CN111534461B - 兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基及其使用方法 - Google Patents
兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基及其使用方法，培养基各组分分别为：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、L‑半胱氨酸盐酸盐一水物、谷氨酸钠、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、KH2PO4、K2HPO4、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉粉、果糖、乳糖。本发明的培养基在只添加0.1％绵羊全血的条件下，活菌数能够维持在3.5×1010CFU/ml以上3个小时；在添加0.1％绵羊全血和1％新生牛血清的条件下，活菌数能够维持在4×1010CFU/ml以上3个小时。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基及其使用方法。
背景技术
兔多杀性巴氏杆菌是从兔子上分离的一种多杀性巴氏杆菌，是一种能让兔子患出血性败血症的细菌。不同年龄、品种的家兔均易感染发病。且本病一年四季均可发生，尤其是在阴雨潮湿、高温高湿、气候多变的季节发病率相对较高。常呈散发或地方性流行，当爆发流行时，常会导致全军覆没。该病爆发的原因众多，难以保证全面控制。通过培养巴氏杆菌制成的活疫苗和灭活疫苗能够有效防护，大大降低家兔患病风险。
目前未见相关兔多杀性巴氏杆菌生长培养基的专利，公开号为CN 108904796 A的专利申请“兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法”用多杀性巴氏杆菌发酵培养基进行发酵培养，活菌数最高也没能超过2×1010CFU/ml。疫苗生产厂家培养多杀性巴氏杆菌所使用的培养基大多是马丁肉汤或者改良马丁肉汤，收获兔巴氏杆菌活菌数水平在1.2—2×1010CFU/ml之间，增菌效果差，活菌数最多只能够维持在2×1010CFU/ml以上1个小时。使用马丁氏肉汤或者改良马丁肉汤这些传统的培养基培养兔多杀性巴氏杆菌时还需要添加0.6％-1％的血清，培养成本高。
发明内容
本发明提供一种个性化的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，该培养基提高了收获兔巴氏杆菌活菌，延长了维持较高活菌数的时间，降低了生产成本。
本发明还提供一种兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基的使用方法，在只添加0.1％绵羊全血的条件下，活菌数能够维持在3.5×1010CFU/ml以上3个小时；在添加0.1％绵羊全血和1％新生牛血清的条件下，活菌数能够维持在4×1010CFU/ml以上3个小时。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，培养基水溶液中各组分的浓度分别为：
丙氨酸：290～435、精氨酸：370～555、天冬氨酸：640～960、L-半胱氨酸盐酸盐一水物：157～236、谷氨酸钠：2030～3045、甘氨酸：180～270、组氨酸：280～420、异亮氨酸：550～825、亮氨酸：830～1245、赖氨酸：740～1110、甲硫氨酸：125～188、苯丙氨酸：450～675、脯氨酸：960～1440、丝氨酸：570～855、苏氨酸：440～660、色氨酸：100～150、酪氨酸：145～218、缬氨酸650～975、KH2PO4：2000～3000、K2HPO4：7000～10500、酵母粉：5000～7500、胰蛋白胨：5000～7500、牛肉粉：5000～7500、果糖：3000～4500、乳糖：2000～4500，上述组分浓度的单位均为mg/L。
进一步地，所述还包括按以下浓度配比的组分：MnCl2：0～0.1、Fe(NO3)3·9H2O：0～0.1、泛酸钙：0～2、烟酰胺：0～5、盐酸硫胺：0～1、生物素：0～0.02、VB12：0～0.1、叶酸：0～1、VB6：0～1、肌醇：0～2，上述组分浓度的单位均为mg/L。
进一步地，所述培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸290、精氨酸370、天冬氨酸640、L-半胱氨酸盐酸盐一水物157、谷氨酸钠2030、甘氨酸180、组氨酸280、异亮氨酸550、亮氨酸830、赖氨酸740、甲硫氨酸125、苯丙氨酸450、脯氨酸960、丝氨酸570、苏氨酸440、色氨酸100、酪氨酸145、缬氨酸650、KH2PO4 2000、K2HPO4 7000、酵母粉5000、胰蛋白胨5000、牛肉粉5000、果糖3000、乳糖2000，上述组分浓度的单位均为mg/L。
进一步地，所述培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸319、精氨酸407、天冬氨酸704、L-半胱氨酸盐酸盐一水物173、谷氨酸钠2233、甘氨酸198、组氨酸308、异亮氨酸605、亮氨酸913、赖氨酸814、甲硫氨酸138、苯丙氨酸495、脯氨酸1056、丝氨酸627、苏氨酸484、色氨酸110、酪氨酸160、缬氨酸715、KH2PO4 2200、K2HPO4 7700、MnCl2 0.1、Fe(NO3)3·9H2O 0.1、泛酸钙2、烟酰胺5、盐酸硫胺1、生物素0.02、VB12 0～0.1、叶酸1、VB6 1、肌醇2、酵母粉5500、胰蛋白胨5500、牛肉粉5500、果糖3300、乳糖2200，上述组分浓度的单位均为mg/L。
本技术方案中，考虑到使用的复合氮源酵母粉、胰蛋白胨和牛肉粉是真菌以及动物来源，各种氨基酸组分与细菌不同，我们采用了均匀设计和正交设计两种实验方法，对添加的氨基酸种类进行了筛选和各氨基酸之间配比进行了优化，添加了一些兔巴氏杆菌需求而复合氮源中含量不够的氨基酸；泛酸钙和生物素在糖代谢，脂肪代谢和脂肪酸合成过程中起重要的催化作用；VB12是谷酰胺辅酶的组成成分，VB12辅酶参与甲硫氨酸和胸腺嘧啶核苷酸的甲基合成；选用了果糖和乳糖两种糖类物质，单糖和双糖的搭配组合，一是保证了长时间发酵C源充足；二是细菌使用两种糖的顺序不一样，细菌会优先利用单糖，在由利用单糖到利用双糖的转换过程中，细菌会利用其它氨基氮源或复合氮源中的含碳物质，由于分解氨基类物质，此时pH值会升高，而在利用糖时会产酸，pH会下降，这个动态平衡刚好能使培养基pH能够长时间维持在兔多杀性巴氏杆菌最适生长pH的范围内，促进细菌增菌。
本发明还公开了一种兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基使用方法，包括以下步骤：
S1、将各组分按照浓度进行配比，制成培养基；
S2、用10M浓度的NaOH溶液将配置好的培养基溶液的pH值调到7.8；
S3、将培养基溶液在116℃高压蒸汽下灭菌20分钟，然后降温至常温；
S4、向培养基溶液中加入培养基溶液体积0.1％的绵羊全血，或者向培养基溶液中加入培养基溶液体积0.1％的绵羊全血和1％的新生牛血清；
S5、将兔多杀性巴氏杆菌种子液接种于步骤S4准备好的培养基溶液中。
较与现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，在只添加0.1％绵羊全血的条件下，活菌数能达到3.5×1010CFU/ml；在添加0.1％绵羊全血和1％新生牛血清的条件下，活菌数能达到4×1010CFU/ml；
2、本发明兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，在只添加0.1％绵羊全血的条件下，其活菌数也是远超于现目前生产水平所能达到的最高活菌数2×1010CFU/ml，能够不使用血清，降低了生产成本；
3、本申请基于细菌代谢特点，从细菌最适生长环境和所需必须营养物质入手，设计开发的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，延长了兔多杀性巴氏杆菌处于生长平稳期的时间，有利于兔多杀性巴氏杆菌收获。
附图说明
图1为本发明的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基与马丁氏肉汤培养基同时添加0.1％绵羊全血和1％新生牛血清，在5L发酵罐中培养兔多杀性巴氏杆菌的生长曲线对比图；
图2为本发明的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基只加入0.1％绵羊全血，在5L发酵罐中培养兔多杀性巴氏杆菌的生长曲线图；
图3为本发明的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，在50L发酵罐中培养基兔多杀性巴氏杆菌，添加0.1％绵羊全血和1％新生牛血清与只添加0.1％绵羊全血的生长曲线对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸290、精氨酸370、天冬氨酸640、L-半胱氨酸盐酸盐一水物157、谷氨酸钠2030、甘氨酸180、组氨酸280、异亮氨酸550、亮氨酸830、赖氨酸740、甲硫氨酸125、苯丙氨酸450、脯氨酸960、丝氨酸570、苏氨酸440、色氨酸100、酪氨酸145、缬氨酸650、KH2PO4 2000、K2HPO47000、酵母粉5000、胰蛋白胨5000、牛肉粉5000、果糖3000、乳糖2000，上述组分浓度的单位均为mg/L。
实施例2
兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸435、精氨酸555、天冬氨酸960、L-半胱氨酸盐酸盐一水物236、谷氨酸钠3045、甘氨酸270、组氨酸420、异亮氨酸825、亮氨酸1245、赖氨酸1110、甲硫氨酸188、苯丙氨酸675、脯氨酸1440、丝氨酸855、苏氨酸660、色氨酸150、酪氨酸218、缬氨酸975、KH2PO4 3000、K2HPO4 10500、酵母粉7500、胰蛋白胨7500、牛肉粉7500、果糖4500、乳糖4500，上述组分浓度的单位均为mg/L。
实施例3
兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸319、精氨酸407、天冬氨酸704、L-半胱氨酸盐酸盐一水物173、谷氨酸钠2233、甘氨酸198、组氨酸308、异亮氨酸605、亮氨酸913、赖氨酸814、甲硫氨酸138、苯丙氨酸495、脯氨酸1056、丝氨酸627、苏氨酸484、色氨酸110、酪氨酸160、缬氨酸715、KH2PO4 2200、K2HPO47700、酵母粉5500、胰蛋白胨5500、牛肉粉5500、果糖3300、乳糖2200，上述组分浓度的单位均为mg/L。
实施例4
兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸319、精氨酸407、天冬氨酸704、L-半胱氨酸盐酸盐一水物173、谷氨酸钠2233、甘氨酸198、组氨酸308、异亮氨酸605、亮氨酸913、赖氨酸814、甲硫氨酸138、苯丙氨酸495、脯氨酸1056、丝氨酸627、苏氨酸484、色氨酸110、酪氨酸160、缬氨酸715、KH2PO4 2200、K2HPO47700、MnCl20.1、Fe(NO3)3·9H2O 0.1、泛酸钙2、烟酰胺5、盐酸硫胺1、生物素0.02、VB120～0.1、叶酸1、VB6 1、肌醇2、酵母粉5500、胰蛋白胨5500、牛肉粉5500、果糖3300、乳糖2200，上述组分浓度的单位均为mg/L。
本发明所述的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基使用方法，包括以下步骤：
S1、将各组分按照浓度进行配比，制成培养基；
S2、用10M浓度的NaOH溶液将配置好的培养基溶液的pH值调到7.8；
S3、将培养基溶液在116℃高压蒸汽下灭菌20分钟，然后降温至常温；
S4、向培养基溶液中加入培养基溶液体积0.1％的绵羊全血，或者向培养基溶液中加入培养基溶液体积0.1％的绵羊全血和1％的新生牛血清；
S5、将兔多杀性巴氏杆菌种子液接种于步骤S4准备好的培养基溶液中。
下面通过实验对本发明的培养基进行验证。
1、按照实施例1的配方配置兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，然后将配置好的培养基用10M浓度的NaOH溶液将培养基溶液的pH值调到7.8；
将培养基溶液在116℃高压蒸汽下灭菌20分钟，然后降温至常温；
向培养基溶液中加入0.1％绵羊全血和1％新生牛血清；配制好马丁氏肉汤培养基，同样加入0.1％绵羊全血和1％新生牛血清作为对照组；
将兔多杀性巴氏杆菌种子液接种于准备好的培养基溶液和对照组的培养基溶液中，连续培养10小时，每小时测细菌的活菌数，得到的兔多杀性巴氏杆菌生长曲线如图1所示。
图中RPM表示本发明的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基。从图1可以看出马丁氏肉汤在5小时后就开始不怎么增长，最高活菌数在2.2×1010CFU/ml左右，7小时后活菌数已经快速下降；RPM一直能稳定增长，能够保持活菌数在4×1010CFU/ml以上3小时。因此可以得出：RPM培养基不论是在增菌效果上，还是维持活菌数上都优于马丁氏肉汤培养基。
2、按照实施例4的配方配置兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，然后将配置好的培养基用10M浓度的NaOH溶液将培养基溶液的pH值调到7.8；
将培养基溶液在116℃高压蒸汽下灭菌20分钟，然后降温至常温；
向培养基溶液中加入0.1％绵羊全血；
将兔多杀性巴氏杆菌种子液接种于准备好的培养基溶液中，连续培养10小时，每小时测细菌的活菌数，得到的兔多杀性巴氏杆菌生长曲线如图2所示。
从图2可以看出，活菌数在7小时已经超过3.5×1010CFU/ml，并且持续到10小时。因此可以得出：在只添加0.1％绵羊全血的条件下，RPM培养效果一样能使活菌数能达到3.5×1010CFU/ml，且活菌数都能够稳定3小时不会有较大波动。既节约了成本，又提高产能，同时方便判断收菌时间。
3、实验1和2均为小试实验。按照实施例1的配方配置兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，并添加0.1％绵羊全血和1％新生牛血清；按照实施例4的配方配置兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，并添加0.1％绵羊全血；然后进行中试试验，连续培养10小时，得到的兔多杀性巴氏杆菌生长曲线如图3所示。小试到中试由于发酵罐硬件条件降低，中试结果会略差于小试结果。但是活菌数在9小时也已经超过3.5×1010CFU/ml，并且能够稳定3小时不会有较大波动。证明本发明的培养基能够得到优质的培养效果。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基在兔多杀性巴氏杆菌增菌培养中的应用，其特征在于，培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸290、精氨酸370、天冬氨酸640、L-半胱氨酸盐酸盐一水物157、谷氨酸钠2030、甘氨酸180、组氨酸280、异亮氨酸550、亮氨酸830、赖氨酸740、甲硫氨酸125、苯丙氨酸450、脯氨酸960、丝氨酸570、苏氨酸440、色氨酸100、酪氨酸145、缬氨酸650、KH2PO4 2000、K2HPO4 7000、酵母粉5000、胰蛋白胨5000、牛肉粉5000、果糖3000、乳糖2000，上述组分浓度的单位均为mg/L。
2.兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基在兔多杀性巴氏杆菌增菌培养中的应用，其特征在于，培养基水溶液中各组分的浓度分别为：丙氨酸319、精氨酸407、天冬氨酸704、L-半胱氨酸盐酸盐一水物173、谷氨酸钠2233、甘氨酸198、组氨酸308、异亮氨酸605、亮氨酸913、赖氨酸814、甲硫氨酸138、苯丙氨酸495、脯氨酸1056、丝氨酸627、苏氨酸484、色氨酸110、酪氨酸160、缬氨酸715、KH2PO4 2200、K2HPO4 7700、MnCl2 0.1、Fe(NO3)3·9H2O0.1、泛酸钙2、烟酰胺5、盐酸硫胺1、生物素0.02、VB12 0.1、叶酸1、VB6 1、肌醇2、酵母粉5500、胰蛋白胨5500、牛肉粉5500、果糖3300、乳糖2200，上述组分浓度的单位均为mg/L。
3.一种兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基使用方法，其特征在于，使用如权利要求1或2中所述的兔多杀性巴氏杆菌增菌培养基，包括以下步骤：
S1、将各组分按照浓度进行配比，制成培养基；
S2、用10M浓度的NaOH溶液将配置好的培养基溶液的pH值调到7.8；
S3、将培养基溶液在116℃高压蒸汽下灭菌20分钟，然后降温至常温；
S4、向培养基溶液中加入培养基溶液体积0.1％的绵羊全血，或者向培养基溶液中加入培养基溶液体积0.1％的绵羊全血和1％的新生牛血清；
S5、将兔多杀性巴氏杆菌种子液接种于步骤S4准备好的培养基溶液中。
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