CN112107681B - 羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括抗原和佐剂，抗原由腐败梭菌C55‑1株，产气荚膜梭菌B型C58‑1株和D型C60‑2株组成。其制备方法为：将菌种接种培养基中，培养得一级种子，再接种于培养基中，培养的二级种子；将二级种子接种培养基中，培养得发酵菌液；将发酵菌液混合后，灭活脱毒，加入佐剂，充分震荡后分装。本发明的三联四防灭活疫苗经过优化培养条件，培养时间缩短，细菌密度(OD值)成倍增加，半成品产毒力更强，远大于传统工艺产品，动物免疫保护效果大大增强，在羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗领域具有推广应用价值。

Description

羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及其制 备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
羊快疫主要发生于绵羊，是由腐败梭菌引起的一种急性传染病。羊突然发病，病程极短，其特征为真胃粘膜呈出血性炎性损害，绵羊患病后消化道粘膜发炎、坏死并引起中毒性休克，使患羊迅速死亡，病死率极高。
羊淬狙是由C型产气荚膜杆菌引起的，以急性死亡为特征，伴有腹膜炎和溃疡性肠炎，1-2岁绵羊易发。
羔羊痢疾又称羔羊梭型痢疾，俗名红肠子病，是新生羔羊的一种毒血症，其特征为持续性下痢和小肠发生溃疡，死亡率很高。
羊肠毒血症是产气荚膜梭菌D型在羊肠道内大量繁殖并产生毒素所引起的绵羊急性传染病。该病以发病急，死亡快，死后肾脏多见软化为特征。
现有羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，由于培养工艺条件的限制，PH没有控制，没有加补料，接种后只等收获时间到收获，使得在该工艺下发酵菌液的OD值较低，活菌数不高，且产毒素量不高，免疫保护率较差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及其制备方法。
经研究，本发明采用以下技术方案：
1、羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗，有效成分包括抗原和佐剂，所述抗原由腐败梭菌C55-1株，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株组成；所述腐败梭菌C55-1株的有效含量为31-60MLD，所述产气荚膜梭菌B型C58-1株的有效含量为400-600MLD；所述产气荚膜梭菌D型C60-2株的有效含量为260-840MLD。
其中，腐败梭菌C55-1株的保藏编号为CVCC 60021，产气荚膜梭菌B型C58-1菌株的保藏编号为CⅤCC60081和产气荚膜梭菌D型C60-2菌株的保藏编号为CVCC 60201。MLD表示最小致死量。
优选的，所述腐败梭菌C55-1株的有效含量为31MLD，所述产气荚膜梭菌B型C58-1株的有效含量为400MLD；所述产气荚膜梭菌D型C60-2株的有效含量为260MLD。
2、上述羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
一级种子制备：将各株菌种分别接种于厌气肉肝汤培养基中，腐败梭菌C55-1株在35-37℃条件下，静止培养16-20小时，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株在35-37℃条件下，静止培养16-18小时，得一级种子；
二级种子制备：将各株一级种子接种于厌气肉肝汤培养基中，腐败梭菌C55-1株在35-37℃条件下，静止培养16-18小时，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株在35-37℃条件下，静止培养16-18小时，得二级种子；
菌液培养：接种前，调节腐败梭菌培养基温度至35-37℃，调节pH至7.4-7.8；将腐败梭菌的二级种子按培养基总量的1％～2％接种，进行发酵培养，发酵培养过程中，温度控制在35-37℃，pH控制在7.4～7.8，从第4小时开始，每两个小时补充营养物质，培养18～22小时，得腐败梭菌发酵菌液；
分别调节产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型培养基温度至35-37℃，调节pH至7.4-7.8；将产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的二级种子分别按培养基总量的1％～2％接种，进行发酵培养，发酵培养过程中，温度均控制在35-37℃，pH控制在6.5～7.4，从第4小时开始，每两个小时补充营养物质，培养14～18小时，分别得产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D发酵菌液；分别调节产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型培养基温度至35℃，调节pH至7.8；
纯化及灭活：将腐败梭菌，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的发酵菌液均按总量的0.8％加入甲醛，在37～38℃条件下，进行灭活脱毒；
配苗分装：将灭活脱毒后的菌液进行配苗分装，加入氢氧化铝胶(即佐剂)，混合后加入硫柳汞或苯酚；灭活脱毒后的混合菌液与氢氧化铝胶的体积比为5:1，充分震荡摇匀，无菌检验合格后分装，即可。
优选的，将产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的二级种子分别按培养基总量的1％～2％接种，进行发酵培养，发酵培养过程中，温度均控制在35℃，pH控制在6.5～7.4，从第4小时开始，每两个小时补充营养物质，培养14～18小时，分别得产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D发酵菌液。
优选的，所述菌液培养中，腐败梭菌培养基，每100mL培养基包括下述物质：牛肉浸粉1～1.5g，牛心浸粉0.5～1g，酵母0.5～0.75g，全胃浸粉0.5～0.75g，可溶性淀粉0.75g和蛋白胨0.65～1g，以及包括加入量为腐败梭菌培养基总量的1％的丙三醇。
优选的，所述菌液培养中，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型培养基，每100mL培养基包括下述物质：牛肉浸粉1～1.5g，牛心浸粉0.5～1g，酵母0.5～0.75g，全胃浸粉0.5～0.75g，可溶性淀粉0.75g和蛋白胨0.65～1g，以及包括加入量为产气荚膜梭菌培养基总量的1％的丙三醇。
优选的，所述菌液培养中，补充的营养物质包括浓度为50％葡萄糖溶液和糊精。50％葡萄糖溶液的补充量为菌液总量的0.5-0.75％，糊精的补充量为菌液总量的0.1～0.2％。
优选的，所述纯化及灭活过程中，腐败梭菌的发酵菌灭活脱毒的时间为5天，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的发酵菌灭活脱毒的时间为7天。
优选的，所述配苗分装中，腐败梭菌，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D的发酵菌液的体积比为1:2:1。
优选的，所述配苗分装中，加入硫柳汞的量为总量的0.004％～0.01％，或加入苯酚的量为总量的0.2％。
3、上述羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗免疫羊的剂量为3mL。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗中，所述腐败梭菌C55-1株的有效含量为31MLD，所述产气荚膜梭菌B型C58-1株的有效含量为400MLD；所述产气荚膜梭菌D型C60-2株的有效含量为260MLD；活菌数提高，使得OD值和产毒素均提高，毒素在一定范围内跟免疫力成正相关，可大大提高羊免疫的效果。
2)本发明的羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，在培养过程中，选择合适的时间添加适量的补料用以添加其生长过程中的营养物质，以及将pH控制在适合生长的范围内，达到高密度培养效果，使得在更短的培养时间内，收获更多的抗原，活菌数大幅增加，收获OD值更高、产毒量更多，且经过优化培养条件后，培养时间缩短，细菌密度(OD值)成倍增加，半成品产毒力更强，从而大大提高产品的免疫原性；
3)本发明的羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗，可用于免疫羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症，免疫羊的剂量为3mL，远小于现有的注射剂量(4～6mL)，降低了疫苗的使用和包装成本，且副作用大大降低，在羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗领域具有推广应用价值。
附图说明
图1为本发明的腐败梭菌(C55-1株)的生长曲线图；
图2为本发明的产气荚膜梭菌B型(C58-1株)的生长曲线图；
图3为本发明的产气荚膜梭菌D型(C60-2株)的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)一级种子制备：将各株菌种分别接种于厌气肉肝汤培养基中，腐败梭菌C55-1株在35℃条件下，静止培养16小时，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株在37℃条件下，静止培养16小时，得一级种子；
二级种子制备：将各株一级种子接种于厌气肉肝汤培养基中，腐败梭菌C55-1株在35℃条件下，静止培养16小时，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株在37℃条件下，静止培养16小时，得二级种子；
菌液培养：配制用于腐败梭菌的培养基，每100mL培养基包括下述物质：牛肉浸粉1.5g，牛心浸粉1g，酵母0.5g，全胃浸粉0.5g，可溶性淀粉0.75g和雨林三号蛋白胨0.65g，以及包括加入量为腐败梭菌培养基总量的1％的丙三醇，接种前，调节腐败梭菌培养基温度至37℃，调节pH至7.8；将腐败梭菌的二级种子按培养基总量的2％接种，进行发酵培养，发酵培养过程中，温度控制在37℃，pH控制在7.5～7.8，从第4小时开始，每两个小时补充浓度50％葡萄糖溶液为菌液总量的0.75％和糊精为菌液总量的0.2％，培养18小时或OD值开始下降停止发酵，得腐败梭菌发酵菌液，并取样送检测定毒力；配置后，均在116℃条件下，灭菌30分钟，降温后保压待用；
配制用于产气荚膜梭菌的培养基，每100mL培养基包括下述物质：牛肉浸粉1.5g，牛心浸粉1g，酵母0.5g，全胃浸粉0.5g，可溶性淀粉0.75g和雨林三号蛋白胨0.65g，以及包括加入量为产气荚膜梭菌的培养基总量的1％的丙三醇，分别调节产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型培养基温度至35℃，调节pH至7.8；将产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的二级种子分别按培养基总量的1％接种，进行发酵培养，发酵培养过程中，温度均控制在35℃，pH控制在6.5～7.4，从第4小时开始，每两个小时补充浓度50％葡萄糖溶液为菌液总量的0.75％和糊精为菌液总量的0.1％，培养14小时或OD值开始下降停止发酵，分别得产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D发酵菌液，并取样送检测定毒力；配置后，均在116℃条件下，灭菌30分钟，降温后保压待用；
灭活：将腐败梭菌，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的发酵菌液均按总量的0.8％加入甲醛，在37～38℃条件下，进行灭活脱毒，腐败梭菌的发酵菌灭活脱毒的时间为5天，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的发酵菌灭活脱毒的时间为7天；
配苗分装：将灭活脱毒后的菌液进行配苗分装，加入氢氧化铝胶，混合后加入苯酚；灭活脱毒后的混合菌液与氢氧化铝胶的体积比为5:1，加入苯酚的量为总量的0.2％，充分震荡摇匀，无菌检验合格后分装。
对照实施例1
原培养工艺包括以下步骤：
1)一级种子繁殖及鉴定：将菌种分别接种于厌气肉肝汤中，35～37℃培养，腐败梭菌培养24小时，B型产气荚膜梭菌培养10～20小时；D型产气荚膜梭菌培养16～24小时，然后用普通琼脂斜面，普通肉汤，厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管接种种子液0.2ml，做纯粹检验，至少培养48小时，证明纯粹作为一级种子；在2～8℃保存，应不超过15日；为便于生产使用，菌种可用多蛋白胨牛心汤半固体或无糖厌气肉肝汤继代，置2～8℃保存，每月移植1次，但最多不超过3代；
2)二级种子繁殖：取一级种子接种于适宜的培养基，在35～37℃培养，腐败梭菌培养24小时，B型产气荚膜梭菌培养10～20小时；D型产气荚膜梭菌培养16～24小时，取样做纯粹检查应纯粹。在2～8℃保存使用期不得超过5日；
3)制苗用培养基：厌气肉肝汤、肉肝胃酶消化汤；
4)制苗用菌液制备：①菌液培养，用培养罐或玻璃瓶静止培养，按培养罐(或瓶)容量装入适量(70％左右)肉肝胃酶消化汤培养基(腐败梭菌用厌气肉肝汤)，冷却至38℃左右立即接种。培养基如经存放，应在临用前煮沸驱氧，待冷却至38℃左右再接种，按培养基总量计算接种量，腐败梭菌为2％，B、D型产气荚膜梭菌为1％。腐败梭菌置37℃培养20～24小时；B、D型产气荚膜梭菌置35℃培养，B型产气荚膜梭菌培养10～20小时；D型产气荚膜梭菌培养16～24小时；②纯粹检验，各菌液培养完成后，分别取样做纯粹检查应纯粹；③毒力测定，取各制苗菌液离心上清，静脉注射体重16～20g小白鼠，其最小致死量应不低于下列标准：腐败梭菌0.005～0.01ml(也可肌肉注射0.01ml菌液)；B型产气荚膜梭菌0.001～0.002ml；D型产气荚膜梭菌(用胰酶活化后)0.0005～0.00075ml；④灭活脱毒，取样后，按各菌液量的0.8％加入甲醛溶液后密封，在37℃灭活脱毒。腐败梭菌6日、产气荚膜梭菌8日，每日充分振荡或搅拌2次，混合后脱毒亦可；⑤灭活检验，取样接种厌气肉肝汤2支，各接种0.2ml，置37℃培养5日，应无菌生长；⑥脱毒检验，每种菌液用16～20g小白鼠2只，各静脉注射离心上清0.4ml，观察24小时，均应健活。如有死亡，应继续脱毒，直到小白鼠不死为止；
5)配苗：①调整菌液pH，经灭活、脱毒检验合格的各菌液，用灭菌纱布或铜纱过滤，以无菌的8％氢氧化钠溶液将pH调至6.8～7.2，即可用于配苗；②羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防疫苗的配制，先将检验合格的腐败梭菌，B型、D型产气荚膜梭菌的脱毒菌液分别按菌液5份加铝胶1份的比例，加入灭菌的氢氧化铝胶，并按总量的0.01％加入硫柳汞，制成单苗。再按B型产气荚膜梭菌疫苗2份，D型产气荚膜梭菌疫苗1份和腐败梭菌疫苗1份的比例，充分混合配成联苗；③半成品检验，无菌检验，按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长；
6)疫苗分装：将配苗好的疫苗液进行混合，组批，定量分装，分装时随时搅拌，使其混合均匀。
相关检测分析
1)OD值的检测分析
具体操作为：将原培养工艺的菌液和改进后培养工艺的菌液在发酵培养过程中，均每隔两个小时进行无菌取样并检测OD值，绘制生长曲线，了解细菌的生长状态，在OD值最高时进行收获。结果如表1和图1～3所示。
表1不同工艺条件下，同一时间内的平均OD值
Figure BDA0002747946180000061
从表1中分析可知，三种菌株在改进培养工艺条件下，培养时间大大缩短，且培养得到的发酵菌液中的平均OD值均大于原培养工艺。从而证明了改进后的培养工艺明显提高了菌液中的OD值。OD值的提升是活菌数提升的标志，活菌数的提升有助于后期产毒量的提升，为提升产品质量奠定了基础。
且从图1～3中分析可知，当腐败梭菌(C55-1株)、产气荚膜梭菌B型(C58-1株)、产气荚膜梭菌D型(C60-2株)分别为20h、16h、12h时，菌数达到最大，产毒量也最多，此时收获制苗具有最好的产品效果。
2)产毒量的检测分析
将原培养工艺的菌液和改进后培养工艺的菌液，在发酵结束后，每一种菌株均进行取样送检，进行毒力测定，毒力测定以家兔和小白鼠的发病死亡时间进行判定。
菌液毒力测定操作：取各制苗菌液离心上清，静脉注射体重16～20g小白鼠，其最小致死量应不低于下列标准：腐败梭菌0.005～0.01mL(也可肌肉注射0.01mL菌液)；B型产气荚膜梭菌0.001～0.002mL；D型产气荚膜梭菌(用胰酶活化后)0.0005～0.00075mL。
家兔选择1.5kg～2kg健康兔子，肌肉注射0.2mL菌液，观察家兔的发病以及死亡时间。结果如表2所示。
表2为不同工艺条件下毒力测定结果
Figure BDA0002747946180000071
从表2中分析可知，在改进后的工艺条件下培养得到的发酵菌液，小鼠、家兔毒力测定来看，新工艺产毒比较好，实验动物的发病和死亡时间缩小了很多，从而证明了经过工艺优化腐败梭菌和产气荚膜梭菌的产毒量均有了极大的提升，而毒力的提升是影响产品效力的最关键因素。
3)成品效力的检测分析
免疫攻毒法，具体操作为：用体重1.5～2.0kg兔或1～3岁的绵羊24只，分成4组，每组6只，其中每组的4只动物皮下或肌肉注射疫苗，兔3.0mL/只，绵羊5.0mL/只，另2只作对照。免疫14～21日后，每只动物各注射强毒菌液或毒素。对照兔或羊应全部死亡，免疫动物至少保护3只。
第1组肌肉注射1MLD的腐败梭菌强毒菌液，观察14日(用胰酶消化牛肉汤生产的疫苗，可静脉注射1MLD的腐败梭菌毒素，观察3～5日)。第2、3和4组分别静脉注射1MLD的C型、B型和D型产气荚膜梭菌毒素，观察3～5日)。
表3原工艺生产成品的效力检验
Figure BDA0002747946180000081
从表3中分析可知，效力检验判定合格是对照全死，每组保护致少3个。表明用原工艺生产的效力检验保护率不好，尤其腐败梭菌(A型)更差。
表4改进工艺生产成品的效力检验
Figure BDA0002747946180000082
Figure BDA0002747946180000091
从表4中数据分析可知，效力检验判定合格是对照全死，每组保护致少3个。经过优化改良的工艺，效果明显，效力保护率明显提高。
综上所述，本发明的羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗用免疫原性良好的腐败梭菌和产气荚膜梭菌B、D型菌种，接种于适宜培养基中进行培养，甲醛灭活脱毒后制成疫苗，用以预防羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症。其中B型代替了C型，同时可以预防猝狙和羔羊痢疾。本发明的羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗，经过了30批生产验证，证明为一种可以克服现有工艺不足的新型羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的培养工艺。本发明的羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，通过在细菌培养过程中在合适的时间添加适量的补料用以添加生长必需的营养物质，同时将PH控制在适合生长的范围里面，使其生长速度加快，发酵时间缩短，OD值更高，活菌数更多，同时产毒素量提高。其制备方法具有培养时间更短、收获OD值更高、产毒量更多、产品免疫原性更好的特点，在羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的生产领域具有推广应用价值。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
一级种子制备：将各株菌种分别接种于厌气肉肝汤培养基中，腐败梭菌C55-1株在35-37℃条件下，静止培养16-20小时，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株在35-37℃条件下，静止培养16-18小时，得一级种子；
二级种子制备：将各株一级种子接种于厌气肉肝汤培养基中，腐败梭菌C55-1株在35-37℃条件下，静止培养16-18小时，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株在35-37℃条件下，静止培养16-18小时，得二级种子；
菌液培养：接种前，调节腐败梭菌培养基温度至35-37℃，调节pH至7.4-7.8；将腐败梭菌的二级种子按培养基总量的1%~2%接种，进行发酵培养，发酵培养过程中，温度控制在35-37℃，pH控制在7.4~7.8，从第4小时开始，每两个小时补充营养物质，培养18~22小时，得腐败梭菌发酵菌液；
分别调节产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型培养基温度至35-37℃，调节pH至7.4-7.8；将产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的二级种子分别按培养基总量的1%~2%接种，进行发酵培养，发酵培养过程中，温度均控制在35-37℃，pH控制在6.5~7.4，从第4小时开始，每两个小时补充营养物质，培养14~18小时，分别得产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D发酵菌液；
所述菌液培养中，腐败梭菌培养基，每100mL培养基包括下述物质：牛肉浸粉1~1.5g，牛心浸粉0.5~1g，酵母0.5~0.75g，全胃浸粉0.5~0.75g，可溶性淀粉0.75g和蛋白胨0.65~1g，以及包括加入量为腐败梭菌培养基总量的1%的丙三醇；产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型培养基，每100mL培养基包括下述物质：牛肉浸粉1~1.5g，牛心浸粉0.5~1g，酵母0.5~0.75g，全胃浸粉0.5~0.75g，可溶性淀粉0.75g和蛋白胨0.65~1g，以及包括加入量为产气荚膜梭菌培养基总量的1%的丙三醇；补充的营养物质包括浓度为50%葡萄糖溶液和糊精；50%葡萄糖溶液的补充量为菌液总量的0.5-0.75%，糊精的补充量为菌液总量的0.1~0.2%；
纯化及灭活：将腐败梭菌，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的发酵菌液均按总量的0.8%加入甲醛，在37~38℃条件下，进行灭活脱毒；
配苗分装：将灭活脱毒后的菌液进行配苗分装，加入氢氧化铝胶，混合后加入硫柳汞或苯酚；灭活脱毒后的混合菌液与氢氧化铝胶的体积比为5:1，充分震荡摇匀，无菌检验合格后分装，即可；
所述羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗，有效成分包括抗原和佐剂，所述抗原由腐败梭菌C55-1株，产气荚膜梭菌B型C58-1株和产气荚膜梭菌D型C60-2株组成；所述腐败梭菌C55-1株的有效含量为31-60MLD，所述产气荚膜梭菌B型C58-1株的有效含量为400-600MLD；所述产气荚膜梭菌D型C60-2株的有效含量为260-840MLD。
2.根据权利要求1所述羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述腐败梭菌C55-1株的有效含量为31MLD，所述产气荚膜梭菌B型C58-1株的有效含量为400MLD；所述产气荚膜梭菌D型C60-2株的有效含量为260MLD。
3.根据权利要求1所述羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述纯化及灭活过程中，腐败梭菌的发酵菌灭活脱毒的时间为5天，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D型的发酵菌灭活脱毒的时间为7天。
4.根据权利要求1所述羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述配苗分装中，腐败梭菌，产气荚膜梭菌B型和产气荚膜梭菌D的发酵菌液的体积比为1:2:1。
5.根据权利要求1所述羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述配苗分装中，加入硫柳汞的终浓度为0.004%~0.01%，或加入苯酚的终浓度为0.2%。
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