CN104262488A - 一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白以及含该融合蛋白的猪流行性腹泻疫苗组合物及其应用。该融合蛋白含猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白和免疫球蛋白Fc片段，该猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白含猪流行性腹泻病毒S蛋白片段的串联组合而成的蛋白。本发明还提供了一种猪流行性病毒疫苗组合物，该疫苗组合物含有融合蛋白和载体。本发明还公开了含该疫苗组合物的制备方法及其在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒所引发疾病的药物中的应用。该融合蛋白制备的疫苗组合物，避免了用猪流行性腹泻病毒全病毒制备传统灭活疫苗过程中全病毒难以分离、培养的技术难题；该融合蛋白可利用基因工程技术进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产。

Description

一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的融合蛋白及含该融合蛋白的疫苗组合物的制备与应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhoea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪腹泻的一种重要急性、接触性、病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高，特别地，7日龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率高达50％，最高的死亡率达100％。该病最早于上世纪70年代发生在英国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到PEDV。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄段的猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤以哺乳仔猪严重，病死率达100％。目前，还没有特效药物可抵抗PEDV，由于该病发病急，流行快，猪群一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。

中国于1980年首次分离到PEDV，以后许多地区相继报道有本病发生，并主要在冬春季节散发，造成的危害巨大。自2010年至今，在我国华南、华北部分省份暴发了严重的传染性腹泻疾病，已超过100万只的猪死亡(Sun RQ,Cai RJ,Chen YQ,et al.Outbreak of porcineepidemic diarrhea in suckling piglets,China.Emerging infectiousdiseases,2012,18(1):161-162)。该疾病发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治均无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失，经研究表明：该疾病的罪魁祸首便是猪流行性腹泻病毒变异株(Chen JF,Liu XZ,Shi D,et al.CompleteGenome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variant.Journalof Virology,2012,86:3408)。

目前，对于该疾病的防控主要采取传统工艺以制备灭活疫苗免疫接种，但PEDV全病毒难以分离、培养。因此，如何解决防控PEDV变异株所带来的疾病的问题是猪流行性腹泻这一领域急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种融合蛋白，以及含该融合蛋白的疫苗组合物与应用。该疫苗组合物可有效预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒所导致的疾病。

本发明的主要目的在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：

(1)猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白；

(2)免疫球蛋白Fc片段。

术语“猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白”是指将具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒蛋白片段进行串联组合而制成的蛋白，包括但不限于猪流行性腹泻病毒S蛋白片段的串联组合而成的蛋白。

术语“猪流行性腹泻病毒S蛋白片段”是指具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒S全蛋白的部分蛋白片段；所述猪流行性腹泻病毒S全蛋白是指猪流行性腹泻病毒纤突蛋白(即spike蛋白)，位于病毒粒子表面，由1380多个氨基酸组成(王树坤，郎洪武，李轶女等.猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达.生物技术进展,2012,2(4):282-287；Chen JF,Liu XZ,Shi D,et al.Complete genome sequence of aporcine epidemic diarrhea virus variant.Journal of virology,2012,86(6):3408)。

优选地，猪流行性腹泻病毒S蛋白片段包括COE中和表位或SS2-SS6-2C10三个中和表位的串联以及COE中和表位二者SS2-SS6-2C10三个中和表位的串联的组合。

优选地，所述COE中和表位的核苷酸序列编码SEQ ID No.2、SEQID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8的编码氨基酸序列。

优选地，所述SS2-SS6-2C10组合的中和表位的核苷酸序列编码为SEQ ID No.10的氨基酸序列。

术语“COE中和表位”是S1蛋白的一个中和表位区(499～639aa)根据CHANG SH BAE J L KANG T T,et al.Identification of theepitoperegion capable of inducing neutralizinganuibodoesagainst the porcine epidemic diarrhea virus MOL CELLS2002,14(2)295-299鉴定，并把这段蛋白的编码基因命名为COE基因，不同毒株之间有1-2位氨基酸的移动。

融合蛋白中猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白和免疫球蛋白Fc片段，可以用本领域熟知的方式连接，在一个优选的实施方式中猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白连接在猪免疫球蛋白Fc的C端，中间可以选择加上连接柔性蛋白作为连接器，也可以选择不加柔性蛋白，作为一种示例，柔性蛋白为GGSSGG大写字母是氨基酸代码。

猪流行性腹泻抗原表位SS2、SS6、2C10，是指S1蛋白中具有中和活性的抗原位点，具体描述参见JianfeiXiaozhen Liu，etlDetection and Molecular Diversity of Spike Gene of Porcine EpidemicDiarrhea Virus in China。Viruses 2013,5,2601-2613；doi:10.3390/v510260此文献全文本发明的一部分引用入本发明。

猪流行性腹泻抗原表位抗原SS2、SS6、2C10可以单独和免疫球蛋白Fc片段融合表达，也可以串联在一起和免疫球蛋白Fc表达，在一个优选的实施方式中猪流行性腹泻抗原表位抗原SS2、SS6、2C10串联和免疫球蛋白Fc表达。

术语融合蛋白：融合蛋白(fusion protein)有两种不同的含义，一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。将两个不同的蛋白质连成一个大分子。可以通过化学方法连接，也可通过基因的融合来实现。

术语“免疫球蛋白Fc片段”是指含有免疫球蛋白重链恒定区2(C_H2)和重链恒定区3(C_H3)且不含免疫球蛋白重链和轻链可变区、重链恒定区1(C_H1)和轻链恒定区1(C_L1)的蛋白质，还可进一步含有位于重链恒定区的铰链区，于本发明中主要用作药物载体。此外，除了重链和轻链可变区之外，所述免疫球蛋白Fc片段可能包含重链恒定区1(C_H1)和/或轻链恒定区1(C_L1)的部分或全部。同样，只要所述免疫球蛋白Fc片段具有与天然蛋白质基本上相似或优于天然蛋白质的生理学作用，则所述免疫球蛋白Fc片段可以是在C_H2和/或C_H3氨基酸序列的相对较长部分中有缺失的片段。即本发明所述免疫球蛋白Fc片段可包含(1)C_H1结构域、C_H2结构域、C_H3结构域和C_H4结构域，(2)C_H1结构域和C_H2结构域，(3)C_H1结构域和C_H3结构域，(4)C_H2结构域和C_H3结构域，(5)一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的部分)的组合，和(6)重链恒定区和轻链恒定区各个结构域的二聚体。

术语“免疫球蛋白Fc片段”包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突变体)。所述氨基酸序列衍生物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守性或保守性取代或它们的组合而不同于天然氨基酸序列的序列，是具有与所述免疫球蛋白Fc片段同样的生物学活性或提高了结构稳定性(如抗热、抗pH等)的衍生物。如：在免疫球蛋白IgG Fc片段中，已知对于结合重要且位于位点214-238、297-299、318-322或327-331处的氨基酸残基可用作修饰的适当靶目标。此外，其它各衍生物也是有可能的，包括其中能形成二硫键的区域被缺失，或天然Fc形式末端的某些氨基酸残基被除去或在此添加了甲硫氨酸残基的衍生物。此外，为了去除效应器功能，缺失可以发生在补体结合位点，诸如C1q结合位点和ADCC位点。制备所述免疫球蛋白Fc片段序列衍生物的技术参阅国际专利申请WO97/34631和WO96/32478。此外，若需要，所述免疫球蛋白Fc片段可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等作用而被修饰。

术语“免疫球蛋白Fc片段”可获自从人或包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠在内的其它动物中分离的天然形式，或可以是重组体或它们的衍生物，获自被转化的动物细胞或微生物。在此，它们可通过从人或动物体中分离完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶加以处理而从天然的免疫球蛋白中获得。木瓜蛋白酶将天然的免疫球蛋白消化成Fab和Fc片段，而胃蛋白酶处理则导致了pF'c和F(ab')2片段的产生。可对这些片段进行如大小排阻层析以分离Fc或pF'c。此外，所述免疫球蛋白Fc片段可以是具有天然糖链、与天然形式相比糖链增加或与天然形式相比糖链减少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可以通过本领域的通用方法完成，诸如化学法、酶促法、利用为生物的遗传工程法。将糖链从Fc片段中去除导致了它与第一补体成分C1的C1q部分的结合亲和力明显降低和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的降低或丧失，从而不会在体内引起不必要的免疫应答。在这点上，去糖基化或未糖基化形式的免疫球蛋白Fc片段可能更适于本发明作为药物载体的目的。

术语“去糖基化”是指从所述免疫球蛋白Fc片段中除去了糖基部分。

术语“未糖基化”指所述免疫球蛋白Fc片段是以非糖基化的形式由原核生物产生，优选为由大肠杆菌产生。

术语“免疫球蛋白Fc片段”可获自从人类或其它动物，包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠，优选猪。此外，所述免疫球蛋白Fc片段可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段，或者通过它们的组合或杂合体制备而来的Fc片段；优选为来自IgG或IgA；最优选为来自猪的IgG。

术语“组合”是指编码同一来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接形成二聚体或多聚体。所述二聚体或多聚体可由选自IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、IgG4Fc片段中的两种或多种片段所组成。

术语“杂合体”是指编码两种或多种不同来源的免疫球蛋白Fc片段的序列存在于单链免疫球蛋白Fc片段中。本发明中，各种类型的杂合体都是由可能的。即结构域杂合体可由选自IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、IgG4Fc的C_H1、C_H2、C_H3、C_H4中的一种至四种结构域组成，且可能包含铰链区。

IgG被划分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四种亚型，本发明包括它们的组合和杂合体；优选来自猪IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四种亚型，包括它们的组合和杂合体。

本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括上述融合蛋白和载体。

优选地，所述融合蛋白的含量为0.5μg/mL-200μg/mL，优选5μg/mL-100μg/mL。

优选地，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂为铝胶佐剂。

优选地，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物由所述融合蛋白和兽医学上可接受的佐剂组成。

术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。

术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application ofadjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunitand adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphaticradical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(RibiIncorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。

优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂为铝胶佐剂。

优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5％-30％，优选为20％。

本发明所用术语“猪流行性腹泻”与“PED”、“猪流行性腹泻病毒”与“PEDV”在本发明中可互换使用。

本发明所用缩略语为：AA，氨基酸；bp，碱基对。

本发明的再一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)克隆表达所述融合蛋白；以及(2)按比例混合所述表达的所述融合蛋白和载体。

优选地，所述步骤(1)中克隆表达所述融合蛋白为分别克隆所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、所述免疫球蛋白Fc片段，再用基因工程手段将两种蛋白进行融合表达。

优选地，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白是由猪流行性腹泻病毒S蛋白片段与间隔子Linker串联组合而成的蛋白，优选地，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段的核苷酸序列包括编码COE中和表位的SEQID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8的氨基酸序列，以及编码SS2-SS6-2C10组合的中和表位的SEQ ID No.10的氨基酸序列。

氨基酸序列；所述免疫球蛋白Fc片段的核苷酸序列编码SEQ IDNo.12氨基酸序列。

优选地，所述的克隆表达方法为采用大肠杆菌表达系统表达。

本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病所引发疾病的药物中的应用。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪流行性腹泻病毒变异株感染时是指抑制猪流行性腹泻病毒的复制、抑制猪流行性腹泻病毒的传播或防止猪流行性腹泻病毒普通株和变异株在其宿主体内定居，以及减轻猪流行性腹泻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

本发明具有以下突出的优点：

(1)所述融合蛋白制备的疫苗组合物，避免了用猪流行性腹泻病毒普通株和变异株全病毒制备传统灭活疫苗过程中全病毒难以分离、培养的技术难题。

(2)所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分即所述融合蛋白进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产。

序列表中：

序列1为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的核苷酸序列1；

序列2为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的氨基酸序列1；

序列3为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的人工合成核苷酸序列2；

序列4为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的氨基酸序列2；

序列5为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的核苷酸序列3；

序列6为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的氨基酸序列3；

序列7为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的核苷酸序列4；

序列8为猪流行性腹泻病毒COE中和表位的氨基酸序列4；

序列9为猪流行性腹泻病毒SS2-SS6-2C10串联组合的中和表位的核苷酸序列；

序列10为猪流行性腹泻病毒SS2-SS6-2C10串联组合的中和表位的氨基酸序列；

序列11为猪免疫球蛋白IgG Fc片段的核苷酸序列；

序列12为猪免疫球蛋白IgG Fc片段的氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所采用猪流行性腹泻攻毒毒株为沪毒株或HN1301株(Porcine epidemic diarrhea virus,strain HN1301)，其中，沪毒株已在中国专利CN101117627A中公开，农业部公告270号文件中将该毒株作为猪流行性腹泻普通株CV777株的效检用强毒株；HN1301株的保藏号为CCTCC NO.V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2013年9月16日，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH7.4PBS溶液，其配方为：1000mL蒸馏水中加入NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实施例以体积比为20％的铝胶佐剂制备猪流行性腹泻疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本实施例中猪流行性腹泻发病的判定标准为：厌食、通常黄色或浅黄色水样腹泻，部分仔猪伴有呕吐、寒颤、脱水等症状，在临床观察的5-6日之内可能有部分仔猪脱水后死亡。发病程度可能轻重不同，但判定发病最基本的、也是不可少的条件是腹泻。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1融合蛋白1的制备、鉴定及含量测定

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪流行性腹泻病毒(登录号：JN599150.1、AB857233.1、AB857234.1)中S蛋白片段中COE中和表位的基因序列(分别见SEQ ID No.1、SEQ ID No.3(人工合成)、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7)、SS2-SS6-2C10组合的中和表位的基因序列(SEQ ID No.9)，以及猪免疫球蛋白IgG(登陆号：NM_213828.1)中Fc蛋白的基因序列(见SEQ ID No.11)通过基因工程手段制备融合蛋白。

1.1猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白的构建及鉴定

构建猪流行性腹泻病毒S蛋白片段中COE中和表位时，在该基因的5′-端和3′-端引入特异性酶切位点如EcoRI和HindIII，由上海生物工程有限公司采用人工合成的方法制备而成，所合成的基因全长均约为400bp，并将合成的基因分别命名为AB1、AB2、AB3、AB4。

特别地，为了保证构建出猪流行性腹泻病毒S蛋白片段SS2-SS6-2C10组合的中和表位的正确结构，防止在构建猪流行性腹泻病毒S蛋白片段中SS2-SS6-2C10组合的中和表位串联组合时出现新的表位，在两表位之间引入间隔子Linker序列GGSSGG(即ggcggcagcagcggcggc)，并在串联组合基因的5′-端和3′-端引入特异性酶切位点如EcoRI和HindIII，由上海生物工程有限公司采用人工合成的方法制备而成，所合成的串联组合基因全长约100bp，命名为CD。

将合成的基因AB1、AB2、AB3、AB4或CD分别和原核表达载体pET-30a(+)分别用EcoRI和HindIII酶切，纯化回收后使用核酸连接酶将AB1、AB2、AB3、AB4、CD基因片段连接至pET-30a(+)载体，以构建重组表达质粒pET-30a-AB1、pET-30a-AB2、pET-30a-AB3、pET-30a-AB4、pET-30a-CD，并转化JM109感受态细胞，经阳性筛选后，通过测定序列分别确定阳性重组质粒。

1.2猪免疫球蛋白Fc片段的构建及鉴定

用Primer5.0引物软件设计扩增猪免疫球蛋白IgG Fc片段的特异性引物，并在序列两端引入HindIII与XhoI酶切位点，引物序列如下：

上游引物：5′AAGCTTCTTGAGGTCGTCGTGT3′

下游引物：5′CTCGAGACCCTGAGTCTTGGA3′。

参照BioteckReagent RNA IsolationSolvent的产品说明进行组织RNA提取，具体操作如下：剪取约1g冻存的肝脏置于研钵内，迅速倒入少许液氮，反复研磨至均匀粉状，期间补加液氮，待液氮挥发完全后，按2ml/g加入RNA-Solv，研磨均匀，待溶液变清亮后，转移至1.5ml EP管中，用枪头吹吸均匀。13000r/min离心1min，用枪头吸出底部残存的絮状沉淀，加入1/5体积的氯仿(约200μl)至EP管中，涡旋混匀，冰浴10min，室温11000r/min离心15min，取上清移入另一EP管，加入500μl异丙醇，混匀，室温放置10min，室温11000r/min离心10min，弃上清，加1ml80％(V/V)乙醇，涡旋混匀，室温7000r/min，离心5min，吸弃乙醇，抽干，加入30μl无RNA酶的ddH₂O溶解，-80℃保存备用。

依TaKaRa Two Step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒说明书，按照反转录RT反应体系配制反应液，具体为：MgCl₂25mM 2μl，10×RNABuffer 1μl，RNase Free H₂O 3.85μl，dNTPs各10mM 1μl，RNA Inhibitor40U/μl 0.25μl，AMV反转录酶5U/μl 0.5μl，下游引物20mM 0.5μl，RNA模板1.5μl。将配制好的RT反应体系震荡混匀，并进行RT反应，其中RT反应程序为：50℃反转录30min，99℃变性5min，4℃搁置5min。

RT反应停止后，立即配制PCR反应液，具体为：5×PCR Buffer10μl，H₂O 29.25μl，TaKaRa Ex TaqHs 5U/μl 0.25μl，上游引物20mM0.5μl。将RT之后的RT反应体系加入PCR反应液中，混匀，8000r/min离心30s，按PCR反应程序进行扩增。其中PCR反应程序为：94℃预热2min，循环1次；94℃变性30s、57℃复性30s、72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸10min，循环1次；并于4℃保存20min，循环1次。

将上述PCR产物电泳，结果在约1000bp附近出现相应的目的条带，用DNA凝胶快速回收试剂盒(上海生工)回收相应DNA片段，纯化片段连接至pMD18-T载体，构建pMD18-T-Fc重组载体，并转化DH5a感受态细菌，经阳性克隆后并测序，测序正确质粒命名为pMD18-T-Fc。

1.3融合蛋白的制备及其生物活性鉴定

将构建的pET-30a-AB、pMD18-T-Fc重组质粒分别使用XhoI、HindIII酶进行双酶切，酶切产物电泳后，分别在5900bp或5500bp、1000bp附近出现相应的pET-30a-AB1、1、pET-30a-AB2、pET-30a-AB3、pET-30a-AB4、pET-30a-CD载体片段和Fc目的片段，使用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段，然后使用核酸连接酶连接，连接产物转化BL21(DE3)感受态细菌，挑选单克隆，接种LB培养液(Kan⁺)，提取核酸，经酶切鉴定后，将阳性质粒送基因公司测序，测序正确的质粒分别命名为pET-30a-AB1-Fc、pET-30a-AB2-Fc、pET-30a-AB3-Fc、pET-30a-AB4-Fc、pET-30a-CD-Fc。鉴定正确的含有重组质粒的重组菌接种LB平板，挑单菌落接种5ml含卡那霉素的LB培养液，于37℃培养箱220rpm过夜培养，将过夜培养物按1％加入新制备的无菌LB培养液中(Kan⁺)，于37℃培养箱220rpm培养至OD₆₀₀约为0.4-0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG诱导表达4-6小时，2000rpm离心30min收获培养物，按原培养物体积的20％加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理30min，20000g离心20min收集沉淀4℃，弃上清。按照Ni-NTA组氨酸纯化柱说明书纯化蛋白，纯化蛋白分别经SDS-PAGE电泳及Westernblotting分析，重组的融合蛋白AB1-Fc、AB2-Fc、AB3-Fc、AB4-Fc、CD-Fc大小与预期均相符，均能与鼠抗PEDV阳性血清发生特异性反应，而同条件的阴性对照未出现相应片段。

1.4融合蛋白含量的测定

将纯化后的融合蛋白AB1-Fc、AB2-Fc、AB3-Fc、AB4-Fc、CD-Fc分别命名为融合蛋白1、融合蛋白2、融合蛋白3、融合蛋白4、融合蛋白5，将其经Bradford定量，结果表明：重组的融合蛋白1、融合蛋白2、融合蛋白3、融合蛋白4、融合蛋白5的浓度分别为190μg/ml、200μg/ml、252μg/ml、285μg/ml、220μg/ml。

实施例2猪流行性腹泻病毒疫苗组合物的制备

使用pH7.4PBS将实施例1制备的融合蛋白进行稀释，并加入铝胶佐剂充分混匀，使疫苗组合物中所含重组的融合蛋白的含量如表1所示，同时保证铝胶佐剂与疫苗组合物的体积比为1:5。将制备好的疫苗组合物作为免疫原，于4℃保存备用。

表1猪流行性腹泻疫苗组合物所含组分

实施例3猪流行性腹泻疫苗组合物免疫效力评价

3.1主动免疫试验

选取3日龄PEDV抗体、抗原阴性仔猪64头，随机分成8组(详情见表2)，8头/组。第1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6组分别肌肉注射实施例2所制备的疫苗1-5，2ml/头；第1-7、1-8组均为空白对照组免疫注射相同剂量的pH7.4的PBS溶液。免疫后14日，采集免疫组和对照组猪血清，分别检测各组血清中和抗体效价。使用SPSS 15.0软件对各仔猪平均抗体效价进行统计分析。同时，免疫组除第1-1、1-5组和空白对照组第1-7组猪每头口服1ml沪毒株病毒液(病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml)进行攻毒外，其余免疫组第1-2、1-3、1-4、1-6组和空白对照组第1-8组猪每头口服1ml HN1301株病毒液(病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml)进行攻毒。攻毒后观察7天，统计各组发病情况，并根据发病判断标准进行评判。

主动免疫效力试验结果见表2。

表2主动免疫效力试验结果

由表2可知：

(1)仔猪免疫后，测定中和抗体效价，免疫猪流行性腹泻疫苗组合物(第1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6组)仔猪的几何平均抗体效价分别为1:73、1:75、1:80、1:79、1:76、1:81，差异不显著(p＞0.05)；但均高于空白对照组(第1-7、1-8组)的免疫效果，且具有显著差异(p＜0.05)。

(2)攻毒后，免疫猪流行性腹泻疫苗组合物(第1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6组)的仔猪，除免疫当日食欲有所下降外，在观察期未见腹泻，精神、饮食均正常，保护率均为100％；而空白对照组(第1-7、1-8组)仔猪分别先后于攻毒后第2天、第3天发病，至观察期结束，发病率为100％，部分仔猪因腹泻脱水而死亡。

3.2被动免疫试验

选取20头外观正常、同期配种，PEDV、TGEV等抗原、抗体检测均呈阴性的妊娠后期母猪，随机分为8组(详情见表3)，其中免疫组(第2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6组)3头/组，剩余2头母猪均作为空白对照(第2-7、2-8组)。第2-1、2-2、2-3、2-4、2-7、2-8组母猪分别在分娩前5-7周肌肉注射免疫实施例3制备的疫苗，2ml/头，3周后，以同样免疫方式及剂量进行二免。

免疫母猪分娩后，同时采集母猪血液，分别处理后，测定中和抗体效价。结果见表3，表明：免疫疫苗1-3的试验组第2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6组母猪血清几何平均抗体效价分别为1:78、1:83、1:82、1:85、1:81、1:87(p＞0.05)，而空白对照组血清为阴性。

从各免疫组及对照母猪所产仔猪，随机挑选8头3日龄仔猪，其中免疫组除第2-1组、第2-5组和空白对照组第2-7组猪每头口服1ml沪毒株病毒液(病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml)进行攻毒外，其余免疫组第2-2、2-3、2-4、2-6组和空白对照组第2-8组猪每头口服1ml HN1301株病毒液(病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/mL)进行攻毒。攻毒后，观察7天，统计各组发病情况，并根据发病判断标准进行评判。

被动免疫效力试验结果见表3。

表3被动免疫效力试验结果

由表3可知：

使用分离的猪流行性腹泻病毒沪毒株或HN1301株攻毒后，免疫猪流行性腹泻疫苗组合物的免疫组(第2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6组)母猪所产仔猪，均未出现腹泻等症状，精神、食欲正常；而空白对照组(第2-7、2-8组)未免疫的母猪所产仔猪攻毒后，均于第3天出现腹泻等临床症状，至第7天观察期结束，全部仔猪出现腹泻等临川症状，部分仔猪因脱水发生死亡。

综上所述，不论是主动免疫还是被动免疫，所用融合蛋白制备的猪流行性腹泻疫苗组合物免疫后均能获得较好的免疫效果，能获得完全保护。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白和免疫球蛋白Fc片段。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白包括猪流行性腹泻病毒变异株S蛋白片段的串联组合而成的蛋白，优选地，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段包括COE中和表位或SS2-SS6-2C10组合的中和表位，优选地，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段包括COE中和表位和SS2-SS6-2C10组合的中和表位串联。

3.根据权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述COE中和表位的核苷酸序列编码SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8的氨基酸序列，所述SS2-SS6-2C10组合的中和表位的核苷酸序列编码为SEQ ID No.10的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段由选自C_H1、C_H2、C_H3、C_H4结构域中的一个至四个结构域组成。

5.根据权利要求4所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段还包括铰链区。

6.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段以及它们的组合和杂合体。

7.根据权利要求6所述融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段选自来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它们的组合和杂合体，优选为来自猪IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它们的组合和杂合体。

8.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括权利要求1所述融合蛋白和载体；优选地，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。

10.一种制备权利要求8所述疫苗组合物的在预防猪流行性腹泻药物中的应用，优选地，所述的流行性腹泻药物中的应用为变异猪流行性腹泻。