CN104001171A - 一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY的制备方法，该抗仔猪腹泻IgY的制备方法包括以下步骤：分离纯化猪流行性腹泻病毒PEDV、猪轮状病毒和大肠杆菌K88，作为抗原；抗原+弗氏完全或不完全佐剂分别制备免疫原；分别免疫8周龄的产蛋鸡，鸡胸部肌肉分点注射免疫原1.0mL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋鸡所产鸡蛋，分离蛋黄；蛋黄加入硫酸葡聚糖，充分搅拌，离心处理；取离心上清，加30％冷乙醇，充分搅拌，离心处理后所得沉淀即为抗仔猪腹泻IgY；抗仔猪腹泻IgY能有效预防和治疗仔猪多种原因引起的腹泻，见效快，效果好。

Description

一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY的制备方法

技术领域

本发明属于医药制备技术领域，尤其涉及一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY的制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻是由猪流行腹泻病毒引起的仔猪和育肥猪的一种急性肠道传染病。猪流行腹泻病毒(PEDV)，属于冠状病毒科冠状病毒属。目前还为发现本病毒有不同的血清型；只发生于猪，各种年龄的猪都能感染发病。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15-90％。病猪是主要传染源。病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染环境、饲料、饮水、交通工具及用具等而传染。主要感染途径是消化道。如果一个猪场陆续有不少窝仔猪出生或断奶，病毒会不断感染失去母源抗体的断奶仔猪，使本病呈地方流行性，在这种繁殖场内，猪流行性腹泻可造成5-8周龄仔猪的断奶期顽固性腹泻。

潜伏期一般为5-8天，人工感染潜伏期为8-24小时。主要的临床症状为水样腹泻，或者在腹泻之间有呕吐。呕吐多发生于吃食或吃奶后。症状的轻重随年龄的大小而有差异，年龄越小，症状越重。一周龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50％，最高的死亡率达100％。病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝。断奶猪、母猪常呈精神萎顿、厌食和持续性腹泻大约一周，并逐渐恢复正常。少数猪恢复后生长发育不良。肥育猪在同圈饲养感染后都发生腹泻，一周后康复，死亡率1％--3％。成年猪症状较轻，有的仅表现呕吐，重者水样腹泻3-4天可自愈；应用抗生素治疗无效。

轮状病毒各种年龄的猪都可感染，感染率最高可达90％～100％，在流行地区由于大多数成年猪都已感染而获得免疫。因此，发病猪多是8周龄以下的仔猪，日龄越小的仔猪，发病率越高，发病率一般为50％～80％，病死率一般为10％以内。潜伏期一般为12～24小时。常方性流行。初精神沉郁，食欲不振，不愿走动，有些吃奶后发生呕吐，继而腹泻，粪便呈黄色、灰色或黑色，为水样或糊状。症状的轻重决定于发病的日龄、免疫状态和环境条件，缺乏母源抗体保护的生后几天的仔猪症状最重，环境温度下降或继发大肠杆菌病时，常使症状加重，病死率增高。

大肠杆菌病，为革兰氏染色阴性，无芽胞，一般有数根鞭毛，常无荚膜的、两端钝圆的短杆菌。在普通培养基上易于生长，于37℃24h形成透明浅灰色的湿润菌落；

仔猪黄痢又称早发性大肠杆菌病，1-7日龄左右的仔猪发生的一种急性、高度致死性的疾病。临床上以剧烈腹泻、排黄色水样稀便、迅速死亡为特征。剖检常有肠炎和败血症，有的无明显病理变化。

从病猪分离到的大肠杆菌有溶血性或非溶血性两类，其O抗原型因不同地域和时期而有变化。但在同一地点的同一流行中，常限于1～2个型。多数病原菌株都有菌毛吸着因子并产生肠毒素，已知吸着因子(也称粘着因子)有K88、K99、987P、F41四种，且各具独特的抗原性。肠毒素以热敏肠毒素LT为主。这是大肠杆菌引起仔猪黄痢的两个主要因素。潜伏期短，一般在24h左右，长的也仅有1-3天，个别病例到7日龄左右发病。窝内发生第一头病猪，一二天内同窝猪相继发病。最初为突然腹泻，排出稀薄如水样粪便，黄至灰黄色，混有小气泡并带腥臭，随后腹泻愈加严重，数分钟即泻1次。病猪口渴、脱水，但无呕吐现象，最后昏迷死亡。

仔猪白痢是由大肠杆菌引起的10日龄左右仔猪发生的消化道传染病。临床上以排灰白色粥样稀便为主要特征，发病率高而致死率低。病原尚不完全肯定。猪肠道菌群失调、大肠杆菌过量繁殖是本病的重要病因。江苏省农业科学院实验证实猪轮状病毒是仔猪白痢的病因之一。气候变化、饲养管理不当是本病发生的诱因。

仔猪水肿病是由溶血性大肠杆菌毒素所引起的断奶仔猪眼睑或其它部位水肿、神经症状为主要特征的疾病。该病多发于仔猪断奶后1～2周，发病率约5％～30％，病死率达90％以上。近年来本病又有新的流行特点：首先发病日龄不断增加，据各地反馈情况80斤-100斤的猪都有水肿病的发生；其次吃的越多、长的越壮的猪发病率和死亡率越高；

大肠杆菌病疫苗目前效果不理想，且一旦出现症状，治疗效果也不明显。

现有技术未能提供一种有效预防和治疗仔猪传染性腹泻的药物。

发明内容

本发明提供了一种抗猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪大肠杆菌K88等多种病原引起仔猪腹泻IgY的制备方法，旨在解决现有技术未能提供能有效预防和治疗仔猪多种原因引起腹泻和早期死亡的问题。

本发明的目的在于提供一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY，该抗仔猪腹泻IgY的配方组成及各个配方所占比例为：按照1∶5的比例用无菌生理盐水将卵黄粉稀释，卵黄粉的纯度大于95％稀释。

进一步，该抗仔猪腹泻IgY的使用方法为：仔猪出生后，立即口服1.0mL，3小时后仔猪吃初乳。

本发明的另一目的在于提供一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY的制备方法，该抗仔猪腹泻IgY的制备方法包括以下步骤：

步骤一，病原的分离、纯化培养及鉴定：

(1)猪流行性腹泻病毒PEDV和猪轮状病毒的分离纯化培养：

取发病仔猪的空肠和肠系膜淋巴结置于乳钵内，剪碎，反复研磨，加入pH值为7.0的PBS制成1∶5的组织匀浆，-70℃反复冻融3次；5000转/分钟离心20分钟，取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤，然后加入双抗100IU/mL，-70℃保存，备用；

将处理病料接种于长成单层的vero细胞，每个样品接种3瓶，设阴性对照，37℃吸附1小时；倾去病毒液，加入含5％血清的M199继续培养，观察4d，不出现病变者继续盲传5代；有细胞病变者继续传代，直到细胞病变稳定；

将出现80％细胞病变者连同培养基一起于-70℃反复冻融3次；5000转/分钟离心20分钟，取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤，然后加入双抗100IU/mL，用于制作PEDV或猪轮状病毒免疫原；用于制作免疫原；

(2)大肠杆菌K88的纯化培养：购买大肠杆菌K88标准菌株，普通营养肉汤培养基进行扩增培养后，用PBS洗涤3次，作为抗原，用于制作大肠杆菌K88的免疫原；

步骤二，PEDV、猪轮状病毒、大肠杆菌K88分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂按照1∶1的比例，振荡器充分震荡混匀，即为免疫原；

步骤三，免疫8周龄的产蛋鸡，鸡胸部肌肉分点注射免疫原完全佐剂1mL，10天后用不完全佐剂免疫原进行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐剂免疫原进行第三次免疫；

步骤四，第三次免疫之后，15天收集蛋鸡所产鸡蛋，分离蛋黄；

步骤五，蛋黄加入硫酸葡聚糖，终浓度3.5％，充分搅拌，5000转/分钟离心30分钟，取上清；

步骤六，上清物加30％乙醇，充分搅拌，离心处理后所得沉淀即为抗仔猪腹泻IgY。

技术效果：

本发明提供的抗仔猪腹泻IgY的制备方法，该抗仔猪腹泻IgY的制备方法包括以下步骤：分离纯化猪流行性腹泻病毒PEDV、猪轮状病毒和大肠杆菌K88，作为抗原；抗原+弗氏完全或不完全佐剂分别制备免疫原；分别免疫8周龄的产蛋鸡，鸡胸部肌肉分点注射免疫原1.0mL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋鸡所产鸡蛋，分离蛋黄；蛋黄加入硫酸葡聚糖，充分搅拌，离心处理；取离心上清，加30％冷乙醇，充分搅拌，离心处理后所得沉淀即为抗仔猪腹泻IgY；抗仔猪腹泻IgY能有效预防和治疗仔猪多种原因引起的腹泻，见效快，效果好。

附图说明

图1是本发明实施例提供的抗仔猪腹泻IgY的制备方法的实现流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

本发明的抗仔猪多种腹泻的复合IgY，该抗仔猪腹泻IgY的配方组成及各个配方所占比例为：按照1∶5的比例用无菌生理盐水将卵黄粉稀释，卵黄粉的纯度大于95％稀释；使用方法为：仔猪出生后，立即口服1.0mL，3小时后仔猪吃初乳。

本发明制剂为上述4种的卵黄免疫球蛋白的纯化物，具有抵抗和杀灭上述病原的效果，初生仔猪胃上皮功能还未完全形成，不能降解卵黄免疫球蛋白，而是直接吸收，血液抗体含量升高，且有效浓度可维持7天。因此，出生3小时仔猪口服本制剂后，能够有效预防和治疗上述4种传染病对仔猪感染。

图1示出了本发明实施例提供的抗仔猪腹泻IgY的制备方法的实现流程。

该抗仔猪腹泻IgY的制备方法包括以下步骤：

步骤S101，分离纯化猪传猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒及大肠杆菌K88的增菌培养；

步骤S102，3种病原+弗氏完全或不完全佐剂制备PEDV、猪轮状病毒、大肠杆菌K88；

步骤S103，免疫8周龄的产蛋鸡，鸡胸部肌肉分点注射免疫原1mL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；

步骤S104，第三次免疫之后，15天收集蛋鸡所产鸡蛋，分离蛋黄；

步骤S105，蛋黄加入硫酸葡聚糖，充分搅拌，离心处理；

步骤S106，取离心上清，加30％乙醇，充分搅拌，离心处理后所得沉淀即为抗仔猪腹泻IgY。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明以PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)猪流行性腹泻病毒、PPV(Porcine rotavirus disease，PPV)猪轮状毒病、大肠杆菌K88为免疫原，制作含有上述3种病原抗体的卵黄抗体，用于预防和治疗仔猪多种病原引起的腹泻，卵黄抗体可用于疾病的预防，也可用于疾病的特效治疗。

实例一：商南县瑞生实业有限责任公司猪存栏5000头，适繁母猪300头，2012年出现7日龄以内仔猪大量腹泻，发病率53％，死亡率37％，2013年3月开始试用本技术试验制剂，至6月，发病率降至3.6％，死亡率降至0.4％。

星光良种猪繁养殖有限公司猪存栏10000头，适繁母猪800头，2012年5月开始试用本试验制剂，与前期相比，初生仔猪腹泻发病率减少88％，死亡率减少90％，7日龄仔猪成活率达到98％，显著提高了公司的经济效益。

丹凤县山凹凹生态发展有限公司猪存栏7000头，适繁母猪500头，2013年5月试用本技术试验制剂，7日龄以内仔猪腹泻发病率减少90.6％，死亡率减少89.3％，本制剂能使初生仔猪获得对猪流行性腹泻病的病毒、轮状病毒及大肠杆菌产生强有力的被动免疫力，有效降低因多种病原引起腹泻而导致的大量死亡。

新起源牧业有限公司猪存栏2000头，适繁母猪1000头，2012年9月试用本技术的试验制剂后，发病率和死亡率显著降低，分别比前期降低92％和89％，显著防止了仔猪的腹泻的发生。

本发明实施例提供的抗仔猪腹泻IgY的制备方法，该抗仔猪腹泻IgY的制备方法包括以下步骤：分离纯化猪流行性腹泻病毒PEDV、猪轮状病毒和大肠杆菌K88，作为抗原；抗原+弗氏完全或不完全佐剂分别制备免疫原；分别免疫8周龄的产蛋鸡，鸡胸部肌肉分点注射免疫原1.0mL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋鸡所产鸡蛋，分离蛋黄；蛋黄加入硫酸葡聚糖，充分搅拌，离心处理；取离心上清，加30％冷乙醇，充分搅拌，离心处理后所得沉淀即为抗仔猪腹泻IgY；抗仔猪腹泻IgY能有效预防和治疗仔猪多种原因引起的腹泻，见效快，效果好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY，其特征在于，该抗仔猪腹泻IgY的配方组成及各个配方所占比例为：按照1∶5的比例用无菌生理盐水将卵黄粉稀释，卵黄粉的纯度大于95％稀释。

2.如权利要求1所述的抗仔猪腹泻IgY，其特征在于，该抗仔猪腹泻IgY的使用方法为：仔猪出生后，立即口服1.0mL，3小时后仔猪吃初乳。

3.一种抗仔猪多种腹泻的复合IgY的制备方法，其特征在于，该抗仔猪腹泻IgY的制备方法包括以下步骤：

步骤一，病原的分离、纯化培养及鉴定：

(1)猪流行性腹泻病毒PEDV和猪轮状病毒的分离纯化培养：

取发病仔猪的空肠和肠系膜淋巴结置于乳钵内，剪碎，反复研磨，加入pH值为7.0的PBS制成1∶5的组织匀浆，-70℃反复冻融3次；5000转/分钟离心20分钟，取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤，然后加入双抗100IU/mL，-70℃保存，备用；

将处理病料接种于长成单层的vero细胞，每个样品接种3瓶，设阴性对照，37℃吸附1小时；倾去病毒液，加入含5％血清的M199继续培养，观察4d，不出现病变者继续盲传5代；有细胞病变者继续传代，直到细胞病变稳定；

将出现80％细胞病变者连同培养基一起于-70℃反复冻融3次；5000转/分钟离心20分钟，取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤，然后加入双抗100IU/mL，用于制作PEDV或猪轮状病毒免疫原；用于制作免疫原；

(2)大肠杆菌K88的纯化培养：购买大肠杆菌K88标准菌株，普通营养肉汤培养基进行扩增培养后，用PBS洗涤3次，作为抗原，用于制作大肠杆菌K88的免疫原；

步骤二，PEDV、猪轮状病毒、大肠杆菌K88分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂按照1∶1的比例，振荡器充分震荡混匀，即为免疫原；

步骤三，免疫8周龄的产蛋鸡，鸡胸部肌肉分点注射免疫原完全佐剂1mL，10天后用不完全佐剂免疫原进行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐剂免疫原进行第三次免疫；

步骤四，第三次免疫之后，15天收集蛋鸡所产鸡蛋，分离蛋黄；

步骤五，蛋黄加入硫酸葡聚糖，终浓度3.5％，充分搅拌，5000转/分钟离心30分钟，取上清；

步骤六，上清物加30％乙醇，充分搅拌，离心处理后所得沉淀即为抗仔猪腹泻IgY。