KR20010037612A - 돼지 대장균 설사증 예방 및 치료용 특이항체를 포함한 난황건조분말을 이용한 사료첨가제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 어린 돼지에서 높은 발생율을 보이는 병원성 대장균에 의한 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 사료첨가제에 관한 것이고, 본 발명에 따른 사료첨가제는 병원성 대장균의 부착인자와 이열성 독소를 혼합한 시험백신을 제조하여 닭에 접종하여 면역시킨 후, 고역가의 난황을 수집한후, 난황을 분말건조시킨 것이다.

이와 같은 사료 첨가제는 기존에 개발된 경구용 면역제제의 장점을 그대로 가지며, 효과도 동일하다. 또한 기존의 면역제제의 생산과정에 포함된 난황의 추출단계가 생략되어 생산성이 뛰어나며, 특히 사료첨가제의 형태로 적용됨으로 적용에 있어서 매우 간편하다. 초유중 항체가의 부족, 초유섭취의 부족, 섭취한 모체이행항체의 소실등의 원인으로 발생하는 대장균증에 대해서 계속적으로 고농도의 항체를 사료의 섭취와 동시에 공급하여 줌으로서 대장균증을 예방 및 치료할 수 있으며, 항생제를 보완하여 사용함으로서 항생제 처치시의 문제점을 줄일수 있다.

Description

돼지 대장균 설사증 예방 및 치료용 특이항체를 포함한 난황건조분말을 이용한 사료첨가제{Feed additive containing the dried powder of egg-yolk antibodies, for prevention and treatment of Porcine diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli}

본 발명은 어린돼지에서 높은 발생율을 보이는 병원성 대장균 설사증의 효과적인 예방 및 치료의 목적으로 특이항체를 포함한 난황의 건조분말을 이용한 경구용 사료첨가제에 관한 것이다.

병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증은 주로 어린일령의 돼지에서 다발하며, 발생률이 높고, 한번 설사증에 걸린 돼지는 치료가 되더라도, 위축돈으로 남게되어 양돈농가에 끼치는 경제적 피해는 매우크다.

이러한 대장균성 설사증은 병원성 대장균의 감염을 통하여 발생한다. 설사를 일으키는 병원성 대장균은 일반 비병원성 대장균과 다르다. 병원성 대장균은 돼지의 경구를 통하여 감염된후 소장점막에 부착하여 증식하며, 장독소를 생성하고, 생성된 독소는 장관내의 삼투압을 변화시켜서 설사를 일으키게 된다. 대장균에 감염되어 설사를 나타내는 돼지는 수분의 손실에 의한 탈수증상을 보이며, 심한경우에는 죽게된다.

이러한 설사증을 일으키는 병원성 대장균은 두가지 주요한 병원성 인자를 가진다. 그러한 인자는 먼저, 소장의 점막에 부착하여 균의증식을 유도하는 부착인자와, 증식한균이 생성하는 장독소로 나눌 수 있다.

병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증은 우리나라 뿐만 아니라, 전세계적으로 발생하고 있으며, 각각의 지역에 따라서 원인균의 특성은 조금씩 다르지만, 앞에서 언급한 공통적인 병원성 인자를 가진다는 점에서는 동일한 특성을 갖는다.

전세계적으로 대장균 설사증의 예방을 위해서는 백신을 통한 예방방법을 사용해 왔으며, 현재까지도 이 방법이 가장 광범위하게 사용되고 있다. 백신을 이용한 대장균증의 예방은 분만전의 어미 돼지에게 백신을 접종하여, 어미돼지의 몸에 항체를 만들게 한 다음, 분만후에 초유를 통하여 항체를 새끼돼지에게 전달함으로서 이루어진다.

어미돼지에게 접종하는 백신은 병원성 대장균의 장관내 부착인자를 실험실에서 분리 정제한 성분과, 장독소중 면역원성이 있는 이열성독소를 포함하기도 한다. 즉, 백신을 맞은 어미돼지는 몸안에 병원성 대장균의 부착인자에 대한 항체를 생성하며, 이를 급여받은 새끼 돼지는 경구를 통하여 침입한 병원성 대장균을 소장점막에 부착하지 못하게 함으로서 대장균증에 대한 방어력을 가진다. 따라서, 대장균증의 예방을 위해서는 효과적인 백신의 개발, 어미돼지의 항체 형성능, 새끼돼지에의 충분한 초유의 급여등이 요구된다.

효과적인 백신은 현재까지 병원성 대장균의 부착인자를 실험실에서 분리 정제한 후 내열성독소를 첨가한 백신이 가장효과가 좋은 것으로 알려져 있다. 하지만 실험실에서의 부착인자의 대량생산은 적절한 배양조건의 설정과 번거로운 정제과정, 정제과정중의 오염문제 등으로 아직까지 우리나라에서는 자체 생산을 하고 있지 못한 실정이다. 다음으로 효과적인 백신을 적절한 시기에 어미돼지에게 접종하였어도 어미돼지의 면역기능과 주위환경 등의 영향으로 새끼돼지에게 충분한 방어능력을 제공할 수 있는 항체의 형성능이 문제가 되며, 초유중에 충분한 항체를 포함하더라도 분만후 24시간내에 새끼돼지들이 충분한 양의 초유를 섭취하는지 여부가 중요하다. 이러한 세가지 조건들중 하나 혹은 그 이상이 원인이 되어 대장균 설사증은 발생한다.

이에, 많은 연구자들은 상술한 문제점을 해결하기 위해 좀더 효과적인 백신의 개발을 위해서 노력해왔다. 그중 유전자 재조합 백신, 자돈 투여용 생균백신 등이 연구되고 있으나, 뚜렷한 연구성과는 보이지 않고 있다. 또한 초유중의 항체의 부족, 혹은 충분한 초유섭취의 실패, 모체이행항체의 소실시기에서의 대장균 설사증의 발생등을 예방하기 위하여, 소, 말 혹은 기타 다른동물에서 대장균 백신을 접종하여 항체를 형성시킨후 혈액을 채취한후, 혈청을 분리하여 이를 예방 및 치료에 응용하는 연구들이 보고되었다. 하지만, 이러한 방법의 단점은 혈청의 안전성의 문제, 안전성 문제의 극복을 위한 검사비용의 증가, 생산기간의 한계성등으로 인한 높은 가격의 형성으로, 효과의 우수성과는 별개로 실용성의 문제가 있다.

다른 방법으로는 대장균의 단클론항체의 이용 가능성이 시도 되었으나, 실용성이 매우 문제가 되었다. 그리고, 대장균증의 일반적인 치료방법으로는 병원성 대장균의 분리와 그 균에 감수성 있는 항생제의 선발과 처치가 일반적인 방법이지만, 항생제의 남용으로 인한 내성균의 출현문제와 식육중 항생제 잔류로 인한 국민건강의 위협은 계속해서 지적되는 문제이다.

한편, 80년대 후반에서 90년대 초에 이르러 몇몇 연구자들에 의해 산란계의 달걀을 이용한 난황항체를 질병의 예방 및 치료 목적으로 사용하기 위한 연구는 많은 나라에서 수행되었으나, 대부분이 혈청중의 항체가의 예측을 목적으로 수행되었다. 시험은 대부분은 병원성 대장균을 이용하여 수행되었고, 일부분에 국한되어 부분적으로 수행되었다.

이에 대해 본 발명자들은 혈청중의 항체의 측정에 그치지 않고, 난황을 면역항체의 대량 생산에 이용하는 경우 일년에 3 내지 4회의 접종으로 계속해서 고면역 달걀을 용이하게 얻을 수 있다는 것을 발견하고, 난황항체를 이용한 경구용 면역제제를 발견하였다. 이에 대해서는 대한민국 특허출원 제98-11875호로 출원하였다.

그러나, 상기 면역제제와 그 제조법은 높은 치료효과에도 불구하고, 난황에서 특이항체를 추출하는 단계가 필요하며, 양돈현장에서 적용하는데 있어서, 돼지를 한 마리씩 잡아서 투여해야하기 때문에 적용에 문제점이 있었다.

이와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 대장균 설사증의 예방 및 치료 목적으로 고역가의 난황항체를 포함한 난황을 분말건조하여, 이를 새끼돼지들이 먹는 사료에 첨가하여 급여할 수 있는 대장균 설사증을 예방 및 치료하기 위한 사료첨가제를 개발하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 대장균 설사증의 예방 및 치료용 난황건조 분말을 이용한 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명은 병원성 대장균의 부착인자와 이열성독소를 혼합한 시험백신을 제조하여 닭에 접종하여 면역시킨후, 고역가의 난황을 수집한 후, 난황을 분말건조시킨 것을 특징으로 하는 돼지 대장균 설사증의 치료 및 예방용 사료첨가제이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

상기 시험백신의 제조를 위하여, 대장균의 섬모항원들인 K88 항원, K99 항원 및 987p 항원과 이열성 장독소를 사용한다. 상기 항원들은 산란계에 접종되어 고역가의 항체 형성을 유도할 수 있는 항원들이다. 항원들은 대량 생성할 수 있는 조건에서 배양하여 균체에서 이들 항원만을 분리, 정제하여 사용한다.

다음으로, 제조된 시험백신을 산란계에 접종하여 면역시키고, 닭의 달걀로부터 고역가의 난황을 수집하고, 분말건조시킨다.

이를 이용하여 야외 대장균설사 발생 농장에 적용한 시험결과 우수한 방어능을 나타냈다.

실시예 1

시험백신의 제조 및 면역

시험백신의 생산을 위한 대장균 섬모항원은 미국 NADC(national animal disease center)에서 분양받아 수의과학검역원에서 보관증인 대장균 균주인 S-175(K88 항원생산용) S-20(K99항원생산용), S-171(987p 항원생산용) 균주를 망카배지(Minca broth)에 37℃, 24시간 진탕배양한 후 8000rpm, 30분간 원심분리하여 균을 수집하였다. 이 균을 적당량의 인산완충액으로(PBS, Phosphate Buffered Saline) 부유하여 0℃ 2분간 2회 블렌딩(blending)한 후, 12,000rpm, 15분간 원심분리한후에 상층액을 수거하여 0.5% 포르말린을 가한후에 암모니움설페이트를 과포화용액이 되도록 서서히 가하고 과포화된 용액을 25,000rpm, 30분간 원심분리한 후에 침전물을 모아서 5℃에서 이틀간 투석하여 섬모항원을 생산한 후에 최종적으로 0.45㎛ 크기의 여과기로 여과하였다. 생산된 섬모항원은 단백질의 농도를 측정하여, 이후 시험백신의 제조에 사용하였다.

대장균 이열성 독소의 생산은 수의과학검역원에서 보관중인 S-99균주를 CAYE(casamino acid yeast extract)배지에 린코마이신을 45mg/L되게 첨가한후 37℃ 24시간동안 진탕배양한후에 8000rpm, 30분간 원심분리하여 균 배양액을 수집하였다. 수집된 배양액에 0.5%되게 포르말린을 가하여 장독소를 불활화시킨후, 0.45㎛ 크기의 여과기로 여과하여 남은균을 제거하였다. 여과한 배양액에 암모니움설페이트를 과포화용액이 되도록 서서히 가하고 과포화된용액을 11,500rpm, 30분간 원심분리한후에 침전물을 모아서 5℃에서 이틀간 투석하여 이열성 독소를 생산하였다. 생산한 이열성독소는 단백질 농도를 측정하여 이후 시험백신의 제조에 사용하였다.

시험백신은 대장균의 세가지 섬모항원(K88, K99, 987p)과 이열성 장독소를 혼합한 후 알루미늄하이드록사이드겔, 혹은 유성보좌제(ISA25, ISA70)를 첨가하여 제조하였다.

산란계의 면역은 약 20주령의 백색레그계에 시험백신을 0.5ml 혹은 1m되게 근육으로 주사하여 시켰다. 시험백신의 접종농도는 닭마리당 각각의 세가지 섬모항원 및 내열성독소가 100㎍되게 조정하여 접종하였다.

실시예 2

난황분말의 조제

난황분말의 조제는 먼저 고역가의 수집한 달걀을 알코올로 잘 소독한후에 달걀의 노른자만을 무균적으로 삼각플라스크에 모았다. 모아진 노른자를 분말건조기에 주입하여 난황분말을 수집하였다. 분말건조기의 주입온도는 140℃, 배출온도는 72℃였다. 달걀 노른자의 부피 1ml당 건조된 분말의 중량은 0.38g이었으며, 합습도는 2%였다. 달걀의 건조전과 건조후의 항체가는 거의 변화가 없었다.

시험예 1

실시예 1과 같이 생산한 시험백신을 닭에 접종하여 백신 접종후 난황을 수집하여 분말건조전과 건조후의 항체가를 효소면역법(ELISA)을 이용하여 조사하였다.

분말건조전 난황중 항체가의 조사를 위한 항체의 추출은 클로로포름을 이용하여 실시하였으며, 효소면역법은 각각의 세가지 섬모항원과 LT항원은 ELISA용 플레이트에 코팅시킨후에 분말건조전 난황추출액은 100배 희석하여 실시하였으며, ELISA방법을 이용 405nm에서 흡광도를 측정하여, 각각의 흡광도를 이용하여 분말건조전과 건조후의 난황중의 항체가를 측정하였다.

표 1에서 나타낸 바와 같이, 특이항체를 포함한 난황의 분말건조전과 후의 항체가는 거의 동일함을 확인할 수 있었다.

난황의 분말건조전후의 항체가의 변화

항원의 구분	흡광도(450nm)
	건조전	건조후
K88항원K99항원987p항원LT항원	2.4062.4861.5171.875	2.3712.4071.4841.571

시험예 2

실시예 2와 같이 생산한 난황건조분말을 대장균 설사증이 발생한 농장의 자돈에 투여군과 대조군으로 나누어 투여군에는 0.2g/두/일의 용량으로 사료에 첨가하여 투여하였다. 이후 투여군과 대조군에서의 시험전 설사발생율, 일자별 설사발생율, 일당 체중증가율등을 조사하여 시험군과 대조군의 성적을 비교하였다.

하기 표 2에서 나타낸 바와 같이 난황분말을 투여한 군은 대조군에 비하여 설사발생율 및 체중증가량에 있어서 큰 차이를 보였으며, 이러한 차이는 난황분말의 투여에 따른 대장균 설사증의 예방 및 치료효과로 판단된다.

난황분말의 대장균 설사증 예방 및 치료효과

구분	시험자돈수	난황분말투여방법 및 기간	투여전 설사발생두수	일당체중증가율	투여후 일자별 설사발생두수
					4일후	8일후	10일후
시험군1	45두(8-16)	0.2g/두/일10일간	21/45(47%)	320g/일/두	7/45	5/45	0/45
시험군2	440두(3-10)	02.g/두/일14일간	95/440(21%)	205g/일/두	0/440	0/440	0/440
대조군	42두(9-11)	무투여	23/42(55%)	213g/일/두	22/42	22/42	20/42

본 발명에서 개발한 특이항체를 포함한 난황건조분말을 이용한 돼지 대장균설사증의 예방 및 치료용 먹이는 사료첨가제는, 어미돼지의 초유중 항체의 부족함을 보완하여, 새끼돼지의 방어력을 높히며, 초유를 충분히 섭취하지 못한 새끼돼지들과, 초유를 통한 항체의 소실시기에 새끼돼지들에게 투여함으로서 신속한 질병의 예방 및 치료효과를 얻을 수 있다. 또한 본 연구에서 개발한 난황의 건조분말은 기존의 면역체제와는 다르게 난황중의 항체의 추출단계가 필요하지 않고, 난황을 이용하기 때문에 새끼돼지에게 투여시 매우 안전하며 항생제 처치시의 내성균의 출현과, 축산물의 항생제 잔류문제를 극복하였다. 또한 개발한 사료첨가제는 난황건조분말을 사료에 혼합하여 급여함으로서 양돈 현장에서의 적용이 매우 간편하다는 장점을 가진다.

본 발명에서 개발한 사료첨가제는 기존의 백신접종법 및 항생제처치법과 비교할 때 매우 안전하며, 투여즉시 효과를 볼 수 있는 우수한 예방 및 치료제제로 판단되며, 우리나라 및 전세계에서 가장 많이 발생하는 대장균성 설사증의 예방 및 치료제로 사용되어 양돈농가의 생산성 향상과 고품질 축산물의 생산에 크게 이바지할 것으로 기대된다.

Claims (1)

1. 병원성 대장균의 부착인자와 이열성 독소를 혼합한 시험백신을 제조하여 닭에 접종하여 면역시킨후, 고역가의 난황을 수집한 후, 난황을 분말건조시킨 것을 특징으로 하는 돼지 대장균 설사증의 예방 및 치료용 사료첨가제.