CN102321180B - 多肽片段组合物及其在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多肽片段组合物及其在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。本发明提供的多肽片段组合物，为序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽和序列表的序列6所示的多肽。本发明提供的多肽片段组合物均可以作为猪繁殖与呼吸综合征合疫苗的活性成分，对于猪繁殖与呼吸综合征的防治具有重大应用价值。本发明提供的疫苗，可以有效应对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原变异，且不存在生物安全性问题，易于大规合成，具有良好的应用前景。

Description

多肽片段组合物及其在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及多肽片段组合物及其在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称为猪蓝耳病，在1987年首次发现于美国，而后迅速传播到加拿大。在欧洲，1990年首次爆发于德国，然后是挪威、比利时、西班牙、英国、法国和丹麦。如今这种疾病已经传播到世界各地，包括南美洲、北美洲、欧洲和亚洲。最近，在我国出现了高毒力变异株，它是由PRRS病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度传染病，可引起母猪的繁殖障碍、各年龄猪发生呼吸道症状以及仔猪死亡，此外还可以导致免疫抑制从而诱发继发感染，对全世界的养猪业都造成了巨大的经济损失。

PRRSV属于动脉炎病毒属，根据病毒抗原的抗原性、基因组及致病性差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型(LV株为代表)和美洲型(VR2332株为代表)。病毒粒子中含有一个核衣壳，核衣壳由正链RNA基因组和核衣壳蛋白(N)组成，核衣壳外边被一层囊膜包裹；病毒的囊膜含有6种病毒结构蛋白：小囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)以及N-糖基化蛋白GP2、GP3、GP4和GP5。M、N和GP5三种蛋白是PRRS病毒的主要结构蛋白，E、GP2、GP3和GP4是次要结构蛋白。M蛋白和GP5以二硫键相连的异源二聚体的形式存在于囊膜中，而次要结构蛋白E、GP2、GP3和GP4则可能是以非共价键结合在一起形成异源多聚体。

目前对关于PRRS的免疫机制缺乏系统的了解，但不少学者认为体液免疫(尤其是中和抗体)和T细胞介导免疫在清除机体PRRSV感染方面发挥主导作用。PRRSV感染猪后会在一定时期内抑制宿主的天然免疫和获得性免疫反应，尤其是抑制PRRSV特异性细胞免疫，使机体不能在感染早期及时清除病毒，从而造成病毒在机体内的持续性感染。研究表明，Nsp9、Gp3、Gp4、Gp5、M和N等蛋白在介导T细胞免疫上发挥着重要功能。

疫苗接种是预防PRRS最有效的方法，国内外已有商业化的PRRS疫苗，包括弱毒疫苗和灭活疫苗。但是，弱毒疫苗在提供免疫保护的同时，还会持续散播疫苗病毒，使得病毒在猪场中循环存在，可能发生重组变异等，并存在着毒力返强等不安全性问题，有时甚至引发PRRS爆发。而灭活疫苗存在着免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生周期长，不能对非疫苗株型的病毒侵染提供免疫保护等缺点，不太适合仔猪免疫，而仔猪带毒是猪场PRRSV持续存在的重要原因。所以，通过弱毒疫苗或灭活疫苗难以控制和根除PRRSV在猪场的存在和流行。

随着近年来学者们对PRRSV本身以及病毒与动物的免疫应答机制的深入研究，提供一种能克服PRRS灭活疫苗和弱毒疫苗的缺点，并同时启动机体的细胞免疫和体液免疫应答的疫苗，已成为当前PRRS疫苗的研究热点，诸如基因工程疫苗(病毒载体、质粒载体及细菌载体等载体疫苗)、亚单位疫苗等。而采用化学合成抗原表位(B细胞表位和T细胞表位)氨基酸序列的方法制备具保护作用的化学合成多肽疫苗，不含核酸，是最为理想的安全性疫苗，也是目前研制预防和控制感染性疾病的主要方向之一。化学合成表位肽疫苗在口蹄疫的防治上已经取得了显著的成果。研制PRRS合成肽疫苗的关键之处在病毒组成蛋白上寻找可启动机体细胞免疫和/或体液免疫的抗原决定簇(即T细胞抗原表位和B细胞抗原表位)。

发明内容

本发明的目的是提供多肽片段组合物及其在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。

本发明提供的多肽片段组合物，为序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽和序列表的序列6所示的多肽。

多肽Ⅰ(序列表的序列1)：TMPPGFELYGGGGSGGGGSFLLVGFKCF；

多肽Ⅱ(序列表的序列2)：CLLPSLLAIGGGGSGGGGSLAALICFVIRLAKNC；

多肽Ⅲ(序列表的序列3)：KGRLYRWRSPVIVEKGGGGSGGGGSCNDSTAPQKVLLAFS；

多肽Ⅳ(序列表的序列4)：ALKVSRGRLLGLLHLGGGGSGGGGSFGYMTFVHFESTNRV；

多肽Ⅴ(序列表的序列5)：KFITSRCRLCLLGRKGGGGSGGGGSNPEKPHFPL；

多肽Ⅵ(序列表的序列6)：VRHHFTPSEGGGGSGGGGSFSLPTQHTVRLIRATAS。

所述多肽片段组合物中，所述各种多肽可等质量混合后包装，也可单独包装，使用时再等质量混合。

所述多肽片段组合物可用于制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗。

所述多肽片段组合物和APP-N蛋白可用于制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗；所述APP-N蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进免疫活性的功能的由序列7衍生的蛋白质。

所述APP-N蛋白具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子编码的蛋白：

1)序列表中序列8所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有促进免疫活性的功能的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有促进免疫活性的功能的DNA分子。

本发明还保护一种预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗，它的活性成分为所述多肽片段组合物。所述多肽片段组合物中，所述各种多肽可等质量混合后包装，也可单独包装，使用时再等质量混合。

本发明还保护另一种预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗，它的活性成分为所述多肽片段组合物和所述APP-N蛋白。所述多肽片段组合物中，所述各种多肽可等质量混合后包装，也可单独包装，使用时再等质量混合。所述活性成分中，所述各种多肽与所述APP-N蛋白均可等质量混合后包装，也均可单独包装，使用时再等质量混合。

以上任一所述的疫苗中还可含有佐剂，如白油。

以上任一所述的疫苗具体可由所述活性成分、水和白油组成。所述疫苗中，所述多肽Ⅰ、所述多肽Ⅱ、所述多肽Ⅲl、所述多肽Ⅳ、所述多肽Ⅴ和所述多肽Ⅵ的浓度均为0.05mg/ml，所述白油的浓度为50％(体积比)。所述疫苗中，所述多肽Ⅰ、所述多肽Ⅱ、所述多肽Ⅲl、所述多肽Ⅳ、所述多肽Ⅴ、所述多肽Ⅵ和所述APP-N蛋白的浓度均为0.05mg/ml，所述白油的浓度为50％(体积比)。

以上任一所述的猪繁殖与呼吸综合征具体可为PRRSV病毒VR2332毒株引发的猪繁殖与呼吸综合征。

以上任一所述疫苗的推荐免疫方法为：分别第1天、第15天、第29天进行免疫；免疫方式：肌肉注射；每头猪的单次免疫剂量：2ml。

本发明提供了一种多肽片段组合物，本发明提供的多肽片段组合物可以作为猪繁殖与呼吸综合征合疫苗的活性成分，对于猪繁殖与呼吸综合征的防治具有重大应用价值。本发明提供的疫苗，可以有效应对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原变异，且不存在生物安全性问题，易于大规合成，具有良好的应用前景。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

白油：购自北京信得威特生物技术公司。

PRRSV病毒VR2332毒株：购自中国兽医药品监察所。

实施例1、多肽片段和APP-N蛋白的合成

一、多肽片段的合成

设计六条多肽片段(均为T细胞抗原表位)，序列如下(由氮末端至碳末端)：

多肽Ⅰ(序列表的序列1)：TMPPGFELYGGGGSGGGGSFLLVGFKCF；

多肽Ⅱ(序列表的序列2)：CLLPSLLAIGGGGSGGGGSLAALICFVIRLAKNC；

多肽Ⅲ(序列表的序列3)：KGRLYRWRSPVIVEKGGGGSGGGGSCNDSTAPQKVLLAFS；

多肽Ⅳ(序列表的序列4)：ALKVSRGRLLGLLHLGGGGSGGGGSFGYMTFVHFESTNRV；

多肽Ⅴ(序列表的序列5)：KFITSRCRLCLLGRKGGGGSGGGGSNPEKPHFPL；

多肽Ⅵ(序列表的序列6)：VRHHFTPSEGGGGSGGGGSFSLPTQHTVRLIRATAS；

分别化学合成以上六条多肽。

二、APP-N蛋白的合成

APP-N蛋白是一种免疫增强剂，如序列表的序列7所示，其编码基因(APP-N基因)如序列表的序列8所示。APP-N蛋白相关专利的申请日为2010年4月2日，申请号为201010140598.6。

1、酵母表达载体APP/pPICZαA的构建

由上海生工生物工程技术服务有限公司合成序列8所示的APP-N基因，然后用如下引物对进行PCR扩增，引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切识别位点：

APP-F：5’-CATCTCGAGGAGGATGAAGTGGATGTGG-3’；

APP-R：5’-CATTCTAGAGTATTCATCATCTTCTACTTCCTTTG-3’。

将PCR扩增产物用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后插入pPICZαA(购自上海普飞生物技术有限公司，V19520)的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，电转化酵母菌株SMD1168H(购自美国invitrogen公司，C18400)，将转化子铺于含zeocin(购自美国invitrogen公司，C19840)100μg/mL的YPDS(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，2％琼脂)平板，42℃培养2-3天，直至长出单菌落，经PCR鉴定后获得阳性重组菌。将阳性重组菌提取质粒进行测序，结果表明得到了重组质粒APP-N/pPICZαA(在pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点之间插入序列表的序列8所示的APP-N基因)。将含有重组质粒APP-N/pPICZαA的酵母菌株SMD1168H命名为重组菌SMD-APP-N/pPICZαA。

2、APP-N在酵母中的表达

将重组菌SMD-APP-N/pPICZαA先接种于BMGY液体培养基中，42℃培养18h(18-20h均可)，待OD₆₀₀值为4时(2-6均可)，1500g离心5分钟收集菌体；在BMMY液体培养基中，将菌体在相同条件下继续培养使其OD₆₀₀值达到1.0；然后每24小时加入终浓度为0.5％(体积百分含量)的甲醇诱导表达，30℃诱导48小时。

3、取5L步骤2得到的发酵液，10000g离心10分钟，收集菌体；将菌体用TE缓冲液洗涤后超声破菌，然后用PBS缓冲液洗涤包涵体，用6M盐酸胍水溶液溶解包涵体；用PBS缓冲液进行透析后离心取上清。

4、将步骤3的上清液用醋酸调节pH值为4.8；过阴离子交换层析柱(层析柱为CaptoQ，购自GE Healthcare；阴离子交换层析柱填充物为高效琼脂糖和右旋糖苷混合物；柱长为10cm、柱子的内径为0.77cm)，收集目标洗脱峰；过Sephacry1分子筛层析柱(分子筛为SuperDex 75，购自GE Healthcare；Sephacry1分子筛层析柱填充物为右旋糖苷交联表氯醇；柱长为50cm、柱子的内径为1.5cm)，收集目标洗脱峰；过滤除菌后冷冻干燥即为APP-N蛋白。

阴离子交换层析包括如下步骤：以Tris-Cl缓冲液(20mM，pH8.0)作为起始液，以NaCl浓度为1M的Tris-Cl缓冲液(20mM，pH8.0)作为终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱时间为1小时，所述洗脱过程中NaCl浓度梯度变化速率恒定，每次收集1ml洗脱液，收集NaCl浓度为0.25M的Tris-Cl缓冲液所洗脱下来的溶液。

分子筛层析包括如下步骤：以NaCl浓度为150mM的Tris-Cl缓冲液(20mM，pH7.5)进行，进行时间为1小时，所述进行过程中NaCl浓度恒定(在16ml处开始收取洗脱液，共收集5ml)。

实施例2、疫苗的制备

一、疫苗甲的制备

1、用注射用水(无菌水)将实施例1制备的多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ分别稀释至1.2mg/ml，然后等体积混合，制成水相抗原(6种多肽片段在水相抗原中的浓度均为0.2mg/ml)。

2、用注射用水(无菌水)将实施例1制备的APP-N蛋白(佐剂)稀释至蛋白浓度为0.2mg/ml，即为蛋白佐剂水相。

3、在6℃条件下(4～8℃均可)，将步骤1的水相抗原和步骤2的蛋白佐剂水相等体积混合，在混匀仪上按照50转/分慢速混匀结合2小时，即为水相佐剂-抗原免疫原(APP-N蛋白的浓度为100μg/ml、多肽Ⅰ的浓度为0.1mg/ml、多肽Ⅱ的浓度为0.1mg/ml、多肽Ⅲ的浓度为0.1mg/ml、多肽Ⅳ的浓度为0.1mg/ml、多肽Ⅴ的浓度为0.1mg/ml、多肽Ⅵ的浓度为0.1mg/ml)。

4、在6℃条件下(4～8℃均可)，将步骤3的水相佐剂-抗原免疫原和白油(佐剂)等体积混合，将混合物加入乳化管内，在组织匀浆器下1500转/分搅拌30秒，即为白油-APP-抗原免疫原(又称疫苗甲)。

二、疫苗乙的制备

1、用注射用水(无菌水)将实施例1制备的多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ分别稀释至0.6mg/ml，然后等体积混合，制成水相抗原(6种多肽片段在水相抗原中的浓度均为0.1mg/ml)。

2、在6℃条件下(4～8℃均可)，将步骤1的水相抗原和白油(佐剂)等体积混合，将混合物加入乳化管内，在组织匀浆器下1500转/分搅拌30秒，即为白油-抗原免疫原(又称疫苗乙)。

三、对照品甲的制备

1、用注射用水(无菌水)将实施例1制备的APP-N蛋白(佐剂)稀释至0.1mg/ml，即为蛋白佐剂水相。

2、在6℃条件下(4～8℃均可)，将步骤1的蛋白佐剂水相和白油(佐剂)等体积混合，将混合物加入乳化管内，在组织匀浆器下1500转/分搅拌30秒，即为对照品甲。

四、对照品乙的制备

将注射用水(无菌水)作为对照品乙。

实施例3、疫苗的效力实验

一、实验动物

50头6周龄且PRRSV抗原、抗体双阴性的健康猪(品种为长白猪，购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平动物实验基地)。

二、应用疫苗免疫动物

将实验动物随机分成5组，每组10只，分别进行如下免疫：

第1组(实验组甲)：采用实施例2制备的疫苗甲进行免疫；

第2组(实验组乙)：采用实施例2制备的疫苗乙进行免疫；

第3组(阴性对照组)：采用实施例2制备的对照品甲进行免疫；

第4组(空白对照组)：采用实施例2制备的对照品乙进行免疫；

第5组(阳性对照组)：采用PRRS市售疫苗进行免疫；PRRS市售疫苗：购自齐鲁动物保健品有限公司，兽药生字：(2005)080011054，为50ml/瓶的包装(每ml病毒含量为≥2×10^7.0TCID₅₀)。

各组的免疫过程均为：分别在实验的第1天、第15天、第29天进行免疫；免疫方式：肌肉注射；每头猪的单次免疫剂量：2ml。

三、淋巴细胞增殖实验

实验的第43天，每头猪分别采集全血，分离外周血单核淋巴细胞(PBMC)，进行如下淋巴细胞增殖实验：

PBMC悬于含有10mM HEPES、抗生素(青霉素和链霉素各100U/ml)和10％(体积百分含量)胎牛血清(FBS)的PRIM-1640培养基中，经细胞计数后，均分至96孔板中(2×10⁶个细胞/孔)，于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养；24小时后加入灭活的PRRSV病毒VR2332毒株作为刺激物，同时以Marc-145细胞(购自中国兽医药品监察所)作为阴性对照的刺激物。培养72小时后加入MTT(20uL/孔)，培养5小时后再加入DMSO(150uL/孔)，混匀10分钟测定570nm吸光值，计算刺激因子SI。SI＝OD570值(样本孔-空白孔)/OD570值(阴性孔-空白孔)。

结果见表1。

表1淋巴细胞增殖实验刺激系数

分组	刺激系数(SI±SEM)
		实验组甲	2.6±0.21
实验组乙	2.1±0.13
		阳性对照组	2.5±0.11
阴性对照组	1.1±0.04
		空白对照组	1.0±0.03

结果表明，本发明提供的疫苗能诱发机体特异性T细胞免疫应答。

四、攻毒实验

实验的第43天，进行攻毒实验，具体如下：将浓度为1×10⁶TCID₅₀/ml的PRRSV病毒VR2332毒株病毒液稀释10倍后，以2ml/头的剂量经颈部肌肉接种至试验动物，继续饲养观察，记录各组动物的反应(包括体温、临床症状和剖检大体病理变化)。

判断病猪的表征为：临床出现体温升高，皮肤出现血点、斑，眼结膜炎，俯跪卧姿，后驱晃动，瘫痪等神经症状；大体解剖见肺从近心端开始出现灶性出血、淤血，脾梗死，淋巴结，肾出血点灶，脑膜充血等；组织病理学见肺间质性肺炎，非化脓性脑炎，淋巴系统退行性变。

攻毒后第21天统计各组猪的发病数和死亡数。结果见表2。

表2疫苗免疫试验保护效力结果

分组	试验动物数(头)	发病数	死亡数	保护率％
					实验组甲	10	0	0	100
实验组乙	10	3	2	70
					阳性对照组	10	0	0	100
阴性对照组	10	10	8	0
					空白对照组	10	10	9	0

本发明提供的六条多肽混合后，可以作为疫苗，对于避免猪被PRRSV病毒感染具有良好的保护效果，具有潜在的应用价值。APP-N蛋白作为一种免疫促进剂，可以作为疫苗的添加成分，增加疫苗的保护效果。

Claims (11)

1.多肽片段组合物，为序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽和序列表的序列6所示的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽片段组合物，其特征在于：所述多肽片段组合物中，各种所述多肽的质量均相等。

3.权利要求1或2所述多肽片段组合物在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

4.权利要求1或2所述多肽片段组合物和APP-N蛋白在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用，所述APP-N蛋白是由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

5.一种预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗，它的活性成分为权利要求1所述多肽片段组合物。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述多肽片段组合物中，各种所述多肽的质量均相等。

7.一种预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗，它的活性成分为权利要求1所述多肽片段组合物和APP-N蛋白；所述APP-N蛋白是由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

8.如权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述多肽片段组合物中，各种所述多肽的质量均相等。

9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于：每种所述多肽的质量均与所述APP-N蛋白的质量相等。

10.如权利要求5至9中任一所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还含有佐剂。

11.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于：所述佐剂为白油。