CN109701007A

CN109701007A - 一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法

Info

Publication number: CN109701007A
Application number: CN201910121282.3A
Authority: CN
Inventors: 陈小云; 杜吉革; 刘莹; 薛麒; 朱真; 印春生; 李启红; 康凯; 姚文生
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明涉及一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗。本发明制备的产气荚膜梭菌β毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有多个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力优良等优点，较我国目前商品化的产气荚膜梭菌天然毒素灭活疫苗大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是我国现行B型和C型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

Description

一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病，其中，对畜牧业危害较大的是羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症、猪红痢等。该菌主要通过其分泌的外毒素致病，根据产生4种主要致死性外毒素α、β、γ和ι的种类，将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型。产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法。

目前使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷。第一是存在生物安全性问题，在该类疫苗的制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。此外，疫苗生产中产生的副产物如培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应特别是联苗中每种菌株的类毒素免疫量均较高，组合后的总免疫量过大，容易引起动物的应激反应；第二是免疫效果不尽理想且不稳定。由于此类灭活疫苗的抗原成分复杂，有效抗原含量较低，导致免疫效果不尽理想，有学者等对自2006年至2015年间的此类疫苗免疫检验结果的统计发现，以血清中和法检验后效力不符合规定的产品共有33批，其β毒素组分效力不符合规定的比例最高，约为72.7％。此外，制备此类疫苗的培养基中需要添加新鲜制备的肉汤，培养基批次间的稳定性无法保障。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。

β毒素(CPB)是B型和C型产气荚膜梭菌的主要致病因子，具有细胞毒性和致死性，能导致人和动物的坏死性肠炎。其中，CPB在B型和C型产气荚膜梭菌中高度保守，氨基酸同源性在99％以上。虽然外源重组CPB分子具有一定的免疫保护作用，但需要考虑到蛋白的毒性。已有的研究表明，以可溶性形式表达的重组CPB具有较强的毒力，而以包涵体形式表达的重组CPB的毒力基本上可以忽略。然而，因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。根据上述的研究内容，本课题组前期申请的专利“一种产气荚膜梭菌CPB基因工程疫苗及其生产方法”(申请号或专利号：201810868174.8)获得了带有助溶标签麦芽糖蛋白(MBP)的、含有4个氨基酸突变(第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸)的重组融合蛋白，rMBP-CPB_m4，结果显示，rMBP-CPB_m4以可溶性的形式表达，经纯化后获得了免疫原性良好的无毒抗原蛋白。由于MBP标签具有较大的蛋白分子量(40kDa)较大，从而导致融合蛋白的有效抗原成分降低，且可能会影响融合蛋白的表达水平。为此，选择分子量小、助溶效果较好的助溶标签是重要的环节。已有研究发现，一种小分子泛素样修饰蛋白SUMO(Small ubiquitin-likemodifier)可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。为此，SUMO与CPB_m4的融合表达具有重要意义。

本发明制备的无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，系采用经过密码子优化、含有SUMO标签蛋白和多个氨基酸突变的β毒素的重组融合蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行B型和C型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。

发明内容

本发明目的在于利用构建的重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白的大肠杆菌制备出产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，用于预防由B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。

本发明技术方案

1.一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白的大肠杆菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/SUB株，该菌株已于2019年01月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17164；

所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变；在N端添加助溶蛋白和C端含有便于蛋白的纯化的标签。

2.本发明所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，含有多个氨基酸的突变，优选的为4个氨基酸突变为第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸。

3.本发明所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，其基因序列经过密码子优化，其N端添加的助溶蛋白，优选的为SUMO标签，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶表达。

4.本发明所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，含有便于蛋白的纯化的标签优选为C端含有6组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。

5.本发明所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

6.本发明所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于其制备方法为：用所述表达产气荚膜梭菌β毒素重组蛋白的埃希氏大肠菌BL/SUB(Escherichia coli)BL/SUB(CGMCC No.17164)株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。

本发明具有以下新的技术效果

1.对β毒素同时进行了多个氨基酸突变，获得了无毒的重组β毒素，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。2.对β毒素的编码基因进行了密码子优化，实现了在大肠杆菌中的高效表达。3.首次将β毒素与小分子量的助溶标签SUMO融合表达，实现了在大肠杆菌中的可溶性表达，获得了有效抗原比例高的融合蛋白，从而一方面避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本，另一方面也避免的大分子量标签蛋白的影响。4.采用基因工程方法制备亚单位疫苗替代传统的培养致病性梭菌制备毒素再灭活脱毒的办法，大大降低了生产过程中的生物安全风险。

本发明的积极意义

本发明涉及一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法。本发明将野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素的第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸获得了对于动物体无毒的β毒素突变体(BL/SUB株)。本发明进一步公开了含有所述产气荚膜梭菌β毒素无毒突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明重组表达的产气荚膜梭菌β毒素无毒突变体在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本发明的产气荚膜梭菌β毒素无毒突变体或其编码基因能够应用于制备预防B型和C型产气荚膜梭菌病的β毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。采用本发明提出的产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，与我国目前商品化的产气荚膜梭菌天然毒素灭活疫苗相比，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，生产方法稳定性好、耗时短，而且所制备的疫苗一免后的血清中和效价对B型和C型产气荚膜梭菌均可达到目前商品化疫苗标准。与前期“一种产气荚膜梭菌CPB基因工程疫苗及其生产方法”(申请号或专利号：201810868174.8)获得的rMBP-CPB_m4相比，本专利获得的融合蛋白中的标签蛋白分子量明显降低，不仅表达量增加，而且有效抗原含量也显著增大，二免血清的中和效价明显增强。此外，凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发。

附图说明

图1：基因工程重组菌BL/SUB株的SDS-PAGE鉴定结果，图中：M₁:Protein marker；PC₁:BSA(1μg)；PC₂:BSA(2μg)；pET:空载体细胞裂解物；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；3:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀。

图2：基因工程重组菌BL/SUB株的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果图中：M2:Western blot marker；PC₁:BSA(1μg)；PC₂:BSA(2μg)；pET:空载体细胞裂解物；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；3:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀。

图3：目的蛋白的纯化图图中M1:Protein marker；1:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；2:流穿液；3:20mM咪唑洗脱液；4:50mM咪唑洗脱液；5～6:500mM咪唑洗脱液。

图4：rSUMO-CPB_m4免疫家兔和绵羊血清对毒素的中和效价图中1：B型产气荚膜梭菌毒素；2：C型产气荚膜梭菌毒素。

本发明涉及生物材料资源信息

本发明涉及的微生物为：含有4个氨基酸突变(分别为第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸)、N端含有SUMO标签、C端含有6组氨酸(6His)标签的表达产气荚膜梭菌β毒素的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/SUB株，该菌株于2019年01月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17164。

本发明具体实施方式

1.大肠埃希氏菌BL/SUB株的构建、表达及鉴定

(1)基因合成

本申请根据产气荚膜梭菌β毒素天然蛋白基因的序列，经密码子优化后，设计了4个氨基酸突变，分别将野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素的第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸，同时，在N端和C端分别添加SUMO标签和6×His标签，从而获得了对于动物体无毒的β毒素突变体。用化学合成的方法，合成了该段基因序列GSUMO-CPB_m4，共包含1296个核苷酸。具体的核酸序列如SEQ ID No.1所示：

氨基酸序列见SEQ ID No.2所示：

(2)融合表达载体的构建

以人工合成的GSUMO-CPB_m4基因为模板，采用引物对1F/1R(序列3/序列4)进行PCR扩增。

其中上游引物1F序列为：

5’-cggccatatg tctgattctg aag-3’23(序列3)，其5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基；

下游引物1R序列为：

5’-ccgcaagctt ttagtggtga tg-3’22(序列4)，其5’端引入限制性内切酶HindIII位点及保护性碱基。

PCR体系为：5×PrimeBuffer(Mg2+plus)10μL，dNTPs 4μL，上、下游引物各1μL，PrimeHS聚合酶1μL，DNA模板2μL，补充dd H₂O至50μL体系。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共33个循环；最后72℃环延伸10min。

扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/Hind III双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入GSUMO-CPB_m4基因阳性克隆pET30a-SUMO-CPB_m4。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

(3)重组GSUMO-CPB_m4基因的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌((Escherichia coli)BL/SUB株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存，该菌株于2019年01月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17164。

(4)目的蛋白的表达

将重组的大肠埃希氏菌(E.coli)BL/SUB株接种于4mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.6～0.8时，将温度降至15℃，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液诱导培养16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图1。从图1可以看出，目的蛋白rSUMO-CPB_m4大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达。目的蛋白的最适诱导表达条件为15℃，诱导表达16h。

(5)目的蛋白的鉴定

采用上述步骤中诱导条件下的rSUMO-CPB_m4，采用抗His抗体，对其进行Westernblot鉴定，结果见图2。从图2可知，15℃、16h诱导的细胞裂解上清中，rSUMO-CPB_m4表达量最高，约占目的蛋白总表达量的17％。由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，进一步确定目的蛋白的最适诱导表达条件为15℃，诱导表达16h。

(6)rSUMO-CPB_m4的纯化将重组的大肠埃希氏菌(E.coli)BL/SUB株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.6～0.8时，将温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液诱导培养16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按照步骤4中的方法收集上清。向上述步骤4收集的上清中，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒(南京金斯瑞公司)的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白。

(7)rSUMO-CPB_m4对小鼠的毒力试验

通过测定rSUMO-CPB_m4对小鼠的毒力，以验证该融合蛋白在体内的实际减毒效果。将纯化的rSUMO-CPB_m4，以及C型产气荚膜梭菌培养上清，分别以不同的剂量，经尾静脉接种16～18g的ICR小鼠，每剂量注射5只，0.2mL/只。结果当接种剂量为0.1mg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而野生型对照组在接种0.001mL时即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，rSUMO-CPB_m4在小鼠体内是无毒的，被确定为毒素无毒突变体。

表1 rSUMOCPB_m4对小鼠的毒力

2.产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的制备

(1)菌种：制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/SUB株，该菌种表达的产气荚膜梭菌β毒素蛋白含有4个氨基酸突变(分别为第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸)、N端含有SUMO标签、C端含有6组氨酸(6His)标签。

(2)制苗用抗原制备：取合格的菌种，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，培养温度37℃，当培养物OD₆₀₀值为0.6～0.8时，温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养16h。

(5)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2 0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。

(6)纯化：按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒(南京金斯瑞公司)的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，-80℃保存备。

(7)蛋白含量检测：用BCA法检检测试剂盒(Pierce^TM BCA Protein Assay Kit，TG268883)测蛋白含量。

(8)疫苗配制：将双相油佐剂(206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。

3.产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的检验

(1)性状

外观乳白色乳剂。

剂型呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5mL。

黏度按《中国兽药典》附录进行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)测定，应符合规定。

(2)装量检查按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

(3)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(4)安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗4.0mL，观察10日。应全部健活。

(5)效力检验

血清中和法：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只和6～12月龄、体重30～40kg的绵羊4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后21日，采血，分离血清。同时，以相同剂量、相同途径对家兔进行二次免疫，二免后14日，采血，分离血清。分别取一免和二免的每只免疫家兔血清0.4mL，分别与B和C型产气荚膜梭菌毒素(含4及以上个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。观察1日，判定结果。

对照鼠全部死亡，血清中和效价对B和C型产气荚膜梭菌毒素分别达到1及以上(0.1mL免疫动物血清中和1及以上MLD毒素)，即判为合格。

免疫攻毒法：用体重1.5～2.0kg健康家兔6只，取其4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL，剩余2只作为对照。接种后21日，取4只免疫组家兔和2只对照组家兔，分别静脉注射1MLD的B和C型产气荚膜梭菌毒素，观察5日。

对照兔全部死亡，免疫动物至少保护3只，即判为合格。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制，通过其它氨基酸位点突获得的β毒素突变体以及添加其它标签实现β毒素突变体在大肠杆菌中高表达和可溶性表达的也在本专利的保护范围内。

实施例1

——大肠埃希氏菌BL/SUB株的构建、表达及鉴定

1.基因合成

本申请根据产气荚膜梭菌β毒素天然蛋白基因的序列，经密码子优化后，设计了4个氨基酸突变，分别将野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素的第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸，从而获得了对于动物体无毒的β毒素突变体。同时，在N端和C端分别添加SUMO标签和6×His标签。用化学合成的方法，合成了该段基因序列GSUMO-CPB_m4，共包含1296个核苷酸。具体的核酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列见SEQ ID No.2所示。

2,融合表达载体的构建

其中上游引物1F序列为：

下游引物1R序列为：

3.重组GSUMO-CPB_m4基因的基因工程菌株的构建

实施例2

——目的基因的表达和鉴定

1.目的蛋白的表达

2.目的蛋白的鉴定

实施例3

——rSUMO-CPB_m4的纯化

将重组的大肠埃希氏菌(E.coli)BL/SUB株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.6～0.8时，将温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液诱导培养16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按照步骤4中的方法收集上清。向上述步骤4收集的上清中，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白rSUMO-CPB_m4。

实施例4

——rSUMO-CPB_m4对小鼠的毒力试验

表1 rSUMOCPB_m4对小鼠的毒力

实施例5

——产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的制备

1.菌种：制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/SUB株。

(1)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。

(2)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。

(3)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，培养温度37℃，当培养物OD₆₀₀值为0.6～0.8时，温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养16h。

(4)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2 0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。

(5)纯化：按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，-80℃保存备。

(6)蛋白含量检测：用BCA法检检测试剂盒(PierceTM BCA Protein Assay Kit，TG268883)测蛋白含量。

(7)疫苗配制：将双相油佐剂(206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。

实施例6

——产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的检验

1.性状

外观乳白色乳剂。

2.装量检查按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

3.无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗4.0mL，观察10日。应全部健活。

5.效力检验

(1)血清中和法：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只和6～12月龄、体重30～40kg的绵羊4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后21日，采血，分离血清。同时，以相同剂量、相同途径对家兔进行二次免疫，二免后14日，采血，分离血清。分别取一免和二免的每只免疫家兔血清0.4mL，分别与B和C型产气荚膜梭菌毒素(含4及以上个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。观察1日，判定结果。

(2)免疫攻毒法：用体重1.5～2.0kg健康家兔6只，取其4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL，剩余2只作为对照。接种后21日，取4只免疫组家兔和2只对照组家兔，分别静脉注射1MLD的B和C型产气荚膜梭菌毒素，观察5日。

对照兔全部死亡，免疫动物至少保护3只，即判为合格。

《中国兽药典》规定，家兔血清中的毒素抗体效价对B型和C型产气荚膜梭菌毒素达到1.0，免疫攻毒法中，免疫动物至少保护3只，即可判为疫苗中B型和C型产气荚膜梭菌毒素部分为合格。如图4所示，一次免疫后，家兔血清中和效价对B和C型产气荚膜梭菌毒素均可达到1(即0.1mL家兔血清可中和1个MLD的C型产气荚膜梭菌毒素)；二次免疫后，家兔血清中的毒素抗体效价对B和C型产气荚膜梭菌毒素分别可达到8～12和8～13个MLD。免疫攻毒法结果显示，在一免21d后进行耳静脉注射1MLD的B型和C型产气荚膜梭菌毒素，免疫组家兔均得到100％(4/4)的保护，对照组家兔全部(2/2)死亡。二免后，羊血清中的毒素抗体效价对B和C型产气荚膜梭菌毒素分别可达到6～9和5～8个MLD。

因此，本发明生产的疫苗，在抗原含量低至100μg/只的情况下，无论是对家兔和绵羊，二次免疫后动物血清中和效价均达到现行《中国兽药典》的标准的6倍以上。对于家兔，一免血清中和效价均达到现行《中国兽药典》的标准，且免疫攻毒保护效果也达到了现行《中国兽药典》的规定，证明该疫苗具有良好的免疫原性。

鉴于我国现有商品化梭菌毒素疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。因此，本申请生产的疫苗是我国现行B型和C型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<220>

<223> 对人工序列的描述：标签蛋白SUMO与产气荚膜梭菌β毒素突变体融合基因序列

<400> 1

catatgtctg attctgaagt aaaccaggaa gcgaaaccgg aagttaaacc ggaagttaaa 60

ccggaaaccc acattaacct gaaagtttct gacggctcct ctgaaatctt cttcaagatc 120

aagaagacca ctccactgcg tcgtctgatg gaggcctttg ctaaacgcca gggtaaagag 180

atggattctc tgcgcttcct gtacgatggt attcgtatcc aagcggatca gactccggag 240

gacctggaca tggaagataa tgacatcatt gaagcccacc gcgaacagat tggcggtgcg 300

acctacggtg gtggcggttc cggcggtggt ggcagccata tgaacgatat tggcaaaacc 360

acgacgatta cccgcaacaa aacgagcgat ggctacacga ttattacgca gaacgacaaa 420

cagattattt cctatcagtc agtggatagc tctagtaaaa acgaagacgg ctttaccgcg 480

tctattgatg cccgtttcat cgatgacaaa tattcctcag aaatgaccac gctgatcaac 540

ctgaccggtt ttatgtcgag caagaaagaa gatgttatca aaaaatacaa tctgcatgat 600

gtcaccaaca gtacggcaat caatttcccg gtccgctact ccatttcaat cctgaacgaa 660

tcgatcaacg aaaacgtcaa aatcgtggat agcatcccga aaaacaccat ctcccaaaaa 720

accgtgtcaa atacgatggg ctacaaaatt ggcggtagca ttgaaatcga agaaaacaaa 780

ccgaaagcat ctatcgaaag tgaatatgct gaatctagta ccatcgaata cgttcagccg 840

gacttttcta ccattcaaac ggatcactcg acgagcaaag ccagttggga caccaaattc 900

acggaaacca cgcgtggcaa ctataatctg aaaagcaaca atccggtgta cggcaacgaa 960

atgtttatgt atggtgaata caccaacgtt ccggcgacgg aaaatattat cccggattat 1020

cagatgtcca aactgattac cggcggtctg aacccgaata tgtcagtggt tctgaccgcc 1080

ccgaatggta cggaagaatc gattatcaaa gtcaaaatgg aacgtgaacg caactgcgcg 1140

tacggcaact ggaatggtgc caacgcggtg ggtcaagtgt attctcgtct ggctttcgat 1200

actccaaacg ttgactctca catcttcacc ttcaagatca actggctgac tcataaagtt 1260

accgcaatcc atcaccatca tcaccactaa aagctt 1296

<210> 2

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<220>

<223> 对人工序列的描述：标签蛋白SUMO与产气荚膜梭菌β毒素突变体融合蛋白序列

<400> 2

His Met Ser Ala Ser Gly Val Ala Gly Gly Ala Leu Pro Gly Val Leu

1 5 10 15

Pro Gly Val Leu Pro Gly Thr His Ile Ala Leu Leu Val Ser Ala Gly

20 25 30

Ser Ser Gly Ile Pro Pro Leu Ile Leu Leu Thr Thr Pro Leu Ala Ala

35 40 45

Leu Met Gly Ala Pro Ala Leu Ala Gly Gly Leu Gly Met Ala Ser Leu

50 55 60

Ala Pro Leu Thr Ala Gly Ile Ala Ile Gly Ala Ala Gly Thr Pro Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ala Met Gly Ala Ala Ala Ile Ile Gly Ala His Ala Gly Gly

85 90 95

Ile Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

His Met Ala Ala Ile Gly Leu Thr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Leu Thr

115 120 125

Ser Ala Gly Thr Thr Ile Ile Thr Gly Ala Ala Leu Gly Ile Ile Ser

130 135 140

Thr Gly Ser Val Ala Ser Ser Ser Leu Ala Gly Ala Gly Pro Thr Ala

145 150 155 160

Ser Ile Ala Ala Ala Pro Ile Ala Ala Leu Thr Ser Ser Gly Met Thr

165 170 175

Thr Leu Ile Ala Leu Thr Gly Pro Met Ser Ser Leu Leu Gly Ala Val

180 185 190

Ile Leu Leu Thr Ala Leu His Ala Val Thr Ala Ser Thr Ala Ile Ala

195 200 205

Pro Pro Val Ala Thr Ser Ile Ser Ile Leu Ala Gly Ser Ile Ala Gly

210 215 220

Ala Val Leu Ile Val Ala Ser Ile Pro Leu Ala Thr Ile Ser Gly Leu

225 230 235 240

Thr Val Ser Ala Thr Met Gly Thr Leu Ile Gly Gly Ser Ile Gly Ile

245 250 255

Gly Gly Ala Leu Pro Leu Ala Ser Ile Gly Ser Gly Thr Ala Gly Ser

260 265 270

Ser Thr Ile Gly Thr Val Gly Pro Ala Pro Ser Thr Ile Gly Thr Ala

275 280 285

His Ser Thr Ser Leu Ala Ser Thr Ala Thr Leu Pro Thr Gly Thr Thr

290 295 300

Ala Gly Ala Thr Ala Leu Leu Ser Ala Ala Pro Val Thr Gly Ala Gly

305 310 315 320

Met Pro Met Thr Gly Ala Thr Thr Gly Val Pro Ala Thr Gly Ala Ile

325 330 335

Ile Pro Ala Thr Gly Met Ser Leu Leu Ile Thr Gly Gly Leu Ala Pro

340 345 350

Ala Met Ser Val Val Leu Thr Ala Pro Ala Gly Thr Gly Gly Ser Ile

355 360 365

Ile Leu Val Leu Met Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Thr Gly Ala Thr

370 375 380

Ala Gly Ala Ala Ala Val Gly Gly Val Thr Ser Ala Leu Ala Pro Ala

385 390 395 400

Thr Pro Ala Val Ala Ser His Ile Pro Thr Pro Leu Ile Ala Thr Leu

405 410 415

Thr His Leu Val Thr Ala Ile His His His His His His

420 425

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<220>

<223> 对人工序列的描述：扩增标签蛋白SUMO与产气荚膜梭菌β毒素突变体融合基因的上游引物1F

<400> 3

cggccatatg tctgattctg aag 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<220>

<223> 对人工序列的描述：扩增标签蛋白SUMO与产气荚膜梭菌β毒素突变体融合基因的下游引物1R

<400> 4

ccgcaagctt ttagtggtga tg 22

Claims

1.一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于该疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白的大肠杆菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/SUB株，该菌株已于2019年01月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17164；该疫苗用于同时预防由B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病；

2.如权利要求1所述无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变，优选的为以下4个氨基酸突变，分别为第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸。

3.如权利要求1所述无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，其基因序列经过密码子优化，并在N端添加的助溶蛋白，优选的为小分子泛素样修饰蛋白SUMO(Small ubiquitin-likemodifier)，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶性表达。

4.如权利要求1所述无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，其C端含有便于蛋白的纯化的标签优选为6组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。

5.如权利要求1所述无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

6.如权利要求1所述无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于其制备方法为：用所述表达产气荚膜梭菌β毒素重组蛋白的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/SUB(CGMCC No.17164)株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。