CN108949606B

CN108949606B - 一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺

Info

Publication number: CN108949606B
Application number: CN201710517663.4A
Authority: CN
Inventors: 丁美娟; 张小飞; 尹秀凤; 卢凤英; 严鹏; 许秀梅; 汪爱芬
Original assignee: Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd
Current assignee: Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2037-06-29
Also published as: CN108949606A

Abstract

本发明公开了一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，属于农业微生物领域，依次通过鸡毒支原体培养基复苏冻干菌种、种子扩大培养、发酵培养得到鸡滑液囊支原体发酵高密度抗原。本发明通过发酵过程中添加鸡毒支原体培养基，调节PH，进行工业放大生产，为鸡毒支原体提供了充分的营养成分，降低了生产成本，抗原含量高，适于规模应用，具有广阔前景。

Description

一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺

技术领域

本发明涉及一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，属于农业微生物领域。

背景技术

鸡毒支原体MG是鸡慢性呼吸道病CRD的病原，且感染率很高，CRD可通过水平和垂直方式传播并在鸡群中长期存在和蔓延，鸡场感染MG后，雏鸡的弱雏率升高，蛋鸡的产蛋率、肉鸡的体重及饲料转化率均下降，对养鸡业的发展造成严重危害，目前，各鸡场对鸡毒支原体的治疗主要是使用抗生素，而鸡毒支原体易产生耐药性，效果也不理想，免疫疫苗是控制鸡毒支原体病的最好措施，然而，鸡毒支原体的高密度培养非常困难，例如对营养需求高，尤其是对PH要求严格，现有技术中，常用的培养基为改良Frey氏培养基，但是并不能满足大规模的培养。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，用于解决鸡毒支原体难以大规模生产的问题，能够提高发酵终点的活菌密度，提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保护效果。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，包括如下步骤：

步骤1：取冻干的鸡毒支原体生产用种子接种于鸡毒支原体培养基中培养，获得培养液，以同样方法将获得的培养液再接种传代1次；

步骤2：将上述传代后的菌液接种于发酵罐的灭菌鸡毒支原体培养基中，培养过程中，在线流加NaOH溶液控制PH值，添加鸡毒支原体培养，待PH值下降至6.4～6.6时，停止发酵，得到菌液，得到鸡毒支原体发酵高密度抗原。

进一步的，所述步骤1中，取冻干的鸡毒支原体生产用种子按1:10的比例接种于鸡毒支原体培养基中，在36～37℃的条件下，培养18～24h，获得培养液，以同样方法将获得的培养液按1:10的比例再接种传代1次。

进一步的，所述步骤2中，将上述传代后的菌液按1％～5％/V/V的比例接种于20L发酵罐的灭菌鸡毒支原体培养基中，发酵罐的培养工艺条件为：温度为35～38℃，罐压为0.03～0.1Mpa，溶氧为30～60％，PH值为7.6～7.8，搅拌速度为80～160rpm。

进一步的，所述步骤2中，培养过程中，在线流加20％NaOH溶液控制PH值至7.2时，添加鸡毒支原体培养基为原培养体积的30％，培养48h，停止在线流加20％NaOH溶液，待PH值下降至6.4～6.6时，停止发酵。

进一步的，还包括步骤3：将所述步骤2中发酵后得到的菌液以1％～5％V/V的比例接种于体积大于20L的发酵罐中进行扩大培养。

进一步的，所述扩大培养所用发酵罐的体积为200L～1500L。

进一步的，所述步骤3中，扩大培养的条件包括：温度为35～38℃，罐压为0.03～0.1Mpa，溶氧为30～60％，PH值为7.6～7.8，搅拌速度为80～160rpm。

进一步的，每升所述鸡毒支原体培养基按如下成分配制：

进一步的，所述鸡毒支原体培养基在121℃温度条件下，高压灭菌15min，在4℃温度条件下保存。

进一步的，所述鸡毒支原体培养基在培养时，再加150～200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，加20％NaOH溶液调pH值至7.6～7.8。

本发明的有益技术效果：按照本发明的鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，本发明提供的鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，通过优化培养基组成，同时通过培养基、PH值、最适温度、通气量、罐压、溶氧浓度DO等方面进行探索，优化高密度发酵培养工艺的各种条件，进行工业放大研究，获得了一种适用于200L～1500L发酵罐高密度培养鸡毒支原体的培养工艺，且可进一步提高菌体密度，最终可实现规模化示范生产线，培养过程中，为鸡毒支原体提供了充分的营养成分，鸡毒支原体为兼性厌氧，发酵罐溶氧范围的控制对鸡毒支原体起着重要作用，培养基的PH也是一个关键因素，通过前期PH优化试验，筛选出适合鸡毒支原体生长的PH范围，最终通过发酵培养基、PH、溶氧等条件控制，实现了鸡毒支原体高密度发酵培养工艺的放大优化，从而解决了鸡毒支原体难以大规模生产的技术难题，进一步提高发酵终点的活菌密度，同时提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保护效果。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例1提供的一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，包括如下步骤：

步骤1：取冻干的鸡毒支原体生产用种子按1:10的比例接种于鸡毒支原体培养基中，在36～37℃的条件下，培养18～24h，获得培养液，以同样方法将获得的培养液按1:10的比例再接种传代1次；

步骤2：将上述传代后的菌液按3％/V/V的比例接种于20L发酵罐的灭菌鸡毒支原体培养基中，发酵罐的培养工艺条件为：温度为37℃，罐压为0.03Mpa，溶氧为40％，PH值为7.7，搅拌速度为100rpm，培养过程中，在线流加20％NaOH溶液控制PH值至7.2时，所述在线流加是通过向灭菌鸡毒支原体培养基中添加NaOH溶液来随时控制灭菌鸡毒支原体培养基的PH值，添加鸡毒支原体培养基为原培养体积的30％，培养48h，停止在线流加20％NaOH溶液，待PH值下降至6.5时，停止发酵，得到菌液，得到鸡毒支原体发酵高密度抗原；

步骤3：将所述步骤2中发酵后得到的菌液以3％V/V的比例接种于体积为200L～1500L的发酵罐中进行扩大培养，扩大培养的条件包括：温度为37℃，罐压为0.03Mpa，溶氧为40％，PH值为7.7，搅拌速度为100rpm；取样计数，活菌数为10¹⁰CCU/ml。

进一步的，在本实施例1中，每升所述鸡毒支原体培养基按如下成分配制：

进一步的，在本实施例1中，所述鸡毒支原体培养基在121℃温度条件下，高压灭菌15min，在4℃温度条件下保存，所述鸡毒支原体培养基在培养时，再加180ml猪血清和1000单位/ml青霉素，加20％NaOH溶液调pH值至7.7。

实施例2：

本实施例2提供的一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，包括如下步骤：

步骤2：将上述传代后的菌液按4％/V/V的比例接种于20L发酵罐的灭菌鸡毒支原体培养基中，发酵罐的培养工艺条件为：温度为37℃，罐压为0.05Mpa，溶氧为40％，PH值为7.7，搅拌速度为100rpm，培养过程中，在线流加20％NaOH溶液控制PH值至7.2时，所述在线流加是通过向灭菌鸡毒支原体培养基中添加NaOH溶液来随时控制灭菌鸡毒支原体培养基的PH值，添加鸡毒支原体培养基为原培养体积的30％，培养48h，停止在线流加20％NaOH溶液，待PH值下降至6.5时，停止发酵，得到菌液，得到鸡毒支原体发酵高密度抗原；

步骤3：将所述步骤2中发酵后得到的菌液以2％V/V的比例接种于体积为200L～1500L的发酵罐中进行扩大培养，扩大培养的条件包括：温度为36.5℃，罐压为0.06Mpa，溶氧为35％，PH值为7.8，搅拌速度为110rpm；取样计数，活菌数为10¹⁰CCU/ml。

进一步的，在本实施例2中，每升所述鸡毒支原体培养基按如下成分配制：

进一步的，在本实施例2中，所述鸡毒支原体培养基在121℃温度条件下，高压灭菌15min，在4℃温度条件下保存，所述鸡毒支原体培养基在培养时，再加150ml猪血清和1000单位/ml青霉素，加20％NaOH溶液调pH值至7.8。

实施例3：

本实施例3提供的一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，包括如下步骤：

步骤3：将所述步骤2中发酵后得到的菌液以1％～5％V/V的比例接种于体积为200L～1500L的发酵罐中进行扩大培养，扩大培养的条件包括：温度为35～38℃，罐压为0.03～0.1Mpa，溶氧为30～60％，PH值为7.6～7.8，搅拌速度为80～160rpm；取样计数，活菌数为10¹⁰CCU/ml。

进一步的，在本实施例3中，每升所述鸡毒支原体培养基按如下成分配制：

进一步的，在本实施例3中，所述鸡毒支原体培养基在121℃温度条件下，高压灭菌15min，在4℃温度条件下保存，所述鸡毒支原体培养基在培养时，再加180ml猪血清和1000单位/ml青霉素，加20％NaOH溶液调pH值至7.7。

对比例1：

本对比例1提供的一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，包括如下步骤：

步骤2：将上述传代后的菌液按10％/V/V的比例接种于20L发酵罐的灭菌鸡毒支原体培养基中，发酵罐的培养工艺条件为：温度为37℃，罐压为0.03Mpa，溶氧为40％，PH值为7.7，搅拌速度为100rpm，待PH值下降至6.5时，停止发酵，得到菌液，得到鸡毒支原体发酵高密度抗原。

进一步的，在本对比例1中，每升所述鸡毒支原体培养基按如下成分配制：

进一步的，在本对比例1中，所述鸡毒支原体培养基在121℃温度条件下，高压灭菌15min，在4℃温度条件下保存，所述鸡毒支原体培养基在培养时，再加180ml猪血清和1000单位/ml青霉素，加20％NaOH溶液调pH值至7.7。

实施例1所得发酵抗原与对比例1所得发酵抗原分别配制鸡毒支原体灭活疫苗进行40-60日宁SPF鸡的免疫，按照现行《中国兽药典》的《鸡毒支原体灭活疫苗制造及检验规程》进行效力检验，结果如表1和表2所示。

表1：实施例1鸡毒支原体攻毒保护效率检验，免疫保护率：88％

免疫保护率＝(对照组攻毒均分-免疫组攻毒均分)/对照组攻毒均分

＝(15/6—2/6)/(15/6)

＝(2.5—0.3)/2.5

＝88％

表2：对比例1鸡毒支原体攻毒保护效率检验，免疫保护率：69.6％

＝(14/6—4/6)/(14/6)

＝(2.3—0.7)/2.3

＝69.6％

由表1和表2可知，实施例1发酵工艺所得抗原的免疫原性明显改善，提高了疫苗的保护效果。

表3为普通发酵工艺与本发明发酵工艺发酵最终培养液培养滴度测定比较。

表3两种工艺培养的支原体培养滴度比较

综上所述，在本实施例中，按照本实施例的鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，本实施例提供的鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，通过优化培养基组成，同时通过培养基、PH值、最适温度、通气量、罐压、溶氧浓度DO等方面进行探索，优化高密度发酵培养工艺的各种条件，进行工业放大研究，获得了一种适用于200L～1500L发酵罐高密度培养鸡毒支原体的培养工艺，且可进一步提高菌体密度，最终可实现规模化示范生产线，培养过程中，为鸡毒支原体提供了充分的营养成分，鸡毒支原体为兼性厌氧，发酵罐溶氧范围的控制对鸡毒支原体起着重要作用，培养基的PH也是一个关键因素，通过前期PH优化试验，筛选出适合鸡毒支原体生长的PH范围，最终通过发酵培养基、PH、溶氧等条件控制，实现了鸡毒支原体高密度发酵培养工艺的放大优化，从而解决了鸡毒支原体难以大规模生产的技术难题，进一步提高发酵终点的活菌密度，同时提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保护效果。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2：将上述传代后的菌液按3%/V/V的比例接种于20L发酵罐的灭菌鸡毒支原体培养基中，发酵罐的培养工艺条件为：温度为37℃，罐压为0.03Mpa，溶氧为40%，PH值为7.7，搅拌速度为100rpm，培养过程中，在线流加20%NaOH溶液控制PH值至7.2时，所述在线流加是通过向灭菌鸡毒支原体培养基中添加NaOH溶液来随时控制灭菌鸡毒支原体培养基的PH值，添加鸡毒支原体培养基为原培养体积的30%，培养48h，停止在线流加20%NaOH溶液，待PH值下降至6.5时，停止发酵，得到菌液，得到鸡毒支原体发酵高密度抗原；

步骤3：将所述步骤2中发酵后得到的菌液以1%～5%V/V的比例接种于200L～1500L的发酵罐中进行扩大培养；扩大培养的条件包括：温度为35～38℃，罐压为0.03～0.1Mpa，溶氧为30～60%，PH值为7.6～7.8，搅拌速度为80～160rpm；

其中，每升所述鸡毒支原体培养基按如下成分配制：

PPLO肉汤 20.0～25.5g

酵母浸出粉 3～7g

水解乳蛋白 4～8g

葡萄糖 7～9g

质量浓度为0.4%的酚红溶液 2ml

去离子水余量。

2.根据权利要求1所述的一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，其特征在于，所述鸡毒支原体培养基在121℃温度条件下，高压灭菌15min，在4℃温度条件下保存。

3.根据权利要求2所述的一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺，其特征在于，所述鸡毒支原体培养基在培养时，再加150～200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，加20%NaOH溶液调pH值至7.6～7.8。