CN108379577A - 一种增强pedv疫苗免疫应答的免疫增强剂 - Google Patents

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Abstract

一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，其特征在于，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸0.5‑0.75%，黄芪提取物1‑1.5%，白芍提取物2‑3%，氯化钠0.85%，维生素C 0.2‑0.4%，其余为蒸馏水。本发明的免疫增强剂能够显著提高母猪和仔猪的免疫应答水平，增强PEDV疫苗的保护效果，提升机体的免疫应答水平，进而提高机体的抗病能力，获得更好的免疫接种保护。

Description

一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂及其制备方法和应用。
背景技术：
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒 （p
orcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种急性、高度接触性、病毒性肠道传染病，一直是严重威胁仔猪健康养殖的主要疫病之一。该病于1971年在英国首次被报道，不久相继在欧洲各国开始流行。其在亚洲流行情况较欧洲更为严重，并呈现出哺乳仔猪高发病率、高致死率的特点。我国于1976年首次报道该病，到2000年，该病已经在全国范围内流行。尤其自2010年末开始，我国猪场从南到北，从东到西陆续暴发了PEDV变异毒株引起的以新生仔猪严重呕吐、水样腹泻和高病死率为主要特征的腹泻疫情。目前PEDV 变异毒株已是我国PEDV流行的优势毒株，变异毒株在我国猪群中的流行已不容忽视，甚至普遍认为变异型PED 将是未来几年内危害仔猪最为严重的腹泻病之一。
疫苗接种是预防控制 PED 的主要手段，自PEDV 出现以来，针对 PED 疫苗的研究一直都在持续进行。目前我国商品化的PED 疫苗主要有传统PEDV 灭活苗和弱毒苗，但灭活疫苗存在对猪的免疫保护力较弱、灭活不完全导致病毒扩散风险等缺陷，弱毒疫苗存在毒力增强、易产生变异株等缺陷。就目前我国 PED 流行现状而言，疫苗免疫仍是控制该病发生、流行和降低高病死率的最佳方法，疫苗应用依然是PED预防和控制的主要途径。随着PEDV 病原学和分子生物学研究的不断深入，其免疫机理日益清楚，PEDV以典型的局部黏膜免疫为主，存在于血清中的Ig G 不能提供完全保护，只有肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体（SIg A）才能抵抗 PEDV 感染，哺乳仔猪通过初乳获得母源SIg A，产生针对PEDV 的被动免疫保护。
PEDV灭活疫苗是最常规的疫苗，制造工艺简单，直接用人工繁殖获得病原微生物，经灭活后作为抗原，具有安全、可靠的特点。目前，已经商品化的灭活疫苗为猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活疫苗。为筛选能用于变异型PEDV 疫苗研发的流行毒株，代洪波等进行PEDV 变异毒株的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效果研究，结果显示以PEDV-JX12分离株制备的灭活疫苗免疫母猪，对哺乳仔猪的保护率达93.75%，表明 PEDV-JX12分离株能够适应细胞培养，免疫接种母猪能给哺乳仔猪提供有效保护，可用于变异型PEDV 流行毒株的疫苗研发。灭活疫苗性质比较稳定，易于保存和运输，抗原含量达到一定水平后免疫母猪，可以有效防控哺乳仔猪PEDV 的发生和流行。
发明专利CN201710012967.5提供了一种猪流行性腹泻病毒变异株灭活疫苗，是由腹泻病毒变异株PEDV/CH/BJ/2014株灭活后制备取得。该疫苗具有良好的免疫原性，母猪产前接种该疫苗后中和抗体产生快、抗体滴度高、维持时间长，而且接种后的母猪所产仔猪能获得较好的被动免疫，能够有效保护仔猪抵抗流行性腹泻病毒的攻击，提高仔猪成活率。发明专利CN201510053897.9公开了一种猪流行性腹泻病毒PEDV鼻腔免疫疫苗及其制备方法，由猪流行性腹泻病毒的疫苗原液、佐剂溶液和叠氮钠溶液按特定的比例混合制得，其中所述的佐剂溶液含有TLR的激动剂、NOD样受体的激动剂、卡波姆和PVPK。其制备的PEDV鼻腔免疫疫苗相比现有的相关疫苗，其效价高、免疫效果好，通过鼻腔黏膜组织进行疫苗免疫，可以同时激发机体黏膜免疫和系统免疫，在母猪乳汁中产生大量的sIgA，通过乳汁将母源抗体传递给仔猪，使仔猪获得有效的免疫保护，预防仔猪流行性腹泻的危害。发明专利WO2016/038197A公开了用于保护母猪的后代免于猪流行性腹泻病毒的疫苗，所述疫苗包含非活PEDV抗原和含油佐剂，其用于通过以对应于至少3.0E6 TCID50杀死的全PEDV的抗原的剂量向怀孕母猪施用所述疫苗而保护所述母猪的后代免于猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染。然而，新毒株的出现导致对目前CV777株疫苗毒免疫效力的质疑，然而目前没有更为合适的新的疫苗毒株出现，如何提高现有灭活疫苗保护力就成为防控PED 的研究热点。
发明内容：
基于现有技术中，PEDV易突变以及疫苗难以适用新毒株等问题，本发明旨在提供一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂及其制备方法和应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，其特征在于，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.5-0.75%，黄芪提取物 1-1.5%，白芍提取物 2-3%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.2-0.4%，其余为蒸馏水。
进一步的，优选的，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.6%，黄芪提取物 1.2%，白芍提取物 2.5%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.3%，蒸馏水 94.55%。
进一步的，优选的，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.5%，黄芪提取物 1%，白芍提取物 3%，氯化钠 0.85%，维生素C0.4%，蒸馏水94.25%。
进一步的，优选的，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸0.75%，黄芪提取物 1.5%，白芍提取物 2%，氯化钠 0.85%，维生素C0.2%，蒸馏水 94.7%。
进一步，优选的，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.65%，黄芪提取物 1.25%，白芍提取物 2.5%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.25%，蒸馏水 94.5%。
其中，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一，黄芪提取物和白芍提取物的制备；
步骤二，按质量百分含量组成，分别称取精氨酸、黄芪提取物、白芍提取物、氯化钠、维生素C和蒸馏水；
步骤三，将步骤二称取的各成分混合均匀，其混合顺序是先将精氨酸、氯化钠、维生素C和白芍提取物溶解在蒸馏水中，而后一边搅拌，一边向其中滴加黄芪提取物，待滴加完后进行均质处理；
步骤四，将步骤三均质后的物料进行过滤除菌操作，分装，即得到所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂。
优选的，其中黄芪提取物采用如下方法制备得到：
步骤A1，取中药黄芪，采用粉碎机器粉碎，过50-100目筛，得到黄芪粉末；
步骤A2，将步骤A1制备得到的黄芪粉末与水按照1：4的重量配比进行混合，在65-68℃下、慢速搅拌保温浸泡12-18小时，过滤分离得到滤液和黄芪滤渣；
步骤A3，将步骤A2得到的黄芪滤渣与浓度为70%（V/W）的乙醇溶液按照1：3的重量配比进行混合，在60℃的条件下恒温回流提取4-5小时，得到提取液；
步骤A4，将步骤A2得到的滤液和步骤A3制备的提取液按1：1的重量配比混合均匀，减压浓缩回收乙醇并浓缩至每毫升0.5g黄芪生药，过滤除菌，即得到所述的黄芪提取物。
其中所述的白芍提取物采用如下方法制备得到：
步骤B1，称取白芍，加入白芍质量8-10倍的60%（W/V）的乙醇，加热回流2次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇，得到白芍粗提液；
步骤B2，将白芍粗提液过已处理好的大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗涤，在用70%（W/V）的乙醇，回收洗脱液中的乙醇，并浓缩至每毫升0.5g白芍生药。
优选的，步骤四中的过滤除菌操作采用0.22μm的过滤膜。
本发明还涉及所述增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂在制备药物中的应用，所述药物用于增强PEDV疫苗免疫应答反应，或者用于预防或治疗主要由PEDV感染引起的猪流行性腹泻。
本发明所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂所制备而成的药物，其用量为仔猪每千克体重0.06-0.08毫升，育肥猪每千克体重0.02-0.03毫升，母猪为每千克体重0.04-0.05毫升。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
第一，本发明针对PEDV感染的相关生理变化，创造性的采用了黄芪提取物和白芍提取物，结合精氨酸、维生素C等制备得到具有免疫增强作用的免疫增强剂，其能够有效地增加仔猪的免疫应答水平，同时，还能增加接种母猪乳汁中sIgA的水平，从而为哺乳期的仔猪提供有效的保护。
第二，本发明在大量试验中整理得到本发明独特的配方组成，且经过严谨的科学试验获得最佳的组分配比，通过试验表明，本发明的各组分的用量并非越多越好，相反，当超过一定的用量范围后，其会表现出一定的免疫抑制。
第三，对比试验中，本发明实施例1、2组相比空白对照组，能够显著提高免疫母猪血清中的IgG水平，并且其乳汁中的IgG水平也得到了较大的提升，而现有技术报道表明，哺乳仔猪抵抗PEDV感染的主要抗体是来自母体乳汁的IgA，因此，该IgA水平的提升能够极大的提升哺乳仔猪抗PEDV感染的能力，减少仔猪腹泻的产生，提高仔猪的存活率。另外，相比组4，即不添加精氨酸组而言，本发明实施例1、2组的血清IgG和乳汁IgA水平也得到了极大的提升，提升约20%以上，这种提升对于母猪的保育和哺乳仔猪免疫力的获得具有重要的意义，该结果也表明，精氨酸在本发明中也起了不可或缺的作用，其能够协同黄芪提取物和白芍提取物等共同刺激机体的免疫系统，提升机体的免疫应答水平，进而提高机体的抗病能力，获得更好的免疫接种保护。
总而言之，本发明的免疫增强剂能够显著提高母猪和仔猪的免疫应答水平，增强PEDV疫苗的保护效果，提升机体的免疫应答水平，进而提高机体的抗病能力，获得更好的免疫接种保护。
具体实施方式
实施例1：一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.6%，黄芪提取物 1.2%，白芍提取物 2.5%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.3%，蒸馏水 94.55%。
其中，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一，黄芪提取物和白芍提取物的制备；
步骤二，按质量百分含量组成，分别称取精氨酸、黄芪提取物、白芍提取物、氯化钠、维生素C和蒸馏水；
步骤三，将步骤二称取的各成分混合均匀，其混合顺序是先将精氨酸、氯化钠、维生素C和白芍提取物溶解在蒸馏水中，而后一边搅拌，一边向其中滴加黄芪提取物，待滴加完后进行均质处理；
步骤四，将步骤三均质后的物料进行过滤除菌操作（0.22μm的滤膜），分装，即得到所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂。
其中黄芪提取物采用如下方法制备得到：
步骤A1，取中药黄芪，采用粉碎机器粉碎，过50目筛，得到黄芪粉末；
步骤A2，将步骤A1制备得到的黄芪粉末与水按照1：4的重量配比进行混合，在65℃下、慢速搅拌保温浸泡18小时，过滤分离得到滤液和黄芪滤渣；
步骤A3，将步骤A2得到的黄芪滤渣与浓度为70%（V/W）的乙醇溶液按照1：3的重量配比进行混合，在60℃的条件下恒温回流提取5小时，得到提取液；
步骤A4，将步骤A2得到的滤液和步骤A3制备的提取液按1：1的重量配比混合均匀，减压浓缩回收乙醇并浓缩至每毫升0.5g黄芪生药，过滤除菌，即得到所述的黄芪提取物。
其中所述的白芍提取物采用如下方法制备得到：
步骤B1，称取白芍，加入白芍质量8倍的60%（W/V）的乙醇，加热回流2次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇，得到白芍粗提液；
步骤B2，将白芍粗提液过已处理好的大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗涤，在用70%（W/V）的乙醇，回收洗脱液中的乙醇，并浓缩至每毫升0.5g白芍生药。
实施例2：一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.5%，黄芪提取物 1%，白芍提取物 3%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.4%，蒸馏水94.25%。
其中，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一，黄芪提取物和白芍提取物的制备；
步骤二，按质量百分含量组成，分别称取精氨酸、黄芪提取物、白芍提取物、氯化钠、维生素C和蒸馏水；
步骤三，将步骤二称取的各成分混合均匀，其混合顺序是先将精氨酸、氯化钠、维生素C和白芍提取物溶解在蒸馏水中，而后一边搅拌，一边向其中滴加黄芪提取物，待滴加完后进行均质处理；
步骤四，将步骤三均质后的物料进行过滤除菌操作，分装，即得到所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂。
其中黄芪提取物采用如下方法制备得到：
步骤A1，取中药黄芪，采用粉碎机器粉碎，过100目筛，得到黄芪粉末；
步骤A2，将步骤A1制备得到的黄芪粉末与水按照1：4的重量配比进行混合，在68℃下、慢速搅拌保温浸泡12小时，过滤分离得到滤液和黄芪滤渣；
步骤A3，将步骤A2得到的黄芪滤渣与浓度为70%（V/W）的乙醇溶液按照1：3的重量配比进行混合，在60℃的条件下恒温回流提取4小时，得到提取液；
步骤A4，将步骤A2得到的滤液和步骤A3制备的提取液按1：1的重量配比混合均匀，减压浓缩回收乙醇并浓缩至每毫升0.5g黄芪生药，过滤除菌，即得到所述的黄芪提取物。
其中所述的白芍提取物采用如下方法制备得到：
步骤B1，称取白芍，加入白芍质量10倍的60%（W/V）的乙醇，加热回流2次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇，得到白芍粗提液；
步骤B2，将白芍粗提液过已处理好的大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗涤，在用70%（W/V）的乙醇，回收洗脱液中的乙醇，并浓缩至每毫升0.5g白芍生药。
实施例3：一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸0.75%，黄芪提取物 1.5%，白芍提取物 2%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.2%，蒸馏水 94.7%。
其中，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一，黄芪提取物和白芍提取物的制备；
步骤二，按质量百分含量组成，分别称取精氨酸、黄芪提取物、白芍提取物、氯化钠、维生素C和蒸馏水；
步骤三，将步骤二称取的各成分混合均匀，其混合顺序是先将精氨酸、氯化钠、维生素C和白芍提取物溶解在蒸馏水中，而后一边搅拌，一边向其中滴加黄芪提取物，待滴加完后进行均质处理；
步骤四，将步骤三均质后的物料进行过滤除菌操作（0.22μm的滤膜），分装，即得到所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂。
其中黄芪提取物采用如下方法制备得到：
步骤A1，取中药黄芪，采用粉碎机器粉碎，过50目筛，得到黄芪粉末；
步骤A2，将步骤A1制备得到的黄芪粉末与水按照1：4的重量配比进行混合，在65℃下、慢速搅拌保温浸泡18小时，过滤分离得到滤液和黄芪滤渣；
步骤A3，将步骤A2得到的黄芪滤渣与浓度为70%（V/W）的乙醇溶液按照1：3的重量配比进行混合，在60℃的条件下恒温回流提取5小时，得到提取液；
步骤A4，将步骤A2得到的滤液和步骤A3制备的提取液按1：1的重量配比混合均匀，减压浓缩回收乙醇并浓缩至每毫升0.5g黄芪生药，过滤除菌，即得到所述的黄芪提取物。
其中所述的白芍提取物采用如下方法制备得到：
步骤B1，称取白芍，加入白芍质量8倍的60%（W/V）的乙醇，加热回流2次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇，得到白芍粗提液；
步骤B2，将白芍粗提液过已处理好的大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗涤，在用70%（W/V）的乙醇，回收洗脱液中的乙醇，并浓缩至每毫升0.5g白芍生药。
实施例4：一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.65%，黄芪提取物 1.25%，白芍提取物 2.5%，氯化钠 0.85%，维生素C0.25%，蒸馏水 94.5%。
其中，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一，黄芪提取物和白芍提取物的制备；
步骤二，按质量百分含量组成，分别称取精氨酸、黄芪提取物、白芍提取物、氯化钠、维生素C和蒸馏水；
步骤三，将步骤二称取的各成分混合均匀，其混合顺序是先将精氨酸、氯化钠、维生素C和白芍提取物溶解在蒸馏水中，而后一边搅拌，一边向其中滴加黄芪提取物，待滴加完后进行均质处理；
步骤四，将步骤三均质后的物料进行过滤除菌操作，分装，即得到所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂。
其中黄芪提取物采用如下方法制备得到：
步骤A1，取中药黄芪，采用粉碎机器粉碎，过100目筛，得到黄芪粉末；
步骤A2，将步骤A1制备得到的黄芪粉末与水按照1：4的重量配比进行混合，在68℃下、慢速搅拌保温浸泡12小时，过滤分离得到滤液和黄芪滤渣；
步骤A3，将步骤A2得到的黄芪滤渣与浓度为70%（V/W）的乙醇溶液按照1：3的重量配比进行混合，在60℃的条件下恒温回流提取4小时，得到提取液；
步骤A4，将步骤A2得到的滤液和步骤A3制备的提取液按1：1的重量配比混合均匀，减压浓缩回收乙醇并浓缩至每毫升0.5g黄芪生药，过滤除菌，即得到所述的黄芪提取物。
其中所述的白芍提取物采用如下方法制备得到：
步骤B1，称取白芍，加入白芍质量10倍的60%（W/V）的乙醇，加热回流2次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇，得到白芍粗提液；
步骤B2，将白芍粗提液过已处理好的大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗涤，在用70%（W/V）的乙醇，回收洗脱液中的乙醇，并浓缩至每毫升0.5g白芍生药。
实施例5：安全性试验
慢性毒性试验：采用本发明实施例1、2、3、4的免疫增强剂对小鼠进行肌肉注射，按照每千克体重0.1毫升的量进行肌肉注射，每周注射1次，连续观察12周，结果表明，注射了实施例1-4任意一种免疫增强剂的小鼠皮毛光滑，行为活动正常，摄食饮水正常，体重正常增加，血液生化指标和血液学均在正常范围内波动，尿常规和骨髓指标均在正常范围内波动，组织脏器未见异常，未见毒理反应。
急性毒性试验：采用本发明实施例1、2、3、4的免疫增强剂对小鼠进行肌肉注射，按照每千克体重2毫升的量进行肌肉注射，隔天注射1次，试验持续14天，共注射7次，试验期间未见死亡和异常毒性反应，结束后解剖试验小鼠，观察肝、肾、脾、胃、心、肺和肠，均未见异常改变。按急性毒性标准，该免疫增强剂无毒。
实施例6：
本发明是发明人在大量探索和大量试验中得到的技术方案，同样，发明人也愿意贡献研发过程中的相关接近的组方，虽然其效果相较本发明稍差，但也能为公众所了解和运用，更能了解本发明的显著效果。以下具体称之为对比实施例：
对比实施例1：免疫增强剂，由以下质量百分含量的成分组成：黄芪提取物 1.2%，白芍提取物 2.5%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.3%，蒸馏水 95.15%。制备方法同本发明实施例1。
对比实施例2：免疫增强剂，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.6%，黄芪提取物 3.2%，白芍提取物 2.5%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.3%，蒸馏水 92.55%。制备方法同本发明实施例1。
对比实施例3：免疫增强剂，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.6%，黄芪提取物 1.2%，白芍提取物 5%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.3%，蒸馏水 92.05%。制备方法同本发明实施例1。
其中对比实施例1中相比实施例1，减少了精氨酸的添加；对比实施例2、3相比实施例1分别调整了黄芪提取物和白芍提取物的用量。
实施例7：母猪保育试验
选取妊娠母猪（70±3天）30头，随机分为6组，分别标注为1组（空白组）、2组（实施例1）、3组（实施例2），4组（对比实施例1）、5组（对比实施例2）、6组（对比实施例3），采用CV777株灭活单苗（由陕西诺威利华生物科技有限公司制备、提供试验用苗）对妊娠母猪进行接种，接种同时，其中组1相应按照每千克体重0.05ml注射生理盐水，组2-6分别相应按照每千克体重0.05mL注射对应的免疫增强剂，首次接种后14天进行第二次接种。分别采集接种前、二免前、二免后14天的母猪血样，不少于3mL/头/次，分别采用Biovet PED ELISA抗体试剂盒检测血样中PEDV IgG水平。同时，在母猪分娩后的第10天，采集母猪乳汁不少于2mL/头，采用Bionote PED IgA ELISA抗体试剂盒检测乳汁中PEDV IgA水平。具体结果如下表1：
表1 母猪保育试验结果
基于以上试验结果可知，本发明实施例1和2所试验的实验组2和3均表现出色，其相比空白对照组，能够显著提高免疫母猪血清中的IgG水平，并且其乳汁中的IgG水平也得到了较大的提升，而现有技术报道表明，哺乳仔猪抵抗PEDV感染的主要抗体是来自母体乳汁的IgA，因此，该IgA水平的提升能够极大的提升哺乳仔猪抗PEDV感染的能力，减少仔猪腹泻的产生，提高仔猪的存活率。另外，相比组4，即不添加精氨酸组而言，本发明实施例1、2组的血清IgG和乳汁IgA水平也得到了极大的提升，提升约20%以上，这种提升对于母猪的保育和哺乳仔猪免疫力的获得具有重要的意义，该结果也表明，精氨酸在本发明中也起了不可或缺的作用，其能够协同黄芪提取物和白芍提取物等共同刺激机体的免疫系统，提升机体的免疫应答水平，进而提高机体的抗病能力，获得更好的免疫接种保护。相比组5和6，仅在用量上与本发明存在差异，然而，本发明徐相比其也取得了显著的改善，这也证明了本发明人大量的试验付出和反复的配比试验劳动是值得的，这种用量的调整给整个免疫增强剂带来了难以预期的免疫能力的提升，特别是通过与组6的比较表明，其中白芍提取物的含量高，但是，其表现出来了一定的免疫抑制，该结果也表明，仅有在特定的配比组成下，本发明才能起到免疫促进作用，否则免疫增强作用不显著，甚至会表现出一定的免疫抑制。
实施例8：断奶仔猪攻毒试验
选取日龄相近的断奶仔猪120头，随机分为6组，分别标注为1组（空白组）、2组（实施例1）、3组（实施例2），4组（对比实施例1）、5组（对比实施例2）、6组（对比实施例3），采用CV777株灭活单苗（由陕西诺威利华生物科技有限公司制备、提供试验用苗）对断奶仔猪进行接种，接种同时，其中组1相应按照每千克体重0.05ml注射生理盐水，组2-6分别相应按照每千克体重0.05mL注射对应的免疫增强剂，首次接种后14天进行第二次接种。第二次接种后30天，采用PEDV强毒毒株（由北京康宝利华生物科技有限公司提供）对断奶仔猪进行攻读，观察仔猪的发病情况和保护率，其中以攻读后7天内不发生病毒性腹泻为受到保护。具体结果如下表2：
表2 断奶仔猪攻毒试验结果
由以上结果可知，本发明实施例1和2的免疫增强剂能够最大化的提高断奶仔猪的免疫应答，形成有效量的保护抗体，从而实现仔猪攻毒后的有效保护，其相比生理盐水注射组仅能实现50%的保护率而言，实施例1和2组的保护率达到95%以上，基本上实现了仔猪的全保护。而对比实施例1相比实施例1减少了精氨酸的添加，而其保护率仅能达到75%作用，说明精氨酸在本发明的免疫增强剂中起到了比较重要的作用，也表明仅有以上成分的协同才能起到最佳的保护效果。另外，相比实施例1和2，对比实施例2和3的保护效果也差于本发明，说明本发明的剂量对于仔猪的免疫保护也是很重要的，特别是对比实施例3，其保护效果最差，而白芍提取物的相对含量增加，然而，其先比而言表现出较差的保护效果，而根据血清学指标测试表明，采用对比实施例3的断奶仔猪表现出一定的免疫抑制，其血清中的IgG水平略低于对比实施例1和2组，接近于组1的生理盐水组的血清IgG水平。

Claims (10)

1.一种增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，其特征在于，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.5-0.75%，黄芪提取物 1-1.5%，白芍提取物 2-3%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.2-0.4%，其余为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，其特征在于，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.6%，黄芪提取物 1.2%，白芍提取物 2.5%，氯化钠0.85%，维生素C 0.3%，蒸馏水 94.55%。
3.根据权利要求1所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，其特征在于，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.5%，黄芪提取物 1%，白芍提取物 3%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.4%，蒸馏水94.25%。
4.根据权利要求1所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，其特征在于，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸0.75%，黄芪提取物 1.5%，白芍提取物 2%，氯化钠 0.85%，维生素C 0.2%，蒸馏水 94.7%。
5.根据权利要求1所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂，其特征在于，由以下质量百分含量的成分组成：精氨酸 0.65%，黄芪提取物 1.25%，白芍提取物 2.5%，氯化钠0.85%，维生素C 0.25%，蒸馏水 94.5%。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，黄芪提取物和白芍提取物的制备；
步骤二，按质量百分含量组成，分别称取精氨酸、黄芪提取物、白芍提取物、氯化钠、维生素C和蒸馏水；
步骤三，将步骤二称取的各成分混合均匀，其混合顺序是先将精氨酸、氯化钠、维生素C和白芍提取物溶解在蒸馏水中，而后一边搅拌，一边向其中滴加黄芪提取物，待滴加完后进行均质处理；
步骤四，将步骤三均质后的物料进行过滤除菌操作，分装，即得到所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中黄芪提取物采用如下方法制备得到：
步骤A1，取中药黄芪，采用粉碎机器粉碎，过50-100目筛，得到黄芪粉末；
步骤A2，将步骤A1制备得到的黄芪粉末与水按照1：4的重量配比进行混合，在65-68℃下、慢速搅拌保温浸泡12-18小时，过滤分离得到滤液和黄芪滤渣；
步骤A3，将步骤A2得到的黄芪滤渣与浓度为70%（V/W）的乙醇溶液按照1：3的重量配比进行混合，在60℃的条件下恒温回流提取4-5小时，得到提取液；
步骤A4，将步骤A2得到的滤液和步骤A3制备的提取液按1：1的重量配比混合均匀，减压浓缩回收乙醇并浓缩至每毫升0.5g黄芪生药，过滤除菌，即得到所述的黄芪提取物。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中所述的白芍提取物采用如下方法制备得到：
步骤B1，称取白芍，加入白芍质量8-10倍的60%（W/V）的乙醇，加热回流2次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇，得到白芍粗提液；
步骤B2，将白芍粗提液过已处理好的大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗涤，在用70%（W/V）的乙醇，回收洗脱液中的乙醇，并浓缩至每毫升0.5g白芍生药。
9.权利要求1-5任一项所述增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂在制备药物中的应用，所述药物用于增强PEDV疫苗免疫应答反应，或者用于预防或治疗主要由PEDV感染引起的猪流行性腹泻。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的增强PEDV疫苗免疫应答的免疫增强剂所制备而成的药物，其用量为仔猪每千克体重0.06-0.08毫升，育肥猪每千克体重0.02-0.03毫升，母猪为每千克体重0.04-0.05毫升。
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