CN109439576B - 一种诺维氏梭菌培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诺维氏梭菌培养基及其制备方法，由基础培养基、血红素溶液和维生素K1溶液按体积比1000ml：(8‑12)ml：(4‑6)ml配制而成；每1000ml基础培养基中包含：胰蛋白胨8‑12g、酵母浸粉8‑12g、磷酸钾4‑6g、葡萄糖8‑12g、糊精0.5‑1.5g、牛肉粒7‑15g。本发明的诺维氏梭菌培养基能够适合和满足诺维氏梭菌的生长需求，极大提高了诺维氏梭菌的生长及繁殖速度，有利于诺维氏梭菌的研究及其疫病防控。

Description

一种诺维氏梭菌培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及厌氧生物培养基制备技术领域，具体涉及一种诺维氏梭菌培养基及其制备方法。

背景技术

诺维氏梭菌能引起人的气性坏疽、动物的恶性水肿、绵羊的大头病和绵羊、山羊、牛、马等的黑疫等疾病，发病急、死亡率高，是人畜共患病中危害较大的一类病原微生物，是严重危害养殖业的重要疾病之一，给畜牧业带来巨大经济损失。

但由于诺维氏梭菌属于厌氧菌，其厌氧培养及筛选培养基的技术困难，目前尚未有诺维氏梭菌的专用培养基。各类文献中提及的培养基，如庖肉培养基、PYG液体培养基、厌气肉肝汤培养基、脑心浸出液肉汤(BHI)培养基等，在诺维氏梭菌培养过程中效果不稳定，总体培养效果较差，细菌生长繁殖速度慢，往往达不到理想的细菌密度或含量。因此，在进行诺维氏梭菌的检验、试验和疫苗生产当中，达不到相应的目标。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种诺维氏梭菌培养基及其制备方法。本发明的培养基能够适合和满足诺维氏梭菌的生长需求，极大提高了诺维氏梭菌的生长及繁殖速度，有利于诺维氏梭菌的研究及其疫病防控。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种诺维氏梭菌培养基，由基础培养基、血红素溶液和维生素K1溶液按体积比1000ml：(8-12)ml：(4-6)ml配制而成；

每1000ml基础培养基中包含：胰蛋白胨8-12g、酵母浸粉8-12g、磷酸钾4-6g、葡萄糖8-12g、糊精0.5-1.5g、牛肉粒7-15g。

优选的，所述诺维氏梭菌培养基，由基础培养基、血红素溶液和维生素K1溶液按体积比1000ml：10ml：5ml配制而成；

每1000ml基础培养基中包含：胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g、糊精1g、牛肉粒12g。

优选的，所述血红素溶液由如下方法制备而成：

将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌。

优选的，所述维生素K1溶液由如下方法制备而成：

将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，灭菌。

进一步的，所述诺维氏梭菌培养基的pH为7.8-8.4。

本发明的第二方面，提供上述诺维氏梭菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胰蛋白胨、酵母浸粉、磷酸钾、葡萄糖、糊精和牛肉粒溶解于蒸馏水中，高温灭菌，配制成基础培养基；

(2)将基础培养基冷却至室温，然后向基础培养基中加入血红素溶液和维生素K1溶液，即制备得到诺维氏梭菌培养基。

优选的，步骤(1)中，所述蒸馏水为双蒸馏水。

本发明的第三方面，提供上述诺维氏梭菌培养基在诺维氏梭菌快速増菌培养中的应用。

本发明的第四方面，提供上述诺维氏梭菌培养基在制备诺维氏梭菌疫苗中的应用。

本发明的第五方面，提供一种诺维氏梭菌的培养方法，包括以下步骤：

将诺维氏梭菌接种至上述诺维氏梭菌培养基中，在37-43℃条件下进行厌氧培养。

优选的，所述厌氧培养的气体环境为：80％氮气、8％氢气和12％二氧化碳。

本发明的有益效果：

(1)本发明的诺维氏梭菌培养基是根据诺维氏梭菌的生理代谢特点设计而成，能够使诺维氏梭菌的培养增效、密度增高，培养速度加快，缩短了培养时间。

(2)本发明的诺维氏梭菌培养基营养成分明确，成分所用原材料易获得，制备方法简单，可大规模生产与使用，具有较强的通用性，便于推广。

(3)本发明的诺维氏梭菌培养基适于诺维氏梭菌的增菌培养、学术研究、制备疫苗等，适用于牛源、羊源、猪源等诺维氏梭菌研究及其疫病防控；亦可作为菌种保存使用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，目前尚未有诺维氏梭菌的专用培养基，现有报道的用于培养诺维氏梭菌的培养基，细菌生长繁殖速度慢，往往达不到理想的细菌密度或含量，因此阻碍了诺维氏梭菌的研究和开发。基于此，本发明的目的是提供一种适用于诺维氏梭菌的培养基。

我们知道，细菌培养的培养效率起决定性作用的是培养基、制备工艺及其气体环境。因此，根据诺维氏梭菌在生长、繁殖和代谢过程中的营养需求，设计诺维氏梭菌培养基中各种营养物的成分、含量及其配比，制备工艺和培养环境是本发明的重要内容。

诺维氏梭菌的培养对培养条件、环境和营养有特殊的要求，其中除了对细胞生长、繁殖和存活起维持作用的有机碳源、氮源及盐类以外，血红素、维生素K1以及外界厌氧环境的气体成分对其起着至关重要的作用。其中，牛肉粒提供了多种细菌所需氨基酸，一定比例的氮气、二氧化碳和氢气环境提供了诺维氏梭菌所需的厌氧环境，并且提供了细菌生长所需的碳源、氮源等。

本发明研究发现，血红素及维生素K1对诺维氏梭菌的生长繁殖有重要作用。不加血红素、不加维生素K1以及两者都不加的培养基培养效果都不理想，加入血红素以及维生素K1，过量浪费，少量则达不到理想效果，这对培养基的配比提出了很高的要求。

在本发明的一种实施方案中，给出了适于诺维氏梭菌培养的培养基组成，其由基础培养基、血红素溶液和维生素K1溶液按体积比1000ml：(8-12)ml：(4-6)ml配制而成；

每1000ml基础培养基中包含：胰蛋白胨8-12g、酵母浸粉8-12g、磷酸钾4-6g、葡萄糖8-12g、糊精0.5-1.5g、牛肉粒7-15g。

其中，所用牛肉粒为去脂肪和筋膜的牛肉粒。

所述血红素溶液由如下方法制备而成：

将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌。

所述维生素K1溶液由如下方法制备而成：

将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，灭菌。

所述诺维氏梭菌培养基的pH为7.8-8.4。

需要说明的是，本发明的培养基不能添加琼脂作为固体培养基使用。

本发明的诺维氏梭菌培养基是根据诺维氏梭菌的生理代谢特点设计而成，各原料组成是一个有机的整体，原料之间具有协同促进作用，共同促进诺维氏梭菌的快速生长繁殖。本发明在试验过程中发现，增加、减少或替换上述诺维氏梭菌培养基的原料组分，都会对诺维氏梭菌的生长产生不利影响；各原料组分的加入量也是经反复试验、无数次摸索才得到的，调整各原料组分的加入量也会对诺维氏梭菌的生长产生不利影响。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：诺维氏梭菌培养基的制备

(1)将胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g、糊精1g和牛肉粒12g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；

(2)将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；

(3)将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；

(4)向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液5mL、血红素溶液10mL，调节pH至7.8-8.4，即制备得到诺维氏梭菌培养基。

实施例2：诺维氏梭菌培养基的制备

(1)将胰蛋白胨8g、酵母浸粉12g、磷酸钾4g、葡萄糖12g、糊精0.5g和牛肉粒15g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；

(2)将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；

(3)将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；

(4)向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液4mL、血红素溶液12mL，调节pH至7.8-8.4，即制备得到诺维氏梭菌培养基。

实施例3：诺维氏梭菌培养基的制备

(1)将胰蛋白胨12g、酵母浸粉8g、磷酸钾6g、葡萄糖8g、糊精1.5g和牛肉粒7g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；

(2)将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；

(3)将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；

(4)向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液6mL、血红素溶液8mL，调节pH至7.8-8.4，即制备得到诺维氏梭菌培养基。

对比例1：

(1)将大豆蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g、糊精1g和牛肉膏12g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；

(2)将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；

(3)将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；

(4)向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液5mL、血红素溶液10mL，调节pH至7.8-8.4，制备得到培养基A。

对比例2：

(1)将胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g和牛肉粒12g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；

(2)将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；

(3)向冷却至室温的基础培养基中无菌加入血红素溶液10mL，调节pH至7.8-8.4，制备得到培养基B。

对比例3：

(1)将胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g和牛肉粒12g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；

(2)将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；

(4)向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液5mL，调节pH至7.8-8.4，制备得到培养基C。

试验例1：诺维氏梭菌的培养：

1.试验方法：

将诺维氏梭菌分别接种于实施例1制备的诺维氏梭菌培养基中，置于80％氮气、8％氢气、12％二氧化碳的厌氧培养箱中，37℃温度调节下进行厌氧培养。

以庖肉培养基、PYG液体培养基以及对比例1-3制备的培养基作为对照，在相同条件下进行培养。

分别在厌氧培养2天和5天后统计各培养基中的活菌密度。

2.试验结果：

各组培养基在厌氧培养不同时间后的活菌密度见表1。

表1：各组培养基在厌氧培养不同时间后的活菌密度

由表1可以看出，与庖肉培养基、PYG液体培养基相比，本发明制备的诺维氏梭菌培养基更加适合于诺维氏梭菌的快速、高效培养；与对比例1-对比例3制备的培养基相比，说明调整本发明诺维氏梭菌培养基的原料组分都会对诺维氏梭菌的生长繁殖产生不利影响。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种诺维氏梭菌培养基，其特征在于，由基础培养基、血红素溶液和维生素K1溶液按体积比1000ml：8-12ml：4-6ml配制而成；

每1000ml基础培养基中包含：胰蛋白胨8-12g、酵母浸粉8-12g、磷酸钾4-6g、葡萄糖8-12g、糊精0.5-1.5g、牛肉粒7-15g；

所述维生素K1溶液由如下方法制备而成：

将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌；

所述血红素溶液由如下方法制备而成：

将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，灭菌。

2.根据权利要求1所述的诺维氏梭菌培养基，其特征在于，由基础培养基、血红素溶液和维生素K1溶液按体积比1000ml：10ml：5ml配制而成；

每1000ml基础培养基中包含：胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g、糊精1g、牛肉粒12g。

3.根据权利要求1所述的诺维氏梭菌培养基，其特征在于，所述诺维氏梭菌培养基的pH为7.8-8.4。

4.权利要求1-3任一项所述的诺维氏梭菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将胰蛋白胨、酵母浸粉、磷酸钾、葡萄糖、糊精和牛肉粒溶解于蒸馏水中，高温灭菌，配制成基础培养基；

(2)将基础培养基冷却至室温，然后向基础培养基中加入血红素溶液和维生素K1溶液，即制备得到诺维氏梭菌培养基。

5.权利要求1-3任一项所述的诺维氏梭菌培养基在诺维氏梭菌快速増菌培养中的应用。

6.权利要求1-3任一项所述的诺维氏梭菌培养基在制备诺维氏梭菌疫苗中的应用。

7.一种诺维氏梭菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将诺维氏梭菌接种至权利要求1-3任一项所述的诺维氏梭菌培养基中，在37-43℃条件下进行厌氧培养。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述厌氧培养的气体环境为：80％氮气、8％氢气和12％二氧化碳。