BR102017011560A2 - processo de produção simples de vacinas recombinantes para animais contra toxinas alfa, beta e épsilon de clostridium perfringens e vacinas obtidas - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se à produção e uso de bacterinas, lisados celulares e antígenos purificados, obtida via tecnologia do dna recombinante, como vacinas ou componentes de formulações vacinais contra toxinas alfa (cpa), beta (cpb) e épsilon (etx)de clostridium perfringens em animais. genes sintéticos e nativos que codificam para as toxinas cpa, cpb e etx foram clonados em vetor de expressão e utilizados para transformar cepas de escherichia coli. após a expressão dos antígenos recombinantes, as culturas foram inativadas (vacina 1), lisadas (vacina 2) ou processadas para obtenção dos antígenos recombinantes purificados (vacina 3), os quais, separadamente, foram adsorvidos em hidróxido de alumínio e usados como vacina para a prevenção de enfermidades causadas pelas toxinas cpa, cpb e etx de c. perfrigens. as formulações vacinais induziram títulos de anticorpos neutralizantes acima do preconizado pelo ministério da agricultura, pecuária e abastecimento (mapa). portanto, vacinas produzidas pela tecnologia do dna recombinante utilizadas na forma não purificada diminuem os custos de produção e consequentemente são uma alternativa viável para utilização em medicina veterinária.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

PROCESSO DE PRODUÇÃO SIMPLES DE VACINAS RECOMBINANTES PARA ANIMAIS CONTRA TOXINAS ALFA, BETA E ÉPSILON DE Clostridium perfringens E VACINAS OBTIDAS

Campos da invenção [001] A presente invenção refere-se à produção e uso de bacterinas, lisados celulares e antígenos purificados, obtidos via tecnologia do DNA recombinante, como vacinas ou componentes de formulações vacinais contra toxinas alfa (CPA), beta (CPB) e épsilon (ETX) de Clostridium perfringens em animais. Genes sintéticos e nativos que codificam para as toxinas CPA, CPB e ETX foram clonados em vetor de expressão e utilizados para transformar cepas de Escherichia coli. Após a expressão dos antígenos recombinantes, as culturas foram inativadas (vacina 1), lisadas (vacina 2) ou processadas para obtenção dos antígenos recombinantes purificados (vacina 3), os quais, separadamente, foram adsorvidos em hidróxido de alumínio e usados como vacina para a prevenção de enfermidades causadas pelas toxinas CPA, CPB e ETX de C. perfrigens. Três aspectos da presente invenção destacam-se: 1- processo de produção simples, que não requer purificação (vacinas 1 e 2) e detoxificação (vacinas 2 e 3); 2- biossegurança, visto que os antígenos produzidos apresentam reduzida toxicidade e; 3- geração de títulos de anticorpos neutralizantes superiores aos preconizados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento(MAPA).

Fundamentos para a invenção [002] O agronegócio é a principal locomotiva da economia brasileira, onde as exportações desse setor somaram US$ 9,11 bilhões em julho deste ano, o que representou 49,2% do total das vendas externas do país no mês de junho. Já as

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2/39 importações totalizaram US$ 1,15 bilhão, com retração de

23,7% em relação ao mesmo período de 2014. Com isso, o saldo da balança comercial do setor foi de US$ 7,96 bilhões

em julho	(Brasil,	2015). Dentre	os	segmentos	do
agronegócio,	a bovinocultura é	responsável	por	um
faturamento	superior	a 60 bilhões	de	reais	ao	ano,

oferecendo mais de 7,5 milhões de empregos nas cadeias produtivas de carne e leite, o que evidencia a importância econômica e social desta atividade para o país (IBGE, 2015). O crescimento da bovinocultura no cenário internacional tem se destacado nas últimas décadas, sendo que, em 2014, o Brasil manteve-se como maior exportador mundial de carne bovina, com 1,56 milhão de toneladas e faturamento de US$ 7,2 bilhões, acompanhando o aumento da demanda por proteína animal, permitindo também alcançar o posto de 2° maior produtor mundial de carne bovina. As perspectivas não só para 2015, como para o médio prazo, são de manutenção do País no topo do ranking (SBA, 2015).

[003] No entanto, alguns problemas sanitários como infecções por Clostrídíum perfringens geram sérios prejuízos á atividade pecuária, causando enfermidade de evolução extremamente rápida nos rebanhos animais com medidas terapêuticas por vezes impraticáveis.

[003] Clostrídíum perfringens é um bacilo Gram-positivo, produtor de esporos, com motilidade mediada por fímbrias (Songer, 1996; Varga et al., 2006) e membro do gênero Clostridium descrito como microaerófilo, e não anaeróbio estrito como os demais (McClane et al., 2006) . É ubíquo na natureza e comensal do trato gastrointestinal de humanos e animais (Hatheway, 1990; McClane et al., 2006; McClane, Robertson et al., 2013). Até o momento, foram descritas 17 exotoxinas produzidas por esse patógeno: toxina-α, -β, -β2, -γ, -δ, -ε, -η, -θ, -ι, -κ, -λ, -μ, -ν, neuraminidase, sialidase, enterotoxina, e hemolisina não α-δ-θ. Dentre

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3/39 essas, quatro são consideradas principais (toxina-α, -β, ε, e -ι) e utilizadas para agrupar a espécie em cinco tipos (A, B, C, D e E) conforme o perfil de produção dessas quatro toxinas (Nillo, 1980; Li et al., 2013). Cada tipo de C. perfringens está relacionado com doenças em diversas espécies (Uzal et al., 2010). A infecção em animais ocorre de duas formas principais: (1) via iatrogênica/traumática (C. perfringens tipo A), causando toxiinfecção principalmente em tecidos musculares, em decorrência de soluções de continuidade na pele provocadas de forma acidental ou iatrogênica, denominadas gangrena gasosa ou edema maligno; e (2) via gastrointestinal, que ocorre pela ingestão de toxinas, esporos dos patógenos (tipos A-E) ou por alterações na microbiota intestinal consequentemente multiplicação excessiva de C. perfringens e produção de toxinas (α, -β, -ε e -ι), levando a enfermidades gastrointestinais entre as quais, toxiinfecção alimentar, enterite necrótica ou hemorrágica, enterocolite e enterotoxemia em diversas espécies (Shreya et al., 2015).

[004] O gene cromossômico plc responsável por codificar CPA, é encontrado em todos os toxinotipos de C. perfringens, a expressão ocorre em níveis elevados no toxinotipo A e em níveis basais nos demais (Titball et al. 1999). CPA é uma proteína de aproximadamente 43 kDa constituída de 370 aminoácidos (Uzal et al., 2010), sendo o domínio N-terminal (1-246) com atividade hemolítica, esfingomielinase e lecitinase, e C-terminal (247-370) responsável pelo reconhecimento da membrana da célula hospedeira. (Flores-Díaz & Alape-Girón, 2003; Sakurai et al., 2004). CPA apresenta atividade fosfolipase C, clivando fosfolipídios da membrana das células hospedeiras, o que, perturba a homeostase celular e desencadeia efeito citolítico e citotóxico em células epiteliais e sanguíneas.

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4/39

A toxicidade sobre células sanguíneas desencadeia hemólise intravascular e agregação plaquetária. Os danos capilares impedem defesas imunológicas atuarem em tecidos afetados (Naylor et al., 1998; Flores-Díaz & Alape-Girón, 2003; Li et al., 2013) . As lesões nos tecidos musculares caracterizam-se por necrose tecidual acompanhada por alta produção de gás no local da infecção (gangrena gasosa).

[005] Codificada pelo gene plasmidial cpb, CPB é membro da família das proteínas heptaméricas denominadas β-toxinas formadoras de poros (fi-pore-forming toxins;

β-PFTs) (Sakurai &

Duncan, 1977; Hunter et al.,

1993).

O efeito citotóxico caracteriza-se pela formação de poros na membrana das células hospedeiras susceptíveis, levando ao ingurgitamento lise, provoca perturbação da permeabilidade vascular e pode atuar sobre canais de Na⁺/K⁺ nos neurônios, desencadeando despolarização da membrana e com al., isso alterações dos impulsos nervosos (Shatursky et

2000; Uzal & McClane, 2011). CPB é extremamente sensível à ação da tripsina, que pode inibir por completo sua função, por isso, animais recém-nascidos com baixos níveis de proteases gástricas são particularmente sensíveis a essa toxina (Sakurai & Duncan, 1978).

[006] Codificada pelo gene plasmidial etx, ETX é a terceira toxina mais potente do gênero Clostridium após a toxina botulínica (Clostridium botulinum) e tetânica (Clostridium tetani) (Bokori-Brown et al., 2011; Popoff, 2011). ETX pertence à família das aerolisinas-e-toxinas formadoras de poro, sua forma ativa é absorvida rapidamente pela mucosa intestinal, através do rompimento das junções apertadas entre as células intestinais, alcançando a corrente sanguínea e então levada a vários órgãos, acumulando-se principalmente nos rins, pulmão, fígado e cérebro (SolerJover et al., 2007). Estudos in vitro da interação de ETX

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5/39 com membrana de células de rim canino Madin-Darby (MDCK), revelam que ETX liga-se rapidamente à superfície celular,

através do	possível receptor	celular 1	para o	vírus	da
hepatite A	(HAVCR1; Ivie	et	al., 2011	, localizados	em
microdomínios resistentes	a	detergente	(MRDs;	Miyata	et
al., 2001).	Etx liga-se	à membrana e	formam	poros	com

estrutura heptamérica, desencadeando rápido efluxo de K⁺ e influxo de Na⁺ e Cl^- para célula, essa perda K⁺ leva a morte rápida das células pela depleção de ATP (Petit et al., 1999; Knapp et al., 2009; Nestorovich et al. , 2010;

Robertson et al., 2011).

[007] Clostridium perfringens protagonizam diversas doenças de importância veterinária, tais como: Gangrena Gasosa, enterotoxemia grave a hemorrágica em ovinos, bovinos, caprinos, equinos, cães, etc., toxiinfecção alimentar em varias espécies (C. perfringens Tipo A); Enterotoxemia grave dos ovinos neonatos (Tipo B); Enterite necrosante em diversas espécies animais, enterotoxemia aguda (Struck) em ovinos (Tipo C); Doença do rim pulposo e enterotoxemias (tipo D) e o Tipo E é o menos frequente, envolvido em surtos de enterotoxemia em algumas espécies animais (Hatheway, 1990).

[008] Clostridium perfringens tipo A, produtor das toxinas CPA, beta-2 e enterotoxina, vem sendo isolado do intestino dos leitões nos últimos anos e é considerado componente da microbiota normal destes animais. Evidências sugerem seu envolvimento nas doenças entéricas em leitões lactentes, principalmente com um a quatro dias de vida (Yaeger, 2007). A infecção se dá logo após o nascimento e a principal fonte de contaminação são os esporos presentes no ambiente e nas fezes das porcas (Taylor e Bergeland, 1992; Holmgren et al., 2006). Estudos da prevalência em leitões são escassos na literatura. Em um estudo retrospectivo realizado no

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6/39 laboratório de diagnóstico veterinário da Universidade de Iowa, nos Estados Unidos, nos anos de 2005 e 2006, C. perfringens tipo A foi identificado como o principal agente causador de diarreia neonatal, compreendendo 48% das 273 amostras (Yaeger, 2007) . No Brasil, Moreno et al. (2003) , isolaram C. perfringens tipo A de leitões de um a cinco dias de idade, de quatro surtos de diarreia neonatal de granjas da região Sul do país. Neste mesmo estudo também foi realizado o diagnóstico diferencial para os demais enteropatógenos, entretanto, todos foram negativos, sendo assim possível afirmar ser C. perfringens tipo A o agente responsável pela doença. Em 2004, Costa et al. isolaram o agente em três rebanhos de granjas comerciais dos estados de Minas Gerais e São Paulo. Estas granjas tinham histórico de elevada incidência de diarreia em leitões lactentes, acometendo animais de um a 21 dias de idade. Na tentativa de isolamento de clostrídios foram sacrificados 15 animais diarreicos, cinco de cada granja. Como diagnóstico diferencial foi realizado apenas o exame parasitológico para Isospora suis, sendo isolado somente C. perfringens tipo A. Estudo similar foi realizado por Cruz-Júnior et al. (2013)em 15 granjas comerciais de Minas Gerai, onde foram selecionados 30 leitões diarreicos e 30 não-diarreicos (controles) com 1 a 7 dias de idade. Esses animais foram eutanasiados e necropsiados, sendo coletados fragmentos do íleo, cólon e ceco para pesquisa de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC), Clostridium difficili, rotavírus e I. suis. Entre os animais diarreicos, C. perfringens tipo A positivos para o gene da toxina beta 2 (cpb2+) foram isolados de 22 animais diarreicos e de 26 animais não

diarreicos sugerindo	ser	membro	comum	da	microbiota
intestinal.
[009] A infecção pelo	C.	perfringens tipo	A	ocorre, na
maioria dos leitões,	dentro de	algumas	horas após o

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7/39 nascimento, e o micro-organismo pode ser encontrado nas primeiras fezes. Os sinais clínicos consistem em diarreia mucóide e pastosa, de coloração amarelada e não hemorrágica, apatia, desidratação e baixa taxa de crescimento (Songer e Uzal, 2005) . À necropsia, pode ser encontrada hiperemia discreta a moderada da mucosa intestinal e dilatação de alças devido à produção aumentada de gases e excesso de conteúdo líquido (Costa et al., 2004). As lesões afetam primariamente o jejuno e o íleo, na histopatologia, pode ser vista uma enterocolite necrosante discreta a moderada, com edema de vilosidades e com mínimos danos ao epitélio e aos vasos sanguíneos (Songer e Glock, 1998). Em geral, as lesões não são muito graves, sejam elas macro ou microscópicas, permitindo sugerir que a diarreia que acompanha estes quadros seja do tipo secretória (Yaeger, 2007) . Contudo, trata-se de uma patologia entérica de elevada morbidade e baixa mortalidade (Collins et al., 1989).

[010] Por ser um comensal do trato gastrointestinal, o diagnóstico de enterite por C. perfringens tipo A torna-se um desafio (Collins et al., 1989; Songer e Glock, 1998). O diagnóstico deve envolver o isolamento, quantificação do agente nas fezes, seguido de tipificação e observação do gene da toxina beta 2. Além disso, inclui-se a avaliação histológica para a possível presença de lesões e associação da ausência do diagnóstico de outros enteropatógenos (Yaeger, 2007). A não detecção da toxina no conteúdo intestinal não é um parâmetro confiável, uma vez que a mesma é muito lábil, sendo rapidamente degradada por outras bactérias ou enzimas intestinais (Sanz et al., 2007).

[011] As medidas de controle visam o manejo correto de higiene, descontaminação do ambiente e vacinação das fêmeas, no intuito de transferir imunidade passiva à progênie, entretanto, a inexistência destas vacinas obriga

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8/39 a utilização cada vez mais precoce de antibióticos nos animais (Taylor, 1999).

[012] Clostridium perfringens tipo C, produtor das toxinas alfa, beta, beta-2 e enterotoxina, é considerado um agente primário de enterites necróticas hemorrágicas, classicamente associadas ao tipo C e acometendo leitões com até três dias de vida, podendo ocorrer de forma precoce, afetando animais com menos de 12 horas de vida (Songer e Uzal, 2005). Ao contrário do C. perfringens tipo A, o tipo C é encontrado em menor frequência e quantidade no intestino de animais saudáveis (Springer e Selbitz, 1999). A letal e necrosante toxina beta é o principal fator da patogênese da doença.

[013] Os micro-organismos podem ser transmitidos horizontalmente na forma vegetativa e contaminar o ambiente da maternidade ou pode ser adquirido nas fezes das mães, podendo persistir no ambiente na forma de esporos e infectar leitões susceptíveis por longos períodos de tempo. A compra de matrizes portadoras é a mais provável fonte de origem da doença nas granjas, mas o micro-organismo pode também ser introduzido por contaminações fecais em botas ou vestimentas. A infecção é oral e leitões recém-nascidos se infectam minutos ou horas após o nascimento (Taylor, 1999).

[014] A morbidade apresenta grande variação podendo chegar a 85% e a letalidade em torno de 50%, podendo alcançar 100% dos animais acometidos. Em estudos de prevalência, Morin et al. (1983) constataram que 0,4 % das diarreias presentes em 749 animais de um a 15 dias tinha como causa o C. perfringens tipo C. Já Yaeger et al. (2002) diagnosticaram em 100 leitões que apresentavam diarreia com até 10 dias de vida, 2% de C. perfringens tipo C como único agente. No Brasil não há trabalhos de prevalência deste agente.

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9/39 [016] Alguns autores classificam os casos de enterite necrótica em hiperagudos, agudos, subagudos e crônicos segundo os sinais clínicos, sendo as formas superaguda e aguda as mais frequentes (Songer e Uzal, 2005) . Na forma superaguda os sinais clíncos aparecem entre 12 a 24 horas após o nascimento do leitão, e a morte em até 24 horas. São observadas diarreia hemorrágica com consistência aquosa e severa desidratação. Nos casos agudos, pode-se observar diarreia hemorrágica, com presenças de restos necróticos, sinais de dor abdominal, desidratação, apatia e a morte podendo ocorrer por obstrução intestinal e toxemia. A forma crônica é bem menos frequente, as fezes apresentam coloração amarelada a esbranquiçada, sendo facilmente confundida com outros enteropatógenos (Rood, 1991) .

[017] À necropsia, as lesões estão comumente restritas ao intestino delgado e podem ser vistos variados graus de hiperemia no mesentério, enterite fibrinonecrótica ou pseudomembranosa e conteúdo intestinal sanguinolento (Songer et al., 2009) . Microscopicamente, as lesões são de necrose profunda da mucosa do intestino delgado, podendo se estender até o ceco e porções do cólon com hemorragia na lâmina própria, submucosa e camadas musculares (Miclard et al., 2009). Além disso, também é comum encontrar trombos, bacilos e/ou esporos e intenso infiltrado inflamatório constituído por neutrófilos, linfócitos, plasmócitos, macrófagos e fibrina.

[018] Os sinais clínicos e achados de necropsia são suficientes para o diagnóstico presuntivo de C. perfringens tipo C nos quadros de enterite necrótica. Diarreias hemorrágicas em leitões, o padrão de mortalidade, a presença de hemorragias e as lesões necróticas no intestino delgado, são os mais importantes achados de base deste diagnóstico. O diagnóstico laboratorial baseado no isolamento e tipificação por biologia molecular (Vieira et

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10/39 al., 2008), bem como na detecção da toxina beta no conteúdo intestinal por soroneutralização são ferramentas importantes para identificação de C. perfringens tipo C como agente causador de enterite hemorrágica em leitões (Straw et al., 1999).

[019] A infecção pelo C. perfringens tipo C pode ser prevenida por meio da vacinação das fêmeas com o toxóide beta, que geralmente é associado à E. coli na vacina que rotineiramente é usada nas granjas de suínos no Brasil. Esse manejo vem sendo utilizado desde a década de 90 e pode ser uma das explicações para a baixa importância do agente no nosso meio como causador de diarreia neonatal em suínos.

[020] A doença provocada pelo C. perfringens tipo D, que normalmente habita o sistema digestivo de ovinos e outros ruminantes, varia amplamente entre os rebanhos. A bactéria não persiste muito tempo no solo e, sob certas condições, podem proliferar rapidamente no intestino e produzir quantidades letais de toxinas. As condições zootécnicas em que a doença ocorre, incluem a pastagem em pastos viçosos em rápido crescimento ou com cereais recém-brotados, e, alimentação intensiva em rebanhos que recebem grãos (Songer, 1996).

[021] Em bovinos, a doença de evolução rápida, com cerca de 2-36 horas, com animal apresentando febre, anorexia, apatia, evoluindo para um quadro de convulsões espasmódicas, coma morte súbita. As enterotoxemias são, junto com aborto, uma das infecções mais importantes em ovinos; acometem principalmente animais jovens, mais susceptíveis, em especial os filhotes de mães não vacinadas. Como todos os animais de um rebanho são submetidos aos mesmos fatores de risco, as enterotoxemias podem provocar a morte simultânea de vários animais em um mesmo rebanho (Helwig, 1967).

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11/39 [022] No Brasil, as enterotoxemias influenciam diretamente na exportação de animais, além de ser importante em relação à taxa de mortalidade neonatal, sendo uma infecção de alta frequência e economicamente significativa. Nos últimos anos, alterações na criação de gado, particularmente o uso de alimentos altamente energéticos em gado de engorda ou leiteiro, levaram a um aumento no número de relatos de infecções pelo C. perfringens tipo D (Lobato et al., 2000).

[023] Apesar de terapias com antimicrobianos (Bhatia et al., 2014), oxigênio hiperbárico, anticorpos neutralizantes, ou até mesmo remoção cirúrgica das partes afetadas serem relatados na literatura como alternativas terapêuticas para infecções por C. perfringens, na maioria dos casos, os efeitos letais extremamente rápidos tornam o tratamento de animais inviável (Bhatia et al., 2014) . Por isso, as vacinas contra toxinas de C. perfringens são extensivamente utilizadas em medicina veterinária, tornando-se a principal medida de controle e profilaxia no rebanho (Petit et al., 1999; Bhatia et al., 2014) .

[024] Vacinas de toxóides são eficientes na geração de imunidade protetora contra toxinas de C. perfringens. No entanto, esse método apresenta algumas desvantagens: (1) risco de reversão da toxicidade em toxóides inativados de forma incorreta (Bhatia et al., 2014); (2) variações das características imunogênicas entre lotes de vacinas (Thaysen-Andersen et al., 2007; Lobato et al., 2010); (3) Possível falha na remoção completa do formaldeído empregado na inativação das toxinas (Bokori-Brown et al., 2014); e (4) impossibilidade de purificação de toxinas específicas para preparo das vacinas (Cavalcanti et al., 2004), visto que há dezessete toxinas de C. perfringens descritas, aliado ao fato de as vacinas serem constituídas por toxinas e bacterinas de inúmeras espécies do gênero Clostridium

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12/39 spp., elevam a carga antigênica no hospedeiro e com isso resposta imunológica inespecífica (Chandran et al., 2010; Bhatia et al., 2014).

[025] Sendo assim, o desenvolvimento de uma formulação vacinal contendo bacterinas recombinantes, compostas pelos clones de E. coli produtores de toxinas recombinantes CPA, CPB e ETX inativados por formaldeído e adsorvidos em hidróxido de alumínio, busca aliar as facilidades da produção de bacterinas com a segurança e previsibilidade das vacinas recombinantes, para sua utilização na vacinação de animais.

[026] Da mesma forma, o desenvolvimento de uma formulação vacinal composta pelos lisados celulares dos clones de E. coli produtores de CPA, CPB e ETX (corpos de inclusão e sobrenadante da lise), adsorvidos em hidróxido de alumínio, visa dispensar tanto a detoxificação com formaldeído das bacterinas, quanto as etapas de solubilização, purificação e diálise (renaturação) das proteínas purificadas. Estas estratégias vacinais foram avaliadas quanto à inocuidade e imunogenicidade utilizando coelhos como modelo animal, e tendo a potência das vacinas mensuradas através do ensaio de soroneutralização em camundongos, conforme Código de Regulações Federais número 9(CRF9; em inglês: Code of Federal Regulations number 9, CFR9) do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (DAEU; em inglês: United States Department of Agriculture, USDA) .

Breve descrição das ilustrações [027] Para melhor entendimento da presente invenção, seguem em anexo as seguintes figuras:

[028] A Figura 1 é a representação gráfica dos vetores de expressão pAE/cpaN, pAE/cpbN e pAE/etxS, utilizados para

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13/39 produção de antígenos recombinante nativos CPA e CPB, e ETX sintética em E. coli;

[028] A Figura 2 é a representação gráfica dos vetores de expressão pET28a/cpaS (A), pET28a/cpbS (B) e pET28a/etxS (C) , utilizados para produção de antígenos recombinante sintéticos CPA, CPB e ETX em E. coli;

[031] Figura 3 é a Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 12% da expressão em vetor pAE de CPA com 43, 85 kDa(A), CPB com 36,3 kDa(B) e ETX 37,59 kDa(C), corado com Comassie Brilliant Blue R-250. 1, Extrato proteico bruto de E. coli BL21 (DE3) Star^TM (CPA - E. coli BL21 (DE3) pLysS^TM) transformada, não induzida com IPTG;

2, Extrato proteico bruto de E. coli BL21 (DE3) Star^TM transformada, induzida por 3 horas com IPTG; 3, Sobrenadante da lise dos extrato proteicos brutos de E. coli BL21 (DE3) Star^TM induzida por 3 horas com IPTG; 4, Pellet da lise solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 0,2% N-Lauroylsarcosine (NLS); 5, Pellet da lise solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 0,4% NLS;

6, Pellet da lise solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 8 M ureia; 7, marcador de massa molecular.

[031] Figura 4 é a Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 12% da expressão em vetor pET28a de CPA com 45,21 kDa (A), CPB com 37,07 kDa (B) e ETX com 34,09 kDa (C), corado com Comassie Brilliant Blue R-250. 1, Extrato proteico bruto de E. coli BL21 (DE3) Star^TM transformada, não induzida com IPTG; 2, Extrato proteico bruto de E.

coli BL21 (DE3) Star^TM transformada, induzida por 3 horas com IPTG; 3, Sobrenadante da lise dos extrato proteicos brutos de E. coli BL21 (DE3) Star^TM induzida por 3 horas com IPTG; 4, Pellet da lise solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 0,2% N-Lauroylsarcosine (NLS); 5, Pellet da lise solubilizado com tampão de lavagem acrescido

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14/39 de 0,4% NLS; 6, Pellet da lise solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 8 M ureia; 7, marcador de massa molecular.

[034] A Figura 5 representa um Western blotting com anticorpo primário monoclonal anti-cauda de poli-histidina frente às proteínas CPA (A), CPB (B) e ETX(C) expressas em vetor pAE. As bandas foram reveladas com 3,3diaminobenzidina e peróxido de hidrogênio (DAB/H2O2) . Coluna 1, marcador pré-corado; coluna 2, Extrato proteico bruto de E. coli BL21 (DE3) Star^TM transformada (CPA - E. coli BL21 (DE3) pLysS^TM), induzida por 3 horas com IPTG;

Descrição da invenção

Por conveniência o significado de alguns termos empregados nas especificações estão descritos abaixo.

[040] CPA (toxina alfa de C. perfringens) - é a principal toxina letal produzida por todos os tipos de C. perfringens, é uma metaloenzima dependente de zinco de 370 aminoácidos composta por dois domínios. A porção C-terminal é responsável pela ligação à membrana plasmática, apresentando epitopos protetores capazes de conferir imunidade contra esta toxina, embora estudos demonstrem que anticorpos contra ambos domínios são necessários para conferir proteção contra hemólise. A porção N-terminal constitui o domínio catalítico caracterizado como uma fosfolipase C. A toxina alfa causa hemólise devido à sua ação de fosfolipase sobre lipídeos da membrana plasmática de eritrócitos, danificando também os vasos sanguíneos, diminuindo o aporte sanguíneo, resultando em gangrena.

[041] CPB (toxina beta de C. perfringens) - é produzida pelos tipos B e C. Atua formando poros na membrana plasmática das células alvo, alterando a permeabilidade das mesmas aos íons Na⁺, K⁺, Cl^- e Ca²⁺, causando desequilíbrio

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15/39 osmótico e consequente lise celular e necrose tecidual, sendo este o principal fator letal em infecções pelo tipo C. Os efeitos causados pela toxina beta são hemorragia ou necrose da mucosa do intestino delgado, podendo também causar efeitos neurológicos, acarretando em constrição arterial, o que pode resultar em morte súbita.

[042] ETX (toxina épsilon de C. perfringens) - é a principal responsável por causar enterotoxemia fatal, problemas renais e distúrbios cerebrais em animais, podendo afetar, também, humanos. Seu mecanismo de ação ainda não foi completamente elucidado, porém sabe-se que ela age formando poros na membrana de células alvo (intestinais, renais e neuronais) de forma a causar alterações na permeabilidade da mesma, levando ao influxo de íons e, consequentemente, à morte celular, além de causar rápida depleção de ATP e permeabilização da membrana mitocondrial e promover necrose.

[043] cpaS - refere-se à sequência sintética de nucleotídeos que codifica para a proteína CPA.

[044] cpbS - refere-se à sequência sintética de nucleotídeos que codifica para a proteína CPB.

[045] etxS - refere-se à sequência sintética de nucleotídeos que codifica para a proteína ETX.

[046] cpaN - refere-se à sequência nativa de nucleotídeos que codifica para a proteína CPA.

[047] cpbN - refere-se à sequência nativa de nucleotídeos que codifica para a proteína CPB.

[048] Na presente invenção a escolha dos antígenos CPA, CPB e ETX foi baseada na análise da literatura a respeito do assunto e em resultados prévios de nossos trabalhos. Após a identificação dos antígenos, primeiramente foram amplificados os genes referentes às toxinas CPA e CPB a

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16/39 partir de uma cepa de C. perfringens tipo C e clonados em vetor de expressão pAE. Posteriormente, foram desenhados e sintetizados genes com códons preferenciais para E. coli e sítios para enzima de restrição para clonagem em vetor de expressão pET28a, que sabidamente possui vantagem de maior controle da expressão se comparado ao primeiro vetor utilizado.

[051] Com base nas sequências nativas e sintéticas de nucleotídeos dos genes cpa, cpb e etx, seguiram os processos de clonagem, expressão, purificação, preparação dos antígenos vacinais e avaliação do potencial imunobiológico destes antígenos, segundo os procedimentos a seguir:

[052] Passo 1A: Clonagem dos genes nativos - A clonagem dos genes nativos foi realizada conforme descrito por Sambrook e Russell [29], com algumas modificações. Para gerar os vetores de expressão pAE/cpaN (Figura 2A) e pAE/cpbN (Figura 2B), um isolado de C. perfringens tipo C gentilmente cedido pela laboratório Leivas Leite foi utilizado como DNA molde para reação em cadeia da polimerase (PCR) juntamente com primers previamente desenhados a partir de sequências depositadas no Genbank (L13198). Os primers para cpaN continham sítios para endonucleases XhoI (CTCGAG) e HindIII (AAGCTT). Os primer para cpbN continham sítios para endonucleases BamHI (GGATCC) e Kpnl (GGTACC) . As PCR foram realizadas separadamente para cada gene em volume final de 25 pl, contendo 1 pl de DNA molde, 25 pmol dos respectivos primers: cpaN-F (5'- CCGCTCGAGTGGGATGGAAAGATT -3')e cpaN-R (5'- C C CAAG CTTTTATTTTATAT TATAAG T TGA -3'); cpbN-F (5'CGGGATCCAATGATATAGGTAAA -3') e cpbN-R (5'GGGGTACCCTAAATAGCTGTTACT -3'); 0,1 mM (cada) dATP, dGTP, dCTP e dTTP (Invitrogen™); 10 mM Tris-HCl (pH 8,4)

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17/39 (Invitrogen™); 0,75 mM MgCl² (Invitrogen™) e 1 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen™). Após, os produtos da PCR (insertos) foram analisados através de eletroforese em tampão 1x tris-borato-EDTA (TBE; 89 mM Tris, 89 mM ácido bórico e 2 mM EDTA), utilizando gel de agarose 1% (0,6 g de agarose, 60 mL de 1x TBE) , a uma voltagem de 100 V, e este corado com brometo de etídeo, com intuito de avaliar sua qualidade e integridade. Em seguida, os fragmentos foram purificados utilizando GFX^TM

PCR DNA and Gel Band

Purification

Kit (GE

Healthcare) submetidos à outra eletroforese mantendo os parâmetros supracitados com o intuito de analisar integridade e qualidade dos fragmentos purificados.

insertos foram digeridos vetor de expressão pAE e os com endonucleases e purificados com GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Este vetor de expressão possui as seguintes características: origem de replicação de E. coli, sítio de múltipla clonagem, gene de resistência ao antibiótico ampicilina, operador lac, promotor T7 (reconhecido pela T7 RNA polimerase de E. coli) e expressão das proteínas recombinantes fusionadas a uma cauda de seis resíduos de histidina em sua porção N-terminal. Para a reação de ligação, foi utilizada a enzima T4 DNA ligase (Invitrogen™) e concentrações equimolares de inserto e vetor. Na construção pAE/cpaN foi utilizado 25 ng de inserto cpaN purificado, 25 ng do vetor pAE purificado após digestão com XhoI e HindIII, 4 pL de tampão 1x e 1 pL de enzima. Na construção pAE/cpbN foi utilizado 25 ng de inserto cpbN purificado, 25 ng do vetor pAE purificado após digestão com BarnHI e Kpnl, 4 pL de tampão 1x e 1 pL de enzima. A reação de ligação foi mantida a 22 °C por 75 min. O produto da ligação foi utilizado para transformar células eletrocompetentes de E. coli DH5a (capacitância de 25 pF, resistência de 200 Ω e voltagem de 2,5 kV) . As células

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18/39 transformadas foram plaqueadas em ágar Luria-Bertani (LB) (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de

NaCl) acrescido de 100 pg.mL^-1 de ampicilina e incubadas a 37 °C, por 12 - 14 h. As colônias que cresceram nas placas, oriundas do processo de transformação, foram semeadas em tubos contendo 10 mL de LB líquido acrescido de ampicilina e incubadas a 37 °C, por 12 - 14 h. As colônias que cresceram nas placas, oriundas do processo de transformação, foram submetidas a uma triagem rápida com fenol-clorofórmio e análise do tamanho do DNA plasmidial por eletroforese em gel de agarose 1% conforme já descrito. Os clones caracterizados como recombinantes nesta triagem, ou seja, que apresentavam o vetor de expressão mais o inserto, foram selecionados e cultivados em 5 mL de meio LB líquido acrescido de 100 pg.mL^-1 de ampicilina, a 200 rpm de agitação, 37 °C, por 12 - 20 h. Deste cultivo, utilizouse 3 mL para extração de DNA plasmidial com GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit (GE Heathcare) , e o DNA resultante desta extração submetido a digestão com as mesmas enzimas de restrição para checar a presença e orientação do inserto.

[053] Passo 1B: Clonagem dos genes sintéticos - Os fragmentos cpa, cpb e etx foram obtidos através síntese de gene sintético contendo sequências codificadoras para as respectivas toxinas com códons preferenciais para expressão E. coli. Os genes tiveram suas sequências verificadas por sequenciamento e foram entregues pela Epoch Life Sciences clonados em vetor de clonagem pUC19 e analisados através de eletroforese em tampão 1x tris-borato-EDTA (TBE), utilizando gel de agarose 1%, a uma voltagem de 100 V, e este corado com brometo de etídeo, com intuito de avaliar sua qualidade e integridade.

[054] A clonagem dos genes sintéticos foi realizada conforme descrito por Sambrook e Russell [29], com algumas

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19/39 modificações. Para clonagem de etxS em vetor pAE (Figura

2C), o inserto foi digerido com as endonucleases com Kpnl e

NcoI e analisado através de eletroforese em tampão 1x tris borato-EDTA (TBE), utilizando gel de agarose 1%, a uma voltagem de

100 V, e este corado com brometo de etídeo, com intuito de avaliar sua qualidade e integridade, bem como eficiência da digestão, sendo em seguida purificado utilizando

GFX^TM PCR DNA and Gel

Band Purification Kit (GE

Heathcare) e realizada outra eletroforese seguindo os parâmetros supracitados com o intuito de analisar integridade qualidade do fragmento purificado. O vetor de expressão foi digerido com as mesmas endonucleases usadas para digestão de cada fragmento de interesse e purificado com GFX^TM

PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE

Heathcare).

Para a reação de ligação, foi utilizada a enzima T4

DNA ligase (Invitrogen) concentrações equimolares de inserto e vetor (25 ng de inserto e de vetor, 4 pL de tampão 10x, 1 pL de enzima). A reação de ligação foi mantida a 16 °C por 2 h.

O produto da ligação foi utilizado para transformar células competentes de E.

coli DH5a (capacitância de 25 pF, resistência de 200 Ω e voltagem de 2,5 kV). As células transformadas foram plaqueadas em ágar Luria-Bertani (LB) (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de NaCl) acrescido de 100 pg.mL^-1 de ampicilina e incubadas a 37 °C, por 12 - 20 h.

As colônias que cresceram nas placas, oriundas do processo de transformação, foram submetidas a uma triagem rápida com fenol-clorofórmio e análise do tamanho do DNA plasmidial por eletroforese em gel de agarose 1% conforme já descrito.

Os clones caracterizados como recombinantes nesta triagem, ou seja, que apresentavam o vetor de expressão mais o inserto, foram selecionados e cultivados em 5 mL de meio LB líquido acrescido de 100 pg.mL^-1 de ampicilina, a 200 rpm de agitação, 37 °C, por 12 - 20 h. Deste cultivo, utilizou

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20/39 se 3 mL para extração de DNA plasmidial com GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit (GE Heathcare) , e o DNA resultante desta extração submetido a digestão com as mesmas enzimas de restrição para checar a presença e orientação do inserto.

[055] Para gerar os vetores de expressão pET28a/cpaS (Figura 1A), pET28a/cpbS (Figura 1B) e pET28a/etxS (Figura 1C) , o vetor contendo os genes sintéticos cpa, cpb e etx foi utilizado como DNA molde para reação em cadeia da polimerase (PCR) juntamente com primers previamente desenhados com auxílio do software Vector NTI 11 (Invitrogen), contendo sítios para endonucleases MheI (GCTAGC) e HindIII (AAGCTT). As PCR foram realizadas separadamente para cada gene em volume final de 25 pl, contendo 1 pl de DNA molde, 25 pmol dos respectivos primers: cpaS-F (5'-CTAGCTAGCTGGGATGGTAAGATTGAT-3')e cpaS-R (5'-CCCAAGCTTTCATTTGATGTTGTAGGTAGA-3'); cpbS-F (5'CTAGCTAGCATGAAGAAGAAGTTCATTAGCC-3') e cpbS-R (5'CCCAAGCTTTCAGCTGTAAACCTGACC-3'); etxS-F (5'CTAGCTAGCAAAGCAAGCTATGACAACGTG-3') e etxS-R (5'CCCAAGCTTTCATTTGATGCCTGGTGC-3'); 0,1 mM (cada) dATP, dGTP, dCTP e dTTP (Invitrogen™); 10 mM Tris-HCl (pH 8,4) (Invitrogen™); 0,75 mM MgCl² (Invitrogen™) e 1 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen™). Após, os produtos da PCR (insertos) foram analisados através de eletroforese em TBE

1x, utilizando gel de agarose 1%, a uma voltagem de 100 V, e este corado com brometo de etídeo, com intuito de avaliar sua qualidade e integridade. Em seguida, os fragmentos foram purificados utilizando GFX^TM PCR DNA and Gel Band

Purification	Kit (GE	He
eletroforese	mantendo	os
intuito de	analisar	a

fragmentos purificados. O insertos foram digeridos com GFX^TM PCR DNA and lthcare) e submetidos a outra parâmetros supracitados com o integridade e qualidade dos vetor de expressão pET28a e os com endonucleases e purificados Gel Band Purification Kit (GE

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Healthcare). Este vetor de expressão possui as seguintes características: origem de replicação pBR322, sítio de múltipla clonagem, gene de resistência ao antibiótico kanamicina, gene lacI que codifica proteína repressora, operador lac, promotor T7 (reconhecido pela T7 RNA polimerase de E. coli) e expressão das proteínas recombinantes fusionadas a uma cauda de seis resíduos de histidina em sua porção N-terminal. Para a reação de ligação, foi utilizada a enzima T4 DNA ligase (Invitrogen^TM) e concentrações equimolares de inserto e vetor. Na construção pET28a/cpaS foi utilizado 25 ng de inserto cpa purificado, 25 ng do vetor pET28a purificado após digestão com NheI e HindIII, 4 pL de tampão 1x e 1 pL de enzima. Na construção pET28a/cpbS foi utilizado 25 ng de inserto cpb purificado, 25 ng do vetor pET28a purificado após digestão com NheI e HindIII, 4 pL de tampão 1x e 1 pL de enzima. Na construção pET28a/etxS foi utilizado 25 ng de inserto etx purificado, 25 ng do vetor pET28a purificado após digestão com NheI e HindIII, 4 pL de tampão 1x e 1 pL de enzima. A reação de ligação foi mantida a 22 °C por 75 min. O produto da ligação foi utilizado para transformar células eletrocompetentes de E. coli DH5a (capacitância de 25 pF, resistência de 200 Ω e voltagem de 2,5 kV) . As células transformadas foram plaqueadas em ágar LuriaBertani (LB) (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura,

0,5% de NaCl) acrescido de 100 pg.mL^-1 de kanamicina e incubadas a 37 °C, por 12 - 14 h. As colônias que cresceram nas placas, oriundas do processo de transformação, foram semeadas em tubos contendo 10 mL de LB líquido acrescido de kanamicina e incubadas a 37 °C, por 12 - 14 h. O pellet de 1 mL foi obtido por centrifugação a 12.000 x g por 2 minutos e posteriormente submetidas a uma triagem com fenol-clorofórmio [30] e análise do tamanho do DNA plasmideal por eletroforese em gel de agarose

91%, conforme

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22/39 já descrito. Os clones caracterizados como recombinantes nesta triagem, ou seja, que apresentavam o vetor de expressão mais o inserto, foram selecionados e o volume restante de cultivo (9 mL) foi utilizado para extração de

DNA plasmidial com GFX^TM Micro PlasmidPrep Kit (GE

Healthcare), e o DNA resultante desta extração submetido a digestão com as mesmas enzimas de restrição utilizadas nas construções, para checar a presença do inserto.

[056] Passo

2: Expressão dos antígenos vacinais expressão das proteínas recombinantes procedeu-se de forma semelhante para os vetores pAE e pET28a, com algumas particularidades. Um clone do plasmídeo recombinante pAE/cpaN foi utilizado para transformar E. coli BL21 (DE3) pLysS^TM. Os vetores pAE/cpbN, pAE/etxS, pET28a/cpaS pET28a/cpbS pET28a/etxS, foram utilizados individualmente para transformar E. coli BL21 (DE3) Star^TM, respectivamente, e estas cultivadas em 10 mL de meio LB líquido acrescido de 100 pg.mL^-1 do respectivo antibiotico, a 200 rpm de agitação, °C, de 12

h. Cinco mililitros de cada cultivo foram utilizados como préinóculo em mL de meio LB líquido acrescido de

100 pg.mL^{- 1} de antibiótico e as culturas incubadas em agitador orbital a 37 °C, sob agitação de

200 rpm até atingirem a densidade ótica a 600 nm (OD600) de 0,6 a

0,8. Neste momento, as culturas foram fracionadas em duas alíquotas de igual volume (25 mL), sendo uma induzida com 0,5 mM de isopropil β-D-tiogalactosídeo (IPTG) e a outra servindo de controle negativo (não induzido), ambas incubadas durante 3 h, 200 rpm, 37 °C. Ao final dos cultivos, coletou-se uma alíquota (1 mL) de cada amostra, centrifugou-se 10.000 x g por 1 min e os pellets foram utilizados para verificar a expressão das eletroforese em proteínas recombinantes, através de uma um gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE 12%) com extrato proteico total, conforme Sambrook e Russel[29].

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23/39 [057] Passo 4: Formulações vacinais - Os antígenos recombinantes expressos em vetor pAE foram utilizados na forma purificada (vacina 3) para imunização dos coelhos, onde, após a expressão das proteínas as culturas foram centrifugadas a 16.000 x g por 10 min a 4 °C. Os pellets foram suspendidos em tampão de lavagem (200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl e 5 mM de imidazole, pH 8,0), sonicados (6 ciclos de 30 s, 60 kHz) e centrifugados (16.000 x g por 20 min a 4 °C). No processo de purificação de rCPA (Figura 3A) e rCPB (Figura 3B), o pellet contendo a proteína em corpos de inclusão, foi suspendido em tampão de solubilização (8 M de uréia, 200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl e 10mM de imidazole, pH 8,0) e incubado sob agitação constante por 24 h a 4°C. Após foi centrifugado 10.000 x g por 1 h a 4 °C e o sobrenadante filtrado em membrana de 0,8 pM (Millipore), seguido da purificação da proteína através de cromatografia de afinidade utilizando colunas Ni²⁺ Sepharose HisTrap, sendo a proteína eluída da coluna com 500 mM de imidazole. A fração contendo a proteína eluída foi identificada através de SDS-PAGE 12%. As alíquotas coletadas contendo a proteína recombinante foram reunidas e dialisadas de forma lenta, utilizando-se membrana de celulose para diálise (25 mm x 16 mm) (Sigma) . A membrana contendo a proteína foi acondicionada em um Kitazato com capacidade para 1 L, contendo 500 mL do tampão utilizado na purificação (8 M de uréia, 200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl, 500 mM de imidazole, pH 8,0). As proteínas foram dialisadas contra 12 L de tampão fosfato salino 1x (PBS), pH 7,4, em sistema de fluxo contínuo, por 92 h a 4°C, onde cerca de 16 trocas foram realizadas para diluir o tampão, fazendo com que a concentração de uréia na amostra baixasse até zero. No processo de purificação da rETX (Figura 3C), o sobrenadante da lise contendo a proteína, foi centrifugado 10.000 x g por 1 h a 4 °C e filtrado em membrana de 0,8 pM

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24/39 (Millipore) , seguido da purificação da proteína através de cromatografia de afinidade utilizando colunas Ni²⁺ Sepharose HisTrap, sendo a proteína eluída da coluna com 500 mM de imidazole. A fração contendo a proteína eluída foi identificada através de SDS-PAGE 12%. As alíquotas coletadas contendo a proteína recombinante foram unidas e dialisadas de forma rápida, utilizando-se membrana de celulose para diálise (25 mm x 16 mm) (Sigma) contra PBS 1x, pH 7,4, por 24 h a 4 °C, para a remoção do imidazol. A concentração das proteínas purificadas (antígenos recombinantes) foi determinada usando BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA), com uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA).

[058] As proteínas recombinantes expressas em vetor pET28a foram produzidas em duas formulações vacinais, a vacina 1 (bacterinas recombinantes) e vacina 2 (lisados celulares). Para a produção da vacina 1, procedeu-se a expressão das proteínas rCPA, rCPB e rETX conforme descrito anteriormente. Assim, após a indução da expressão proteica por 3 h com IPTG, os cultivos foram inativados pela adição de 0,2 % (v/v) de formaldeído puro e mantido sob agitação de 200 rpm, por 24 h a 37 °C. Em seguida, o processo de inativação das bactérias foi avaliado por plaqueamento de uma alíquota de 100 pL do cultivo após incubação com formaldeído em ágar LB. Confirmada a inativação, o cultivo foi centrifugado (10.000 x g, 4 °C, 10 min), lavado com PBS estéril para remoção de formaldeído residual e usado como antígeno vacinal.

[059] Para a preparação da vacina 2, composta por corpos de inclusão contendo rCPA e rCPB (fração insolúvel; Figura 4AB) e sobrenadante da lise contendo rETX (fração solúvel; Figura 4C), As frações obtidas após a lise das células por sonicação (6 ciclos de 30 s, 60 kHz) e centrifugação

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25/39 (10.000 x g por 20 min a 4 °C). O Pellet foi lavado 3x com solução de salina tamponada fosfatada (PBS pH 7.4) por centrifugação (10.000 x g por 20 min a 4 °C) para obtenção dos corpos de inclusão contendo rCPA e rCPB insolúveis, contrariamente, a rETX se mostrou solúvel e foi obtida do sobrenadante da lise. rCPA e rCPB presentes nos corpos de inclusão e a rETX presente no sobrenadante da lise foram avaliadas e quantificadas por SDS-PAGE 12%, sendo utilizadas diretamente como antígenos vacinais. A expressão das proteínas recombinantes foi também confirmada através da técnica de Western blotting (WB) utilizando anticorpo de camundongo monoclonal anti-cauda poli-histidina e anticorpo anti-imunoglobulina de camundongo conjugado com peroxidase (Sigma) nas diluições 1:6.000 e 1:4.000, respectivamente, segundo instruções do fabricante (Figuras 7, 8 e 9).

[060] Passo 6: Imunização dos animais - As proteínas recombinantes CPA, CPB e ETX expressas em vetor pAE, foram utilizadas na forma purificada para inocular coelhos (Oryctolagus cuniculus) e a resposta imune humoral avaliada por soroneutralização em camundongos, conforme preconizado pelo CFR9 - USDA. Um total de 24 coelhos (Laboratório Nacional Agropecuário, Pedro Leopoldo, MG, Brasil) de 1,8 a 2,6 Kg, divididos aleatoriamente em 3 grupos de 8 animais sendo um para a vacina de subunidade recombinante com hidróxido de alumínio (15%), um para o controle negativo e outro controle positivo (vacina comercial), foram inoculados por via subcutânea com volume total de 5 ml, nos dias 0 e 21. Amostra de sangue foi coletada por punção cardíaca no dia 35 após a primeira vacinação, centrifugada a 4.000 x g por 10 min e o soro usado para constituir um pool, que foi armazenado a -20 °C. Na avaliação da resposta imune humoral induzida nos animais imunizados, os soros foram titulados quanto aos níveis de antitoxina CPA, CPB e ETX em unidades internacionais por mililitro (UI/mL). Para

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26/39 a titulação dos níveis de antitoxina CPA, 1 mL de soro foi incubado com 10 DL50 de toxina CPA por 30 minutos a 37 °C. Dez camundongos foram inoculados via endovenosa com 0,2 mL da mistura acima e observados por 72 horas. A proteção de 80% dos animais corresponde a 4 UI/mL. Para a titulação de antitoxina CPB, os soros foram incubados a 56 °C por 30 minutos. Em seguida, diluições seriadas de base 2 em solução fosfato salina peptonada (1%) foram incubadas com igual volume de 1L+ de toxina CPB por 30 minutos a 37 °C. Para cada diluição, cinco camundongos foram inoculados com 0,2 mL via endovenosa e observados por 72 horas. Para a titulação dos níveis de antitoxina ETX, 10 DL50 foi incubado com diluições seriadas de soro a temperatura ambiente por 30 minutos de modo que o volume final da mistura fosse de 5 mL. Após o período de incubação, 0,5 mL da mistura foi inoculada via endovenosa em 4 camundongos Swiss Webster, que foram observados por 72 h quanto a mortes e o resultado é calculado baseado na sobrevivência dos animais. Para as antitoxinas beta e épsilon, caso todos camundongos morram, 0,5 mL da mistura contém menos que 1 e 0,1 UI de antitoxina beta e épsilon respectivamente. Já caso todos sobrevivam, 0,5 mL de mistura contém mais que 1 e 0,1 UI de antitoxina beta e épsilon, respectivamente. Foram determinadas 9,6, 24,4 e 25 UI/mL de antitoxina CPA, CPB e ETX, respectivamente, em média, no sangue dos coelhos vacinados com os antígenos purificados, superando o mínimo estabelecido pelo MAPA em sua Portaria n. 49 (1997).

[061] A mesma metodologia de vacinação foi empregada em bovinos, ovinos e caprinos (7 animais por grupo) . O grupo controle (mesmo número de animais) foi inoculado com solução salina estéril. A metodologia descrita no parágrafo anterior para titulação dos níveis de antitoxina também foi utilizada com os soros dos bovinos, ovinos e caprinos.

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Tabela 1. Níveis de antitoxinas no soro de ruminantes vacinados com as toxinas purificadas CPA, CPB e ETX recombinantes de C. perfringens.

ANIMAIS	ANTITOXINA CPA	ANTITOXINA CPB	ANTITOXINA ETX
Mínimo*	4	10	2
Bovino 1	4,8	14,4	12, 0
Bovino 2	5,7	14,4	14, 4
Bovino 3	4,8	12,0	14, 4
Bovino 4	4,8	14,4	14, 4
Bovino 5	5,7	14,4	12, 0
Bovino 6	5,7	14,4	12, 0
Bovino 7	4,8	12,0	10, 0
Ovino 1	4,0	12,0	7,2
Ovino 2	4,0	14,4	10, 0
Ovino 3	4,0	14,4	10, 0
Ovino 4	4,0	14,4	7,2
Ovino 5	4,8	14,4	6, 0
Ovino 6	4,8	12,0	6, 0
Ovino 7	4,8	14,4	7,2
Caprino 1	4,8	14,4	10, 0
Caprino 2	4,0	12,0	12, 0
Caprino 3	4,8	14,4	10, 0

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Caprino 4	5,7	14,4	10, 0
Caprino 5	4,0	12,0	7,2
Caprino 6	4,8	14,4	6, 0
Caprino 7	4,8	14,4	7,2

*Conforme preconizado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) em sua Portaria N° 49 (1997).

[062] As proteínas recombinantes expressas em vetor pET28a foram produzidas em duas formulações vacinais, a vacina 1 (bacterinas recombinantes) e vacina 2 (lisados celulares) foram inoculados em coelhos e a resposta imune humoral avaliada por soroneutralização em camundongos como descrito anteriormente. Coelhos foram imunizados com os dois tipos de vacinas, utilizando-se 4 grupos com 8 (oito) animais cada (Tabela 1). Cada animal recebeu as proteínas CPA, CPB e ETX em duas doses com 200 pg de cada proteína nas diferentes formulações vacinais (lisado celular e bacterina) via subcutânea, com intervalo de 21 dias entre as doses. Utilizou-se neste experimento um grupo controle negativo, no qual somente solução salina estéril tamponada com fosfato foi inoculada nos animais e um grupo controle positivo vacinados com toxóide comercial. Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca no dia 35 após a primeira vacinação, centrifugada a 4.000 x g por 10 min e o soro usado para constituir um pool, que foi armazenado a 20 °C. Na avaliação da resposta imune humoral induzida nos animais imunizados, os soros foram titulados quanto aos níveis de antitoxina CPA, CPB e ETX em UI/mL. Foram determinadas 0 e 10 UI/mL de antitoxina CPB e ETX, respectivamente, no sangue de animais vacinados com as formulações 1 (bacterina recombinantes) e 2 (lisados

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29/39 celulares), a titulação de antitoxina CPA está em processo de análise.

Tabela 2. Formulações recombinantes avaliadas.

GRUPO	FORMULAÇÃO VACINAL
G1	Vacina 1 (bacterinas)
G2	Vacina 2 (lisados celulares)
G3	Controle negativo (PBS 1x)
G4	Controle positivo (Toxóide comercial)

Tabela 3. Título de antitoxinas contra CPA, CPB e ETX gerados pelas formulações recombinantes.

FORMULAÇÃO VACINAL	ANTITOXINA CPA	ANTITOXINA CPB	ANTITOXINA ETX
Vacina 1 (bacterina)	-	ND	10 UI/mL
Vacina 2 (lisado celular)	-	ND	10 UI/mL
Controle negativo	-	ND	ND
Controle positivo	-	10 UI/mL	10 UI/mL

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Claims (4)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de clonagem e expressão para produção de vacinas recombinantes contra toxinas alfa (CPA) , beta (CPB) e épsilon (ETX) produzidas por

Clostridium perfringens, caracterizado por usar genes sintéticos otimizados para expressão em Escherichia coli (genes cpa, cpb e etx); e genes nativos obtidos por reação em cadeia da polimerase (PCR) (genes cpa, cpb e etx), que codificam para as toxinas recombinantes CPA, CPB e ETX.

2/2 solubilização, purificação ou redobramento das toxinas recombinantes;

6.

Processo de produção de vacinas recombinantes contra toxinas CPA, CPB e ETX produzidas por

C. perfringens compostas por extratos de células de E. coli recombinantes (lisados obtidas por sonicação, uso de homogeneizador, prensa francesa ou método afim, caracterizado por usar clones recombinantes de E. coli expressando CPA, CPB conforme reivindicação 1, ou expressando e ETX, outros antígenos recombinantes.

Processo de produção de vacinas recombinantes compostas por lisados celulares, conforme reivindicação 6, caracterizado por separar a fração solúvel e insolúvel (corpos de inclusão) dos lisados celulares por centrifugação;

8. Processo de produção de vacinas compostas por lisados celulares, conforme reivindicação 6, caracterizado por dispensar a solubilização, purificação ou redobramento das toxinas recombinantes;

9. Processo de produção de vacinas recombinantes contra toxinas CPA, CPB e ETX produzidas por C. perfringens, conforme reivindicações 2, 4 e 6, caracterizado por dispensar o cultivo de C. perfringens para a obtenção das toxinas CPA, CPB e ETX;

10. Vacinas recombinantes (antígenos purificados, bacterinas e lisados celulares) contra as toxinas CPA,

CPB e ETX produzidas por C.

perfringens, conforme reivindicações 2,

2. Processo de produção de vacinas recombinantes contra toxinas CPA, CPB e ETX produzidas por C. perfringens compostas por proteínas recombinantes solubilizadas, purificadas e redobradas, caracterizado por usar clones recombinantes de E. coli expressando CPA, CPB e ETX, conforme reivindicação 1;

3. Formulações para finalidades terapêuticas, diagnosticas, vacinas ou qualquer finalidade imunobiológica, caracterizadas por conterem as toxinas recombinantes purificadas CPA, CPB e ETX de C. perfringens, conforme reivindicação 2.

4. Processo de produção de vacinas recombinantes contra toxinas CPA, CPB e ETX produzidas por C. perfringens compostas por células de E. coli recombinantes inativadas (bacterinas recombinantes) com formaldeído, Beta-propiolactona, timerosal ou similar, ou mediante tratamento físico (térmico, ultrassom ou pressão), caracterizado por usar clones recombinantes de E. coli expressando CPA, CPB e ETX, conforme reivindicação 1, ou expressando outros antígenos recombinantes.

5. Processo de produção de vacinas compostas por bacterinas recombinantes, conforme reivindicação 4, caracterizado por dispensar a lise celular,

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4 e 6, caracterizadas por compreenderem antígenos capazes de estimular resposta imunológica protetora contra as toxinas CPA, CPB e ETX, pela formação de anticorpos que neutralizam as referidas toxinas.