SE(肠炎沙门氏菌)、SK(肯塔基沙门氏菌)、ST(鼠伤寒沙门氏菌)或SH(海德尔堡沙门氏菌)攻击菌株攻击所有处理组中的鸡。通过活菌计数分析来确定攻击剂量。
方法
将无具体病原体的14周龄鸡随意分成三个处理组并接种疫苗。使用0.5ml IM(肌内)剂量对一个组接种肠炎沙门氏菌-肯塔基沙门氏菌-鼠伤寒沙门氏菌菌苗(疫苗A)。用0.5ml疫苗A也对第二组进行接种，通过SQ(皮下)途径施用。使用0.5ml剂量对第三组施用安慰剂：这些鸡中一半通过SQ途径施用安慰剂，一半通过IM途径施用安慰剂。在18周龄时，通过相同的途径对鸡施用另外0.5ml剂量的疫苗或安慰剂。在第二次接种疫苗后8周，此时鸡为26周龄，用毒性异种SE、SK、ST或SH攻击菌株攻击所有的鸡。攻击后一周，对鸡进行尸体剖检，从每只鸡中收集盲肠、肝/脾或卵巢，并测试SE、SK、ST或SH定殖。再分离结果用于完成预防分数(prevented fraction)评估，以确定菌苗是否帮助减少SE、SK、ST或SH在盲肠、肝/脾或卵巢中的定殖。在RTI(农村技术公司(Rural Technologies,Inc))进行接种疫苗、观察、攻击和再分离。
对沙门氏菌的筛查
1.接种疫苗前
在六周龄时对20只鸡实行安乐死并进行尸体剖检。对肝、脾和盲肠取样，并如以下在“组织定殖的检测”部分中所述的那样进行测试。在13周龄时从所有鸡获取泄殖腔拭子。这些鸡中的每一只用预先弄湿的拭子擦拭，并且将5个鸟(鸡)拭子汇集入容纳10ml连四硫酸盐亮绿(胆汁)富集肉汤(tetrathionate brilliant green enrichment broth)(TTBG)的管内。将所述管在42℃下孵育48小时。孵育24小时后，将的各TTBG肉汤培养物的10-微升等分试样划线到含有tergitol 4的木糖赖氨酸琼脂板(XLT4)上，并在37℃下孵育48小时。孵育24小时后，检查XLT4板上黑色或黑色为中心的菌落(这对于沙门氏菌而言是典型的)(Difco Manual,1998)的存在。在孵育后48小时将在第一次划线至XLT4上后对典型的沙门氏菌菌落呈阴性的肉汤培养物再次划线至XLT4上，并在24小时和48小时后对平板进行评估。然后，通过延迟二次富集(Delayed Secondary Enrichment)(DSE)对24小时和48小时取样呈阴性的样品进行测试。简言之，将TTBG管设置于室温(20-25℃)下5-7天，然后将1ml样品转移至9ml新鲜的TTBG中。然后将这些管在37℃下孵育24小时，接种到XLT4板上，在37℃下孵育平板48小时。孵育48小时后，检查XLT4板上黑色或黑色为中心的菌落(这对于沙门氏菌而言是典型的)(Difco Manual,1998)的存在。
2.接种疫苗后/攻击前
在攻击之前两周，此时鸟(鸡)为24周龄，从所有待攻击的鸟(鸡)获取泄殖腔拭子，并如上所述筛查沙门氏菌的存在。
攻击的方法
在二次接种疫苗后8周，此时鸟(鸡)是26周龄，通过口服施用或肌内施用用0.5ml稀释至含有1x 103至1x 107个菌落形成单位(CFU)的SE、SK、ST或SH的新鲜生长的毒性(virulent)异种培养物攻击所有的鸟(鸡)。为了制备攻击物，使冷冻的菌种解冻，将1ml转移到250ml大豆蛋白胨肉汤中，并在37℃下孵育6小时。将一(1)ml的6小时培养物加入到预定体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，用于所述经口攻击或肌内攻击。将该攻击制剂连续稀释并涂板，以获得攻击处的活菌计数。
组织定殖的检测
在攻击后7天(dpc)，对每只鸟(鸡)进行尸体剖检。对肝、脾、卵巢和具有内容物的盲肠袋(cecal pouches)进行取样，并测试攻击菌株定殖作为证明保护反应的直接方法。将完整的脾和大约1g肝放置在相同的组织研磨机中，将20ml TTBG加入到每个研磨机中，将组织切碎并随后在37℃下孵育48小时。将包括卵的卵巢放置在Whirl-Pak袋中，手工浸软、称重并以1:10w/v的组织对培养基的比率转移至TTBG，并且随后在37℃下孵育48小时。将每个大约1g的具有内容物的盲肠袋(cecal pouch)放置在具有盖子的一次性无菌组织研磨机中，加入20ml TTBG肉汤，将组织切碎并将容纳样品的组织研磨机在42℃下孵育48小时。孵育24小时后，将各TTBG肉汤培养物的等分试样划线至XLT4琼脂上并在37℃孵育24小时。使TTBG肉汤培养物返回到适当的温度下孵育，用于进一步生长。孵育24小时后，检查XLT4板上黑色或黑色为中心的菌落(这对于沙门氏菌而言是典型的)(Difco Manual,1998))的存在。在孵育后48小时，将第一次在XLT4上对典型的沙门氏菌菌落呈阴性的肉汤培养物第二次再划线至新的XLT4板上，在37℃下孵育24小时，并在那时进行评估。关于确认试验，将在XLT4板上沙门氏菌的典型细菌菌落接种到三种不同的琼脂(三糖铁琼脂(TSI)、赖氨酸铁琼脂(LIA)和小牛肉琼脂)上，并在37℃下孵育24小时。如果分离物在TSI和LIA上给出典型的沙门氏菌反应(Difco Manual,1998)，那么从小牛肉琼脂平板上挑出该分离物的菌落，用于在单因子种族特异性沙门氏菌O单因子抗血清中凝集，以确认沙门氏菌种群，以及在沙门氏菌H:g,m抗血清中凝集，以确认攻击有机体的沙门氏菌血清型。
对初次富集呈阴性的来自所有处理组的所有组织样品通过延迟二次富集(DSE)进行测试。简言之，在初始48小时孵育期之后将TTBG培养物储存在室温(20-25℃)下。在移至室温下六(6)天后，通过将1ml培养物加入到9ml新鲜的TTBG中来在新鲜的TTBG肉汤中富集该培养物。然后在42℃下孵育样品。在孵育24小时后，将各TTBG肉汤培养物的等分试样划线到XLT4琼脂上并在37℃下孵育48小时。在孵育24和48小时后，检查XLT4板上黑色或黑色为中心的菌落(这对于沙门氏菌而言是典型的)(Difco Manual,1998)的存在。
评估者
接受含菌苗的抗原的IM和SQ接种组各自与接种安慰剂的组比较攻击后攻击菌株在内脏器官、盲肠、肝/脾、卵巢和生殖道中的定殖。通过计算SE、SK、ST或SH在内脏器官、生殖道和/或肠中的定殖的预防分数(prevented fraction)(风险率的补充)来从统计学上评估各处理组的菌苗的功效。
统计学
预防分数(风险率的补充)根据公式PF＝1–pv/pc来计算，其中pv和pc分别是被接种疫苗者和对照物的受影响分数(affected fraction)。如规程中所陈述的，对照组含有所有接受安慰剂的鸡，无论IM施用还是SQ施用。使用9.3版System(由APHIS提供编码)和R2.13.0对所有可利用的数据实施所有的分析。
结果
对沙门氏菌的筛查
来自六周龄鸡的所有组织样品和来自24周龄鸡的所有泄殖腔样品都是阴性的，这表明鸡在接种疫苗之前和攻击之前是没有沙门氏菌的。
安全性观察
每天观察鸡的任何与疫苗相关的不利反应和死亡率。在任何鸡中都没有观察到不利的疫苗反应或死亡的发生。
1.针对肠炎沙门氏菌(SE)感染的保护
结果阐述于下表4以及图2A和2B中。
表4：使用疫苗A的再分离频率(％)、预防分数和95％置信界限。
1CL＝置信界限
2一只鸡在攻击后一天死亡，并被排除在统计之外
3两只鸡不具有发育中的卵巢，并被排除在统计之外
IM:肌内
SQ:皮下
N/A:不适用
结果显示：
通过SQ途径施用的疫苗A有效地减少和预防所有被测试的内脏器官(例如肝/脾)、盲肠和卵巢的SE定殖。
尤其，在盲肠和卵巢中获得大于0.5的预防分数，这意味着该疫苗治疗在此类内脏器官中改进了超过50％(PF＝0.569和PF＝0.584)保护SE功效。这些结果还阐述于图2A中，其中在盲肠(78％)和卵巢(70％)中获得大于70％的保护SE功效。
通过IM途径施用疫苗A甚至更有效地减少所有内脏(例如肝/脾)、盲肠和卵巢的SE定殖(表3：对于肝/脾和卵巢，PF>0.7，且图2B：对于肝/脾、盲肠和卵巢，保护SE功效>75％)。
对于SQ和IM途径两者，所有内脏的95％置信下限值都大于0，这是统计学上显著的证据，用通过SQ和IM途径施用的疫苗A对鸡进行接种有效地减少所述内脏器官的SE攻击菌株定殖。
2.针对鼠伤寒沙门氏菌(ST)感染的保护
结果阐述于下表5以及图3A和3B。
表5：使用疫苗A的再分离频率(％)、预防分数和95％置信界限。
1CL＝置信界限
IM:肌内
SQ:皮下
N/A:不适用
结果显示：
通过SQ或IM途径施用的疫苗A有效地减少和预防肝/脾和盲肠的ST定殖。尤其，在肝/脾中获得大于0.5的预防分数，这意味着在此类内脏中改进的保护功效。图3A和3B还阐述了对于SQ和IM途径两者，在肝/脾(保护ST功效>70％)和盲肠(保护ST功效为40％)中改进的保护功效。
3.针对肯塔基沙门氏菌(SK)感染的保护
结果阐述于下表6和图4中。
表6：对于盲肠使用疫苗A的再分离频率(％)、预防分数和95％置信界限。
1CL＝置信界限
2一只鸡在攻击后一天死亡，并从统计中排除。
3两只鸡在攻击之前死于败血症。
4一只鸡死于球虫感染且一只鸡由于充满水的作物且没有饲料而死亡。
IM:肌内
SQ:皮下
N/A:不适用
结果显示：
通过SQ或IM途径施用的疫苗A有效地减少和预防盲肠内的SK定殖。
尤其，通过IM途径获得约0.64的预防分数，且通过SQ途径获得大于0.4的预防分数。图4还说明了使用SQ和IM途径，该疫苗具有改进的针对SK的保护功效(保护SK功效>85％，图4)。
4.针对海德尔堡沙门氏菌(SH)感染的保护
表7：使用疫苗A的再分离频率(％)、预防分数和95％置信界限。
1CL＝置信界限
IM:肌内
SQ:皮下
N/A:不适用
结果显示：
在通过SQ途径使用疫苗A进行接种的组中，来自内脏器官肝和脾的SH攻击菌株的再分离百分率是13％，来自盲肠的SH攻击菌株的再分离百分率是41％，且来自卵巢的SH攻击菌株的再分离百分率是8％，在安慰剂组中分别是82％、69％和59％(图5A)。对于所有三种组织，预防分数的95％置信下限大于零。因此，当通过SQ途径施用时，在所述内脏器官、盲肠和卵巢中疫苗A减少了SH感染。
在通过IM途径使用疫苗A进行接种的组中，来自内脏器官肝和脾的SH菌株的再分离百分率是19％、来自盲肠的SH菌株的再分离百分率是70％，来自卵巢的SH菌株的再分离百分率是14％(图5B)。对于所述内脏器官和卵巢，预防分数的95％置信下限大于零。因此，当通过IM途径施用时，在所述内脏器官和卵巢中疫苗A减少了SH感染。
通过IM或SQ途径施用的包含SE-ST-SK细菌的疫苗A令人惊奇地有效减少和预防接种疫苗的动物的内脏器官(肝/脾)和卵巢的SH感染。
E.疫苗组合物的安全性
通过计算小母鸡中肌内注射位点反应，已经分析了疫苗A的安全性。在表8中定义评分方法。
表8
结果阐述于图6中并且显示了取决于沙门氏菌OD/剂量，与简单的WO乳液中的现有技术疫苗相比的疫苗A(SE-ST-SH)的平均反应得分。
在1.15和1.03 SE OD/剂量下，简单的WO乳液中的疫苗分别具有4.8和10.2的平均反应得分。
疫苗A获得的平均反应得分是3.7，然而沙门氏菌OD/剂量是约5倍浓缩(5.1)。
这些结果令人惊奇地显示，本发明疫苗的肌内注射具有弱的平均反应得分，由此证明改进的安全性。

Claims (17)

1.疫苗，其在水包油包水(WOW)乳液中包含有效量的至少一种抗原和佐剂化合物。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述佐剂化合物是氢氧化铝。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述至少一种抗原是细菌细胞，优选活细菌、减毒细菌或灭活细菌。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述细菌是沙门氏菌属细菌，优选选自肠炎沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌或其组合。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述WOW乳液包含一种或数种油和至少一种表面活性剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述油包括植物油、动物油、矿物油或其混合物，优选矿物油。
7.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述至少一种表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯。
8.根据权利要求1所述的疫苗，其包含包埋在油性颗粒内的水泡，所述油性颗粒分散在外水相中。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其中所述疫苗中的所述至少一种抗原的总量的至少60％(w/w)，优选60％至75％含于所述油性颗粒中。
10.根据权利要求8所述的疫苗，其中所述油性颗粒包含植物油、动物油、矿物油或其混合物，优选矿物油。
11.根据权利要求8所述的疫苗，其中所述佐剂化合物在所述外水相中。
12.根据权利要求11所述的疫苗，其中所述外水相进一步包含一小部分所述至少一种抗原和所述另外的佐剂，优选抗原-佐剂复合物。
13.根据权利要求1所述的疫苗，其中可通过包括以下步骤的方法获得所述疫苗：
a)将所述至少一种抗原的溶液在油基中乳化，由此形成油包水(WO)乳液，
b)将所述WO乳液加入到分散相中，由此形成WOW乳液并乳化所述WOW乳液，和
c)将所述WOW乳液与所述另外的佐剂混合，所述另外的佐剂优选与额外量的所述至少一种抗原组合。
14.根据权利要求1所述的疫苗，其中一小部分所述抗原包埋在油性颗粒中，优选包埋在尺寸为1至40μm的油性颗粒中。
15.根据权利要求1所述的疫苗，其用于在动物中诱导针对所述抗原的免疫反应。
16.制备包含至少一种抗原和另外的佐剂的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述至少一种抗原的溶液在油基中乳化，由此形成WO乳液，
b)将所述WO乳液加入到分散相中，由此形成WOW乳液并乳化所述WOW乳液，和
c)将所述WOW乳液和所述佐剂混合，所述佐剂优选地与额外量的所述至少一种抗原组合。
17.给非人动物接种疫苗的方法，其包括对所述动物施用有效量的权利要求1所述的疫苗。
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