CN107308445A - 羊三联四防亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊三联四防亚单位疫苗及其制备方法，属于动物疫病防控领域。本发明由产气荚膜梭菌β‑ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白和佐剂组成。本发明克隆、表达的产气荚膜梭菌C58‑1株的β‑ε(β和ε融合蛋白)和腐败梭菌C55‑2株α毒素蛋白，纯化后与佐剂混合后配制成疫苗免疫小白鼠和家兔，利用《中国兽药典》二〇一五年版三部关于羊“三联四防疫苗”检验标准检验合格，并且攻毒保护试验结果表明，免疫上述蛋白的动物对产气荚膜梭菌B型、C型、D型和腐败梭菌具有100％保护力。因此，本发明可替代传统“三联四防”疫苗。

Description

羊三联四防亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及动物疫病防控领域，特别涉及一种羊三联四防亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

产气荚膜梭菌(C.perfringens)最早是由英国人Welchii和Nuttad从一个腐败的、产生气泡的人尸血管中分离得到的，因此，曾被命名为魏氏梭菌(Cl.welchii)。产气荚膜梭菌是一种条件性致病菌，可引起多种动物坏死性肠炎、肠毒血症和创伤性气性坏疽。牲畜方面，可引起羊肠毒血症、羔羊痢疾、牛羊猝狙；中大猪和母猪胀气及猝死、仔猪坏死性肠炎；马、鹿、兔的梭菌性肠炎等。家禽方面，可引起鸡、鸭、鸽等坏疽性皮炎和坏死性肠炎，给养禽业造成巨大经济损失。根据不同菌株对α、β、ε、ι毒素产生的情况将该菌分为A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)、E(α、ι)5个型。很多菌株还产生肠毒素(C.perfingens enterotoxin,CPE)、β2毒素、产气荚膜梭菌溶血素(PFO)、坏死性肠炎毒素(NetB)和产气荚膜梭菌大分子细胞毒素(tpeL)。

梭菌外毒素是梭菌疫苗的有效免疫抗原，且利用灭活梭菌培养过程中产生的毒素可实现梭菌性疾病的有效免疫。因此，培养此类细菌，使其大量生长繁殖并分泌高浓度、强毒力的毒素，可制备免疫效果优良的疫苗。羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗(简称羊三联四防灭活疫苗)就是其中之一，在我国被广泛使用。

常规羊三联四防灭活疫苗生产中一般使用厌气肉肝胃酶消化汤培养厌气梭菌，需要牛肉、肝、胃蛋白酶等原料，成本高，并且工艺复杂。另一方面，由于受到原材料品质的影响(如抗生素的残留、新鲜度等)，培养基质量不易控制，进而影响疫苗的质量。其次，常规苗具有免疫剂量大(5mL/只)、免疫副反应较高等缺点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，解决现有技术中羊三联四防疫苗生产工艺复杂、成本高、培养基质质量不易控制、进而影响疫苗质量且免疫剂量大、免疫副反应较高的问题，本发明提供了一种羊三联四防亚单位疫苗及其制备方法。本发明利用原核表达系统高效表达了魏氏梭菌株C58-1株的β-ε(β和ε融合蛋白)和腐败梭菌C55-2株α毒素蛋白，纯化后与佐剂混合后配制成疫苗，替代传统“三联四防”疫苗。

本发明的技术方案为：

一种羊三联四防亚单位疫苗，由产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白和佐剂组成。

作为优选方案，所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白、佐剂的重量比为1-3:1-3:1-3。

比如，本发明疫苗可由10mL浓度为1.0mg/mL的产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白原液、10mL浓度为1.0mg/mL的腐败梭菌α毒素重组蛋白原液、20mL PBS溶液和10g铝胶构成。

作为优选方案，所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白的制备方法如下：

根据产气荚膜梭菌C58-1株β和ε基因序列设计六条特异性引物，引物序

列为：pεb1947s1:GCTTTTCCTAGGGATG；

pεb1947s2:AATGATATAGGTAAAACTACTAC；

pεb1947r1:TTTTATTCCTGGTGCC；

pεb1947r2:CTTCTTTCGCCGC；

pεb1947r3:TACCTATATCATTCGCTTTCG；

pεb1947r4:TATTTTGAATGTAAATATATGAC；

其中下划线部分是β和ε序列自带的AvrⅡ和SalⅠ酶切位点，斜体和黑体部分是连接肽序列；

将C58-1株β毒素基因和ε毒素基因克隆在PET-32a载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET1947；

将pET1947与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET1947；

用IPTG对重组菌株诱导表达，经纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白。

作为优选方案，腐败梭菌α毒素重组蛋白的制备方法如下：

根据腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列，设计1对特异性引物，克隆α毒素基因序列的349-1014nt区域，引物序列为：

pα666s:GGGGGATCCAGATACAATCCAAATGATC

pα666r:GGGGTCGACCCATTCTGAATATCCATTA；

其中下划线部分是添加的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点；

腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列克隆在PET-2载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET666；

将pET666与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET666；

用IPTG对重组菌株诱导表达，经纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白。

产气荚膜梭菌C58-1株β毒素基因、ε毒素基因以及β毒素和ε毒素连接肽基因序列为：

所述腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列为：

所述羊三联四防亚单位疫苗的制备方法，由所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白和佐剂复配而成。

所述羊三联四防亚单位疫苗的制备方法，包括步骤：

1)获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白

根据产气荚膜梭菌C58-1株β和ε基因序列设计六条特异性引物，引物序

列为：pεb1947s1:GCTTTTCCTAGGGATG；

pεb1947s2:AATGATATAGGTAAAACTACTAC；

pεb1947r1:TTTTATTCCTGGTGCC；

pεb1947r2:CTTCTTTCGCCGC；

pεb1947r3:TACCTATATCATTCGCTTTCG；

pεb1947r4:TATTTTGAATGTAAATATATGAC；

其中下划线部分是β和ε序列自带的AvrⅡ和SalⅠ酶切位点，斜体和黑体部分是连接肽序列；

将C58-1株β毒素基因和ε毒素基因克隆在PET-32a载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET1947；

将pET1947与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET1947；

用0.1mM的IPTG，30℃，对重组菌株诱导表达5h，经Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白；

2)获得所述腐败梭菌α毒素重组蛋白

根据腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列，设计1对特异性引物，克隆α毒素基因序列的349-1014nt区域，引物序列为：

pα666s:GGGGGATCCAGATACAATCCAAATGATC

pα666r:GGGGTCGACCCATTCTGAATATCCATTA；

其中下划线部分是添加的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点；

腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列克隆在PET-2载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET666；

将pET666与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET666；

用IPTG对重组菌株诱导表达，经纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白；

3)将所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白和佐剂均匀混合，获得羊三联四防亚单位疫苗。

本发明的有益效果为：

本发明克隆、表达的产气荚膜梭菌C58-1株的β-ε(β和ε融合蛋白)和腐败梭菌C55-2株α毒素蛋白，纯化后与佐剂混合后配制成疫苗免疫小白鼠和家兔，利用《中国兽药典》二〇一五年版三部关于羊“三联四防疫苗”检验标准检验合格，并且攻毒保护试验结果表明，免疫上述蛋白的动物对产气荚膜梭菌B型、C型、D型和腐败梭菌具有100％保护力。因此，本发明可替代传统“三联四防”疫苗。

另外，本发明中融合蛋白除了两个蛋白质序列外，中间加有疏水性连接肽，两种蛋白有充分空间展开，生物活性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为β-ε毒素基因克隆；M.DNA分子量标准(DL2000)；1，2，3.PCR扩增产物；

图2为pET1947的酶切鉴定；M.DNA分子量标准(DL15000)；1-3.pET1947的SalⅠ和AvrⅡ双酶切产物；

图3.为腐败梭菌α毒素基因666bp片段的克隆；M.DNA分子量标准(DL2000)；1，2，3，4，5.PCR扩增产物；

图4为pET666的酶切鉴定；M，DNA分子量标准(DL2000)；1-2，pET666的SalⅠ和BamHⅠ双酶切产物；

图5为pET1947表达产物的SDS-PAGE分析；M，蛋白质分子量标准；1，重组菌；2，空质粒菌株对照；3，诱导菌株上清；4，诱导菌株包涵体；

图6为pET666表达产物的SDS-PAGE分析；M，蛋白质分子量标准；1，pET666转入Rosetta表达菌株，30度诱导,上清；2，pET666转入Rosetta表达菌株，30度诱导,包涵体；3，pET 666转入Rosetta表达菌株，20度诱导,上清；4，pET 666转入Rosetta表达菌株，20度诱导,包涵体。

具体实施方式

实施例1：魏氏梭菌C58-1株β-ε和腐败梭菌C55-2株α毒素的克隆和表达载体的构建

1.1β-ε毒素基因克隆和表达载体的构建

根据C58-1株β和ε序列，设计了6条特异性引物，引物序列为：

pεb1947s1:GCTTTTCCTAGGGATG；

pεb1947s2:AATGATATAGGTAAAACTACTAC；

pεb1947r1:CTTCGCCGCCGCTTCCGCTTTTATTCCTGGTGCC；

pεb1947r2:

GGGGTCGACCTATATCATTCGCGCCGCCGCTTCTTTCGCCGC；

pεb1947r3:TACCTATATCATTCGCTTTCG；

pεb1947r4:TATTTTGAATGTAAATATATGAC。其中下划线部分是β和ε序列自带的AvrⅡ和SalⅠ酶切位点，斜体和黑体部分是连接肽序列。

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图1所示。由结果表明，存在一条小于2000bp的特异性条带，与片段理论大小一致。

利用限制性核酸内切酶SalⅠ和AvrⅡ对克隆在pET-32a载体的β-ε毒素基因进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳图像出现2条近似2000bp和5900bp的目的条带，其大小与融合蛋白基因和pET-32a载体相符合。因此，获得正确的重组表达质粒，命名为pET1947(图2)。

1.2α毒素基因克隆和表达载体的构建

根据C55-2株α毒素序列，设计了1对特异性引物，克隆α毒素序列的349-1014nt区域，引物序列为：

pα666s:GGGGGATCCAGATACAATCCAAATGATC

pα666r:GGGGTCGACCCATTCTGAATATCCATTA。其中下划线部分是添加的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图3所示。由结果表明，存在一条小于750bp的特异性条带。

利用限制性核酸内切酶SalⅠ和BamHⅠ对克隆在pET-32a载体的666片段毒素基因进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳图像分别出现目的条带，其大小与毒素基因和pET-32a载体相符合。因此，获得正确的重组表达质粒，命名为pET666(图4)。

实施例2β-ε和α毒素的表达与纯化

1.2β-ε毒素的表达与纯化

将pET1947与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET1947；将重组菌株BL21(DE3)-pET1947按照1:100的比例加入LB/Amp的培养基中，37℃摇床摇菌(180r/min)3h。当OD600达到0.4时，加入浓度1mol/L的IPTG，同时设置空载体对照组，于37℃摇床上诱导5h，转速为180r/min。之后，取诱导的菌液以4000r/min转速离心20min，PBS重悬，超声波破碎至澄清状态。在4℃温度下，以12000r/min转速离心10min。超声波破碎诱导的菌液各1mL，裂解后的菌液于10000r/min转速离心10min，收集沉淀和上清，进行SDS-PAGE电泳分析，分析表达产物的存在形式。

沉淀经8M尿素变性溶解并用PH值7.4的PBS透析复性，利用GE公司的His-Trap FF预装柱固定于AKTA-Purifier100仪上，按仪器要求进行分离纯化，收集各分离成分后进行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE分析结果表明，β-ε毒素基因在包涵体获得表达(图5)。其分子质量约为87ku。

2.2α毒素的表达与纯化

将pET666与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET666；将重组菌株BL21(DE3)-pET666按照1:100的比例加入LB/Amp的培养基中，37℃摇床摇菌(180r/min)3h。当OD600达到0.4时，加入浓度1mol/L的IPTG，同时设置空载体对照组，于37℃摇床上诱导5h，转速为180r/min。之后，取诱导的菌液以4000r/min转速离心20min，PBS重悬，超声波破碎至澄清状态。在4℃温度下，以12000r/min转速离心10min。超声波破碎诱导的菌液各1mL，裂解后的菌液于10000r/min转速离心10min，收集沉淀和上清，进行SDS-PAGE电泳分析，分析表达产物的存在形式。

沉淀经8M尿素变性溶解并用PH值7.4的PBS透析复性，利用GE公司的His-Trap FF预装柱固定于AKTA-Purifier100仪上，按仪器要求进行分离纯化，收集各分离成分后进行SDS-PAGE分析。

用SDS-PAGE分析结果表明，α毒素基因666片段获得了表达，其分子质量约为44ku。IPTG诱导重组菌株毒素在包涵体获得表达(图6)。

实施例3β-ε和α毒素蛋白对动物免疫保护研究(根据中华人民共和国兽药典2010版三部羊“三联四防疫苗”检验标准)

3.1小鼠致死活性试验及结果

选用明胶缓冲液对腐败梭菌α毒素重组蛋白、产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白进行稀释，选50、100、150ug三个滴度，每个滴度各腹腔注射小鼠2只，观察3～5天。稀释方法及结果如下表1所示。试验结果表明，腐败梭菌α毒素重组蛋白、产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白对小鼠有毒性，腹腔注射小鼠的MLD均应在50-100ug之间。

表1 β-ε和α毒素蛋白毒力检测

注：*死亡数/注射数，下标为动物死亡时间。

3.2脱毒试验

3.2.1腐败梭菌α毒素重组蛋白脱毒试验

添加甲醛0.5％的比例，4℃，灭活脱毒6天，0.2ml/200ug，腹腔注射小鼠2只，观察5天，小鼠无死亡。

3.2.2产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白脱毒试验

添加甲醛0.5％的比例，4℃，灭活脱毒6天，0.2ml/200ug，腹腔注射小鼠2只，观察5天，小鼠无死亡。

3.3铝胶苗的制备及实验兔、绵羊免疫

3.3.1疫苗配制

配制α毒素+融合蛋白-铝胶苗，详见下表2。

表2 β-ε和α铝胶苗的配制

3.3.2实验兔免疫

免疫实验兔4只，每只实验兔皮下或肌肉注射1.0ml疫苗(含α毒素抗原、融合蛋白抗原各200ug)。免疫21天后，采血分离血清，进行小鼠血清中和试验。

3.3.3绵羊免疫

免疫绵羊24只，分成4组，每组6只，其中每组的4只动物皮下注射1.0ml疫苗(含α毒素抗原、融合蛋白抗原各200ug)，另2只作对照。免疫21天后，每只动物各注射强毒毒素，进行免疫攻毒试验。

3.4小鼠中和试验及结果

试验方法：分别采取免疫兔血清，4只动物血清等量混合，取混合血清0.4ml分别与0.8ml的腐败梭菌毒素(含4个小鼠MLD)、C型产气荚膜梭菌毒素(含4个小鼠MLD)、B型产气荚膜梭菌毒素(含4个小鼠MLD)和D型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠MLD)，置37℃作用40分钟，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3ml/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。检测腐败梭菌毒素中和效价的小鼠观察3日，检测其他毒素抗体效价的小鼠观察1日，判定结果。

判定标准：对照鼠全部死亡，血清中和效价对腐败梭菌毒素、B型产气荚膜梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素的效价达到1(0.1ml免疫动物血清中和1MLD毒素)，D型产气荚膜梭菌毒素达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)，即判为合格。实验结果如表3所示。

中和试验结果表明：α毒素+融合蛋白-铝胶苗血清中和对腐败梭菌天然毒素的效价可达到1(0.1ml免疫动物血清可中和1MLD毒素)；对B、C型产气荚膜梭菌天然毒素的效价可达到1(0.1ml免疫动物血清可中和1MLD毒素)，对D型产气荚膜梭菌天然毒素的效价可达到3(0.1ml免疫动物血清可中和1MLD毒素)，因此本发明的β-ε和α铝胶苗判为合格。

表3 β-ε和α铝胶苗的血清中和实验

3.5绵羊攻毒试验及结果

试验方法及标准：用1～3岁的绵羊24只，分成4组，每组6只，其中每组的4只动物皮下或肌肉注射疫苗1.0ml/只，另2只作对照。免疫21日，每只动物各注射强毒毒素。对照羊应全部死亡，免疫动物至少保护3只。

第1组静脉注射1MLD的腐败梭菌毒素，观察3～5日。第2、3和4组分别静脉注射1MLD的C型、B型和D型产气荚膜梭菌毒素，观察3～5日。实验结果如表4所示。试验结果表明：α毒素+融合蛋白-铝胶苗，对腐败梭菌毒素，B、C、D型产气荚膜梭菌毒素的绵羊免疫保护率均为100％，疫苗判为合格。

表4 β-ε和α铝胶苗对绵羊攻毒保护实验

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 羊三联四防亚单位疫苗及其制备方法

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1947

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaaaaaa atcttgtaaa aagtttagca atcgcatcag cggtgatatc catctattca 60

atagttaata ttgtttcacc aactaatgta atagctaagg aaatatctaa tacagtatct 120

aatgaaatgt ccaaaaaagc ttcttatgat aatgtagata cattaattga gaaaggaaga 180

tataatacaa aatataatta cttaaagaga atggaaaaat attatcctaa tgctatggca 240

tattttgata aggttactat aaatccacaa ggaaatgatt tttatattaa taatcctaaa 300

gttgaattag atggagaacc atcaatgaat tatcttgaag atgtttatgt tggaaaagct 360

ctcttaacta atgatactca acaagaacaa aaattaaaat cacaatcatt cacttgtaaa 420

aatactgata cagtaactgc aactactact catactgtgg gaacttcgat acaagcaact 480

gctaagttta ctgttccttt taatgaaaca ggagtatcat taactactag ttatagtttt 540

gcaaatacaa atacaaatac taattcaaaa gaaattactc ataatgtccc ttcacaagat 600

atactagtac cagctaatac tactgtagaa gtaatagcat atttaaaaaa agttaatgtt 660

aaaggaaatg taaagttagt aggacaagta agtggaagtg aatggggaga gatacctagt 720

tatttagctt ttcctaggga tggttataaa tttagtttat cagatacagt aaataagagt 780

gatttaaatg aagatggtac tattaatatt aatggaaaag gaaattatag tgcagttatg 840

ggagatgagt taatagttaa ggttagaaat ttaaatacaa ataatgtaca agaatatgta 900

atacctgtag ataaaaaaga aaaaagtaat gattcaaata tagtaaaata taggagtctt 960

tctattaagg caccaggaat aaaagcggaa gcggcggcga aagaagcggc ggcgaaagcg 1020

aatgatatag gtaaaactac tactataact agaaataaga catcagatgg ctatactata 1080

attacacaaa atgataaaca gataatatca tatcaatctg ttgactcttc aagtaaaaat 1140

gaagatggtt ttactgcatc tatagatgct agatttatcg atgataaata ttcatctgaa 1200

atgacaactt taataaactt aactggattt atgtcttcaa aaaaagaaga tgttataaaa 1260

aaatacaatt tgcatgatgt tactaattct actgcaatta attttccggt tagatactcg 1320

atttctattt taaatgaaag tattaatgaa aatgtaaaaa tagttgatag tattcctaaa 1380

aatacaattt ctcaaaaaac tgtatccaat acaatgggat acaaaatagg aggttcaatt 1440

gaaatagaag aaaataaacc taaagcttca attgaaagcg aatatgctga atcatctaca 1500

atagaatatg tccaacctga tttttctact atacagacag atcattcaac ctctaaagct 1560

tcatgggata caaaatttac agaaactact cgtggtaatt ataatttaaa atcaaacaac 1620

cctgtatatg gaaatgaaat gtttatgtac ggaagatata ctaatgttcc tgcaactgaa 1680

aatataattc cagattatca aatgtcaaaa ttaataacag gtggtttaaa ccctaatatg 1740

tctgtagttc taactgctcc taatggtact gaagaatcta taataaaagt taaaatggag 1800

cgtgaaagaa actgttatta tcttaattgg aatggtgcta actgggtagg acaagtctat 1860

tccaggctag cttttgatac cccaaatgta gatagtcata tatttacatt caaaataaat 1920

tggcttactc acaaagtaac agctatt 1947

<210> 2

<211> 666

<212> DNA

<213> 腐败梭菌

<400> 2

agatacaatc caaatgatcc ttatgcaagt ggatatcgtg caaaagatag actttctatg 60

agaatatcaa atgttagatt tgttattgac aatgattcta taaaattagg tacacctaaa 120

gtgaaaaaat tagcaccttt aaactctgct agttttgatt taataaatga aagtaaaact 180

gagtctaaat tatcaaaaac atttaattat acaacttcta aaacagtttc taaaacagat 240

aactttaaat ttggagaaaa aataggagta aaaacatcat ttaaagtagg tcttgaagct 300

atagttgaca gtaaagttga gacaagcttt gaatttaatg cagaacaagg ttggtcaaat 360

acaaatagta ctactgaaac taaacaagaa agtactacat atactgcaac agtttctcca 420

caaactaaaa agagattatt cctagatgtg ttaggatcac aaattgatat tccttatgaa 480

ggaaaaatat atatggaata cgacatagaa ttaatgggat ttttaagata tacaggaaat 540

gctcgtgaag atcatactga agatagacca acagttaaac ttaaatttgg taaaaacggt 600

atgagtgctg aggaacatct taaagattta tatagtcata agaatattaa tggatattca 660

gaatgg 666

Claims (8)

1.一种羊三联四防亚单位疫苗，其特征在于：由产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白和佐剂组成。

2.如权利要求1所述羊三联四防亚单位疫苗，其特征在于：所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白、佐剂的重量比为1-3:1-3:1-3。

3.如权利要求1或2所述羊三联四防亚单位疫苗，其特征在于，所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白的制备方法如下：

根据产气荚膜梭菌C58-1株β和ε基因序列设计六条特异性引物，引物序列为：pεb1947s1:GCTTTTCCTAGGGATG；

pεb1947s2:AATGATATAGGTAAAACTACTAC；

pεb1947r1:TTTTATTCCTGGTGCC；

pεb1947r2:CTTCTTTCGCCGC；

pεb1947r3:TACCTATATCATTCGCTTTCG；

pεb1947r4:TATTTTGAATGTAAATATATGAC；

其中下划线部分是β和ε序列自带的Avr Ⅱ和Sal Ⅰ酶切位点，斜体和黑体部分是连接肽序列；

将C58-1株β毒素基因和ε毒素基因克隆在PET-32a载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET1947；

将pET1947与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET1947；

用IPTG对重组菌株诱导表达，经纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白。

4.如权利要求1或2所述羊三联四防亚单位疫苗，其特征在于，腐败梭菌α毒素重组蛋白的制备方法如下：

根据腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列，设计1对特异性引物，克隆α毒素基因序列的349-1014nt区域，引物序列为：

pα666s:GGGGGATCCAGATACAATCCAAATGATC

pα666r:GGGGTCGACCCATTCTGAATATCCATTA；

其中下划线部分是添加的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点；

腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列克隆在PET-2载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET666；

将pET666与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET666；

用IPTG对重组菌株诱导表达，经纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白。

5.如权利要求3所述羊三联四防亚单位疫苗，其特征在于，产气荚膜梭菌C58-1株β毒素基因、ε毒素基因以及β毒素和ε毒素连接肽基因序列为：

6.如权利要求4所述羊三联四防亚单位疫苗，其特征在于，所述腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列为：

7.如权利要求1所述羊三联四防亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：由所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白和佐剂复配而成。

8.如权利要求7所述羊三联四防亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1)获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白

根据产气荚膜梭菌C58-1株β和ε基因序列设计六条特异性引物，引物序列为：pεb1947s1:GCTTTTCCTAGGGATG；

pεb1947s2:AATGATATAGGTAAAACTACTAC；

pεb1947r1:TTTTATTCCTGGTGCC；

pεb1947r2:CTTCTTTCGCCGC；

pεb1947r3:TACCTATATCATTCGCTTTCG；

pεb1947r4:TATTTTGAATGTAAATATATGAC；

其中下划线部分是β和ε序列自带的Avr Ⅱ和Sal Ⅰ酶切位点，斜体和黑体部分是连接肽序列；

将C58-1株β毒素基因和ε毒素基因克隆在PET-32a载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET1947；

将pET1947与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET1947；

用IPTG对重组菌株诱导表达，经纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白；

2)获得所述腐败梭菌α毒素重组蛋白

根据腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列，设计1对特异性引物，克隆α毒素基因序列的349-1014nt区域，引物序列为：

pα666s:GGGGGATCCAGATACAATCCAAATGATC

pα666r:GGGGTCGACCCATTCTGAATATCCATTA；

其中下划线部分是添加的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点；

腐败梭菌C55-2株α毒素基因序列克隆在PET-2载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pET666；

将pET666与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-pET666；

用IPTG对重组菌株诱导表达，经纯化，获得所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白；

3)将所述产气荚膜梭菌β-ε融合蛋白、腐败梭菌α毒素重组蛋白和佐剂均匀混合，获得羊三联四防亚单位疫苗。