KR20080005277A

KR20080005277A - 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 백신

Info

Publication number: KR20080005277A
Application number: KR1020077026795A
Authority: KR
Inventors: 후차파 자야파; 케빈 오코넬
Original assignee: 쉐링-프라우 리미티드
Priority date: 2005-04-18
Filing date: 2006-04-17
Publication date: 2008-01-10
Also published as: JP2008536936A; ES2583484T3; CR9443A; US20060233825A1; CA2606180A1; CA2606180C; IL186701A0; US20150140033A1; MA29406B1; EP1874344A1; TNSN07387A1; NZ562637A; RU2007142337A; ZA200709516B; PE20061398A1; TWI311057B; AU2006236365A1; DK1874344T3; RU2434638C2; US9662380B2

Abstract

본 발명은 씨. 퍼프린겐스(C. perfringens) 알파형 톡소이드, 이의 항원성 단편, 씨. 퍼프린겐스 알파형 독소의 불활성화된 항원 단편, 또는 이의 배합물을 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 당해 백신을 사용하여 클로스트리디움성 질환으로부터 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

씨. 퍼프린겐스, 톡소이드, 클로스트리디움성 질환, 백신

Description

씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 백신{C. perfringens alpha toxoid vaccine}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 전문이 본원에 참조로서 인용되는 35 U.S.C. §119(e)하에 2005년 4월 18일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/672,289호의 우선권을 주장하는 비-가출원이다.

본 발명은 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드, 이의 항원성 단편, 알파 독소의 불활성화된 항원성 단편 및 이의 배합물을 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 이들 백신을 사용하여 클로스트리디움성 질환으로부터 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens)(씨. 퍼프린겐스)는 천연적으로, 토양, 부패 유기 물질, 및 사람을 포함하는 동물의 장 미생물군(flora)에서 발견되는 혐기성 세균이다. 씨. 퍼프린겐스는 또한 경제적으로 가치있는 사육 동물에서 발견되는 다수의 클로스트리디움성 질환에 대한 병인학적 제제이다. 씨. 퍼프린겐스는 알파 독소, 베타 독소, 베타 2 독소, 엡실론 독소, 테타 독소, 뮤 독소, 델타 독소, 이오타 독소, 카파 독소 및 람다 독소를 포함하는, 동물의 병원성 효과를 유발하는 다수의 독소를 생산한다. 더욱이, 씨. 퍼프린겐스는 하이알루로니다제, 산 포스파타제, 프로테아제, 콜라겐아제, 설파타제 및 뉴라미니다제를 포함하는, 병원성 효과를 유발할 수 있는 기타 생물학적 활성 물질을 암호화한다.

씨. 퍼프린겐스의 상이한 균주는 특정 세균이 생산하는 독소의 범위에 따라 생유형 A 내지 E로서 지정된다[Justin et al., Biochemistry 41 :6253-6262 (2002); McDonel, PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS; F Dorner and J Drews (eds.) Pergamon Press, Oxford (1986)]. 초기에. 당해 분류는 마우스 또는 기니피그에서 혈청학적 중화 분석을 기초로 하였다. 보다 최근에 분자적 분류 방법은 씨. 퍼프린겐스의 다수의 독소들중 하나를 암호화하는 유전자 서열을 표적으로 하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한다.

말에서 장 클로스트리디움증(clostridiosis)은 씨. 퍼프린겐스 A형이 고농도로 장내 존재한다는 것과 관련되어 있다. 증세를 앓는 말은 다수의 물설사를 하고 사망율이 높다. 씨. 퍼프린겐스 A형은 또한 젖먹이 돼지 및 모유 공급 돼지의 장 질환과 연계되어 있고 당해 증세는 약한 괴사성 장염 및 융모 위축을 포함한다[문헌참조: Songer, CHn. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

씨. 퍼프린겐스에 의해 발병되는 클로스티리디움성 질환은 소장(장 형태)에서 컨플루언트 섬유괴사성 병변("터키쉬 타월"), 및/또는 간에서 담관간염증과 함께 씨. 퍼프린겐스 연관 간염증 또는 섬유소성 괴사로 인한 잘-살찌운 새의 급사를 특징으로 한다. 증세를 앓는 새에서 우울증, 설사 및 탈수가 급속하게 진행된다. 사망율은 2% 내지 50%이다. 간 병리는 도살장에서 시체 처리 문제를 유발한다.

괴사성 장염(NE)은 사육 조류에 상당한 경제적 문제점을 유발하는 씨. 퍼프린겐스에 의해 발병되는 클로스트리디움성 장 질환의 한 예이다. 당해 질환은 특히, 2주 내지 10주된 노면 사육된 구이용 닭에서 일반적이지만 당해 질환은 칠면조 및 우리에서 알을 낳는 암탉에서도 보고되었다. 괴사성 장염은 일반적으로 2차 질환으로서 또는 정상적인 장내 미생물군(microflora)이 변화되어 병원성 씨. 퍼프린겐스의 비정상적 증식을 허용하는 상황에서 사육 조류에서 발생한다. 만연된 준임상적 괴사성 장염은 공지되어 있지 않은데 그 이유는 병변이 단지 부검을 통해 관찰될 수 있기 때문이다. 그러나, 손상된 먹이 전환 및 체중 감소에 대한 보고는 준임상적 질환때문이었다[문헌참조: Lovland and Kadhusdal, Avian Path. 30:73-81 (2001)]. 천연 발생 및 실험적 모델 둘다에서 괴사성 장염을 유발하는 소인 요소는 (a) 콕시듐증, (b) 기생 유충의 체내 이행. (c) 고기육 또는 밀이 풍부한 사료 및 (d) 면역억제 질환을 포함한다. 추가로, 괴사성 장염은 실험적으로 (i) 씨. 퍼프린겐스에 의해 오염된 사료를 동물에게 제공하거나; (ii) 동물에게 식물 배양물을 경구로 또는 모이주머니에 투여하거나 (iii) 세균 부재 조 독소의 액체 배양물을 동물에게 십이지장으로 투여함에 의해 재발될 수 있다.

씨. 퍼프린겐스 A형 또는 C형은 사육 조류에서 괴사성 장염을 유발하는 2개의 생유형이고 알파 독소가 검출된 것중에 가장 일반적인 독소이다[문헌참조: Wages and Opengart, Necrotic Enteritis, pp: 781-785, In: Disease of Poultry, 11th ed., (eds., Saif et a/.), Iowa State Press, Ames, IA (2003)]. 실질적으로, A형으로 감염된 42마리의 사육 조류로부터 수득된 90% 초과의 씨. 퍼프린겐스 분리물은 시알리다제와 함께 치명적인 알파 독소, 및 테타 및 뮤 독소를 생산했다[문헌참조: Daube et al., AJVR 54:496-501 (1996)]. 추가로, 씨. 퍼프린겐스 A형에 의해 생산되는 장독소는 괴사성 장염을 앓는 닭에서 동정되었고 장질환에 관여할 수 있다[문헌참조: Niilo, Can. J. Comp. Med. 42:357-363 (1978)].

최근에, 씨. 퍼프린겐스 A형 또는 C형이 cpb2 유전자[문헌참조: Gilbert et al., Gene 203:56-73 (1997)]를 암호화할 수 있고 이의 생성물인 베타 2 독소를 발현할 수 있는 것으로 보고되었다. 돼지에서 베타 2 독소의 발현과 신생 돼지의 장염간의 강한 관련성이 관찰되었다[문헌참조: Bueschel et al., Vet Micro 94:121-129 (2003)]. 베타 2 독소는 또한 말 및 소의 장염에서 병원성 요소로서 관련되었다. 상기 문헌의 부에스철(Bueschel et al., supra) 등은 추가로, 이들이 수득한 3020마리의 씨. 퍼프린겐스 분리물중 37.2%가 베타 2 독소를 암호화하고 있고 조사된 씨. 퍼프린겐스 A형 분리물중 35.1%가 베타 2 독소를 암호화하고 있는 것으로 보고되었다. 조류 씨. 퍼프린겐스 A형 야생 분리물의 제한된 샘플(n=5)은 cpb2 유전자형에 대해 약 35%가 양성이고 이들 중 40%가 또한 베타 2 독소를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 문헌[참조: Engstrom et al., Vet Micro 94:225-235 (2003)]에서는 PCR을 사용하여 간염을 앓는 닭 기원의 씨. 퍼프린겐스 분리물의 12%가 또한 cpb2에 대해 양성임을 밝혔다. 씨. 퍼프린겐스 A형의 장독소는 또한 닭에서, 결찰된 장 루프 모델에서 유체를 축적시키는 병원성인 것으로 밝혀졌다[문 헌참조: Niilo, Appl. Micro. 28:889-891 (1974)].

씨. 퍼프린겐스를 억제하기 위한 현재 노력은 위생 대책 및 항생제를 동물 사료에 첨가하는 것에 의존한다. 질환의 클로스트리디움성 성분은 항생제에 잘 반응하여 일반적으로 항생제 사료 첨가제 및 이온 공극 형성(ionophorous) 항콕시듐 약제에 의해 억제된다. 그러나, 항생제는 고가이고 세균 내성의 촉진과 관련된 날로 증가하는 문제점에 봉착된다.

많은 씨. 퍼프린겐스 관련 질환의 진행은 급속적이고 흔히 치명적이기때문에, 백신 접종은 또한 사육 동물에서 중요한 억제 방법이 되고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,292,307호는 씨엘. 오에데마티엔스(Cl. oedematiens) 및 씨엘. 셉티쿰(Cl. septicum) 톡소이드 기원의 톡소이드를 추가로 포함하는, 씨. 퍼프린겐스 A형, B형 및 D형의 톡소이드로부터 제조되는 하나의 "범용" 다가 백신을 정의하고 있다. 추가로, 백신은 흔히 다가이고 불활성화된 세포, 독소 또는 이들 2개의 배합물로 이루어져 있고 시판되고 있다[문헌참조: Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

암컷 가축의 백신 접종은 또한 태어나는 후손의 수동적 보호를 유발할 수 있다. 병리학적 클로스트리움 감염으로부터 포유류 신생 동물의 수동적 보호는 초유 항체 형태로 특이적 항체의 전달에 의존한다. 예를 들어, 문헌[참조: Smith and Matsuoka [Am. J. Vet. Res. 20:91-93 (1959)]은 불활성화된 백신을 사용하여 임신한 양에 접종하고 씨. 퍼프린겐스의 엡실론 독소에 대하여 어린 양이 모계적으로 유도된 보호를 받게되는 것으로 보고하였다. 어린 포유류에서 수동 면역은 전형적 으로 2 내지 3주 지속한다[문헌참조: Songer,Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

젖먹이 포유류와는 반대로, 조류에서 수동 면역은 몇가지 명백한 단점을 갖고 있고 가장 명백하게는 우유로부터 수득되는 모계 항체가 완전 부재라는 것이다. 수동 면역이 이들의 관찰된 관련성에 대한 한가지 가능한 설명이지만 문헌[참조: Heier et al., Avian Diseases 45:724-732 (2001)]은 씨. 퍼프린겐스 알파 독소에 대해 천연적으로 존재하는 특이적 모계 항체의 역가가 낮은 무리에서 보다 이의 역가가 상당히 높은 역가를 갖는 노르웨이 구이용 무리에서 병아리의 생존율이 상당히 높다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[참조: Lovland et al. Avian Pathology 33(1 ):83-92 (2004)]은 백신 접종되지 않은 암탉의 후손과 비교하여 씨. 퍼프린겐스 A형 또는 C형 독소를 기초로 한 백신이 접종된 암탉의 후손의 온건한 수동적 보호와 일관성 있는 결과를 보고하였다.

지금까지, 씨. 퍼프린겐스로부터 상업적으로 상당한 보호는, 씨. 퍼프린겐스 세균에 의해 생성되는 모든 병리학적 성분에 대해서는 아닐지라도, 대부분에 대한 모계 항체가 접종물에 존재하지 않는다면 달성될 수 없는 것으로 나타난다. 예를 들어, 장독소를 함유하지 않는 생성물을 사용한 네발 동물의 백신 접종은 어린 돼지에게 단지 부분적인 보호를 제공하고 어미 염소의 항-엡실론 독소 항체는 독혈증으로인한 죽음로부터 보호하지만 장염에 대해서는 보호하지 못한다[문헌참조: Songer, CHn. Micro. Rev, 9(2):216- 234 (1996)].

실질적으로, 다양한 생물유형의 씨. 퍼프린겐스 및 이의 상응하는 독소 및 해로운 생활성 물질에 관한 인상적인 양의 데이타가 수집되었지만, 식품 생산 동물에서 클로스트리디움성 질환은 농장주에게는 상당한 경제적 부담으로 남아있다. 따라서, 씨. 퍼프린겐스의 병리학적 효과로부터 가축을 보호하는 추가의 수단을 제공할 필요가 있다. 보다 특히, 사육 조류에서 씨. 퍼프린겐스에 대한 안전하고 효과적인 백신을 제공할 필요가 여전히 남아있다. 더욱이, 암컷 동물, 특히, 수정 및/또는 임신한 암컷 가축에 투여되어 이의 후손을 수동적으로 보호할 수 있는 씨. 퍼프린겐스에 대한 단순한 백신을 제공할 필요가 있다.

본원에서의 인용되는 임의의 문헌은 당해 문헌의 참조가 본원 보다 "선행기술"로서 유용한 것임을 인정하는 것으로 해석되지 말아야한다.

발명의 요약

본 발명은 항원으로서, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원성 단편 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 불활성 항원성 단편 및/또는 이의 배합물를 포함하는, 씨. 퍼프린겐스에 대한 백신을 제공한다. 본 발명은 추가로 항원으로서, 단일 씨. 퍼브린겐스 알파형 톡소이드 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원성 단편 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 불활성 항원성 단편 및/또는 이의 배합물로 필수적으로 이루어진 백신을 추가로 제공한다.

바람직하게, 본 발명의 백신 투여당 0.25 내지 0.6ml의 1회 또는 2회 투여는 당해 백신으로 접종된 동물(예를 들어, 닭)의 항혈청 ml당 항-알파 독소 항체의 4 이상의 항독소 유니트(A.U.)를 유도하기에 충분하다. 당해 유형의 한 양태에서, 백신으로 접종된 동물의 항혈청 ml당 항-알파 독소 항체의 항독소 유니트(A.U.)의 결정은 면역화 후 6주 내지 7주째에 수행한다. 특정 양태에서, 1회 백신 투여는 백신 접종된 동물의 항혈청 ml당 항-알파 독소 항체의 4 이상의 항독소 유니트(A.U.)를 유도하기에 충분한 반면, 또 다른 양태에서, 2회 백신 투여가 필요하다. 한 양태에서, 항원은 2이상의 총 배합력 유니트(Total Combining Power Unit)((TCP)를 갖는다.

하나의 당해 양태에서, 동물은 조류이다. 특정 양태에서, 조류는 닭이다. 또 다른 양태에서, 조류는 칠면조이다.

한 양태에서, 항원은 씨. 퍼프린겐스 A형 세포로부터 기원하는 것, 예를 들어, 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드이다. 또 다른 양태에서, 항원은 씨. 퍼프린겐스 C형 세포로부터 기원하는 것, 예를 들어, 씨. 퍼프린겐스 C형 알파 독소의 불활성 항원 단편이다. 여전히 또 다른 양태에서, 항원은 씨. 퍼프린겐스 B형으로부터 기원하는 것이다. 여전히 또 다른 양태에서, 항원은 씨. 퍼프린겐스 D형으로부터 기원하는 것이다. 또 다른 양태에서, 항원은 씨. 퍼프린겐스 E형으로부터 유래하는 것이다. 여전히 또 다른 양태에서, 백신은 씨. 퍼프린겐스 아유형으로부터 기원하는 항원을 포함한다.

한 양태에서, 본 발명의 백신은 단일 씨. 퍼프린겐스 항원 유형인 항원을 포함하고, 단, 단일 씨. 퍼프린겐스 항원 유형만이 백신에 존재한다. 당해 유형의 하나의 특정 양태에서, 씨. 퍼프린겐스는 A형이다. 관련 양태에서, 씨. 퍼프린겐 스는 C형이다. 하나의 양태에서, 항원은 알파 톡소이드이다. 당해 유형의 특정 양태에서, 알파 톡소이드는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액에 의해 포함된다. 특정 양태에서, 백신은 단일 씨.퍼프린겐스 유형인 A형의 알파 톡소이드 상등액을 포함한다.

본 발명의 한 백신에서, 항원은 본래 씨. 퍼프린겐스 세포에 의해 암호화된 알파 독소의 알파 톡소이드이다. 본 발명의 또 다른 백신에서, 항원은 재조합 폴리펩타이드, 즉, 유전자 조작된 유전자에 의해 암호화된 것이다. 당해 유형의 양태에서, 재조합 폴리펩타이드는 상응하는 알파 독소의 효소 영역이 유전자 제거되거나 변형되었지만 하나 이상의 항원성 에피토프를 보유하는 알파 톡소이드이다.

특정 양태에서, 항원은 전세포 제제중에 존재한다. 또 다른 양태에서, 항원은 세포 부재 제제중에 존재한다. 또 다른 양태에서, 항원은 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액중의 알파 톡소이드이다. 당해 유형의 특정 양태에서, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액은 또한 세포 부재 제제이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 백신은 또한 다중 항원을 함유하여 동물 피검체에 투여되는 경우 다양한 특이성의 항체를 제조할 수 있다. 이들 모든 항체가 질환에 대해 보호성일 필요는 없다. 당해 유형의 특정 양태에서, 당해 항원은 또한 씨. 퍼프린겐스로부터 유래한다. 따라서, 본 발명의 백신은 알파 톡소이드와 함께 다양한 기타 활성 또는 불활성 병원성 인자를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 알파 톡소이드는 기타 클로스트리디움 및 비-클로스트리디움 세포, 톡소이드 및 추출물 뿐만 아니라 알파 독소의 불활성 항원 단편과 배합될 수 있다.

본 발명의 당해 다가 백신은 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원성 단편, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 불활성 항원성 단편, 및/또는 이의 배합물을 포함하고 바이러스 항원 및/또는 세균 항원 및/또는 기생충 항원을 추가로 포함한다. 당해 유형의 특정 양태에서, 항원의 바이러스 공급원은 감염성 낭 질환(infectious bursal disease) 바이러스이다. 또 다른 양태에서, 항원의 바이러스 공급원은 감염성 기관지염 바이러스이다. 또 다른 양태에서, 항원의 바이러스 공급원은 레오바이러스이다. 여전히 또 다른 양태에서, 항원의 바이러스 공급원은 뉴캐슬 질환 바이러스이다. 또 다른 양태에서, 항원의 세균성 공급원은 이. 콜리이다. 또 다른 양태에서, 항원의 세균성 공급원은 살모넬라(Salmonella)이다. 또 다른 양태에서, 항원의 세균성 공급원은 캄필로박터(Campylobacter)이다. 또 다른 양태에서, 항원의 기생충 공급원은 에이메리아(Eimeria)로부터 기원하는 것이다. 당해 유형의 특정 양태에서, 백신에 사용되는 항원은 에이메리아 난충(morozoite)의 일부인 에이메리아 포낭 또는 이의 혼합물이다. 관련 양태에서, 기생충의 천연 숙주는 조류이다. 당해 유형의 특정 양태에서, 기생충은 에이메리아이고 기생충의 천연 숙주는 닭이다.

본 발명의 다가 백신은 또한 하기의 항원중 하나 이상을 포함할 수 있다: 씨. 퍼프린겐스 베타 독소, 씨. 퍼프린겐스 베타 2 독소, 씨. 퍼프린겐스 장독소, 씨. 퍼프린겐스 엡실론 독소, 씨. 퍼프린겐스 이오타 독소, 씨. 퍼프린겐스 카파 독소, 씨. 퍼프린겐스 람다 독소, 씨. 퍼프린겐스 테타 독소, 씨. 소르델리(C. sordellii) 출혈성 독소, 씨. 소르델리 치명적 독소, 씨. 디피실(C. difficile) A 독소, 씨. 디피실 B 독소, 씨. 셉티쿰(C. septicum) 알파 독소, 씨. 노비이(C. novyi) 알파 독소 및 씨. 노비이 베타 독소.

본 발명의 특정 다가 백신에서, 당해 백신은 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 항원성 단편, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 불활성 항원성 단편. 및/또는 이의 임의의 배합물을 포함하고 추가로 감염성 낭 질환 바이러스 및/또는 감염성 기관지염 바이러스 및/또는 레오바이러스, 및/또는 뉴캐슬 질환 바이러스, 및/또는 이. 콜리, 및/또는 살모넬라, 및/또는 캄필로박터 기원의 세균성 항원, 및/또는 에이메리아 기원의 기생충 항원을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 다가 백신은 단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원성 단편, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원성 단편 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 불활성 활성 단편 및/또는 이의 배합물로 필수적으로 이루어진다. 관련 양태에서, 백신은 본원에 제공된 바와 같이, 바이러스 항원 및/또는 세균성 항원 및/또는 기생충 항원을 함유한다.

본 발명의 백신은 또한 애쥬반트를 포함할 수 있다. 하나의 통상적인 동물 애쥬반트는 수산화알루미늄 애쥬반트이다. 또 다른 애쥬반트는 항원과 함께 유중수 유제중에 포함될 수 있다. 당해 유형의 특정 백신에서, 유중수 유제는 70% 오일상 및 30% 수성상으로 제조된다. 또 다른 양태에서, 애쥬반트는 특히 수산화알루미늄 애쥬반트가 아니다. 하나의 당해 양태에서, 비-수산화알루미늄 애쥬반트를 포함하는 백신은 사육 조류에 투여된다. 특정 양태에서, 백신은 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드, 애쥬반트, 및 바이러스, 세균 및/또는 세균 추출물로부터 수득된, 재조합 또는 천연의, 하나 이상의 보호 항원을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 백신으로 조류를 면역화시켜 조류에 능동 면역을 제공하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 당해 능동 면역을 위한 백신 투여량은 약 0.05 내지 약 0.1ml이다. 한 양태에서, 조류는 칠면조이다. 또 다른 양태에서, 조류는 닭이다. 또 다른 양태에서, 조류는 꿩이다. 본 발명은 또한 본 발명의 다가 백신을 조류에 투여하여 다중 질환으로부터 이를 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 임신한 암컷의 후손 출산 전에 암컷 동물(예를 들어, 모체)에게 본 발명의 백신을 투여함을 포함하는, 암컷 동물(예를 들어, 임신한 암컷)의 후손에 수동 면역을 제공하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 암컷은 조류이고 백신은 후손을 포함하는 알을 낳기 전에 조류 암컷에 투여된다. 이러한 방식으로, 당해 후손에는 수동 면역이 제공된다. 하나의 당해 양태에서, 조류는 닭이다. 또 다른 양태에서, 조류는 칠면조이다. 여전히 또 다른 양태에서, 조류는 꿩이다.

특정 양태에서, 당해 방법은 클로스트리디움성 질환에 대한 수동 면역을 백신 접종된 동물의 후손에 제공한다. 한가지 당해 방법에서, 클로스트리디움성 질환은 클로스트리디움성 장 질환이다. 당해 유형의 특정 방법에서, 클로스트리디움 장 질환은 괴사성 장염이다. 또 다른 당해 방법에서, 클로스트리디움 질환은 담관간염이다. 여전히 또 다른 양태에서, 당해 방법은 클로스트리디움성 질환에 대한 수동 면역을 백신 접종된 동물의 후손에 제공할뿐만 아니라 괴저성 피부염, 셉티쿰 및/또는 간염에 대한 보호를 제공한다.

한 양태에서, 암컷 동물의 후손에 수동 면역을 제공하는 방법은 다중 질환으로부터 후손을 보호하기 위해 다가 백신을 암컷 동물에 투여함을 포함한다. 당해 유형의 특정 양태에서, 암컷 동물은 사육 조류 계열에 존재하고 이의 후손은 다중 사육 조류 질환으로부터 보호된다.

특정 양태에서, 암컷 동물의 후손에 수동 면역을 제공하기 위한 투여량은 백신 투여당 약 0.25ml이다. 또 다른 양태에서, 투여량은 백신 투여당 약 0.4ml이다. 여전히 또 다른 양태에서, 투여량은 백신 투여당 약 0.6ml이다. 하기 예시된 양태에서, 투여량은 백신 투여당 약 0.5ml이다.

본 발명은 추가로 본 발명의 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 당해 방법은 배양 배지에서 씨. 퍼프린겐스 세포를 증식시켜 씨. 퍼프린겐스 알파 독소를 세포 배지로 분비하는 특정 양의 배양 세포를 생산함을 포함한다. 이어서 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드는 분비된 알파 독소를 불활성화시킴에 의해 생성된다. 다수의 배양된 세포는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액을 형성하기 위해 배양 배지로부터 제거된다. 당해 방법의 특정 양태에서, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액의 농도는, 백신 투여당 0.25 내지 0.6ml의 1 또는 2회 투여로 백신 접종된 동물(예를 들어, 닭)의 항혈청 ml당 항-알파 독소 항체의 4 이상의 항독소 유니트(A.U.)를 유도하기에 충분하도록 조정된다. 하나의 당해 양태에서, 농축 과정은 저분자량의 오염물을 제거하기 위한, 완충액에 대한 정용여과를 포함한다.

본 발명의 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 백신을 제조하는 방법은 추가로, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액과 애쥬반트를 혼합함을 포함할 수 있다. 하나의 당해 양태에서, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액은 유중수 유제에서 혼합한다. 당해 유형의 특정 양태에서, 유중수 유제는 70% 오일상 및 30% 수성상으로 제조된다.

당해 방법에 사용되는 씨. 퍼프린겐스 세포는 단일 씨. 퍼프린겐스 유형 세포로부터 기원하는 것일 수 있다. 당해 유형의 특정 양태에서, 단일 씨. 퍼프린겐스 세포 유형은 씨. 퍼프린겐스 A형 세포이다. 또 다른 양태에서, 단일 씨. 퍼프린겐스 세포 유형은 씨.퍼프린겐스 C형 세포이다.

본 발명의 당해 및 기타 측면은 하기의 상세한 설명을 참조로 보다 잘 이해될 것이다.

본 발명은 동물에서 클로스트리디움성 질환의 예방을 위해 안전하고 효과적인 씨. 퍼프린겐스에 대한 고유 백신을 제공한다. 특정 양태에서, 암컷 동물 피검체에 본 발명의 백신의 투여는 암컷 동물을 면역화시키고 후속적으로 출생 후손으로 수동적으로 전달될 수 있는 항체를 생성시킨다. 한 양태에서, 본 발명은 해로운 씨. 퍼프린겐스 감염에 대해 효과적인, 특이적 최소량의 단일 씨. 퍼프린겐스 유형의 알파 톡소이드를 포함하는 백신을 제공한다. 특정 양태에서, 백신은 본 발명의 알파 톡소이드 및 약제학적으로 허용되는 애쥬반트의 안전하고 면역학적으로 유효한 배합물을 포함한다.

본 발명의 백신을 사용하여 씨. 퍼프린겐스가 관여하는 임의의 증상 또는 질환으로부터 보호할 수 있다. 당해 질환은 클로스트리디움성 질환을 포함한다. 당해 유형의 한 양태에서, 클로스트리디움성 질환은 클로스트리디움성 장 질환이다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 괴사성 장염으로서 공지된, 사육 조류에서의 클로스트리디움성 장 질환의 예방에 효과적인 백신을 제공한다. 기타 질환 증후군은 또한 본 발명의 백신에 의해 예방될 수 있고 클로스트리디움 관련 간염, 담관간염 및 괴저성 피부염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 단일 씨. 퍼프린겐스 유형으로부터 수득된 특정 최소량의 알파 톡소이드(즉, 특정 최소량의 TCP)를 포함하는 백신이 임의의 추가적인 치명적 독소가 챌린지된 씨. 퍼프린겐스에 의해 발현되는지에 상관없이 백신 접종된 암컷 동물 피검체의 후손을 괴사성 장염과 같은 클로스트리디움 질환으로부터 보호함을 기재한다. 본 발명은 추가로, 백신 접종된 암컷 동물로부터 특정 최소의 항-알파 독소 반응을 유발하는 백신을 기재하고 있고, 당해 백신은 또한 임의의 추가적인 치명적 독소가 천연에 존재하는 씨. 퍼프린겐스에 의해 발현되는지에 상관없이, 백신 접종된 암컷 동물 피검체의 후손을 클로스트리디움성 질환으로부터 보호한다. 본 발명의 백신은 또한 허용가능한 애쥬반트와 함께 투여될 수 있다.

하기 예시된 바와 같이, 알파 독소를 발현하지만 이에 상응하는 베타 2 독소는 발현하지 않는 불활성화된 씨. 퍼프린겐스 A형 분리물로부터 유래하는 백신으로 접종된 암탉은 예상치 않게 알파 독소 및 베타 2 독소 둘다를 발현하는 씨. 퍼프린겐스 균주의 챌린지로부터 3주된 후손 병아리의 수동 면역화를 유도하였다. 지금까지, 이들 별개의 독소에 대한 당해 교차 보호가 입증되지 않았었다. 따라서, 본 발명은 특정 최소량의 항-알파 독소를 자극하여, 씨. 퍼프린겐스 챌린지 균주가 어떠한 기타 독소를 발현하든지간에 상관없이, 괴사성 장염과 같은 클로스트리디움성 질환에 대해 보호할 수 있는 비교적 단순한 백신을 제공한다.

실질적으로, 씨. 퍼프린겐스에 의해 생성되는 다수의 독소 및 기타 생물학적 활성 단백질이 동물에 대해 병원성 효과를 나타내고 이들 다양한 독소 및 기타 단백질이 괴사성 장염의 병리에 기여하는 것이 문헌에 많이 언급되어 있지만, 본원에 기재된 독특한 백신은 백신접종된 구이용 암탉에서 씨. 퍼프린겐스에 대한 실질적인 면역 반응 및 이어서 이들의 후손들에 수동 면역 둘다를 제공한다.

본 발명은 임의의 이론 또는 모델과는 완전히 무관한 것이지만, 본원에 제공된 결과는 씨. 퍼프린겐스 알파 독소가 괴사성 장염으로부터 보호하는데 필요하고 충분한 항원성 성분이라는 것과는 일관성이 있다. 베타, 베타 2 및 장독소는 괴사성 장염의 병리에 중요할 수 있지만, 본원에 제공된 결과는 알파 독소가 괴사성 장염용 백신에 필요한 유일한 톡소이드이라는 것과 일관성이 있다. 추가로, 알파 독소 생산은 일반적으로 A형 균주에서 최고이기 때문에, 특히, 씨. 퍼프린겐스 A형 균주가 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 공급원으로서 유용하다. 그러나, 기타 씨. 퍼프린겐스 유형은, 특히, 유전자 변형을 사용하여 당해 기타 유형에서 알파 독소 생산 수준을 증가시키는 경우에 성공적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 하기의 용어는 하기에 제시된 정의를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 "보호 항원"은 특이적 항체의 생산을 유도하여 항원으로 백신접종된 동물 및/또는 이의 후손을 감염 및/또는 질환으로부터 보호해주는 항원이다. 당해 보호 항원을 함유하는 백신은 "면역학적으로 유효한"것으로 언급된다.

본원에 사용된 바와 같이, 특정 단백질과 관련된 용어 "항원성 단편"은 항원성 단백질의 단편이다. 예를 들어, 알파 독소 또는 알파 톡소이드의 항원성 단편은 항원성인 알파 독소 또는 알파 톡소이드의 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, 알파 독소 또는 알파 톡소이드의 항원성 단편은 각각 전장의 단백질로부터 1개 정도의 적은 아미노산이 결실된 대형 단편들을 포함하는, 알파 독소 또는 알파 톡소이드의 임의의 단편일 수 있다. 특정 양태에서, 알파 독소 또는 알파 톡소이드의 항원성 단편은 6 내지 120개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 추가로, 소정의 알파 독소의 항원성 단편은 천연으로부터 분리되거나 화학적 합성을 통해 분리된 단백질로부터 재조합에 의해 수득될 수 있다. 더욱이, 항원성 단편은 재조합 발현을 통해, 알파 독소, 알파 톡소이드 또는 이의 단편의 단백질 분해 후 수득될 수 있거나 또한 예를 들어, 펩타이드 합성을 통해 드 노보(de novo)로 생성될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 "불활성 항원 단편"은 하나 이상의 항원성 에피토프를 보유하지만 해롭게 하는데 충분한 알파 독소의 촉매적 활성을 보유하고 있지 않은 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 항원성 단편이다. 불활성 항원성 단편은 단독으로 사용될 수 있거나 또한 융합 단백질로 혼입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알파 톡소이드"는 임의의 불활성 알파 독소(예를 들어, 불활성 전장 알파 독소)를 언급하지만 어떠한 방식으로든지 알파 독소를 불활성화시켜 알파 톡소이드를 생산하는 특정 수단을 제한하고자 하는 것은 아니다. 당해 불활성화 방법은, (i) 온전한 단백질을 변형시키는 화학적 방법, 예를 들어, 포름알데하이드 또는 글루타르알데하이드 처리; (ii) 물리적 방법, 예를 들어, 가열; (iii) 단백질을 변형시키는 효소적 방법, 독소를 단편들로 절단하는 프로테아제; (iv) 단백질의 효소 영역을 제거하거나 변형시키지만 하나 이상의 항원성 에피토프를 보유하도록 알파 독소 유전자의 유전자 조작과 같은 재조합 방법[내용 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,817,317호]; 및/또는 상기 모든 방법 또는 임의의 방법의 조합을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 씨 퍼프린겐스 "알파 톡소이드 상등액"은 적어도 독소를 생산하는 대다수의 세포가 제거된(즉, 70% 초과의 세포가 제거된, 및 특정 양태에서, 90% 초과의 세포가 제거된) 불활성화된 씨. 퍼프린겐스 알파 독소를 포함하는 용액이다. 특정 양태에서, 불활성화된 씨. 퍼프린겐스 알파 독소는 당해 배양 배지에 첨가되고/되거나 배양된/증식됨에 이어서 불활성화된 씨. 퍼프린겐스 세포에 의해 배양 배지로 분비된다. 또 다른 양태에서, 불활성화된 씨. 퍼프린겐스 알파 독소는 세포 용해를 통해 유리됨에 이어서 불활성화된, 세포 연합된 씨. 퍼프린겐스 알파 독소를 포함한다. 알파 톡소이드 상등액을 제조하는 수단은 어떠한 방식으로든지 용액으로부터 세포 또는 세포 잔해를 제거하는 임의의 특정 방법으로 제한됨을 의미하지 않고 원심분리, 칼럼 크로마토그래피, 한외여과등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "세포-부재" 용액은 90% 초과의 세포가 배양물로부터 제거된 것이다. "세포-부재" 용액을 제조하는 수단은 어떠한 방식으로든지 용액으로부터 세포 또는 세포 잔해를 제거하는 임의의 특정 방법으로 제한됨을 의미하지 않고 원심분리, 칼럼 크로마토그래피, 한외여과등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 씨. 퍼프린겐스 유형"은 다중 유형, 예를 들어, A형 및 B형 및 C형과는 반대로 하나의 씨 퍼프린겐스 유형, 예를 들어, A형 또는 B형 또는 C형등을 언급한다. 따라서, "단일 씨. 퍼프린겐스 유형"의 알파 톡소이드를 포함하는 세포, 상등액, 조성물, 제제, 백신등은 하나의 특정 씨. 퍼프린겐스 유형으로부터 기원하는 알파 톡소이드를 함유하고 임의의 다른 씨. 퍼프린겐스 유형으로부터 기원하는 알파 톡소이드는 함유하지 않는 세포, 상등액, 조성물, 제제, 백신등이다. 한편, 당해 세포, 상등액, 조성물, 제제, 백신등은 기타 씨. 퍼프린겐스 톡소이드 및/또는 애쥬반트 및/또는 면역 자극제등을 포함하는, 기타 비-알파 톡소이드 성분을 함유할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 항혈청 mL당 항-알파 독소 항체의 "항독소 유니트" 또는 "A.U."는 "항-알파 독소 중화 시험" 유니트 또는 "TNT" 유니트와 상호교환적으로 사용되고 마우스 생분석에서 알파 독소의 독성 효과를 중화시키는 혈청 능력으로서 정의된다. 당해 시험에서, 국제 표준[유럽 약전 5.0.:01/2005:0088, pp. 803-804]에 의해 설정된 공지된 양의 알파 독소는 연속 희석된 백신 접종된 동물 기원의 혈청과 혼합한다. 당해 혼합물을 실온에서 1시간동안 항온처리함에 이어서 마우스의 정맥내로 주사한다. 독소가 혈청에 의해 완전히 중화되는 경우 당해 마우스는 생존할 것이고 그렇지 않다면 죽을 것이다. 항독소 유니트 또는 역가는 독소를 중화시키는 혈청의 최고 희석값의 역수로서 결정된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "총 배합력"은 "TCP"로 약칭되고 문헌[참조: Batty, Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Chapter 8, Volume 5A (1971), ed. JR Norris and DW Ribbons]]에 기재된 바와 같이 정의된다. 당해 분석에서, 특정 용적의 알파 톡소이드 상등액은 공지된 양의 항독소 유니트와 접촉시킨다. 항독소와 알파 톡소이드의 결합을 허용하는 적합한 항온처리 시간, 예를 들어, 실온에서 1시간을 제공한 후, 공지된 양의 알파 독소를 첨가한다. 이어서 잔류하는 유리 항독소에는 알파 독소와 결합하는데 적합한 시간, 예를 들어, 실온에서 1시간을 부여한다. 이어서 유리 알파 독소의 양은 기질을 용액에 첨가하여 알파 독소의 효소 활성을 측정하여 결정된다. 적합한 기질은 적혈구(특히, 양 적혈구) 및 레시틴을 포함한다. 이어서 알파 톡소이드는 결정된 효소 활성의 양을 기준으로하는 계산을 통해 정량할 수 있다. 분석 용액에 존재하는 알파 톡소이드의 양이 클수록, 당해 분석에서 측정된 효소 활성의 양도 크다.

용어 "유형" 및 "생유형"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 다양한 독소 유전자의 발현을 기준으로 씨. 퍼프린겐스의 특정 표현형을 언급한다. 클로스트리디움 퍼프린겐스는 4개의 주요 독소인 알파, 베타, 엡실론 및 이오타의 생산을 기준으로 분류된다. 씨. 퍼프린겐스 A형은 알파 독소를 생산하고, B형은 알파, 베타 및 엡실론 독소를 생산하고, C형은 알파 및 베타 독소를 생산하고, D형은 알파 및 엡실론 독소를 생산하고, E형은 알파 및 이오타 독소를 생산한다. 씨. 퍼프린겐스에서 17개 정도로 많은 외독소가 밝혀졌다. 씨. 퍼프린겐스의 생유형은 추가의 클로스트리디움성 독소 및/또는 효소중 몇몇 또는 이 모두의 생산을 기준으로 하는 분류이다. 예를 들어, 씨. 퍼프린겐스 A형의 장독성 병원형은 알파 독소에 추가로 테타 및 뮤 독소를 생산할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 다가 백신은 2개 이상의 상이한 항원을 포함하는 백신이다. 당해 유형의 특정 양태에서, 다가 백신은 2개 이상의 상이한 병원체에 대한 수용체의 면역계를 자극한다.

용어 "애쥬반트" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 면역계를 자극시키는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이러한 의미에서, 애쥬반트는 하나 이상의 백신 항원에 대한 면역반응을 증진시키는데 사용된다. 애쥬반트는 백신 투여 전, 동시에 또는 후에 표적 동물에 투여될 수 있다. 본 발명의 애쥬반트는 천연 공급원, 재조합 및/또는 화학적 합성 등을 포함하는 임의의 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 애쥬반트로서 사용되는 화학적 화합물의 예는 알루미늄 화합물, 대사가능하고 대사가능하지 않은 오일, 블록 중합체, ISCOM(면역 자극 복합체), 비타민(비타민 E, 비타민 A, 셀레늄 및 비타민 B12를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 및 무기물, 쿠일 A(사포닌) 및 CARBOPOL^®을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 때때로, 면역 자극제로서 특정하게 언급되는 애쥬반트의 추가의 예는 세균 및 진균류 세포벽 성분(예를 들어, 리포폴리사카라이드, 지단백질, 당단백질, 무라밀펩타이드, 베타-1,3/1,6-글루칸), 식물 기원의 다양한 복합 탄수화물(예를 들어, 글리캔, 아세만난), 동물 기원의 다양한 단백질 및 펩타이드(예를 들어, 호르몬, 사이토킨, 동시 자극 인자) 및 바이러스 및 기타 공급원 기원의 신규 핵산(예를 들어, 이본쇄 RNA, CpG)을 포함한다. 추가로, 상기 언급된 물질의 임의의 배합물은 애쥬반트 효과를 제공할 수 있고 따라서 본 발명의 애쥬반트를 형성할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "항-알파 독소"는 알파 독소와 결합하는 항체(모노클로날 또는 폴리클로날)이다. 알파 독소에 대한 항체는 상기된 바와 같이 TNT 분석에 의해 측정될 수 있다. 또한, 항체는 알파 독소의 용혈성 효과를 차단하는 능력에 의해 검출될 수 있다. 용혈 억제 분석에서, 소정의 양 적혈구의 제제의 완전한 용해를 촉매하기에 충분한 공지된 양의 알파 독소는 연속 희석된 혈청과 혼합하고 36±2℃에서 1시간동안 항온처리한다. 이어서 당해 혼합물은 36±2℃에서 3시간동안 0.5% 양 적혈구와 항온처리한다. 항체가 알파 독소와 결합하는 경우, 독소는 적혈구를 용해시킬 수 없다. 당해 역가는 용혈을 유발하지 않는 혈청의 최고 희석값의 역수에 의해 측정된다. 유사한 분석에서, 포스포리파제 활성을 억제하는 알파 독소에 결합하는 항체의 능력은 레시틴의 효소 절단을 차단하는 항혈청의 최고 희석물을 결정함에 의해 측정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 용어 단백질과 상호교환적으로 사용되고 추가로 펩타이드를 포함하는 것으로 의미된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 2개 이상의 아미노산의 중합체이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 천연에 존재하는 단백질; 재조합 단백질; 화학적으로 합성된 단백질; 천연에 존재하는 단백질, 재조합 단백질 또는 화학적으로 합성된 단백질의 단편; 및 천연에 존재하는 단백질, 재조합 단백질 및/또는 화학적으로 합성된 단백질, 및/또는 이들의 임의의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게, 용어 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 중합체를 지칭하는데 사용되는 반면, 용어 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 중합체를 지칭하는데 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "이종성 뉴클레오타이드 서열"은 본 발명의 단백질, 예를 들어, 본 발명의 알파 독소를 암호화거나 이의 단편(예를 들어, 불활성 활성 단편)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 재조합 방법에 의해 첨가되어 천연적으로 형성되지 않는 핵산을 형성하는 뉴클레오타이드 서열이다. 당해 핵산은 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 단일의 연속 뉴클레오타이드 서열일 필요는 없고 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 배합된 다중 비연속 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이종성 뉴클레오타이드 서열은 제한 절단 부위, 조절 부위, 프로모터 등을 포함하는 비암호화 서열을 포함할 수 있다. 여전히 또 다른 양태에서, 이종성 뉴클레오타이드는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 수단으로서 기능할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 조합되는 경우, 본 발명의 모든 융합 단백질을 암호화하는데 필요하고 충분한 이종성 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원성 단편 및/또는 상응하는 알파 독소의 불활성 항원성 단편으로 "필수적으로 이루어진" 백신은 클로스트리디움성 질환으로부터보호하는 면역학적 유효량의 단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드, 및/또는 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원성 단편, 및/또는 상응하는 알파 독소의 불활성 항원성 단편을 함유하지만 클로스트리디움성 질환으로부터 보호 작용을 하는 것으로 공지된 면역학적 유효량의 임의의 기타 항원, 예를 들어, 또 다른 씨. 퍼프린겐스 항원 또는 또 다른 씨. 퍼프린겐스 알파형 독소, 알파톡소이드 또는 이의 단편을 함유하지 않는 백신이다. 당해 백신은 추가로 감염성 낭 질환 바이러스, 레오바이러스 및 뉴캐슬 질환 비아러스로부터의 바이러스 항원; 이. 콜리, 살모넬라 및 캄필로박터 기원의 세균성 항원 및 에이메리아로부터 기원하는 것과 같은 기생충 항원과 같은 기타 질환과 관련된 항원을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 특정 투여량 값과 연계되어 사용되는 용어 "약"은 투여량 값이 지적된 값의 20% 이내에 있는 것을 의미하고, 예를 들어, 약 0.5ml의 투여량은 0.4 내지 0.6ml을 포함할 수 있다.

씨. 퍼프린겐스 A형의 분리

씨. 퍼프린겐스 A형과 같은 씨. 퍼프린겐스 분리물은 감염된 동물의 대소변 샘플 및/또는 장 박리물로부터 수득될 수 있다. 샘플/박리물을 혈액 한천 플레이트상에 스트리킹하여 혐기적으로 24 내지 48시간동안 35 ±1℃에서 배양하고 씨. 퍼프린겐스 A형과 유사한 콜로니 각각을 집어내었다. 씨. 퍼프린겐스 A형 분리물로서의 이의 실체를 확인하기 위해, 선별된 콜로니는 유전자 구성을 포함하는, 특징적인 씨. 퍼프린겐스 A형의 생화학적 성질에 대해 추가로 조사될 수 있다.

분리물중의 알파 독소 유전자의 존재는 PCR과 같은 유전자 분석에 의해 결정될 수 있다. 알파 독소의 발현은 난황을 사용하는 분석에서 레시티나제 활성 및/또는 양 적혈구를 사용하는 용혈 분석에 의해 나타날 수 있다. 특정 양태에서, 고수준의 알파 독소를 발현하는 씨. 퍼프린겐스 분리물은 본 발명의 백신의 제조에 사용한다. 선택된 씨. 퍼프린겐스 분리물은 4 내지 24시간동안 영양물 브로쓰에서 혐기적으로 증식시킬 수 있다. 배양물은 예를 들어, 포르말린으로 불활성화되고 농축되고 당해 백신중에 블렌딩될 수 있다.

씨. 퍼프린겐스 독소

알파 독소 - 알파 독소는 모든 유형의 씨. 퍼프린겐스에 의해 생성된다. 알파 독소는 레시틴을 분해하여 포스포릴콜린 및 디글리세라이드를 형성할 수 있는 다기능성 포스포리파제 C이다. 정맥내로 투여되는 경우, 알파 독소는 마우스에 치명적인으로 나타났다. 알파 독소는 또한 명백한 용혈성이다. 그러나, 적혈구의 민감성은 적혈구의 공급원으로서 사용되는 동물의 종에 따라 크게 다양할 수 있다. 알파 독소는 또한 혈소판 응집, 혈소판, 백혈구 및 기타 체세포의 용해를 유발할 뿐만 아니라 혈관 투과성을 증가시킨다.

베타 독소 - 베타 독소는 씨. 퍼프린겐스 B형 및 C형에 의해 생성된다. 베타 독소는 장 염증 및 점액의 대량 상실에 관여하고 장 움직임을 억제한다. 베타 독소는 분자량이 35kDa인 단백질이고 기타 씨. 퍼프린겐스 독소 보다, 트립신과 같은 단백질 분해 효소에 보다 더 민감하다. 베타 독소는 동물에 치명적인 것으로 마우스가 가장 민감하고 닭이 최소로 민감한 것으로 보고되었다.

베타 2 독소 - 베타 2 독소는 씨. 퍼프린겐스 독소중에서 가장 최근에 발견된 것이다. 이의 유사한 명명에도 불구하고, 베타 2 독소와 베타 독소의 아미노산 서열은 상동성을 나타내지 않는다. 문헌은 특정 동물에서 베타 2 독소와 괴사성 장염간의 강한 연관성을 보여주었다[문헌참조: Garmory et al., Epidemiol. Infect. 124:61-67 (2000), Herholz et al., J. Clin. Morco, Feb:358-361 (1999)]. 베타 2 독소는 28kDa의 분자량을 갖는다. 베타 2 독소는 마우스에 치명적이고 특성 세포주에 세포독성이어서 액틴 세포골격에 영향을 주지 않으면서 세포의 팽창 및 용해를 유도하는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Manteca et al., Vet. Microb. 86:191-202 (2002), Schotte et al., J. Vet Med B 51 :423-416 (2004), Gilbert et al., Gene 203:65-73 (1997)].

장독소 - 장독소는 전형적으로 씨. 퍼프린겐스 A형 균주에 의해 생성된다. 장독소의 존재는 통상적으로 장 질환 관련 균주와 조직 가스 괴저와 연관된 균주를 구분하는데 사용된다. 가스 괴저를 유발하는 균주는 천연적으로 장독소를 갖지 않는다. 장독소는 분자량이 34kDa인 열 민감성 단백질이다. 마우스에 대한 치사량은 약 10마이크로그램이다. 장독소의 초기 작용은 숙주 세포에 공극을 형성하여 세포의 투과성을 변화시키고 거대분자 합성을 억제하고 세포골격을 붕괴시키고 최종적으로 용해시키는 것이다[문헌참조: Songer, CHn. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)]. 장독소는 장 세포내에서 전체 수송을 역전환시킨다.

엡실론 독소 - 엡실론 독소는 씨. 퍼프린겐스 B형 및 D형에 의해 생성된다. 엡실론 독소는 내인성 트립신에 의해 극히 강력한 신경독소로 전환되는 전구독소로서 분비된다. 정맥내로 투여되는 경우, 엡실론 독소는 마우스에 극히 치명적일 수 있다. 엡실론 독소는 신경 조직에 대해 높은 친화성을 나타내고 혈관 투과를 유발하는 효과를 갖는다. 엡실론 독소는 또한 소화관 벽의 투과를 유발하여 그차제를 포함하여 거대 분자가 혈류로 진입할 수 있도록 한다. 이어서 엡실론 독소는 혈류를 통해 뇌로 이동하여 여기에서 삼투압 균형을 붕괴시킨다. 뇌에서의 삼투압 균형의 붕괴는 감염된 동물이 죽기 전에 관찰되는 신경학적 징후를 유발한다.

카파 독소 - 카파 독소는 씨. 퍼프린겐스 A형, D형, E형 및 몇몇 B형 및 C형에 의해 생성되는 콜라겐 가수분해 효소이다. 카파 독소는 80kDa의 분자량을 갖고 마우스에 치명적이다. 마우스에 카파 독소의 정맥내 주사는 폐의 강한 출혈로 인해 1시간 이내에 죽음을 초래한다.

테타 독소 - 씨. 퍼프린겐스의 대부분의 균주는 테타 독소를 생성한다. 테타 독소는 혈액 한천 플레이트상에서 콜로니 주변에서 관찰되는 명백한 용혈 지대에 관여하는 74kDa 단백질이다. 정제된 테타 독소는 마우스에 극히 치명적이어서 수분 이내에 죽음을 초래한다. 테타 독소는 특정 스테로이드에 의해 억제되고 콜레스테롤이 가장 강한 억제제이다.

수동 면역

본 발명은 본 발명의 항원, 예를 들어, 백신의 효과를 이의 신생 새끼에게 전달할 수 있는, 비-사람 암컷, 특정 수정 및/또는 임신한 암컷의 백신 접종용 알파 톡소이드인 본 발명의 최소량의 항원의 안전하고 면역학적 유효량의 제제로 이루어진 백신을 포함한다. 모계로부터 후손에게로의 면역력 전달은 "수동 면역"으로 호칭된다. 수동 면역은 특히, 포유동물에서 나타나는 바와 같이 초유의 섭취 또는 사육 조류에서 나타나는 바와 같이 난황의 혈류로의 항체의 흡수를 통해 성취될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같이, 사육 조류는 난내(in ovo)내에서 항체를 섭취하여 순환계 항체의 수준을 상승시킬 수 있다.

본원에서 입증된 바와 같이, 특정량의 항-알파 독소가 신생 동물에게 수동으로 전달되는 경우 독성 클로스트리디움 퍼프린겐스 챌린지로부터 신생 동물을 보호한다. 하기에 기재된 바와 같이 보호 정도는 지금까지 완전하게 예상되지 못했는데 그 이유는 경구 씨. 퍼프린겐스 A형 챌린지에 대항하여 상당한 보호력을 제공하기 위해서는 장이 항체로 침지되어야만 하는 것으로 사료되기 때문이다. 유사하게, 신생 포유동물에서 초유의 주입을 통한 점액 면역력의 모계 항체 전달과 난황에서 모계 항체 흡수간에 관련성이 존재한다는 것은 놀라운 것이다. 닭에 대해 하기에서 입증된 바와 같이, 항-알파 독소 항체는 난내에서 혈류로 흡수된다. 더욱이, 본 발명은 암탉의 혈류에서 특정 한정된 최소 항-알파 독소 항체 역가를 유도하는 것이 후손 탄생 수주 후에 수행된 씨. 퍼프린겐스 A형 챌린지로부터 암탉의 백신 접종된 후손을 보호하기에 충분함을 기재하고 있다.

능동 면역

본 발명은 닭 병아리(예를 들어, 구이용 병아리) 및/또는 어린 칠면조 백신 접종용으로서 괴사성 장염, 괴사성 피부염 및 괴저 피부염에 대해 능동 면역을 제공함을 포함한다. 병아리 및/또는 새끼는 1회 또는 2회 백신 투여로 약 하루 또는 약간 그 이상(탄생 수주 이내)에서 탄생 초기에 백신 접종된다. 능동 면역을 성취하기 위해 적절한 백신 투여량은 약 0.05ml 내지 약 0.5ml로 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 백신 투여량은 약 0.05ml 내지 약 0.1ml이다.

세포 배양물

클로스트리디움 퍼프린겐스는 증식동안에 알파 독소를 배지로 분비한다. 증식 배지로부터 적어도 대다수의 세포를 불활성화시키고 제거한 후, 수득된 용액은 알파 톡소이드 상등액으로 언급된다. 세포는 일반적으로, 반응성을 촉진시키고 면역 반응을 감소시킬 수 있는, 백신의 외인성 항원을 최소화하기 위해 제거된다. 그러나, 한정된 양의 세포 연합 알파 독소가 있다. 따라서, 알파 독소 항원은 농축되거나 비농축된 형태로, 세포 및/또는 배지로부터 유래할 수 있다.

씨. 퍼프린겐스는 플라스크, 유리병, 단지 또는 기계적 발효기를 포함하는, 임의의 적당한 용기에서 증식할 수 있다. 발효는 증식동안에 모니터하여 알파 독소 생산이 최고점에 있는 경우 발효물을 수거할 수 있다. 전형적인 방법은 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동(PHAST 시스템등), 면역분석, 헤모라이신 및 레시티나제 활성 분석을 포함한다. 세포 배양 유체 또는 세포 추출물은 포름알데하이드(0.1 내지 2.0%) 또는 포름알데하이드와 열의 조합으로 불활성화시킬 수 있다. 전형적으로 단백질 변성을 위해 사용되고 또한 사용될 수 있는 기타 화학 물질은 글루타르알데하이드, 페놀, 다양한 세제(예를 들어, 트리톤 X-100), 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 및 알콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 잔류 포름알데하이드 수준은 불활성화동안에 모니터되어 과도한 무독화(toxoiding) 또는 부족한 무독화 없이 최적의 수준을 유지시킨다. 유리된 포름알데하이드를 측정하기 위한 전형적인 방법은 문헌[참조: 유럽 약전(01/2005:20418) 또는 9 CFR(113.100)]에 기재되어 있다. 기타 유형의 독소 불활성화제를 측정하기 위한 유사한 방법들이 유용하다. 특정 경우에, 알파 독소는 고의적으로 당해 시점에 부족하게 무독화하여 항독소의 개발을 위해 중요한 에피토프의 변성을 최소화함에 이어서 당해 과정의 후반 시점에서 탈독화를 위해 처리된다. 글루타르알데하이드, 페놀, 다양한 세제(예를 들어, 트리톤 X-100), 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 및 알콜과 같은, 독소를 불활성화시킬 수 있는 기타 적합한 화학 또는 생화학 제제가 또한 사용될 수 있다.

수득한 알파 톡소이드는 해로운 효과 없이 임의의 추가 가공전에 특정 시간동안 보관될 수 있다. 전형적으로, 최적의 보관은 2 내지 8℃에서이다. 그러나, 불활성화된 클로스트리디움성 톡소이드는 극히 안정하고 또한 보다 고온에서 보관될 수 있다. 8℃ 온도 이상에서 6개월 이상의 보관 기간동안, 총 배합력 시험(TCP) 또는 기타 유사한 면역학적 분석에 의해 톡소이드의 효능을 재시험하여 톡소이드의 면역원 안정성을 결정하도록 권고될 수 있다.

원심분리 및/또는 여과에 의해 불활성화된 배양 배지로부터 세포를 제거하여 톡소이드 상등액을 수득할 수 있다. 세포의 제거는 세포 성분에 의해 유발될 수 있는 조직 반응성을 감소시키는 작용을 하는 반면, 제제로부터 여분 항원의 제거는 면역 반응이 백신의 톡소이드 성분에 집중되도록 도와준다.

불활성화된 배양 배지는 한외여과(바람직하게, 30,000 분자량 컷-오프 이하의 한외여과 막을 사용) 또는 동결건조를 포함하는 다수의 임의의 수단에 의해 농축될 수 있다. 농축과정은 수용액(예를 들어, 포스페이트 완충 식염수)에 대한 정용여과를 포함하여 제제로부터 저분자량의 오염물을 제거할 수 있다. 농축된 유체는 적합한 분석이 유체의 잔류 독성이 제거되었음을 지적할때까지 포름알데하이드 및/또는 가열로 수회 재처리할 수 있다. 당해 분석은 마우스 생분석, 즉, 유체를 마우스에 주사하고 마우스에 대한 이의 효과를 관찰하거나, 헤모라이신 활성 또는 레시티나제 활성등을 측정하는 것을 포함한다.

용액의 pH는 블렌딩하기 전에 애쥬반트로의 최적의 결합, 오일과의 유화 및/또는 용액의 안정성을 보장하기 위해 재조정될 수 있다. 알파 독소의 등전점(pI)는 약 5.5이다[문헌참조: Smith et al., The Pathogenic Anaerobic Bacteria, (3rd Ed.) Charles Thomas Publishers, p. 116 (1984)]. 톡소이드 용액의 pH 조정은 단백질상의 총 하전량을 변화시키고 이는 알루미늄 애쥬반트와 같은 특정 애쥬반트로의 결합을 증진시키는데 유리하다. pH는 또한 장기간에 걸친 보관동안 알파 톡소이드의 안정성을 증가시키는 수준으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 이들의 pI에서 용액으로부터 침전될 가능성이 높지만 당해 값의 pH 1 단위의 초과 또는 미만에서는 일반적으로 안정하다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA와 같은 핵산을 사용하여 본 발명의 단백질 및/또는 항원, 예를 들어, 알파 독소를 발현하는 재조합 세균 숙주 세포를 제조할 수 있다. 당해 재조합 숙주 세포는 불활성화, 즉 박테린으로 전환될 수 있고 백신과 같은 면역 조성물에 사용될 수 있다.

추가로, 본 발명의 알파 독소 또는 이의 불활성 항원성 단편을 암호화하는 것들을 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 수득 및/또는 작제는 알파 독소, 알파 톡소이드 또는 이의 단편의 제조를 촉진시킬 수 있다. 알파 독소, 알파 톡소이드 및/또는 항원성 단편은 본 발명의 특정 백신을 제조하는데 유용하다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 단백질 및/또는 항원성 단편의 발현 및 분리를 허용하는 핵산 작제물을 포함한다. 본 발명의 당해 측면에서 사용되는 항원의 핵산 및 이에 상응하는 재조합 단백질에 대한 서열은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 백신에 사용될 수 있는 소수의 항원 샘플은 이들의 GenBank 승인번호 및 이들의 아미노산 서열을 기재하는 과학 문헌과 함께 하기에 제공된다.

백신내 사용될 수 있는 항원의 예

¹ 당해 문헌에 제공된 서열은 본원 참조로서 인용된다.

본 발명의 백신에 사용될 수 있는 단백질 항원을 암호화하는 핵산은 이종성 뉴클레오타이드 서열을 추가로 함유할 수 있다. 숙주 세포에서 본 발명의 재조합 단백질을 발현시키기 위해, 상응하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터가 작제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 또는 이의 변이체를 함유하는 발현 벡터를 포함한다.

뉴클레오타이드 암호화 서열의 축퇴성으로 인해, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 기타 뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 수행에 사용될 수 있다. 이들은 대립형질 유전자, 기타 균주 기원의 상동성 유전자 및/또는 서열내 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈의 치환으로 변형되어 사일런트 변화를 생성하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 포함된다. 일반적으로 사용되는 하나의 숙주 세포는 이. 콜리 세포이다.

cDNA의 클로닝 및 이의 상응하는 재조합 단백질의 발현을 위한 일반적인 방법은 문헌[참조: Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)]에 기재되어 있다.

추가로, 당업계에 공지된 돌연변이 유발을 위한 임의의 기술을 사용하여 본 발명의 천연 알파 독소를 변형시킬 수 있고 당해 기술은 시험관내 부위 지시된 돌연변이유발[Hutchinson et ai, J. Biol. Chem., 253:6551 (1978); Zoller and Smith, DNA, 3:479-488 (1984); Oliphant et al., Gene, 44:177 (1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:710 (1986); Wang and Malcolm, BioTechniqυes 26:680- 682 (1999); 이의 전문 내용이 본원에 참조로서 인용됨]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. TAB@ 링커(Pharmacia) 등 및 PCR 기술은 또한 부위 지시된 돌연변이유발을 위해 사용될 수 있다[문헌참조: Higuchi, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70 (1989)].

본 발명의 폴리펩타이드

본 발명은 본 발명의 알파 독소 및 알파 톡소이드, 이의 변이체, 불활성 항원 단편 및 이의 융합 단백질을 포함하는, 분리된 폴리펩타이드 및/또는 재조합 폴리펩타이드를 포함한다. 추가로, 기능적으로 등가인 아미노산 잔기가, 야생형 아미노산 서열내에서 보존성 아미노산 치환이 되게하는 아미노산 잔기로 치환된, 변화된 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 의해 포함된다.

예를 들어, 서열내에 당해 아미노산 잔기중 하나 이상은 기능적 등가물로서 작용하는, 유사한 극성의 또 다른 아미노산으로 치환되어 사일런트 변화를 유발할 수 있다. 당해 서열내 아미노산의 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다.

예를 들어, 비극성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하(염기성) 아미노산은 아르기닌 및 라이신을 포함한다. 음전하(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

특히 바람직한 보존성 아미노산 치환은:

(a) 양전하가 유지될 수 있도록 Arg의 Lys로의 치환 또는 그 반대의 치환;

(b) 음전하가 유지될 수 있도록 Asp의 Glu로의 치환 또는 그 반대의 치환;

(c) 유리 -OH가 유지될 수 있도록 Thr의 Ser로의 치환 또는 그 반대의 치환;

(d) 유리 NH₂가 유지될 수 있도록 Asn의 Gln으로의 치환 또는 그 반대의 치환;

(e) 대략적으로 등가의 소수성 아미노산으로서 Leu 또는 Val의 Ile로의 치환 또는 그 반대의 치환이다.

항원성 단편을 포함하는, 본 발명의 모든 폴리펩타이드는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 특정 양태에서, 융합 단백질은 원핵 세포에서 발현된다. 당해 융합 단백질은 예를 들어, 항원 또는 이의 단편의 항원성을 증진시키거나; 항원성을 상쇄시키지 않으면서 이의 독성을 저하 또는 제거하거나; 본 발명의 항원을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 후자 경우에 융합 단백질의 분리는 항원에 융합된 단백질/펩타이드에 대해 특이적인 친화성 칼럼의 사용으로 촉진될 수 있다. 당해 융합 단백질은 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질, 말토스-결합 단백질(MBP) 융합 단백질, FLAG-태그된 융합 단백질 또는 폴리-히스티딘-태그된 융합 단백질을 포함한다. Ser-Gly 링커와 같은 특이적 링커 서열은 또한 당해 융합 단백질의 일부일 수 있다.

실질적으로, 융합 폴리펩타이드의 발현은 안정한 발현을 촉진시킬 수 있고/있거나 융합 파트너의 성질에 따른 정제를 허용한다. 따라서, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 정제는 친화성 태그를 갖는 융합 단백질을 사용하여 단순화될 수 있다. 예를 들어, GST는 고형 지지체 매트릭스에 접합된 글루타티온에 결합하고 MBP는 말토스 매트릭스에 결합하고 폴리-히스티딘은 Ni-킬레이트화 지지체 매트릭스에 킬레이트된다[문헌참조: Hochuli et al., Biotechnology 6:1321-1325 (1998)].

융합 단백질은 적당한 완충액을 사용하거나 예를 들어, 알파 독소와 이의 융합 파트너 사이에 유전자 조작된 절단 부위에 특이적인 프로테아제로 처리하여 특이적 매트릭스로부터 용출될 수 있다. 또한, 알파 독소는 녹색 형광 단백질과 같은 마커 단백질과 조합될 수 있다[문헌참조: Waldo et al., Nature Biotech. 17:691-695 (1999); U.S. Patent No. 5,625,048 and WO 97/26333, 이의 전문 내용은 본원에 참조로서 인용된다].

대안적으로 또는 추가로, 기타 칼럼 크로마토그래피 단계(예를 들어, 겔 여과, 이온 교환, 친화성 크로마토그래피등)를 사용하여 본 발명의 천연 또는 재조합 폴리펩타이드를 정제할 수 있다(하기 참조). 많은 경우에, 당해 칼럼 크로마토그래피 단계는 보다 통상적인 중력 기반 과정 대신에 고성능 액체 크로마토그래피 또는 유사 방법을 사용한다.

추가로, 알파 독소 및 이의 불활성 항원 단편을 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있다[문헌참조: Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., pp. 382, Grant, ed. (1992)].

일반적인 폴리펩타이드 정제 과정

일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드를 정제하기 위한 초기 단계는 예를 들어, 황산암모늄 분획화; 용매 배출 분획화, 예를 들어 에탄올 침전중에서 염용 또는 염석을 포함할 수 있다. 추가로, 고속 초원심분리를 단독으로 또는 기타 추출 기술과 연계하여 사용할 수 있다.

일반적으로, 우수한 2차 분리 또는 정제 단계는 인산칼슘 겔, 하이드록시애퍼타이트 또는 고형상 결합을 사용한 고형상 흡착을 포함한다. 고형상 결합은 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 디에틸 [2-하이드록시프로필 아미노에틸(QAE) 세파덱스 또는 셀룰로스]과 같은 음이온 교환제 또는 카복시메틸(CM) 또는 설포프로필(SP) 세파덱스 또는 셀룰로스와 같은 양이온 교환제를 사용한 이온 결합을 통해 수행될 수 있다. 고형상 결합의 또 다른 수단은 페닐세파로스와 같은 고형 지지체 및 고염 완충액을 사용한 소수성 상호작용의 사용 및 예를 들어, 활성화된 지지체에 결합된 알파 독소-항체를 사용하는 친화성 결합 면역 결합의 사용을 포함한다. 기타 고형상 지지체는 특이적 염료 또는 렉틴등을 함유하는 것들을 포함한다.

정제 과정 말기에 흔히 사용되는 추가의 고형상 지지체 기술은 세파덱스 및 세파로스 겔과 같은 크기 배척에 의존한다. 또한, 크기 배척 막 필터를 사용하는 가압 또는 원심분리 막 기술이 사용될 수 있다. 흔히 이들 2개의 방법은 번갈아 사용된다.

고형상 지지체 분리는 일반적으로 저속 원심분리 또는 칼럼 크로마토그래피에 의해 배치식으로 수행된다. FPLC로서 당해 관련 기술을 포함하는, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 액체 크로마토그래피를 수행하기 위한 현재 가장 일반적인 수단이다. 크기 배척 기술은 또한 저속 원심분리를 사용하여 성취될 수 있다. 추가로, 겔 전기영동 기술과 같은 크기별 침투 기술이 사용될 수 있다. 이들 기술은 일반적으로 튜브, 슬랩 또는 모세관 전기영동에 의해 수행된다.

폴리펩타이드 정제를 포함하는 거의 모든 단계는 완충 용액을 사용한다. 달리 특정되지 않는 경우, 일반적으로 25 내지 100mM 농도의 완충염을 사용한다. 저농도 완충액은 일반적으로 5 내지 25mM 농도를 의미한다. 고농도 완충액은 일반적으로 농도가 0.1 내지 2.0M 농도인 완충제의 농도를 의미한다. 전형적인 완충액은 대부분의 생화학 카탈로그로부터 구입될 수 있고 트리스, 피로포스페이트, 모노포스페이트 및 디포스페이트와 같은 통상적인 완충액 및 메스(Mes), 헤페스(Hepes), 맙스(Mops), 트리신(Tricine) 및 체스(Ches)와 같은 굿(Good) 완충액을 포함한다[문헌참조: Good et al., Biochemistry, 5:467 (1966); Good and Izawa, Meth. Enzymol., 24B:53 (1972); and Fergunson and Good, Anal. Biochem., 104:300 (1980)]. 모든 이들 기술을 수행하기 위한 재료는 제조원[Sigma Company in St. Louis, Missouri]과 같은 다양한 공급원으로부터 구입할 수 있다.

백신 성분

씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드: 특정 양태에서, 동물 백신은 괴사성 장염으로부터의 보호를 위해 요구되는 최소량의 알파 톡소이드를 함유하는 것이 유리하다. 당해 수준은 하기 예시된 특정 조건하에서 투여당 2 총 배합력 유니트(TCP)인 것으로 결정되었다. TCP 유니트는 국제 표준[문헌참조: Batty, Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Chapter 8, Volume 5A (1971 ) ed. JR Norris and DW Ribbons]을 기준으로 설정되고 본 발명의 백신은 용이하게 블렌딩되어 목적하는 효능을 가질 수 있다. 2 미만의 TCP 유니트는 당해 조건하에서도, 백신이 면역 자극제를 추가로 포함하는 경우 사용될 수 있다. 임의의 경우에, 백신이 동물 혈청 mL당 4 이상의 항독소 유니트를 유발하는 것이 바람직할 수 있다.

알파 톡소이드의 정량: 일반적으로, 최적의 수준이 백신내 포함되는 것을 보장하기 위해 알파 톡소이드를 정량하는 것이 바람직할 수 있다. 톡소이드를 정량하는 한가지 통상적인 방법은 총 배합력(TCP) 시험을 사용하는 것이다. 당해 분석에서, 특정 용적의 알파 톡소이드 상등액을 공지된 양의 항독소 유니트와 접촉시킨다. 항독소와 알파 톡소이드를 결합시키는 적합한 항온처리 기간, 예를 들어, 0.5 내지 2시간을 부여한 후, 공지된 양의 알파 독소를 첨가한다. 이어서 잔류하는 유리된 항독소가 알파 독소와 결합하도록 적합한 기간을 부여한다, 이어서 유리된 알파 독소의 양은 당해 용액에, 알파 독소의 포스포리파제 C 활성에 대한 기질을 첨가함에 의해 측정한다. 적합한 기질은 적혈구(특히 양 적혈구) 및 레시틴을 포함한다. 이어서, 알파 톡소이드는 포스포리파제 C 활성의 양을 근거로 하는 계산을 통해 정량될 수 있다. 분석 용액에 존재하는 알파 톡소이드의 양이 많을 수록, 보다 큰 포스포리파제 C 활성의 양이 당해 분석에서 측정된다. 또한, 당해 측정은 포스포리파제 C 활성을 측정하는 것 없이 수행될 수 있고 예를 들어, 임의의 경쟁 항체 결합 분석이 사용될 수 있고 크로마토그래피 단계, 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA), 또는 바이아코어(Biacore) 장치등에 의한 경쟁 결합 분석의 도입을 포함한다.

추가의 항원: 클로스트리디움성 질환은 흔히 복합 감염으로서 나타나고 따라서, 기타 클로스트리디움 톡소이드의 첨가는 병리학적 및 임상적 징후를 추가로 감소시킬 수 있다. 위장관염을 유발하는 것으로 공지된, 유기체 기원의 기타 클로스트리디움성 톡소이드의 비제한적인 예는 복합 감염에 대한 효능을 증가시키기 위해 본 발명의 백신에 첨가될 수 있는 씨, 퍼프린겐스 기원의 것들을 포함하여, 씨. 퍼프린겐스 베타 독소, 베타 2 독소, 테타 독소, 엡실론 독소, 장독소, 카파 독소, 람다 독소 및 이오타 독소; 씨. 소르델리(C. sordellii) 출혈 독소(HT) 및 치명적 독소(LT), 씨. 디피실 A 및 B 독소; 씨. 셉티쿰 알파 독소; 및 씨. 노비이 알파(A) 및 베타(B) 독소를 포함한다.

기타 세균, 바이러스, 진균류 또는 기생충 기원의 항원은 또한 본 발명의 백신에 포함될 수 있다. 당해 항원은 기타 독소 또는 톡소이드, 세균 및/또는 세균 기원의 추출물; 진균류 및/또는 진균류 기원의 추출물; 바이러스 및/또는 바이러스 단백질; 및/또는 기생충 또는 기생충 기원의 단백질을 포함한다. 본원에 제공된 공급원으로부터의 적당한 바이러스, 세균 및 기생충 항원은 당업계에 널리 공지되어 있다.

세균 유기체의 비제한적인 예는 에스케리치아 콜리, 캄플로박터(Camplobacter) 종, 파스퇴렐라(Pasteurella) 종, 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 클라미디아(Chlamydia), 에리시펠라스(Erysipelas) 종, 파스퇴렐라 종, 보르데텔라(Bordetella) 및 오르니토박테리움(Ornithobacterium)이다.

관련 독소의 비제한적인 예는 백신의 면역학적 반응을 증진시킴에 이어서 씨. 퍼프린겐스의 알파 독소 및 마이코독소에 대한 항독소의 생산을 개선시키는 것으로 공지된 그람 음성 세균 리포폴리사카라이드(LPS)이다.

적절한 바이러스의 비제한적인 예는 코로나바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 엔테로바이러스형 바이러스, 토로바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스, 비르나바이러스, 헤르페스바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 마레크스 질환 바이러스, 출혈성 장염 바이러스 및 뉴캐슬 질환 바이러스이다.

기생충의 비제한적인 예는 코시디아, 예를 들어, 에이메리아 종 및 크립토스포리디아이다[문헌참조: US 2004/0018215A1, 이의 전문 내용이 본원에 참조로서 인용된다].

애쥬반트

애쥬반트는 또한 백신 제제의 면역반응을 개선시키고/시키거나 안정성을 증가시키는데 유용하다. 애쥬반트는 전형적으로 면역계의 비특이적 자극제로서 기재되지만 또한 특정 부분의 면역계를 표적화하는데 유용할 수 있다. 당해 활성을 갖는 하나 이상의 화합물은 백신에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 백신은 애쥬반트를 추가로 포함한다. 애쥬반트로서 사용될 수 있는 화학적 화합물의 예는 알루미늄 화합물(예를 들어, 수산화알루미늄), 대사가능하고 대사가능하지 않은 오일, 미네랄 오일 용액중의 만니드 올리에이트 유도체를 포함하는 무기 오일(예를 들어, 제조원(Seppic SA, France)의 MONTANIDE ISA 70) 및 DRAKEOL 6VR과 같은 경 미네랄 오일, 블록 중합체, ISCOM(면역 자극 복합체), 비타민 및 미네랄(비타민 E, 비타민 A, 셀레늄 및 비타민 B12를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 및 CARBOPOL®을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

때로는 면역 자극제로서 언급되는 기타 적합한 애쥬반트는 사이토킨, 성장 인자, 케목킨, 림프구 세포 배양물로부터의 상등액, 단핵구, 림프 기관 기원의 세포, 세포 제제 및/또는 식물, 세균 또는 기생충 기원의 추출물(스타필로코커스 아우레우스 또는 리포폴리사카라이드 제제) 또는 미토겐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일반적으로, 애쥬반트는 본 발명의 항원과 동시에 투여된다. 그러나, 또한 애쥬반트는 백신 접종하기 2주 이내에 및/또는 백신 접종 후 특정 시간동안, 예를 들어, 알파 톡소이드가 조직에 잔류하는 한 투여될 수 있다.

백신의 제조

본 발명의 백신을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 한 양태에서, 백신은 본 발명의 항원, 예를 들어, 단일 씨. 퍼프린겐스 유형의 알파 톡소이드 상등액과 약제학적으로 허용되는 애쥬반트의 안전하고 면역학적 유효량의 배합물을 블렌딩함을 포함한다. 알파 톡소이드의 양은 백신의 투여당 2이상의 총 배합력(TCP) 유니트를 함유하도록 정량될 수 있다. 알파 톡소이드 상등액은 백신 접종된 동물 기원의 항혈청 ml당 4.0 이상의 항독소 유니트(A.U.)를 수득하는데 요구되는 투여 크기를 최소화하기 위해 농축될 수 있다. 기타 약제학적으로 허용되는 면역 조절제의 첨가는 백신 접종이 여전히 백신 접종된 동물 기원의 항혈청 ml당 요구되는 4.0 A.U.의 항-알파 독소 항체를 수득하는 한, 투여당 2유니트 미만이 되도록 TCP 요구량을 감소시킬 수 있다. 특정 양태에서, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드는 추가로 농축/한외여과, 크로마토그래피 및 원심분리에 제한되지 않는 당해 기술에 의해 알파 톡소이드 상등액으로부터 정제된다.

백신의 투여

백신은 액체, 유제, 무수 분말 및/또는 임의의 비경구 경로를 통한 연무, 임의의 비경구 경로, 정맥내, 복강내, 표피내, 난절법, 피하내, 근육내 또는 예를 들어, 경구, 비강과 같은 점막 경로에 의한 접종, 에어로졸, 안구 적가, 난내 투여 또는 동결 건조 분말로서 이식으로 투여될 수 있다.

동물 피검체

용어 "동물 피검체"는 병원성 세균에 의해 감염될 수 있는 동물 종을 언급하고 특정 양태에서, 사람을 포함한다. 적합한 동물 피검체는 또한 야생동물, 가축(예를 들어, 고기, 우유, 버터, 달걀, 모피, 가죽, 깃털 및/또는 양모를 위해 사육되는), 짐운반 짐승, 연구용 동물, 애완 동물, 및 동물원, 야생 거주지 및/또는 서커스를 위해/에서 사육되는 것들을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명의 동물 피검체는 "식품 생산" 동물이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "식품 생산" 동물은 소비용(예를 들어, 칠면조, 구이용 닭) 또는 사람에 의한 소모품(예를 들어, 젖소, 산란 암탉등)용의 모든 동물 및/또는 기타 동물을 포함하는 것으로 이해된다. 당해 동물의 비제한적인 목록은 사육 조류, 즉, 닭, 칠면조, 거위, 오리, 타조등, 암소(예를 들어, 소, 젖소, 버팔로), 양(예를 들어, 염소 또는 숫양), 돼지(예를 들어, 멧돼지, 수컷돼지 또는 어린돼지) 및 말(예를 들어, 수말)을 포함한다.

또 다른 양태에서, 동물 피검체는 애완 동물이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "애완" 동물은 집고양이(고양잇과), 개(개과), 토끼종, 수말(말), 설치류(예를 들어, 기니피그, 다람쥐, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐 및 햄스터), 영장류(예를 들어, 원숭이), 및 집비둘기, 비둘기, 앵무새, 소형앵무새, 마코앵무, 카나리아등과 같은 조류를 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명의 백신이 유익할 수 있는 것으로 고려되는 기타 동물은 유대동물(예를 들어, 캥거루), 파충류(예를 들어, 사육 거북이), 사냥감 새, 백조, 주조류 및 기타 경제적으로 중요한 가축을 포함한다.

하기의 실시예는 단지 본 발명을 예시하고자 한 것이지 어떠한 방식으로든지 발명의 범위를 제한시키는 것으로 해석되지 말아야 한다.

실시예 1

피하 경로에 의해 백신 접종된 구이용 암탉에서 백신의 효능

요약

단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드(A형)를 포함하는 백신을 사용한 피하 경로에 의한 구이용 암탉의 백신 접종은 (i) 백신 접종된 구이용 암탉에서 면역원성 반응, (ii) 백신 접종된 구이용 암탉의 알에서 상당한 항-알파 톡소이드 항체 및 (iii) 백신 접종된 구이용 암탉의 이후 출생된 후손의 수동 보호를 유발한다.

재료

씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드: 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드는 하기와 같이 제조한다: 씨. 퍼프린겐스 A형 배양물은 37℃ ±2의 온도에서 대형 발효기(5000L)에서 혐기적 조건하에 증식시킨다. 발효 동안에 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 7.8 ±2로 유지한다. 발효 동안에 또한 탄수화물(덱스트린)을 첨가(1% w/v 이하)하여 증식을 촉진시킨다. 배양물을 3 내지 6시간동안 증식시킨다. 증식 말기에, 포름알데하이드 용액을, 최종 수준이 0.5%를 초과하지 않도록 발효기에 첨가한다. 세포는 원심분리에 의해 제거하고 수득한 상응액은 공극 크기의 범위가 0.25 내지 2.0㎛인 포집 필터로 여과한다. 온도는 당해 과정동안에 5℃ 내지 3℃로 유지한다. 이어서 불활성화된 배양 상등액을 정용여과하고 분자량 컷오프가 20,000 분자량 미만인 필터에 의한 한외여과를 사용하여 10 내지 30배 농축시킨다. 농축된 상등액을 향후 백신으로 블렌딩하기 위해 2 내지 8℃에서 보관한다. 블렌딩하기 전에, 농축된 상등액은 상기된 배합력 시험(TCP)를 사용하여 효능에 대해 분석한다. 톡소이드 각 배치의 효능을 ml당 TCP 유니트로 할당한다.

백신: 불활성화된 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드를 포함하는 상등액은 ml당 4 배합력 유니트(TCP)를 함유하는 유중수 유제로서 블렌딩한다. 유제는 70% 오일상 및 30% 수성상으로 제조한다.

오일상은 하기와 같이 제조한다:

미네랄 오일 89.20%

Span 80 10.00%

벤질 알콜 0.75%

트리에탄올아민 0.05%

수성상은 하기와 같이 제조한다:

씨. 퍼프린겐스 A형 톡소이드 + 식염수 88%

33% 트윈 80/식염수 용액 12%

총 30% 수성상을 70% 오일상에 서서히 첨가하고 실버슨(Silverson) 균질화기로 유화시킨다(다른 인라인 균질화기가 또한 사용될 수 있다). 균질화 시간은 유제 용적에 의존하고 점도, 입자 크기 및 유제의 안정성에 의해 37℃에서 3일 이상동안 측정한다. 젠타마이신을 수성상에 첨가하여 최종 농도가 30㎍/ml 이하의 연속 용적이 되도록 한다. 티머로솔을 수성상에 첨가하여 최종 농도가 0.01% 이하의 연속 용적이 되도록 한다.

백신 접종: 블렌딩된 백신을 투여당 0.5ml로 어린 암탉의 피하내로 백신 접종한다. 제1 백신 투여량을 14주 나이에서 투여하고 제2 투여량은 20주 나이에서 투여한다. 20마리의 구이용 어린 암탉에 투여당 1TCP를 함유하는 상기된 블렌딩된 백신을 접종한다. 제2 그룹의 20마리의 어린 암탉에 투여당 2TCP를 함유하는 상기된 블렌딩된 백신을 접종한다. 제3 그룹의 20마리의 어린 암탉을 대조군으로서 사용하고 백신 접종하지 않는다. 총 2 내지 3마리의 수탉을 각 그룹의 어린 암탉과 섞어서 수정된 알을 생산한다.

수동 면역

32, 52 및 65주된 백신 접종된 암탉 및 대조군 암탉으로부터 알을 수거한다. 이들 알로부터 부화된 후손 병아리를 사용하여 표 1에 기재된 바와 같이 수동 보호 를 평가한다.

각 시점에서 사용되는 후손 병아리의 수

암탉의 나이	백신 접종된 그룹에서 후손 병아리	챌린지 대조군 그룹에서 후손 병아리
32주	9	9
52주	30	20
65주	14	18

병아리에 첫 2주동안 약물처리되지 않은 고단백질 음식물을 먹이고 이어서 남은 시험 가간동안 정상적인 사료로 전환한다. 각각의 새에 알파 독소와 베타 2 독소 둘다를 발현하는 독성 씨. 퍼프린겐스 A형을 경구로 챌린지한다. 챌린지 투여량은 3ml의 투여량에서 ml당 6.3 x 10⁷ 내지 6.3 x 10⁸ 콜로니 형성 유니트를 함유한다. 18일 또는 19일 나이에서 시작하여 3일 연속으로 새에 챌린지한다. 챌린지 마지막 날 2일 후에 새를 희생시키고 이어서 괴사성 장염 병변에 대해 조사한다. 후손 병아리에 대한 효능 결과는 각각, 각각의 병아리 모계의 백신 접종 상태 및 임의의 경우 하기에 제공된 등급 스케일에 따른 괴사성 장염 병변의 정도를 나타내는 표 2 내지 4에 기재한다. 표 2는 32주된 암탉 기원의 후손 병아리를 나타내고 표 4는 65주된 암탉 기원의 후손 병아리를 나타낸다. 표 5는 투여당 2 TCP로 백신접종된 암탉 기원의 후손 병아리에 대한 평균 스코어를 보여준다. 보여지는 바와 같이, 백신 접종된 암탉의 후손은 백신 접종되지 않은 암탉의 후손에 비하여 투여된 세균 챌린지로부터 상당히 보호된다.

괴사성 장염(NE) 병변에 대한 등급 스케일

0 = 소장에서 어떠한 괴사성 장염 전체 병변이 나타나지 않음; 장은 정상적인 유연성(개방된 후 그자체가 원상태로 감긴다)을 갖는다.

1 = 얇고 늘어진 장 벽(장이 개방된 경우 평평하게 남아있고 원위치로 다시 감기지 않는다): 점막을 덮는 과량 또는 점성의 점액 또는 점막의 국부 또는 다국부적인 약한 홍조 또는 혈관의 출혈.

2 = 단일 또는 극소수의 다국부적 면적의 장 벽의 홍조 및 종창; 장 점막의 단일 또는 소수의 다국부적 면적의 궤양 또는 괴사.

3 = 장 점막의 확대된 다국부적 면적의 괴사 및 궤양 ± 점막 표면상의 상당한 출혈 또는 섬유 층 또는 괴사 잔해(터키쉬 타월 출현).

4 = 2 이상으로 스코어된 괴사성 장염 전체 병변을 갖는 죽은 동물.

항체 역가

혈청: 혈액 샘플은 33주 및 78주 나이의 암탉에서 채혈한다. 실온에서 2 내지 4시간동안 혈액을 응고시킴에 이어서 원심분리 후 혈청을 수득한다. 혈청은 항체 역가에 대해 시험될때까지 -10℃ 이하에서 보관한다. 씨. 퍼프린겐스 알파 독소에 대한 항체 역가는 하기와 같은 연속 희석 및 양 적혈구를 사용한 용혈 억제 분석에 의해 평가한다: 연속 희석(2배)은 시험된 각 샘플에 대해 V-바닥 미세역가 플레이트에서

수행한다. 공지된 양의 알파 독소를 희석된 샘플을 함유하는 각 웰에 첨가한다. 이어서 플레이트를 36 ±2℃에서 1시간동안 항온처리하여 혈청으로부터 수득된 항체가 알파 독소와 복합체를 형성하도록 한다. 당해 항온처리 후, 0.5% 용액의 양 적혈구를 웰에 첨가하고 플레이트를 3시간동안 36℃ ±2℃에서 항온처리하여 복합체를 형성하지 않은 알파 독소가 적혈구를 용해시키도록 한다. 이어서 플레이트를 용혈 부재에 대해 검사한다. 어떠한 용혈도 나타내지 않는 시험 샘플의 최고 희석값의 역수가 종점으로서 간주된다. 항체 역가는 표 6 내지 8에 나타낸다.

난황: 난황을 처리하여 항체 역가를 측정한다. 간략하게, 난황을 분리하고 시판되는 추출 완충액(Promega EGGstract System®, Promega Catalog No. G1531 and G2610, Madison, Wisconsin)과 혼합한다. 추출 후, IgY 펠렛을 수득하고 이어서 본래 용적의 난황으로 인산 완충 식염수와 함께 재현탁시킨다. 난황 추출물을 5개 이상의 알로부터 모으고 상기 혈청에 대해 기재된 바와 같은 용혈 억제(HI) 분석을 사용하여 항체 역가에 대해 시험한다. 40, 52 및 65주된 나이의 층으로부터 수거된 난황은 상기 방식으로 항체에 대해 평가한다. 난황에 대한 항체 역가는 표 9에 나타낸다.

^*2 미만의 값은 기하학적 평균을 계산할 목적으로 1로서 간주된다.

실시예 2

근육내 경로에 의해 백신 접종된 구이용 암탉에서 백신의 효능

요약

수동 면역

총 14마리의 구이용 어린 암탉에, 2 TCP를 함유하는, 상기 실시예 1의 백신 0.5ml의 2개 투여량을 근육내 백신 접종한다. 추가 그룹의 40마리의 어린 암탉을 대조군으로서 사용한다. 3마리의 수탉을 상기된 바와 같이 각 그룹의 어린 암탉과 섞는다. 제1 투여량의 백신을 10주 나이에 투여하고 제2 투여량을 23주 나이에 투여한다. 32주 나이의 암탉으로부터 알을 수거하고 부화시켜 실험적 씨. 퍼프린겐스 챌린지 후 후손 병아리에서 수동 보호를 측정한다.

표 10은 백신 접종된 암탉 및 대조군 암탉의 후손 병아리에 대해 상기 실시예 1의 등급 스케일에 의해 측정된 바와 같은 상응하는 병변에 대한 괴사성 장염의 발생 건수 및 메디안 스코어를 나타낸다. 표 11은 개개의 후손 병아리의 괴사성 장염 병변에 대한 메디안 스코어를 보여준다. 표 12는 개개의 후손 병아리의 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 독소에 대한 항체 역가를 나타내는 반면, 32주 나이에서 백신접종된 암탉 및 대조군 암탉으로부터 수거된 난황에 대한 항체 역가는 표 13에 나타낸다.

² 상기 실시예 1에서 기술한 용혈 억제 분석에 의해 측정된 바와 같은 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 독소에 대한 항체.

³ 2 미만의 값은 기하학적 평균을 계산할 목적으로 1로서 간주하였다.

기하학적 평균 = 681 ≤ 2

실시예 3

피하 경로에 의해 백신 접종된 SPF 백색 레그혼 어린 암탉에서 혈청학

항체 역가

항체 역가는 1, 2 또는 3 TCP를 함유하는 상기 실시예 1의 백신으로 피하내 백신 접종된 SPF 백색 래그혼 어린 암탉에서 평가한다. 어린 암탉은 15주 나이에서 0.5ml의 백신으로 백신 접종하고 부스터 투여량을 백신 접종을 개신하지 4주째에 투여한다. 혈액 샘플은 부스터 백신 접종한지 6주째에 수거한다. 각 개개의 새 기원의 혈청은 실시예 1에 기재된 바와 같은 용혈 억제 분석에 의해 항체 역가에 대해 평가한다.

^*2미만의 역가는 기하학적 평균 역가를 측정하기 위해 1로서 간주한다.

백색 레그혼 층으로부터 25주 나이에 수거된 알에서 항체 역가는 용혈 억제 역가에 대해 평가한다. 결과는 표 15에 나타낸다.

백색 레그혼 암탉으로부터 모은 혈청에서 독소 중화 역가(TNT)의 측정

암탉으로부터 모은 혈청에서 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 독소에 대한 항독소 역가는 마우스를 사용하여 평가한다. 모은 혈청은 문헌[참조: Code of Federal Regulations, Animal and Plant Health Inspection Service, Department of Agriculture]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 항독소 역가에 대해 시험한다. 당해 항독소를 측정하는데 사용되는 방법은 현재 9CFR §113.111(c)와 유사하고 단, 알파 독소와 항독소 시약이 베타 독소와 항독소 대신 사용된다. 하기의 시험 시약을 사용하여 항독소 역가를 측정한다:

1) 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 항독소: IRP 426(제조원(Center for Veterinary Biologies, USDA)으로부터 수득함).

2) 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 독소 IRP 446(제조원(Center for Veterinary Biologies, USDA)으로부터 수득함).

간략하게, 희석된 표준 항독소 또는 혈청은 공지된 양의 표준 알파 독소와 배합한다. 이어서 비중화된 독소의 존재는 혼합물을 마우스에 주사하여 검출한다. 이어서 독소 활성에 대한 공지된 양의 표준 알파 항독소 효과에 대한 비교는 생분석에서 마우스를 죽음으로부터 보호하는 표준 또는 시험 혈청의 희석값을 측정하여 평가한다. 백색 레그혼 어린 암탉으로부터 모은 혈청에서 항독소 역가는 하기 표 16에 나타낸 바와 같다.

실시예 14

근육내 경로에 의해 백신 접종된 SPF 백색 레그혼 어린 암탉에서 혈청학

항체 역가

1, 2 또는 3 TCP를 함유하는, 상기 실시예 1의 백신이 2회 근육내로 접종된 SPF 백색 레그혼 어린 암탉에서의 항체 역가를 평가한다. 어린 암탉은 백신 0.5ml로 10주째에 백신 접종하고 부스터 투여량을 백신 접종 개시한지 4주째에 투여한다. 부스터 백신 접종후 7주째에 혈액 샘플을 수거한다. 각각의 어린 암탉 혈청은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 용혈 억제 분석에 의해 항체 역가에 대해 평가하고 하기 표 17 및 표 18에 나타낸다.

^* 2 미만의 역가는 기하학적 평균 역가를 측정하기 위해 1로서 간주한다.

암탉으로부터 모은 혈청에서 독소 중화 역가(TNT)는 상기 실시예 3에 기재된 바와 같은 과정을 사용하여 평가하고 결과는 하기 표 18에 나타낸다.

당해 백색 레그혼 층으로부터 25주 나이에서 수거된 알에서 항체 역가는 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 용혈 억제 역가에 대해 평가한다. 당해 결과는 하기의 표 19에 요약되어 있다.

실시예 5

돼지에서 다가 및 1가 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 비교

요약

본 발명의 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드 백신으로 임신한 암퇘지/어린 암퇘지를 백신 접종하여 신생 돼지에서 수동 보호를 제공하는 방법을 기재한다. 당해 결과는 초유를 통해 어린 돼지에게 전달될 수 있는 암퇘지에서의 항체 반응을 보여준다.

재료

씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드: 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드는 상기 실시예에 기재된 바와같이 제조한다.

백신: 본 발명의 백신은 2 미만의 총 배합력 유니트를 함유하는 불활성화된 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드와 블렌딩할 수 있다. 당해 백신은 미네랄 오일, 식물성 오일(땅콩 오일, 대두 오일), 스쿠알렌, 스쿠알렌 및 기타 대사 가능한 오일을 함유하는 수중유 유제를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 애쥬반트와 블렌딩할 수 있다. 세포닌, CARBOPOL®과 같은 애쥬반트 및 알루미늄 함유 애쥬반트(수산화알루미늄, 인산알루미늄)은 또한 백신 제제에 사용될 수 있다. 백신은 추가로 이. 콜리(K88, K99, 987P, 1형); 씨. 퍼프린겐스로부터의 톡소이드; 및/또는 클로스트리디움 디피실을 포함하는 기타 병원성 세균 , 로타바이러스 및/또는 크립토스포레디아 기원의 톡소이드를 포함하는 기타 항원을 함유한다.

투여

백신은 분만하기 전에 초유 주입을 통해 신생 돼지에서 수동 면역을 제공하기 위해, 근육내 또는 피하 경로로 임신한 암퇘지/어린 암퇘지에 투여한다.

결과

당해 연구는 3개의 백신을 비교하는 32주된 돼지에서 수행한다:

백신 #1: 2ml 용량중에 4 TCP의 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드를 함유하는 수산화알루미늄 애쥬반트와 블렌딩함.

백신 #2: 2ml의 용량중에 4TCP의 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드, 이. 콜리 K88, 이. 콜리 K99, 이. 콜리 987P, 이. 콜리 1형 및 씨. 퍼프린겐스 C형 베타 톡소이드와 블렌딩함.

백신 #3: 어떠한 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드를 함유하지 않지만 2ml의 용량중에 이. 콜리 K88, 이. 콜리 K99, 이. 콜리 987P, 이. 콜리 1형 및 씨. 퍼프린겐스 C형 베타 톡소이드를 함유하는 위약 백신으로서 제조함.

10마리 돼지의 1개 그룹을 2ml의 백신 #1로 근육내로 백신 접종한다. 10마리 돼지의 제2 그룹은 2ml의 백신 #2로 근육내로 백신 접종한다. 7마리 돼지의 제3 그룹은 2ml의 백신 #3으로 백신 접종한다. 2ml의 부스터 용량을 초기 백신 접종 후 20일째에 투여한다. 혈청 샘플은 초기 백신 접종(0일)시, 부스터 백신 접종 후 20일째(40일) 및 부스터 백신 접종 후 41일째(61일)에 수거한다. 이어서 혈청 샘플은 상기 실시예 1에 기재된 용혈 억제 분석에 의해 알파 독소에 대한 항체 역가에 대해 평가한다. 3개의 백신에 대한 결과는 각각 표 20 내지 22에 나타낸다.

실시예 6

백신 접종된 암퇘지로부터 모은 혈청에서 독소 중화 역가(TNT)의 측정

4마리의 임신한 암돼지를 고르게 2개의 처리군으로 나눈다. 한 그룹은 상기 실시예 5의 백신 #1의 2ml 용량중에 4 TCP를 함유하는 2.0ml의 백신으로 근육내 경로에 의해 백신 접종한다. 기타 그룹은 백신 접종되지 않은 대조군이다. 암퇘지는 분만하기 전 약 6 내지 7주째에 백신 접종하고 부스터 투여량은 이후 3주째에 투여한다. 백신 접종 전 및 분만하기 바로 전에 혈액 샘플을 채취한다. 표 23은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같은 독소 중화 시험(TNT)를 사용한 알파 독소에 대한 항독소 역가에 대해 혈청 샘플을 평가한 것을 보여준다.

본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 의해 이의 범위가 제한되지 말아야 한다. 실질적으로, 본원에 기재된 것 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변형이 이전의 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다. 당해 변형은 첨부된 청구항의 범위이내에 속하는 것으로 의도된다.

추가로, 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적인 것이고 기술할 목적으로 제공된 것으로 이해되어야만 한다. 다양한 문헌이 본원에 인용되어 있고 이의 내용은 본원에 참조로서 인용된다.

Claims

씨. 퍼프린겐스(C. perfringens) 알파 톡소이드, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드의 항원 단편, 씨. 퍼프린겐스 알파 독소의 불활성 항원 단편, 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원을 포함하고,

백신 투여당 0.25 내지 0.6ml의 1회 또는 2회 투여가, 당해 백신으로 백신 접종된 닭 항혈청 ml당 항-알파 독소 항체의 4 이상의 항독소 유니트(A.U.)를 유도하기에 충분한 백신.
제1항에 있어서, 항원이 세포 부재 제제중에 존재하는 백신.
제1항에 있어서, 항원이 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액중의 알파 톡소이드인 백신.
제1항에 있어서, 항원이 재조합 폴리펩타이드인 백신.
제1항에 있어서, 항원이 2 이상의 TCP를 갖는 백신.
제1항에 있어서, 항원이, 씨. 퍼프린겐스 A형 알파 톡소이드 및 씨. 퍼프린겐스 C형 알파 톡소이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신.
제1항에 있어서, 애쥬반트를 추가로 포함하는 백신.
제7항에 있어서, 유중수 유제가 항원 및 애쥬반트를 포함하는 백신.
제8항에 있어서, 유중수 유제가 70% 오일상 및 30% 수성상으로 제조되는 백신.
제1항에 있어서, 항원이 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드이고 단, 단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드만이 백신중에 존재하는 백신.
제10항에 있어서, 알파 톡소이드가 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액에 의해 포함되는 백신.
제1항에 있어서, 씨. 퍼프린겐스 베타 독소, 씨. 퍼프린겐스 베타 2 독소, 씨. 퍼프린겐스 장독소, 씨. 퍼프린겐스 엡실론 독소, 씨. 퍼프린겐스 이오타 독소, 씨. 퍼프린겐스 카파 독소, 씨. 퍼프린겐스 람다 독소, 씨. 퍼프린겐스 테타 독소, 씨. 소르델리(C. sordellii) 출혈성 독소, 씨. 소르델리 치명적 독소, 씨. 디피실(C. difficile) A 독소, 씨. 디피실 B 독소, 씨. 셉티쿰(C. septicum) 알파 독소, 씨. 노비이(C. novyi) 알파 독소 및 씨. 노비이 베타 독소중 하나 이상을 추 가로 포함하는 다가 백신인 백신.
제12항에 있어서, 다가 백신이,

감염성 낭 질환 바이러스(infectious bursal disease virus), 감염성 기관지염 바이러스, 레오바이러스 및 뉴캐슬 질환 바이러스의 공급원중 하나 이상으로 부터 기원하는 하나 이상의 바이러스 항원,

이. 콜리, 살모넬라(Salmonella) 및 캄필로박터(Campylobacter)의 공급원중 하나 이상으로부터 기원하는 하나 이상의 세균성 항원 및

에이메리아(Eimeria) 기원의 하나 이상의 기생충 항원

을 추가로 포함하는 백신.
제1항에 있어서,

감염성 낭 질환 바이러스, 감염성 기관지염 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스, 이. 콜리, 살모넬라, 캄필로박터 및 에이메리아의 공급원중 하나 이상으로부터 기원하는 하나 이상의 부가 항원을 추가로 포함하는 다가 백신인 백신.
단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드, 알파 톡소이드의 항원성 단편, 단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 독소의 불활성 항원 단편 및 이의 임의의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원으로 필수적으로 이루어지고,

단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 톡소이드 및 단일 씨. 퍼프린겐스 알파형 독소의 불활성 항원 단편이 동일 유형이고,

백신 투여당 0.25 내지 0.6ml의 1회 또는 2회 투여가, 당해 백신으로 백신 접종된 닭 항혈청 ml당 항-알파 독소 항체의 4 이상의 항독소 유니트(A.U.)를 유도하기에 충분한 백신.
암컷 조류가, 다중 질환에 대한 수동 면역이 제공되는 후손을 포함하는 알을 낳기 전에, 당해 암컷 조류에게 제13항에 따른 백신을 투여함을 포함하는, 암컷 조류의 후손에 다중 사육 조류 질환에 대한 수동 면역을 제공하는 방법.
암컷 조류가, 수동 면역이 제공되는 후손을 포함하는 알을 낳기 전에, 당해 암컷 조류에게 제1항에 따른 백신을 투여함을 포함하는, 암컷 조류의 후손에 클로스트리디움성 질환에 대한 수동 면역을 제공하는 방법.
제17항에 있어서, 조류가 닭 또는 칠면조인 방법.
제17항에 있어서, 클로스트리디움성 질환이 클로스트리디움성 장 질환인 방법.
제19항에 있어서, 클로스트리디움성 장 질환이 괴사성 장염인 방법.
제17항에 있어서, 클로스트리디움성 질환이 담관간염, 괴저성 피부염 및 봉와염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
(a) 배양 배지에서 씨. 퍼프린겐스 세포를 증식시켜, 씨. 퍼프린겐스 알파 독소를 세포 배지로 분비하는 특정 양의 배양 세포를 생성시키는 단계;

(b) 분비된 알파 독소를 불활성화시켜 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드를 생성시키는 단계;

(c) 배양 배지로부터 대다수의 배양 세포를 제거하여 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액을 형성시키는 단계 및

(d) 백신 투여당 0.25 내지 0.6ml의 1회 또는 2회 용량으로 백신 접종된 조류의 항혈청 ml당 항-알파 독소 항체의 4 이상의 항독소 유니트(A.U.)를 유도하기에 충분하도록 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액의 농도를 조정하는 단계

를 포함하는, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 백신을 제조하는 방법.
제22항에 있어서, 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 상등액을 유중수 유제와 혼합함을 추가로 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 유중수 유제가 70% 오일상 및 30% 수성상으로 제조되는 방법.
제24항에 있어서, 씨. 퍼프린겐스 세포가 단일 씨. 퍼프린겐스 유형 세포인 방법.
제25항에 있어서, 단일 씨. 퍼프린겐스 유형 세포가 씨. 퍼프린겐스 A형 세포 및 씨. 퍼프린겐스 C형 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.