JP2017518338A - 二重アジュバントワクチン組成物、調製及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ワクチンは、通常、免疫応答を増強及び改善するために、特に抗体応答を延長するために、アジュバントと共に製剤化される。例えば、鉱物油中で乳化された抗原の溶液に相当するフロイントアジュバント(Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine, 1942, 49, 548-553)は、最初、免疫賦活剤又は免疫強化物質として使用されていた。フロイントアジュバントは、油中水型(WO)エマルションを形成し、基本的には抗原の持続放出を介してアジュバント効果を示す。
a)油性基剤中で少なくとも1つの抗原の溶液を乳化し、それにより、WOエマルションを形成すること、
b)前記WOエマルションを分散相に追加し、それにより、WOWエマルションを形成し、場合により、前記WOWエマルションをさらに乳化すること、及び
c)好ましくはさらなる量の前記少なくとも1つの抗原と組み合わせて、前記WOWエマルションをさらなるアジュバントと混合すること
を含む方法である。
本発明は、改善された新規ワクチン組成物、それらの調製方法及びそれらの使用を提供する。本発明は特に、WOWエマルション中の有効量の少なくとも1つの抗原を含む新規ワクチンであって、アジュバントをさらに含む新規ワクチンを開示する。本発明は、このような二重アジュバント系が容易に注射可能であり、安全であり、他のアジュバント系を使用する従来技術のワクチンよりも優れた有効性(防御免疫)を提供するという本発明者らによる予想外の知見に端を発する。特に、本発明者らは、少なくとも1つの抗原と二重アジュバント系とを含む本発明のワクチンの相乗効果を実証した。本発明者らはまた、このようなワクチンのin vivoにおけるsalmonella感染症に対する改善された防御効果、及びそれらの安全性を実証した。
「抗原」という用語は、動物に導入されると、動物の免疫系によって認識され、免疫応答を誘発し得る作用物質を指す。動物に投与されると、抗原は、一般に、免疫系の抗原認識分子、例えば免疫グロブリン(抗体)又はT細胞抗原レセプター(TCR)と特異的に相互作用して免疫応答を誘発し、細胞性応答(例えば、記憶細胞(例えば、記憶B及びT細胞)又は細胞傷害性細胞)及び/又は体液性(抗体)応答を引き起こす。
示されているように、本発明は、WOW製剤とアジュバント化合物とを組み合わせる。WOW製剤及びアジュバントは両方ともアジュバント活性を発揮し、これらは、驚くべきことに、本発明にしたがって組み合わせると相乗効果を提供する。
「WOW」という用語は、水中油中水型エマルションを意味する。水中油中水型(WOW)エマルションは、小水滴又は水小胞(内水相)が油性粒子(油相)内に包埋され、連続する水相(外水相)中に分散されているエマルションである。WOWエマルションは、第1のエマルション中で水相が油相に付加され、続いて、少なくとも第2のエマルション中で前記油相が水相中に分散されて生じる。図1に示されている本発明の特定のWOWエマルション又は組成物は、典型的には、第1の界面活性剤膜によって囲まれた水小胞又は小滴に対応する内水相と、第2の界面活性剤膜によって囲まれた油相と、外水相とを含む。
本発明のWOWエマルションに使用するための適切な油としては限定されないが、植物油、動物油及び鉱物油又はそれらの混合物が挙げられる。
好ましい実施態様では、本発明のWOWエマルションは、少なくとも1つの界面活性剤をさらに含有する。
本発明のワクチン及び組成物は、1つ又は複数の塩を場合によりさらに含む。塩の追加は、油性粒子への水の浸透を阻害し、油性粒子をさらに安定化し得る。
本発明の組成物は、獣医学分野で許容し得る1つ以上の保存剤をさらに含み得る。限定されないが、適切な保存剤の例としては、
−酸、例えば安息香酸、ソルビン酸及びそれらのナトリウム又はカリウム塩;
−エステル、例えばメチルパラベン、エチルパラベン及びプロピルアパラベン;
−アルコール、例えばクロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、フェノキシエタノール、フェノール、例えばクロロクレゾール及びo−フェニルフェノール;
−水銀化合物、例えばチメロサール、ニトロメルゾール、硝酸フェニル水銀及び酢酸フェニル水銀;
−第4級アンモニウム化合物、例えば塩化ベンザルコニウム(benalkonium chloride)及び塩化セチルピリジニウム
が挙げられる。
本発明の組成物は、それ自体が当技術分野で一般に公知の技術を使用して生産され得る。しかしながら、好ましくは、前記方法は、WOWエマルションを形成する第1の工程、及び前記WOWエマルションをさらなるアジュバント化合物と混合する第2の工程を含む。
a)油性基剤中で前記少なくとも1つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型(WO)エマルションを形成する工程、
b)前記WOエマルションを分散相に追加し、それにより、WOWエマルションを形成し、前記WOWエマルションを乳化する工程、及び
c)好ましくはさらなる量の前記少なくとも1つの抗原と組み合わせて、前記WOWエマルションをさらなるアジュバントと混合する工程
を含む方法によって得られる。
a)油性基剤中で前記少なくとも1つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型(WO)エマルションを形成する工程、
b)前記WOエマルションを分散相に追加し、それにより、WOWエマルションを形成し、前記WOWエマルションを乳化する工程、及び
c)好ましくはさらなる量の前記少なくとも1つの抗原と組み合わせて、前記WOWエマルションをさらなるアジュバントと混合する工程
を含む方法である。
a)約22000rpm、3回の循環の多段階乳化セットによって、油性基剤中で前記少なくとも1つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型(WO)エマルションを形成すること、
b)約3000rpm、3回の循環及び約10000rpm、さらに1回の循環の多段階乳化セットによって、分散相中で前記WOエマルションを乳化し、それにより、WOWエマルションを形成すること、及び
c)好ましくはさらなる量の前記少なくとも1つの抗原と組み合わせて、さらなるアジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムを前記WOWエマルションと混合すること
を含む。
本発明の好ましい組成物及びワクチンは、以下に記載される。これらの組成物は、in vivo(内臓中を含む)で強力かつ持続的な免疫防御を誘導して、例えば、様々な疾患に対する非ヒト動物の有効な防御を可能にし得る。
本発明のワクチン及び組成物は、動物において有効量の前記少なくとも1つの抗原を送達するために使用され得る。
細菌抗原は、最低抗原濃度で生産したSalmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン生成物の組み合わせであった。Salmonella抗原を追加しない以外は、全てのアジュバント及び他の成分を含有するワクチンと同じプロセスを利用して、プラセボを生産した。Salmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン及びプラセボの各0.50ml用量の抗原性製剤を以下の表1に示す。
水酸化アルミニウム942mlを、プールした抗原206ml(プールした抗原の25%)と混合することによって、水酸化アルミニウム−抗原複合体を調製した。複合体を室温で少なくとも4時間混合し、次いで使用まで2〜7oCで保存した。
油性基材3222mlを、約22,000毎分回転数(rpm)で乳化器によって循環させ、乳化器のエントリー直前に、プールした抗原620ml(プールした抗原の75%)を徐々に追加した。抗原を追加した後、22,000回転、3回の循環で、溶液を乳化した。これにより、油中水型(WO)エマルションを作成した。
次いで、WOエマルションを分散相(0.85%塩化ナトリウム、Tween 80及びチメロサール)5008mlに激しく混合しながら徐々に追加し、1時間混合した。これにより、水中油中水型(WOW)エマルションを作成した。
3,000rpm、3回の循環で乳化し、続いて10,000rpm、1回の循環で乳化することによって、WOWエマルションの粒径を減少させた。D10及びD90の粒径範囲は、それぞれ8.6及び12.2マイクロメートルであった。
次いで、水酸化アルミニウム−抗原複合体1148mlをWOWエマルションに混合し、充填前に室温で少なくとも1時間混合した。
細菌抗原は、最低抗原濃度で生産したSalmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン生成物の組み合わせであった。Salmonella抗原を追加しない以外は、全てのアジュバント及び他の成分を含有するワクチンと同じプロセスを利用して、プラセボを生産した。Salmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン及びプラセボの各0.50ml用量の抗原性製剤を以下の表2に示す。
水酸化アルミニウム943mlを、プールした抗原360ml(プールした抗原の25%)と混合することによって、水酸化アルミニウム−抗原複合体を調製した。複合体を室温で少なくとも4時間混合し、次いで使用まで2〜7oCで保存した。
油性基材3223mlを、約22,000毎分回転数(rpm)で乳化器によって循環し、乳化器のエントリー直前に、プールした抗原1079ml(プールした抗原の75%)を徐々に追加した。抗原を追加した後、22,000回転、3回の循環で、溶液を乳化した。これにより、油中水型(WO)エマルションを作成した。
次いで、WOエマルションを分散相(0.85%塩化ナトリウム、Tween 80及びチメロサール)4394mlに激しく混合しながら徐々に追加し、1時間混合した。これにより、水中油中水型(WOW)エマルションを作成した。
3,000rpm、3回の循環で乳化し、続いて10,000rpm、1回の循環で乳化することによって、WOWエマルションの粒径を減少させた。D10及びD90の粒径範囲は、それぞれ9.3及び12.6マイクロメートルであった。
次いで、水酸化アルミニウム−抗原複合体1300mlをWOWエマルションに混合し、充填前に室温で少なくとも2時間混合した。
材料
比較評価のために、ワクチン1〜4を調製する。
4週齢及び8週齢時に、ニワトリにワクチン接種し、12週齢時にチャレンジした。チャレンジの7日後(13週齢)に、剖検を実施した。
結果を以下の表3に示す。右端の欄から分かるように、ワクチン1はSalmonella感染症を予防した一方(0.002)、ワクチン2〜4はあまり有効ではなく、細菌感染症を本質的に予防しなかった。
材料及び方法
動物
本研究では、Charles Riverの特定病原体除去ニワトリを使用した。1日齢時に、雛を、South Dakota State University Brookings, South DakotaにあるRural Technologies, Inc.の施設に移した。研究期間中、全てのニワトリは、同じ部屋(混合)にいた。ニワトリの陰性salmonella状態を確認するために、12週齢及び24週齢時に個々のニワトリから総排泄腔スワブを採取し、salmonellaの再単離について試験した。
異種の、SE(Salmonella Enteritidis)、SK(Salmonella Kentucky)、ST(Salmonella Typhimirium)又はSH(Salmonella Heidelberg)チャレンジ株を、全ての処置群のニワトリにチャレンジした。生菌数アッセイによって、チャレンジ用量を決定した。
14週齢の特定病原体除去ニワトリを3つの処置群にランダムに分け、ワクチン接種した。0.5mlのIM(筋肉内)用量を使用して、Salmonella Enteritidis-Kentucky-Typhimuriumバクテリン(ワクチンA)を第1の群にワクチン接種した。また、SQ(皮下)経路による投与によって、与ワクチンA 0.5mlを第2の群にワクチン接種した。0.5ml用量を使用して、プラセボを第3の群に投与した;プラセボをSQ経路によってこれらのニワトリの半分に投与し、IM経路によって半分に投与した。18週齢時に、別の0.5ml用量又はプラセボを同じ経路によってニワトリに投与した。2回目のワクチン接種の8週間後(ニワトリが26週齢であった時点)に、病原性異種SE、SK、ST又はSHチャレンジ株を全てのニワトリにチャレンジした。チャレンジの1週間後に、ニワトリを剖検し、各ニワトリから盲腸、肝臓/脾臓又は卵巣を採取し、SE、SK、ST又はSHのコロニー形成について試験した。バクテリンが、盲腸、肝臓/脾臓又は卵巣におけるSE、SK、ST又はSHのコロニー形成の減少を支援したか否かを決定するために、再単離の結果を使用して予防分画の評価を行った。ワクチン接種、観察、チャレンジ及び再単離は、RTI (Rural Technologies, Inc)で行った。
1.ワクチン接種前
6週齢時に、ニワトリ20羽を安楽死させ、剖検した。以下の「組織コロニー形成の検出」のセクションに記載されているように、肝臓、脾臓及び盲腸をサンプリング及び試験した。13週齢時に、全てのニワトリから総排泄腔スワブを採取した。ウェットタイプの綿棒を用いて、これらの各ニワトリからスワブを取り、5つの鳥スワブを、四チオン酸ブリリアントグリーン増菌培養液(TTBG)10mlを含有するチューブにプールした。チューブを42℃で48時間インキュベーションした。24時間のインキュベーション後、各TTBGブロス培養物の10マイクロリットルアリコートを、タージトール4(XLT4)を含有するキシロースリジン寒天プレート上にストリークし、37℃で48時間インキュベーションした。24時間のインキュベーション後、salmonellaに典型的な黒色又は黒色中心コロニー(Difco Manual, 1998))の存在について、XLT4プレートを調査した。1回目にXLT4上にストリークした後のsalmonellaに典型的なコロニーについて陰性であったブロス培養物を、インキュベーションの48時間後にXLT4上に再びストリークし、24時間及び48時間後にプレートを評価した。次いで、24時間及び48時間のサンプリングから陰性であったサンプルを、遅延二次増菌法(DSE)によって試験した。簡潔に言えば、TTBGチューブを室温(20〜25℃)で5〜7日間置いてから、サンプル1mlを新鮮なTTBG 9mlに移した。次いで、これらのチューブを37℃で24時間インキュベーションし、XLT4プレート上に植菌し、プレートを37℃で48時間インキュベーションした。48時間のインキュベーション後、salmonellaに典型的な黒色又は黒色中心コロニー(Difco Manual, 1998))の存在について、XLT4プレートを調査した。
チャレンジの2週間前(鳥が24週齢であった時点)に、チャレンジすべき全ての鳥から総排泄腔スワブを採取し、上記のようにsalmonellaの存在についてスクリーニングした。
2回目のワクチン接種の8週間後(ニワトリが26週齢であった時点)に、SE、SK、ST又はSHの新たに成長させた病原性異種培養物0.5ml(1×103〜1×107コロニー形成単位(CFU)を含有するように希釈したもの)を、経口投与又は筋肉内投与によって、全ての鳥にチャレンジした。チャレンジを調製するために、凍結シードを解凍し、1mlを250ml大豆ペプトンブロスに移し、37℃で6時間インキュベーションした。経口チャレンジ又は筋肉内チャレンジのために、6時間培養物1mlを所定量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に追加した。このチャレンジ調製物を連続希釈及びプレーティングして、チャレンジで生菌数を求めた。
チャレンジの7日後(dpc)に、各鳥を剖検した。肝臓、脾臓、卵巣及び内容物を伴う盲腸嚢をサンプリングし、防御応答を実証する直接的な方法として、チャレンジ株のコロニー形成について試験した。脾臓全体及び肝臓約1gを同じ組織粉砕機に入れ、TTBG 20mlを各粉砕機に追加し、組織を細分し、次いで、37℃で48時間インキュベーションした。卵を含む卵巣をホワールパックバッグに入れ、手でマセレートし、計量し、1:10w/vの組織媒体比でTTBGに移し、次いで、37℃で48時間インキュベーションした。内容物を伴う各盲腸嚢約1グラムを蓋付き使い捨て滅菌組織粉砕機に入れ、TTBGブロス20mlを追加し、組織を細分し、サンプルを含有する組織粉砕機を42℃で48時間インキュベーションした。24時間のインキュベーション後、各TTBGブロス培養物のアリコートをXLT4寒天上にストリークし、37℃で24時間インキュベーションした。さらなる成長のために、TTBGブロス培養物を適切な温度で再びインキュベーションした。24時間のインキュベーション後、salmonellaに典型的な黒色又は黒色中心コロニー(Difco Manual, 1998))の存在について、XLT4プレートを調査した。1回目にXLT4上のsalmonellaに典型的なコロニーについて陰性であったブロス培養物を、インキュベーションの48時間後の2回目に新たなXLT4プレート上に再びストリークし、37℃で24時間インキュベーションし、その時点で評価した。確認試験のために、XLT4プレート上のsalmonellaに典型的であった細菌コロニーを、3つの異なる寒天(三糖鉄寒天(TSI)、リジン鉄寒天(LIA)及び仔牛寒天)上に植菌し、37℃で24時間インキュベーションした。単離株が、TSI及びLIA上でsalmonellaの典型的反応を示した場合(Difco Manual, 1998)、Salmonella群を確認するために単一因子種特異的Salmonella O単一因子抗血清中で、及びチャレンジ生物のSalmonella血清型を確認するためにSalmonella H:g,m抗血清中で、凝集用仔牛寒天プレートからその単離株のコロニーを採取した。
チャレンジ後に、内臓、盲腸、肝臓/脾臓、卵巣及び生殖管におけるチャレンジ株のコロニー形成について、抗原を含有するバクテリンを投与したIM及びSQワクチン接種群を、プラセボワクチン接種群とそれぞれ比較した。内臓、生殖管及び/又は腸管におけるSE、SK、ST又はSHのコロニー形成の予防分画(リスク比の補数)を計算することによって、各処置群のバクテリンの有効性を統計的に評価した。
式PF=1−pv/pc(式中、pv及びpcは、それぞれワクチン接種及びコントロールの罹患率である)にしたがって、予防分画(リスク比の補数)を計算した。プロトコールに示されているように、コントロール群は、IM又はSQ投与にかかわらず、プラセボを投与した全てのニワトリを含む。SAS(登録商標)System, version 9.3(コードはAPHISによる提供)及びR 2.13.0を使用して、全ての利用可能なデータについて、全ての分析を実施した。
Salmonellaのスクリーニング
6週齢のニワトリ由来の全ての組織サンプル、及び24週齢のニワトリ由来の全ての排出サンプルは陰性であったが、これは、ワクチン接種前及びチャレンジ前に、これらのニワトリにはSalmonellaがなかったことを示している。
あらゆるワクチン関連副作用及び死亡について、ニワトリを毎日観察した。いかなるニワトリにおいても、有害なワクチン反応又は死亡の発生は観察されなかった。
結果を以下の表4並びに図2A及び2Bに示す。
SQ経路によって投与したワクチンAは、全ての試験した内蔵、例えば肝臓/脾臓、盲腸及び卵巣のSEコロニー形成を軽減及び予防するのに有効であった。
結果を以下の表5並びに図3A及び3Bに示す。
SQ経路又はIM経路によって投与したワクチンAは、肝臓/脾臓及び盲腸のSTコロニー形成を軽減及び予防するのに有効であった。
結果を以下の表6及び図4に示す。
SQ経路又はIM経路によって投与したワクチンAは、盲腸におけるSKコロニー形成を軽減及び予防するのに有効であった。
SQ経路によってワクチンAをワクチン接種した群では、内臓肝臓及び脾臓からのSHチャレンジ株の再単離率は13%であり、盲腸からの再単離率は41%であり、卵巣からの再単離率は8%であり、プラセボ群では、それぞれ82%、69%及び59%であった(図5A)。予防分画の95%信頼限界の下限は、これら全ての組織で0超であった。したがって、内臓、盲腸及び卵巣では、ワクチンAは、SQ経路によって投与した場合にSH感染症を軽減した。IM経路によってワクチンAをワクチン接種した群では、内臓肝臓及び脾臓からのSH株の再単離率は19%であり、盲腸からの再単離率は70%であり、卵巣からの再単離率は14%であった(図5B)。予防分画の95%信頼限界の下限は、内臓及び卵巣で0超であった。したがって、内臓及び卵巣では、ワクチンAは、IM経路によって投与した場合にSH感染症を軽減した。
雌鶏における筋肉内注射部位の反応を計算することによって、ワクチンAの安全性を分析した。スコアリング方法は、表8に定義されている。
Claims (17)
- 有効量の少なくとも1つの抗原と、水中油中水型(WOW)エマルション中のアジュバント化合物とを含む、ワクチン。
- アジュバント化合物が水酸化アルミニウムである、請求項1に記載のワクチン。
- 少なくとも1つの抗原が、細菌細胞、好ましくは、生きているか、弱毒化されたか又は不活性化された細菌である、請求項1に記載のワクチン。
- 細菌がsalmonella菌であり、好ましくは、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella Enteritidis)、サルモネラ・ケンタッキー(Salmonella Kentucky)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella Typhimurium)、サルモネラ・ハイデルベルグ(Salmonella Heidelberg)又はそれらの組み合わせから選択される、請求項3に記載のワクチン。
- 前記WOWエマルションが、1つ又はいくつかの油及び少なくとも1つの界面活性剤を含む、請求項1に記載のワクチン。
- 油が、植物油、動物油、鉱物油又はそれらの混合物、好ましくは鉱物油を含む、請求項5に記載のワクチン。
- 少なくとも1つの界面活性剤が、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ソルビタンからなる群より選択される、請求項5に記載のワクチン。
- 外水相中に分散されている油性粒子内に包埋された水小胞を含む、請求項1に記載のワクチン。
- ワクチン中の前記少なくとも1つの抗原の総量の少なくとも60%(w/w)、好ましくは60%〜75%が油性粒子に含まれる、請求項8に記載のワクチン。
- 油性粒子が、植物油、動物油、鉱物油又はそれらの混合物、好ましくは鉱物油を含む、請求項8に記載のワクチン。
- アジュバント化合物が外水相中にある、請求項8に記載のワクチン。
- 外水相が、前記少なくとも1つの抗原のフラクション及び前記さらなるアジュバント、好ましくは抗原−アジュバント複合体をさらに含む、請求項11に記載のワクチン。
- a)油性基剤中で前記少なくとも1つの抗原の溶液を乳化し、それにより、油中水型(WO)エマルションを形成すること、
b)前記WOエマルションを分散相に追加し、それにより、WOWエマルションを形成し、前記WOWエマルションを乳化すること、及び
c)好ましくはさらなる量の前記少なくとも1つの抗原と組み合わせて、前記WOWエマルションをさらなるアジュバントと混合すること
を含む方法によって得ることができる、請求項1に記載のワクチン。 - 抗原のフラクションが、油性粒子、好ましくは1〜40μmのサイズを有する油性粒子に包埋されている、請求項1に記載のワクチン。
- 動物において前記抗原に対する免疫応答を誘導するのに使用するための、請求項1に記載のワクチン。
- 少なくとも1つの抗原とさらなるアジュバントとを含むワクチンを調製するための方法であって、
a)油性基剤中で前記少なくとも1つの抗原の溶液を乳化し、それにより、WOエマルションを形成する工程、
b)前記WOエマルションを分散相に追加し、それにより、WOWエマルションを形成し、前記WOWエマルションを乳化する工程、及び
c)好ましくはさらなる量の前記少なくとも1つの抗原と組み合わせて、前記WOWエマルションを前記アジュバントと混合する工程
を含む、方法。 - 有効量の請求項1に記載のワクチンを該動物に投与することを含む、非ヒト動物にワクチン接種するための方法。
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