CN110643522A - 禽多杀性巴氏杆菌的培养基、培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于禽多杀巴氏杆菌的培养基、培养方法及其应用，该方发中培养基的组分简单、明确，可用于培养禽多杀性巴氏杆菌，其不但能够满足微生物生长所需的碳源、氮源，且特别适合禽多杀性巴氏杆菌快速生长，有利于其大规模培养，缩短培养周期。同时该培养基无需添加动物血清或全血等辅助剂，培养得到的禽多杀性巴氏杆菌有利于用于制备疫苗，该疫苗具有较高的稳定性、不易引起动物的应激反应且具有保护率高的特点。

Description

禽多杀性巴氏杆菌的培养基、培养方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物学领域，具体涉及一种禽多杀性巴氏杆菌的培养基、培养方法及其应用。

背景技术

禽多杀性巴氏杆菌是能引起禽霍乱疾病的细菌，该疾病是一种侵害禽类养殖业的接触性传染病，发病率和病死率都很高。控制禽霍乱的主要措施以疫苗和抗生素药物为主。其中抗菌药由于药物依赖性高、抗生素残留、停药易复发等缺点，市场逐渐倾向疫苗免疫方法控制该疾病。常见的疫苗主要有禽多杀性巴氏杆菌灭活苗、蜂胶灭活苗、油乳剂灭活苗和禽多杀性巴氏杆菌活苗等。根据我国《兽用生物制品制造与检验规程(2000版)》部分内容指出，规定培养禽多杀性巴氏杆菌主要是液体培养发酵法和扁瓶固体培养法。液体发酵与扁瓶固体发酵相比，前者生产效率较高、成品成本较低等优势逐步被市场认可，科学研究者也把逐渐把注意力集中在液体发酵培养禽多杀性巴氏杆菌。

近年来，针对禽多杀性巴氏杆菌培养基配方和培养方法如下，培养基配方集中体现在马丁肉汤、改良马丁肉汤、GKLB(葡萄糖磷酸钾LB培养基)、LB培养基，并针对培养部分成分进行调整；以改良马丁肉汤为例，该培养基需要添加0.1-1.0％裂解血球全血，培养基配方越复杂，成分越不明了都会对下游制备成的免疫疫苗的稳定性有可能造成不良影响。因此，传统的培养方法具有培养周期长、制备得到的免疫疫苗保护效果差的缺点。

发明内容

基于此，针对上述问题，本发明的其中一个目的在于提供一种用于禽多杀性巴氏杆菌大规模培养的培养基。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用于禽多杀性巴氏杆菌的培养基，所述培养基的溶剂为水，溶质为以下组分：

本发明的另一个目的还在于，提供一种培养周期短的培养方法，培养得到的禽多杀性巴氏杆菌制备得到的疫苗效果好。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种禽多杀性巴氏杆菌的培养方法，包括以下步骤：

(1)一级种子的制备：将禽多杀性巴氏杆菌于平板上进行菌种划线复壮；

(2)二级种子的制备：在一级种子的平板上刮取单菌落接种于液体培养基，振摇培养，得二级种子；

(3)上罐发酵：将二级种子接种于如上所述的培养基中，进行发酵培养。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述的液体培养基为含有葡萄糖的LB培养基，所述葡萄糖在液体培养基中的终浓度为0.4％～0.6％。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述的发酵培养包括：

第一阶段：控制pH值为7.1～7.5，搅拌转速为80～90R/min，通气量为10～20L/min，培养2～5h；

第二阶段：控制搅拌转速为120～140R/min，关闭通气和pH调节，培养至pH值降至6.2～6.8。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述发酵培养的温度为37～39℃。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述发酵培养中，发酵罐的罐压为

0.01～0.02MPa。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述刮取单菌落接种于液体培养基为：每500ml液体培养基中接种90～120个单菌落。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述振摇培养的条件为：温度37～38℃，转速100～130R/min振摇2～4h。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述的平板上进行菌种划线复壮为：取保藏的菌株液，于平板划线后，37～38℃倒置培养16～20h。

本发明的另一个目的还在于提供一种禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，为实现上述目的，具体技术方案如下：

一种禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，其特征在于，其活性组分为上述的培养方法得到的禽多杀性巴氏杆菌。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明经过发明人创造性劳动，提供了一种组分简单、明确的培养基，可用于培养禽多杀性巴氏杆菌，其组分不但能够满足微生物生长所需的碳源、氮源，且特别适合禽多杀性巴氏杆菌快速生长，有利于其大规模培养，缩短培养周期。同时该培养基无需添加动物血清或全血等辅助剂，培养得到的禽多杀性巴氏杆菌有利于用于制备疫苗，该疫苗具有较高的稳定性、不易引起动物的应激反应且具有保护率高的特点。

本发明所述的禽多杀性巴氏杆菌的培养方法，明确了用于发酵培养的培养基的组分，无需添加动物血清类物质，可避免动物血清对于下游制备的疫苗的稳定性造成不良影响，使得疫苗对易感动物的保护效果得以提高。

而且，本发明还通过对二级种子制备中使用到的LB培养基进行改良，加入了葡萄糖，与LB培养基中的其余营养物质相互配合，促进禽多杀性巴氏杆菌快速达到对数生长期，缩短二级种子的制备周期，进一步缩短培养周期，提高效率。本发明所述发酵培养的工艺设置份为两个阶段，第一阶段适应禽多杀性巴氏杆菌代谢产生酸性物质的特点，严格控制pH值为7.1～7.5，使得禽多杀性巴氏杆菌处于最适生长环境，第二阶段关闭通气和关闭pH调节，使活菌处于氧气含量低的环境中，有利于细菌稳定生长、产生某些酸性和低氧情况下的代谢产物，从而进一步使得培养得到的禽多杀性巴氏杆菌制备得到的疫苗具有高保护率。

附图说明

图1为本发明所述培养方法的流程示意图；

图2为本发明所述无机盐氨基酸培养基接种禽多杀性巴氏杆菌培养前后的外观示意图，A是无机盐氨基酸培养基，B是经培养8h培养无机盐氨基酸培养基；

图3为平板涂布法计算菌液活菌数的示意图；

图4为本发明所述无机盐氨基酸培养基于发酵罐内接种二级种子前后的对比图，A为接种二级种子前的透明澄清培养基，B为接种发酵培养后浑浊的培养基。

具体实施方式

本发明提供了一种禽多杀性巴氏杆菌的培养基和培养方法。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

1材料

1.1种毒：禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，批号为19990201，即：禽多杀性巴氏杆菌C48-1，血清型A:1。

1.2培养基及补料

表1

1.2.1改良TSA平板：称取胰蛋白胨大豆琼脂粉4g，加入100mL超纯水中，煮沸溶解，121℃高压15min，待其自然冷却至60℃左右时加入2mL的新生牛血清，混匀后分装制成平板。

1.2.2 50％葡萄糖溶液：称取2.5g葡萄糖，加超纯水至5ml，121℃高压灭菌30min，4℃保存备用。

1.2.3改良LB培养基(二级种子液所用培养基)：称取胰蛋白胨5g、酵母粉2.5g、NaCl(氯化钠)2.5g，加蒸馏水定容至495mL，121℃高压30min。待培养基冷却至室温，加入上述50％葡萄糖溶液5ml，即获得改良LB培养基。

1.2.4 1M NaOH(氢氧化钠)：称取20g固体氢氧化钠加超纯水定容至0.5升，121℃高压30min。

1.2.5无机盐氨基酸培养基(发酵罐所用培养基)按照下表2进行配置。

表2无机盐氨基酸培养基

序号	材料	g/L
			1	L-精氨酸	0.2
2	L-半胱氨酸	0.12
			3	L-异亮氨酸	0.065
4	L-苯丙氨酸	0.095
			5	3水磷酸氢二钾	10.00
7	磷酸二氢钾	1.36
			8	氯化钠	1.19
9	D(+)-葡萄糖	10
			10	L-天冬氨酸	1.6
11	七水硫酸镁	0.25

配制方法：

称取序号1-4各材料混合，溶于50ml超纯水，制备成20×液体1；

称取序号5-8各材料混合，溶于800ml超纯水，制备成1×溶液2；

称取材料9，溶于20ml超纯水，制备50％葡萄糖溶液3；

称取材料10，溶于100ml超纯水，制备10×溶液4；

称取材料11，溶于25ml超纯水，制备40×溶液5。

将各溶液1-5进行121℃高压20min。等降至室温将溶液1-5无菌操作混合均匀即为无机盐氨基酸培养基。

备注：数字后有×表示，浓缩至数字的倍数，譬如10×表示配制成的为10倍浓缩液。

2发酵

发酵工艺流程如图1所示。

2.1一级种子制备

从-80℃菌种保存冰箱取一菌株液离心管，放置冰浴至化解。选用一块上述1.2.1配制的改良TSA平板进行菌种划线复壮，划线后37℃恒温培养箱倒置培养16-20h。

2.2二级种子制备

按照上述1.2.3配方对应成比例配制500ml改良LB培养基，按照每10毫升液体加2个单菌落比例，在上述2.1一级种子平板刮取约100个单菌落接种于500ml LB培养基，37℃，转速120R/min震荡3-4h。当发现菌液颜色变深和浑浊可进行下一步。本实施例本次实验中，菌液颜色变深和浑浊耗时3h。

2.3上罐前准备

按照1.2.5所述比例，制备约20L无机盐氨基酸培养基，溶液2所有材料(见表1)在发酵罐内进行内高压蒸汽灭菌，其余溶液1、3、4、5均按照比例在普通高压蒸汽灭菌锅灭菌。

2.4上罐

当发酵罐温度到达合适培养温度36-38℃，将上述2.2获得的500ml二级种子液体和2.3制备的各溶液通过无菌接种操作全部接种到发酵罐中。其中，无机盐氨基酸培养基配制完成后，发酵前的外观如图2A所示，接种禽多杀性巴氏杆菌发酵结束后外观如图2B所示。

2.5发酵罐参数调节与操作

全程控制培养温度为37℃，罐压0.01MPa。发酵培养0-2小时阶段，1M NaOH(氢氧化钠)控制pH 7.40，转速90R/min搅拌，通气量10-20L/min；培养2-5小时后，关闭通气阀门和排气阀门，偶尔通过通气阀与排气阀调节罐体罐压为0.01-0.02MPa，转速130R/min搅拌，关闭pH调节，待pH值降至约6.50左右停止发酵。此时为发酵终点。20L发酵结束，经检验活细胞数浓度达到2.0×10¹⁰～2.5×10¹⁰cfu/ml，即每毫升发酵液含有两百亿至两百五十亿活细胞个数。

对比例1

对比例1与实施例1的培养方法基本相同，主要区别在于对比例1中上罐培养时采用的培养基为葡萄糖磷酸钾LB培养基(GKLB)，而非无机盐氨基酸培养基。

表3GKLB培养基成分

培养基成分	含量g/L
		胰蛋白胨	9-11
酵母粉	4-6
		三水磷酸氢二钾	7-11
葡萄糖	9-11
		氯化钠	4-6

全程控制培养温度为37℃，罐压0.01～0.02MPa，1M NaOH调节pH 7.40，转速90R/min搅拌，发酵时长为8h，通气量为10-20L/min。

对比例2

对比例2与实施例1的培养方法基本相同，主要区别在于对比例2中发酵罐参数调节与操作中，全程控制培养温度为37℃，罐压0.01～0.02MPa，pH 7.40，转速90R/min搅拌。发酵时长为5h，通气量为10-20L/min。

对比例3

对比例3为传统常规的培养方法，参考自以下文献：

《动物医学进展》，2015，36(8)：120-123，禽多杀性巴氏杆菌不同培养培养方法制备的种子液对高密度发酵培养菌数的影响。

其与实施例1培养方法的主要区别在于：一级种子采用马丁琼脂平板，所需时间为18h；二级种子制备和发酵罐培养时采用马丁肉汤培养基，所需时间为至少12小时；发酵罐培养8h。

对比例4

对比例子4为市售禽巴氏杆菌疫苗，购买自山东华宏生物工程有限公司，商品名为禽多杀性巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗。按照说明书内容对易感动物进行免疫保护。

实施例2禽多杀性巴氏杆菌制备疫苗

1、按照上述实施例1中的1.2.1方法制备若干改良TSA平板，使用1.2.3方法配制得到的改良LB作为稀释培养基。取10ml实施例1和对比例1-2所述的发酵液作为样品，按稀释10倍梯度稀释发酵液。取100μl培养物稀释液加入到改良TSA平板，使用无菌涂布棒均匀涂布，37℃倒置培养12-16小时，选择合适的稀释板进行计数。发酵结果检验活细胞数计数的培养平板示意图如图3所示。稀释倍数越高，平板张起的点点单菌落个数越多换算活细胞数就越高。活细胞数(cfu/ml)＝单菌落个数×稀释倍数×10。

2、禽多杀性巴氏杆菌荚膜提取：

1)收集上述发酵液

2)分装到50ml离心管，8000R/min，15min，10℃。弃上清收集沉淀菌泥。

3)加脱膜液，290g氯化钠和SDS 25g混合加超纯水至1000ml，121℃高压30min冷却至室温即为脱膜液。称重菌泥，按照1g菌泥加20ml脱膜液比例混合。

4)56℃水浴震荡1.5h后放置4℃冰箱保存，过夜，备用。

5)8900R/min，30min，10℃离心上述步骤4)产物。收集上清即完成荚膜提取。

制苗：制苗前需要对荚膜提取液进行BCA蛋白含量检测。BCA蛋白含量即为抗原含量。取荚膜提取液，加入适量氢氧化铝胶，抗原与铝胶体积比(3:1)，无菌环境操作充分混合。其中，在本实施例中，所述兽用铝胶盐水稀释液，购买自吉林和元生物工程股份有限公司。

3、效力检验(动物实验)：

用实施例1、对比例1-2发酵得到的禽多杀性巴氏杆菌制备得到的疫苗，免疫28日龄SPF鸡，免疫剂量为2mg/只。另外，以为同日龄SPF鸡为对照组。免疫21日后，使用C48-1株禽多杀性巴氏杆菌通过腿部肌肉注射1个MLD₅₀的菌液(菌液经培养后稀释至10⁷稀释度，0.1ml/只)，对照组保护率为0表示攻毒成立，此时统计SPF鸡的存活情况，计算保护率。

对比例4按照说明书类容进行相同日龄SPF鸡免疫，免疫后21日进行相同量攻毒。

实施例1、对比例1-2所述的培养方法，发酵培养时间、培养得到的活菌浓度、制备得到的疫苗效力测试结果，如表4所示：

表4

由上表可知，本发明所述的培养方法，培养周期短、用于制备疫苗的保护率高；同时发酵培养使用的无机盐氨基酸培养基的组分清晰明确，无需添加裂解血球全血或者血清等物质，有利于下游制备得到的免疫疫苗的稳定性，保证了疫苗对于易感动物的保护率。对比例1中，采用的GKLB培养基中而非本发明实施例1中所述的无机盐氨基酸培养基，其总培养周期为40-48h，得到的发酵液中活菌数为1.0×10¹⁰～1.5×10¹⁰CFU/ml，发酵培养效率远远低于实施例1，制备得到的疫苗对于易感动物的保护率为46.7％，低于实施例1；而对比例2中，其采用全程控制pH值、通气量的方法，虽然其发酵所需周期、得到的活菌数均与实施例1相当，但因其没有对发酵工艺参数进行分段控制，其制备得到的疫苗对易感动物的保护率为70.0％，略低于实施例1；而对比例3中，至发酵终点时，得到的发酵液中活菌数为1.0×10¹⁰～3×10¹⁰CFU/ml，但培养所需时间为至少38h，对比例3的发酵效率远低于实施例1。对比例4中，市售禽巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗保护率只有35％。远低于实施例1。

对比例2和对比例3，相同发酵培养条件，不同培养基，活菌数表现为对比例3优于对比例2。

实施例1与对比例3，相同培养基(无机盐氨基酸培养基)，发酵第二阶段不同操作，免疫保护率和细菌数表现为实例1优于对比例3。

实施例1、对比例1-2，免疫保护率均比对比例4好。

实施例1与对比例3对比，节省了发酵操作周期。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于禽多杀性巴氏杆菌的培养基，其特征在于，所述培养基的溶剂为水，溶质为以下组分：

2.一种禽多杀性巴氏杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)一级种子的制备：将禽多杀性巴氏杆菌于平板上进行菌种划线复壮；

(2)二级种子的制备：在一级种子的平板上刮取单菌落接种于液体培养基，振摇培养，得二级种子；

(3)上罐发酵：将二级种子接种于如权利要求1所述的培养基中，进行发酵培养。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)所述的液体培养基为含有葡萄糖的LB培养基，所述葡萄糖在液体培养基中的终浓度为0.4％～0.6％。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)所述的发酵培养包括：

第一阶段：控制pH值为7.1～7.5，搅拌转速为80～90R/min，通气量为10～20L/min，培养2～5h；

第二阶段：控制搅拌转速为120～140R/min，关闭通气，进行培养，培养期间关闭pH调节，培养至pH值降至6.2～6.8即可。

5.根据权利要求2-4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为37～39℃。

6.根据权利要求2-4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养中，发酵罐的罐压为0.01～0.02MPa。

7.根据权利要求2-4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述刮取单菌落接种于液体培养基为：每500ml液体培养基中接种90～120个单菌落。

8.根据权利要求2-4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述振摇培养的条件为：温度37～38℃，转速100～130R/min振摇2～4h。

9.根据权利要求2-4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述的平板上进行菌种划线复壮为：取保藏的菌株液，于平板划线后，37～38℃倒置培养16～20h。

10.一种禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗，其特征在于，其活性组分为权利要求2-9任一项所述的培养方法得到的禽多杀性巴氏杆菌。

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