KR101622554B1 - 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법 - Google Patents

면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 강아지를 감염시킬 수 있는 서로 다른 전염성 질병에 대한 항원을 각각 준비하는 단계;
상기 준비된 항원들과 면역형성용 항원을 제조하는 단계;
상기 제조된 면역형성용 항원을 산란계 및 젖소에 접종하는 단계;
상기 산란계로부터 면역계란을 수거 및 젖소로부터의 면역초유를 수거하는 단계;
상기 수거한 면역계란의 난황을 채취하여 면역초유와 혼합 후 분말로 제조하는 단계를 포함하여 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

Description

면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법{Method for producing a composition for the treatment of diseases of dogs with immune antibody}
본 발명은 강아지의 설사병 및 호흡기질병에 대한 고 면역 항체를 생산하기 위하여 각 병원체의 항원을 제조하여 산란계 및 임신한 젖소에 접종하여 면역 난황항체 및 면역초유를 생산하고, 면역증강, 설사예방 및 장기능 개선에 좋은 생균제를 첨가한 후 제품을 제조하여 어린 강아지에 급여하여 설사 및 호흡기질병을 예방 또는 치료함으로서 질병에 의한 폐사감소와 성장지연을 최소화함으로서 축산농가의 생산성을 향상시키는 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
면역처리 된 동물의 혈청으로부터 얻어진 특이항체(Specific IgG)는 진단과 순수과학 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다.
IgG를 사용할 수 있는 또 하나의 주요 분야는 간접면역(Passive immunization)이다. 간접 면역이란 병원균에 대한 특이항체를 다른 동물에서 만들고 이렇게 만들어진 항체를 질병의 예방을 위해 대상 동물에게 투여하는 것을 말한다. 간접면역은 전염병의 예방에 효과가 있다는 것이 여러 연구를 통해 그동안 밝혀져 왔다.
난황내의 IgG 는 IgY(Immune globulin Yolk)라 한다.
젖소가 분만 후 며칠간 분비하는 초유(colostrum)는 단백질, 당, 지질, 비타민, 미네랄 등의 영양소를 함유하고 있을 뿐만 아니라 다양한 성장인자(growth factor)와 항 미생물인자(anti-microbial factor)등의 생체 활성성분을 가지고 있다. 항 미생물인자로서는 면역글로불린, 락토페린(lactoferrin) 및 라이소자임(lysozyme), 락토페록시다제(lactoperoxidase)등이 있으며, 초유에는 생후 몇 주간 병원체로부터 방어할 수 있는 면역글로브린은 질병에 대한 역할이 매우 중요하다.
최근 인체의 특정 전염성 병원체를 동물을 이용하여 면역항체를 생성하고 이들 항체를 각종 식품에 첨가 섭취함으로서 질병의 치료 또는 예방에 이용되고 있다.
사람 또는 동물에서 각종 질병으로부터 보호하기 위해 하나의 병원체가 감염된 후 회복됨으로서 면역기능이 발휘된다. 또한 질병을 앓지 않고 면역을 위해서는 특정 병원균으로 예방약을 제조하여 접종하므로 면역을 얻게 하는 것이 보통이나, 외부에서 이미 만들어진 면역물질을 체내에 주입시켜 질병에 대한 효력을 얻게 할 수 도 있다.
일반적으로 강아지의 경우 집단 사육 시 백신과 항생제의 사용으로 질병에 의한 피해를 감소시킬 수는 있으나, 어린 일령의 강아지들은 질병의 병원체에 노출되고 질병에 대한 저항력도 떨어져 많은 질병이 복합적으로 감염되어 큰 피해가 예상될 뿐 아니라, 모체 이행항체의 결여로 질병에 대한 저항력이 약해 방어능력이 어려운 실정으로 문제시 되고 있다.
현재 우리나라에서 강아지에 문제시되고 있는 질병은 개 파보바이러스, 디스템퍼바이러스, 코로나바이러스, Canine adenovirus 및 전염성호흡기 질환인 개 전염성기관지염(Canine infectious tracheobronchitis; Kennel cough)을 들 수 있으며, 이러한 질병들은 전염력이 강한 소화기 및 호흡기질병으로서, 복합적으로 감염 시 강아지의 높은 폐사율이 발생되기 때문에 새로운 차원의 예방과 치료 기술이 요구되기도 한다.
국내공개특허공보 공개번호 제1020070050499(2007.05.15)호에는 개 병원체에 의해서 야기된 질병 또는 장애, 예를 들어, 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica)에 의해서 야기된 감염성 기관지염, 개 디스템퍼 (CD) 바이러스에 의해서 야기된 개 디스템퍼, 개 아데노바이러스 타입 1 (CAV-1)에 의해서 야기된 감염성 개 간염 (ICH), 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2)에 의해서 야기된 호흡기 병, 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스에 의해서 야기된 개 파라인플루엔자, 개 코로나바이러스 (CCV) 및 개 파보바이러스 (CPV)에 의해서 야기된 장염, 및 렙토스피라 브라티슬라바 (Leptospira brastislava), 렙토스피라 캐니콜라 (Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포타이포사 (Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 익테로헤모라지에 (Leptospira icterohaemorrhagiae) 또는 렙토스피라 포모나 (Leptospira pomona)에 의해서 야기된 렙토스피라증으로부터 개를 보호하는 배합 백신 및 방법에 관한 기술이 공개되어 있고,
국내등록특허공보 등록번호 제1012438710000(2013.03.08)호에는 개 파보바이러스 백신, 진단제 및 이의 이용 방법이 기재되어 있으며,
국내등록특허공보 등록번호 제1001171420000호에는 개의 관상 비루스(CCV)의 감염으로 말미암는 병으로부터 개와 같은 동물들을 보호하기 위한, 효과적인 양의 세포-관련된 CCV 페프로마 단백질로 이루어지는 왁진과, 상기 CCV로 감염된 세포 배양으로부터 제조되는 왁진이 공개되어 있고.
국내등록특허공보 등록번호 제1012427570000(2013.03.06)호에는 개 코로나 바이러스의 항원결정기를 포함하는 재조합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환되는 숙주세포, 상기 단백질을 포함한 백신 및 상기 단백질을 이용하여 제조된 난황항체를 포함하는 개 코로나바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 조성물 및 이를 이용한 개 코로나바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 방법이 기재되어 있으며,
국내등록특허공보 등록번호 제1005631970000(2006.03.15)호에는 개 파보바이러스 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 재조합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환되는 숙주세포, 상기 단백질을 포함하는 백신 및 상기 단백질을 이용하여 제조된 항체를 포함하는 개 파보바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 조성물이 공개되어 있음을 알 수 있다.
1. 국내공개특허공보 공개번호 제1020070050499호 2. 국내등록특허공보 등록번호 제101243871호 3. 국내등록특허공보 등록번호 제100117142호 4. 국내등록특허공보 등록번호 제101242757호 5. 국내등록특허공보 등록번호 제100563197호
본 발명의 주된 목적은 강아지의 소화기 및 호흡기질병인 개 파보바이러스, 디스템퍼바이러스, 코로나바이러스, Canine adenovirus 및 개 전염성기관지염을 동시에 치료할 수 있는 조성 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다음과 같은 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 강아지의 주요 질병인 개 파보바이러스, 디스템퍼바이러스, 코로나바이러스, Canine adenovirus 및 개 전염성기관지염의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 어린 일령의 강아지에 큰 피해를 주고 있는 질병 원인체의 항원을 각각 제조, 면역증강제를 첨가하여 항원을 혼합하여 제조된 면역제제를 산란계 및 젖소에 주기적으로 접종, 산란계에서는 항원에 대한 면역항체가 형성된 면역난황을 수득하고, 분만한 젖소로부터 30시간이내의 면역초유를 수거하여, 면역난황에 면역초유를 혼합하여 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 분말로 건조시킨 후, 생균제(Bacillus subtills , Lactobacillus acidophilus , Enterococcus faecium)을 첨가하여 질병에 대한 방어력 및 저항력을 증강시켜 강아지질병을 치료하는 것이 본 발명을 이루고자 하는 과제 해결 수단인 것이다.
본 발명은 강아지 질병에 대한 방어력을 증강시켜 주므로, 항생물질을 사용하지 않고도 질병에 대한 저항력을 높여주고, 목적 동물에 대한 안전성 및 안정성이 뛰어나 강아지질병에 대한 예방 및 치료 목적으로 사용함으로서 사육농가의 소득증대에 크게 이바지할 수 있는 한편 생산된 축산물에 대한 잔류 항생물질에 대한 문제점을 해결할 수 있는 효과가 있는 것이다.
본 발명은 강아지를 감염시킬 수 있는 서로 다른 전염성 질병에 대한 항원을 각각 준비하는 단계;
상기 준비된 항원들과 면역형성용 항원을 제조하는 단계;
상기 제조된 면역형성용 항원을 산란계 및 젖소에 접종하는 단계;
상기 산란계로부터 면역계란을 수거 및 젖소로부터의 면역초유를 수거하는 단계;
상기 수거한 면역계란의 난황을 채취하여 면역초유와 혼합 후 분말로 제조하는 단계를 포함하여 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 강아지의 주요 질병인 개 파보바이러스, 디스템퍼바이러스, 코로나바이러스, Canine adenovirus 및 개 전염성기관지염의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 어린 일령의 강아지에 큰 피해를 주고 있는 질병 원인체의 항원을 각각 제조, 면역증강제를 첨가하여 항원을 혼합하여 제조된 면역제제를 산란계 및 젖소에 주기적으로 접종, 산란계에서는 항원에 대한 면역항체가 형성된 난황을 수득하고, 분만한 젖소로부터 30시간이내의 초유를 수거하여 제조하는 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 어린 일령의 강아지에서 발병하는 소화기질병 및 호흡기질병의 주요 원인에 대한 치료의 목적으로 이용할 수 있는 물질로서, 강아지에 큰 피해를 주고 있는 질병은 다음과 같다.
1. 개 파보바이러스(Canine parvovirus; CPV)
개 파보바이러스 감염증은 1978년 이래 전 세계적으로 발생 보고된 전염성질병이며, 전염력 및 폐사율이 높은 소화기질병이다. 감염된 강아지의 설사분변을 통해 입으로 감염되는 질병으로 식욕감퇴, 구토, 수양성 및 출혈성설사, 탈수 등이 관찰되며 경구감염 5일후 중증이 되며 감수성 있는 강아지가 바이러스에 노출되면 100% 감염되는 질병이다.
2. 개 디스템퍼바이러스(Canine distemper virus, CDV)
개 디스템퍼바이러스는 대표적인 급성 열성의 바이러스성 질병으로 36일의 잠복기를 거쳐 비염, 식욕감퇴, 눈꼽형성, 안검건조, 발열, 심한 호흡기증상(폐렴), 소화기장애, 신경증상 등을 나타내며, 전염성이 강하고 치사율이 높으며 신경증상을 나타내는 경우 거의 100% 폐사하는 무서운 질병으로 어린 일령에서 많이 발병한다.
3. 개 코로나바이러스(Canine coronavirus, CCV)
개 파보바이러스 감염증과 혼합 감염돼 더욱 증상을 악화시키므로 중요한 바이러스성 질병으로 인식하고 있으며 구토, 설사와 탈수, 혈변, 기력감퇴, 식욕부진 등의 임상증상 및 악취나는 혈변을 배출하며 어린 일령에서 많이 발병한다.
4. 개 아데노바이러스(Canine adenovirus; CAV)
Canine adenovirus는 type-1형과 type-2형의 두가지 유형이 있다.
type-1형은 전염성간염을 일으키며 고열, 신경증상 및 눈에 심각한 손상을 일으키며,
type-2형은 호흡기질병을 일으키는 유형으로서, 상 하부 호흡기감염에 따른 기침, 쉰 목소리, 비염, 발열 등의 증상을 나타내고 있으며, 개 디스템퍼바이러스, 파라인플루엔자바이러스 등과 복합 감염되어 강아지의 전염성기관지염(Canine infectious tracheobronchitis)을 유발하는 질병이다.
5. 개 전염성기관지염(Canine infectious tracheobronchitis)
개 전염성기관지염(Canine infectious tracheobronchitis; Kennel cough)은 높은 전염성을 가진 호흡기질병으로 기침과 콧물을 특징으로 하며, 원인체는 전염성기관지염을 일으키는 Bordetella bronchiseptica균에 의해 유발되며, 높은 전염성을 가진 호흡기질병으로서, 디스템퍼바이러스 감염 시 2차 감염을 일으켜 기관지 폐렴을 유발한다. 특히 어린 강아지에서 심한 증상을 나타내며, 감염 후 3~4일 후 콧물, 건성기침 및 구토 등의 임상증상을 보이다 차츰 39℃이상의 체온이 급격히 상승하여 심한 경우 기관지 폐렴을 나타낸다.
이에, 본 발명은 강아지의 주요 질병인 개 파보바이러스, 디스템퍼바이러스, 코로나바이러스, Canine adenovirus 및 개 전염성기관지염의 예방 및 치료의 목적으로 이용할 수 있는 물질을 개발하고자 연구한 결과,
위 질병에 대한 감염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 하게 되었다.
이하 본 발명을 실시 예 에 의한 상세한 설명은 다음과 같다.
실시예1. (항원제조 ; 개 파보바이러스(Canine parvovirus, CPV) 배양)
제1공정(바이러스접종 배양)
A72(Canine tumor cell origin) 세포를 ml당 20만개씩 부유시켜 37℃에서 2~3일간 배양한 후 단층이 50% 형성되었을 때 증식용 배양액을 제거한 후, 표2에 기재된 유지용 배양액에 개 파보바이러스를 ml당 103.0TCID50을 접종하여 37℃에서 4일간 회전 배양 한 다음,
제2공정(바이러스 수확)
접종바이러스에 의한 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 약 80%이상 보일 때 바이러스 배양 감염액을 채독하여 -80℃에서 2회 동결융해를 반복한 후 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액만 분리하였다. (상층액을 항원으로 사용)
실시예2(항원제조; 디스템퍼바이러스(Canine distemper virus, CDV) 배양)
제1공정(바이러스 접종 배양)
10일령 SPF(Specific pathogen free egg) 발육계란의 계태아 섬유아세포를 ml당 100만개씩 부유한 배양액(표1;참조)에 디스템퍼바이러스를ml당 104.0TCID50 접종하여 37℃에서 5일간 회전 배양 한 다음,
제2공정(바이러스 수확)
접종바이러스에 의한 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 약 80%이상 보일 때 바이러스 배양 감염액을 채독하여 -80℃에서 2회 동결융해를 반복한 후 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액만 분리하였다.
(상층액을 항원으로 사용)
실시예3(항원제조; 개 코로나바이러스(Canine coronavirus, CCV) 배양)
제1공정(바이러스접종 배양)
A72(Canine tumor cell origin) 세포를 ml당 20만개씩 부유시켜 37℃에서 증식용 배양액(표1 참조)에 배양하여 배양세포의 단층이 형성되었을 때 증식용 배양액을 제거한 다음, 표2에 기재된 배양액에ml당 104.0TCID50의 코로나바이러스를 접종하고 37℃에서 3~5일간 회전 배양 한 다음,
제2공정(바이러스 수확)
접종바이러스에 의한 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 약 80%이상 일어났을 때 배양 감염액을 채독하여 -80에서 2회 동결융해를 반복한 후 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액만 분리하였다.
(상층액을 항원으로 사용)
실시예4(항원제조; Canine adenovirus(CAV) 배양)
제1공정(바이러스접종 및 배양)
A72(Canine tumor cell origin)세포를 ml당 20만개씩 부유시켜 37℃에서 증식용 배양액(표1 참조)에 배양하여 배양세포의 단층이 형성되었을 때 증식용 배양액을 제거한 다음, 표2에 기재된 유지용 배양액에 ml당 104.0TCID50의 Canine adenovirus type-1 및 type-2를 각각 접종하고 37℃에서 3~4일간 각각 회전배양 한 후에,
제2공정(바이러스 수확)
접종바이러스에 의한 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 약 80%이상 일러났을 때 배양 감염액을 각각 채독하여 -80에서 2회 동결융해를 반복한 후 농축하여 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액만 분리하여 제조하였다.(상층액을 항원으로 사용)
실시예5(항원제조; Bordetella bronchiseptica 배양)
제1공정(종균배양)
동결 건조된 종균(Bordetella bronchiseptica )을 10ml Tryptic soy broth 배지에 접종하고 37℃에서 12~15시간 배양한 다음, 종균으로 사용.
제2공정(배양)
Tryptic soy broth 배지 1,000ml에 종균 10ml 접종하고 37℃에서 150rpm 으로 18시간 진탕 배양 한다.
제3공정(균체수집 및 처리)
상기에서 37℃에서 150rpm 으로 18시간 진탕 배양한 감염배양액에 0.3% 포르말린을 가하여 불활화 시킨 후, 8,000rpm 30분간 원심 분리하여 균체를 수집한 다음 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.2)로 1회 세척하여 PBS에 부유시켜 제조하였다.
(Spectrophotometer를 이용 410nm파장에서 흡광도(Optical dencity: OD)를 측정한 다음 항원으로 사용)
실시예6(항원제조; Dermonecrotoxin(DNT) toxoid 배양)
Dermonecrotoxin(DNT) toxoid는 종균(Bordetella bronchiseptica )을 Tryptic soy broth에서 37℃, 18시간 배양한 후에 8,000rpm, 30분간 원심 분리하여 균을 집균하고 PBS로 2회 세척하여 적당량의 PBS에 부유시켜 Sonication을 이용하여 균체를 파괴 한 후, 8,000rpm, 30분간 원심 분리하여 하였다.
원심분리한 상청액을 BCA protein assay reagent kit(Pierce Co)를 이용하여 단백질 농도를 측정한 후에 crude DNT 항원농도는 500㎍/ml 사용.
[표 1. 세포증식용 배양액 조성성분(1,000)]
Alpha MEM ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 930ml
Fetal bovine serum(FBS) ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 50ml
7.5% NaHCO3ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 20ml
Penicillin G-Naㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100unit/ml
Streptomycin sulfateㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100㎍/ml
Fungizoneㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.025㎍/ml
[표 2. 세포유지용 배양액 조성성분(1,000ml)]
Alpha MEMㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 950ml
Fetal bovine serum(FBS)ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 30ml
7.5% NaHCO3ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 20ml
Penicillin G-Naㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100unit/ml
Streptomycin sulfateㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100㎍/ml
Fungizoneㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.025㎍/ml
[표 3. Phosphate buffered saline(1,000ml)]
Sodium chlorideㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 8g
Potassium chlorideㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.2g
KH2PO4ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 0.2g
Na2HPO4ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 1.15g
실시예7(면역형성용 항원제조; 산란계 접종용)
실시예 1내지 실시예 5에서 배양한 상층액을 5배로 농축한 개 파보바이러스(7ml), 디스템퍼바이러스(5ml), 코로나바이러스(7ml) 및 Canine adenovirus(5ml)의 항원에 6ml의 Bordetella bronchiseptica 감염증의 배양균체 및 toxin을 혼합한 항원 30ml에 Oil adjuvant(Montnide ISA70) 70ml을 혼합하여 1,000rpm에서 30분간 유제한 다음, 유성교반기(Homogenizer)를 이용하여 면역형성용 항원 을 제조하였다.
실시예8 (면역형성용 항원제조; 젖소 접종용)
실시예 1내지 실시예 5에서 배양한 상층액인 개 파보바이러스 20ml, 디스템퍼바이러스 10ml, 코로나바이러스 20ml, Canine adenovirus 10ml에 Bordetella bronchiseptica 항원 20ml에 Oil adjuvant(Montnide ISA25) 5ml, 수산화알루미늄 겔 15ml을 가하여 1,000rpm에서 30분간 유제한 다음 면역형성용 항원 을 제조하였다.
실시예9(면역형성용 항원 접종방법; 산란계)
상기 실시예 7에 따라 생산된 산란계 면역형성용 항원을 20주령의 산란계에 마리당 0.8ml씩 앞가슴 근육에 1차 접종하고, 2차 접종은 1차 접종 3주후에 접종한 다음, 그 이후 접종은 3개월 단위로 추가 접종하였다.
실시예10(면역형성용 항원 접종방법; 젖소)
상기 실시예 8에 따라 생산된 젖소 면역형성용 항원을 임신한 젖소의 분만 2개월 전 부터 3주 간격으로 3회 마리당 2.0ml씩 둔부근육에 접종하였다.
실시예11(면역이 형성된 계란 수거)
상기 실시예 9에 따라 면역형성용 항원을 3차접종 2주후부터 면역 항체가 형성된 계란을 위생적으로 수거한 후, 150ppm의 차아염소산나트륨을 계란에 분사하여 깨끗하게 세척한 다음, 건조실에서 계란 표면의 수분을 완전히 건조시킨 후에, 건조시킨 계란을 할란하여 면역항체가 형성된 난황만을 채취하여 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 분말로 제조하는데 사용하였다.
실시예12(면역이 형성된 초유 수거)
상기 실시예 10에 따라 면역형성용 항원을 접종한 후 분만한 어미로부터 30시간이내의 초유를 약 10리터 수거하여 멸균된 용기에 담아 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 분말로 제조하는데 사용하였다.
실시예13(면역항체의 분말건조 공정)
분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 디스크 및 노즐형태의 분무방법으로 병원체에 대한 면역이 형성된 면역난황액 1리터에 면역초유 1리터를 각각 혼합하여 수분을 건조시키는 방법으로 수분함량이 10%미만의 분말로 건조시켜 제조하였다.
실시예14
개 파보바이러스, 디스템퍼바이러스, 코로나바이러스, Canine adenovirus 및 개 전염성기관지염에 대한 면역난황항체 및 면역초유 항체가 함유된 난황건조분말(85g)에 포도당(5g), 글라이신(1g), 염화칼륨(0.2g), Ascorbic acid(0.1g), 중조(1g), Sorbitol(0.2g) 및 프락토 올리고당(4.5g)로 조성된 배양액에 배양액 대비 중량비 100:3의 비율로 생균제인 Bacillus subtills(1×1010CFU), Lactobacillus acidophilus(1×1010CFU), Enterococcus faecium(1×1010CFU)에서 선택된 어느 하나를 첨가하여 제품을 제조하였다.
실험예1(항원에 대한 항체가 시험)
실시예 11, 12에 따라 수거된 면역난황액과 면역초유에 대한 항체가를 측정하기 위하여 임신한 젖소 8마리를 선정하여 5마리는 시험군으로, 3마리는 대조군으로 하였다.
시험군에는
실시예 9에 따라 산란계에 면역형성용 항원을 접종하고 젖소 5마리에는 실시 예10에 따라 면역형성용 항원을 접종하였다.
실시예 12에 따라 시험군 5마리의 젖소가 분만한 후 면역초유를 각각 수거하고, 실시예 11에 따라 수거된 면역난황액을 수거하여 면역난황 5리터에 면역초유 5리터를 혼합하여 5마리에 대한 시험품을 실시예 13에 따라 각각 제조하였다.
대조군에는 항원을 접종하지 않은 산란계의 난황액을 수거하고, 젖소 3마리의 초유를 각각 수거하여 난황 5리터에 초유 5리터를 혼합하여 3마리에 대한 시험품을 실시예 13에 따라 각각 제조하였다.
실시 예 13에 따라 제조된 시험품 8마리(시험군 5마리, 대조군 3마리)에 대한 항체가시험을 각각 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)으로 측정한 결과 다음과 같은 시험성적을 얻었다.
시험재료 항 체 가
CPV CDV CCV CAV Bordetella
bronchiseptica
시험군 시험품 1 640 512 1,280 128 1,280
시험품 2 1,280 128 2,560 512 2,560
시험품 3 1,280 512 2,560 256 1,280
시험품 4 2,560 512 1,280 256 2,560
시험품 5 1,280 128 1,280 128 2,560
대조군 시험품 1 10 10 10 10 20
시험품 2 10 10 10 10 20
시험품 3 10 10 10 10 20
실험예2(면역제제에 대한 야외 농장에서의 효능시험)
가. 야외 실증시험(A농장)
어미 견 90마리 규모의 농장에서 설사로 인해 폐사가 심한 강아지 대상으로 제품을 급여한 후 제제에 대한 효능을 평가하였다. 이 농장에서 폐사된 어린강아지의 설사분변 및 부검 조직 검사 결과, 파보바이러스, 코로나바이러스 및 Canine adenovirus가 상재되어 있었으며, 디스템퍼바이러스 및 개전염성기관지염 등이 복합적으로 감염되어 있었다.
실시예 14에 따라 제조된 제품의 효능을 평가하기 위해 1일령 강아지 180마리를 선정하여 시험군 110마리에는 제품을 1일 2회씩 마리당 1g을 용해하여 3일간 구강으로 급여하였으며, 비 급여 대조군 70마리와 함께 14일간 격리 사육하면서 강아지의 생존마리수 및 임상관찰을 조사하였다.
조사한 결과 아래 표와 같이 총 110마리의 시험군에서는 14일 후 98마리가 생존하여 생존율이 89.0%로 확인되었고, 총 70마리의 대조군에서는 26마리가 생존하여 생존율이 37.1%로 조사되었으며, 본 제품에 대한 어린 강아지의 설사병 치료에 효과가 있는 것으로 분석되었다(표.5)
또한 시험군에서의 임상관찰 한 결과, 구토(8/110), 호흡곤란(7/110), 콧물 및 기침(15/110) 눈꼽형성(5/110)등의 가벼운 임상증상을 나타내었으며, 대조군에 비해 빠른 회복상태를 보였다.
비 급여 대조군에서는 구토(45/70), 호흡곤란(44/70), 콧물 및 기침(59/70), 눈꼽형성(18/70)등의 복합적인 임상증상을 나타내었다(표6)
1일령 강아지에 급여 후 생존율
구분 시험 마리수 관찰일수 급여량(일) 생존 마리수 생존율(%)
시험군 110 14일 1g/3일 98 89.0
대조군 70 14일 무처치 26 37.1
1일령강아지에 급여 후 임상관찰 결과
구분 관찰
일수		 임상관찰(증상발현 마리수/시험 마리수)
구토 호흡곤란 콧물, 기침 눈꼽형성
시험군 14일 8/110 7/110 15/110 5/110
대조군 14일 45/70 44/70 59/70 18/70
나. 야외 실증시험(B농장)
어미 견 60마리 규모의 농장에서 이유 강아지의 설사로 인해 폐사와 성장이 늦어 피해를 보는 사육농장을 대상으로 제품을 급여한 후 제제에 대한 효능을 평가하였다. 이 농장에서 폐사된 어린강아지의 설사분변 및 부검 조직 검사 결과, 파보바이러스, Canine adenovirus 및 코로나바이러스가 상재되어 있었으며, 디스템퍼바이러스 및 개 전염성기관지염 등이 복합적으로 감염되어 있었다.
실시예 14에 따라 제조된 제품의 효능을 평가하기 위해 1일령 강아지 110마리를 선정하여 시험군 70마리에는 제품을 1일 2회씩 마리당 1g을 용해하여 3일간 구강으로 급여하였으며, 비 급여 대조군 40마리와 함께 14일간 격리 사육하면서 강아지의 생존마리수 및 임상관찰을 조사하였다.
조사한 결과 아래 표와 같이 총 70마리의 시험군에서는 14일 후 59마리가 생존하여 생존율이 84.2%로 확인되었고, 총 40마리의 대조군에서는 14마리가 생존하여 생존율이 35.0%로 조사되었으며, 본 제품에 대한 어린 강아지의 설사병 치료 및 예방에 효과가 있는 것으로 분석되었다(표.7 참조)
또한 시험군에서의 임상관찰 한 결과 구토(9/70), 호흡곤란(11/70), 콧물 및 기침(13/70), 눈꼽형성(9/70)등의 가벼운 임상증상을 나타내었으며,
비 급여 대조군에서는 구토(22/40), 호흡곤란(24/40), 콧물 및 기침(24/40), 눈꼽형성(12/40)등의 복합적인 임상증상을 나타내었다(표.8참조)
1일령 강아지에 급여 후 생존율
구분 시험
마리수		 관찰일수 급여량(일) 생존마리수 생존율(%)
시험군 70 14일 1g/2일 59 84.2
대조군 40 14일 무처치 14 35.0
1일령강아지에 급여 후 임상관찰 결과
구분 관찰일수 임상관찰(증상발현 마리수/시험 마리수)
구토 호흡곤란 콧물, 기침 눈꼽형성
시험군 14일 9/70 11/70 13/70 9/70
대조군 14일 22/40 24/40 24/40 12/40
상기한 바와 같이 본 발명은 개 파보바이러스, 디스템퍼바이러스, 코로나바이러스, Canine adenovirus 및 개 전염성기관지염을 동시에 치료할 수 있는 물질을 개발하기 위하여,
위 질병에 대한 특이적인 면역 난황항체에 면역초유를 혼합하여 이용하는 방법에 초점을 맞춰 다양한 연구를 진행하던 중,
면역 난황항체 및 면역초유를 혼합한 건조분말에 생균제, 포도당 및 플락토 올리고당 등의 부형제를 첨가한 후 제품을 제조하여 강아지에 급여를 통한 수동면역으로 항병력을 향상시킬 수 있었으며, 위 질병에 대한 제품의 효력시험에서 치료효과를 확인할 수 있었다.
또한 시험군에서 임상관찰에서 증상이 발현된 강아지들은 빠른 회복상태를 보였으며, 또한 성장기에서의 질병감염 및 성장지연을 예방하고 항생물질을 사용하지 않고 질병을 치료함으로서 질병에 대한 관리와 친환경적인 사육방법으로 애완견 및 강아지의 폐사를 줄이고 국민보건향상에 기여함과 동시 애완견 및 강아지 사육농가의 소득 증대에도 크게 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법에 있어서,
    강아지를 감염시킬 수 있는 서로 다른 전염성 질병에 대한 항원을 각각 준비하는 단계;
    상기 준비된 항원들과 면역형성용 항원을 제조하는 단계;
    상기 제조된 면역형성용 항원을 산란계 및 젖소에 접종하는 단계;
    상기 산란계로부터 면역계란을 수거 및 젖소로부터의 초유 수거하는 단계;
    상기 수거한 면역계란의 난황을 채취하여 면역초유와 혼합하여 분말로 제조하는 단계;로 구성되며,

    상기 강아지를 감염시킬 수 있는 서로 다른 전염성 질병에 대한 항원을 각각 준비하는 단계는
    A72(Canine tumor cell origin) 세포를 ml당 20만개 부유시켜 37℃에서 2~3일간 배양한 후 단층이 50% 형성되었을 때 증식용 배양액을 제거한 후, 유지용 배양액에 개 파보바이러스를 ml당 103.0TCID50을 접종하여 37℃에서 4일간 회전 배양 한 다음,
    상기 접종바이러스에 의한 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 80%이상 보일 때 바이러스 배양 감염액을 채독하여 -80℃ 에서 2회 동결융해를 반복한 후 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액만 분리하여
    강아지를 감염시킬 수 있는 서로 다른 전염성 질병에 대한 항원을 준비하고,

    상기 준비된 항원들과 면역형성용 항원을 제조하는 단계는
    상기 강아지를 감염시킬 수 있는 서로 다른 전염성 질병에 대한 항원을 각각 준비하는 단계에서 준비된 개 파보바이러스(7ml)의 항원에 6ml의 Bordetella bronchiseptica 감염증의 배양균체 및 toxin을 혼합한 항원 30ml에 Oil adjuvant(Montnide ISA70) 70ml을 혼합하여 1,000rpm에서 30분간 유제한 다음, 유성교반기(Homogenizer)를 이용하여 면역형성용 항원 을 제조하며,

    상기 제조된 면역형성용 항원을 산란계 및 젖소에 접종하는 단계에서 산란계 접종은 산란계 면역형성용 항원을 20주령의 산란계에 마리당 0.8 ml 씩 앞가슴 근육에 1차 접종하고, 2차 접종은 1차 접종 3주후에 접종한 다음, 그 이후 접종은 3개월 단위로 추가 접종하고.
    상기 제조된 면역형성용 항원을 산란계 및 젖소에 접종하는 단계에서 젓소의 접종은 젖소 면역형성용 항원을 임신한 젖소의 분만 2개월 전 부터 3주 간격으로 3회 마리당 2.0 ml 씩 둔부근육에 접종하며,

    상기 산란계로부터 면역계란을 수거 및 젖소로부터의 초유 수거하는 단계에서 면역계란 수거는 면역형성용 항원을 3차접종 2주후부터 면역 항체가 형성된 계란을 위생적으로 수거한 후, 150ppm의 차아염소산나트륨을 계란에 분사하여 깨끗하게 세척한 다음, 건조실에서 계란 표면의 수분을 완전히 건조시킨 후에, 건조시킨 계란을 할란하여 면역항체가 형성된 난황만을 채취하여 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 분말로 제조하고,

    상기 산란계로부터 면역계란을 수거 및 젖소로부터의 초유 수거하는 단계에서 젖소로부터의 초유 수거는 면역형성용 항원을 젖소에 접종한 후 분만한 어미로부터 30시간 이내의 초유를 10리터 수거하여 멸균된 용기에 담아 분말로 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 제조하며,

    상기 수거한 면역계란의 난황을 채취하여 면역초유와 혼합하여 분말로 제조하는 단계는 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 디스크 및 노즐형태의 분무방법으로 병원체에 대한 면역이 형성된 면역난황액 1리터에 면역초유 1리터를 각각 혼합하여 수분을 건조시키는 방법으로 수분함량이 10% 미만의 분말로 건조시켜 제조함을 특징으로 하는 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법.
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