CN104419744A - 一种厌氧增菌培养基及其配制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种厌氧增菌培养基及其配置方法，该培养基包含蛋白胨、酵母浸粉、脑心浸液肉汤、葡萄糖、硫代乙醇酸钠、氯化血红素、维生素K1、抗凝剂、厌氧指示剂、蒸馏水；根据其特殊的配比，可制备出能够能促进厌氧细菌大量繁殖的培养基，该培养基应用在临床上厌氧病原菌的培养，可提高厌氧病原菌的阳性检出率。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种厌氧增菌培养基及其配制方法。
背景技术
厌氧菌引起的菌血症近年呈上升趋势且造成的死亡率较高。20世纪70年代血培养厌氧菌分离率高达20%～30%, 其中脆弱拟杆菌群占78%, 在革兰阴性菌中仅次于大肠埃希菌占第二。近年厌氧菌耐药性的出现使经验治疗面临挑战，厌氧菌引起的临床感染及临床后果重新受到重视。厌氧血培养是为临床提供快速、准确诊断厌氧菌血症的金标准方法。
对厌氧菌血症回顾性研究表明，厌氧菌血症因诊断错误导致的死亡率可高达55%～63%，但在明确病原菌后采用针对性治疗，死亡率可降至14%～17%。因此，厌氧血培养结果对临床治疗的指导作用显而易见，漏检血培养中的厌氧菌将导致严重后果。准确、及时的厌氧血培养结果对针对性抗菌治疗即为重要，厌氧增菌培养基的质量决定了血培养的厌氧菌的阳性检出率和检出时间。由于厌氧菌对环境条件的要求苛刻，生长速度慢，实验室报告结果时间较长，不能对临床及时指导。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供一种厌氧增菌培养基，该培养基能促进临床标本中厌氧细菌的繁殖，提高厌氧病原菌的阳性检出率。
按照本发明的厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨20-28份，酵母浸粉1.5-4.0份，脑心浸液肉汤0.5-1.5份，葡萄糖0.6-2.5份，硫代乙醇酸钠2.5-4.0份，氯化血红素0.003-0.008份，维生素K1为0.0003-0.0008 份，抗凝剂0.3-0.5份，厌氧指示剂0.00005- 0.0003份，蒸馏水900-1100份。
上述方案中优选的是，还包含含量为 0.05-0.15份的L-半胱氨酸或维生素C。
上述任一方案中优选的是，还包含碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的任一种或几种混合物，含量为0.3-0.6份。
上述任一方案中优选的是，蛋白胨25份，酵母浸粉2份，脑心浸液肉汤1份，葡萄糖2份，硫代乙醇酸钠3份，氯化血红素0.005份，维生素K1为0.0005 份，抗凝剂0.35份，厌氧指示剂0.0001份，蒸馏水1000份。
上述任一方案中优选的是，还包含含量为0.1份的L-半胱氨酸或维生素C。
上述任一方案中优选的是，还包含碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙和碳酸氢铵中的任一种或几种混合物，含量为0.4份。
上述任一方案中优选的是，所述蛋白胨为多价胨，所述多价胨是胰化酪蛋白和胃蛋白的等重量混合蛋白胨。
上述任一方案中优选的是，所述蛋白胨为胰蛋白胨、大豆蛋白胨等中的任一种或几种的混合。
上述任一方案中优选的是，所述抗凝剂为聚茴香脑磺酸钠、对氨基苯甲酸、硫酸镁、吸附抗生素复合树脂等中的任一种或几种混合。
上述任一方案中优选的是，所述厌氧指示剂为刃天青和/或亚甲基蓝（美兰）。
上述厌氧增菌培养基的配置方法，包括以下步骤：
（1）准备原料：蛋白胨20-28份，酵母浸粉1.5-4.0份，脑心浸液肉汤0.5-1.5份，葡萄糖0.6-2.5份，硫代乙醇酸钠2.5-4.0份，氯化血红素0.003-0.008份，抗凝剂0.3-0.5份，厌氧指示剂0.00005- 0.0003份；
（2）将步骤（1）中的原料放入烧杯中，加入蒸馏水900-1100份，搅拌混均，调节pH值6.8-7.0；然后加热煮沸，以驱逐液体中的氧气；
（3）将步骤（2）中煮沸后的培养基转移到充有氮气的厌氧瓶或厌氧管中，此过程应避免引入氧气；转移完成后，还应继续通入氮气10-20秒；然后封闭厌氧瓶或厌氧管，使其避免进入氧气；
（4）将步骤（3）中装有培养基的厌氧瓶或厌氧管进行灭菌处理；
（5）在步骤（4）中灭菌后的培养基中加入0.0003-0.0008 份的维生素K1，该培养基即可使用。
上述方案中优选的是，步骤（1）中的原料还包含含量为0.05-0.15份的L-半胱氨酸或维生素。
上述方案中优选的是，步骤（1）中的原料还包含碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的任一种或几种混合物，含量为0.3-0.6份。
上述方案中优选的是，步骤（2）中所述调节pH值是使用1mol/L的NaOH溶液进行调整。
上述方案中优选的是，步骤（2）中所述煮沸时间为8-13分钟。
上述方案中优选的是，所述煮沸时间为10分钟。
上述方案中优选的是，步骤（4）中所述灭菌处理是在110-125℃ 下，进行湿热灭菌18-25分钟。
上述方案中优选的是，所述湿热灭菌为20分钟。
本发明厌氧增菌培养基营养成分充足，蛋白胨、脑心浸液等能为厌氧菌的生长提供丰富的营养，氯化血红素、维生素K1作为细菌生长刺激因子，硫代乙醇酸钠作为除氧剂，抗凝剂聚茴香脑磺酸钠可有效中和溶菌酶、抑制吞噬细胞以及使某些氨基糖苷类抗生素失活，使细菌更好地生长。提供的适宜的环境条件能促进临床标本中厌氧细菌的繁殖，提高厌氧病原菌的阳性检出率。
具体实施方式
为了进一步了解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的技术内容进行详细阐述；实施例只对本发明起示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性修改，都应属于本发明的保护范围。
实施例1
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨25克，酵母浸粉2克，脑心浸液肉汤1克，葡萄糖2克，硫代乙醇酸钠3克，氯化血红素0.005克，维生素K1为0.0005克，抗凝剂0.35克，厌氧指示剂0.0001克，蒸馏水1000ml，L-半胱氨酸0.1克，碳酸氢钠0.4克。
在本实施例中，所述蛋白胨为胰蛋白胨；所述抗凝剂为聚茴香脑磺酸钠；所述厌氧指示剂为刃天青。
上述厌氧增菌培养基的配置方法，包括以下步骤：
（1）准备原料：蛋白胨25克，酵母浸粉2克，脑心浸液肉汤1克，葡萄糖2克，硫代乙醇酸钠3克，氯化血红素0.005克，抗凝剂0.35克，厌氧指示剂0.0001克，L-半胱氨酸0.1克，碳酸氢钠0.4克。
（2）将步骤（1）中的原料放入烧杯中，加入蒸馏水1000ml，搅拌混均，调节pH值6.8；然后加热煮沸，以驱逐液体中的氧气；通入氮气至培养基冷却；
（3）将步骤（2）中冷却后的培养基转移到厌氧瓶中，此过程应避免引入氧气；转移完成后，还应继续通入氮气15秒；然后封闭厌氧瓶，使其避免进入氧气；
（4）将步骤（3）中装有培养基的厌氧瓶进行灭菌处理；
（5）在步骤（4）中灭菌后的培养基中加入0.0005 克的维生素K1，该培养基即可使用。
在本实施例中，步骤（2）中所述调节pH值是使用1mol/L的NaOH溶液进行调整；所述煮沸时间为10分钟。
在本实施例中，步骤（4）中所述灭菌处理是在121℃ 下，进行湿热灭菌20分钟。
下面结合试验，对本实施例中的厌氧增菌培养基与其他现有的培养基进行比较。
本实施例中的厌氧增菌培养基和现有技术中的液体硫乙醇酸盐培养基、牛脑心浸液培养基分别培养大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、溶组织梭菌（ATCC19401）和产气荚膜梭菌，并对其各自的生长情况进行分析。
具体试验方法：将大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、溶组织梭菌（ATCC19401）和产气荚膜梭菌各自的菌悬液1.0ⅹ108cfu/ml，分别稀释100倍，并分别取0.1ml接种在厌氧增菌培养基、液体硫乙醇酸盐培养基和牛脑心浸液培养基中，置于厌氧罐内，37℃培养48小时后，观察实验结果，如下表1：
表1
从表1中可以看出：厌氧菌（溶组织梭菌ATCC19401和产气荚膜梭菌）在本实施例的厌氧增菌培养基中能良好生长，细菌生长情况优于液体硫乙醇酸盐培养基和牛脑心浸液培养基；兼性厌氧菌（大肠埃希菌ATCC25922）在本实施例的厌氧增菌培养基中能生长；严格需氧菌（铜绿假单胞菌ATCC27853）不能在本发明培养基中生长。
本实施例中：ATCC是美国标准生物品收藏中心的缩写，在ＡＴＣＣ保藏的菌株都有特定的编号，列举的大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、溶组织梭菌（ATCC19401）代表所用菌株为该细菌的标准菌株；cfu/ml是指每毫升样品中含有的细菌菌落总数。
实施例2
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨20克，酵母浸粉1.5克，脑心浸液肉汤0.5克，葡萄糖0.6克，硫代乙醇酸钠2.5克，氯化血红素0.003克，维生素K1为0.0003克，抗凝剂0.3克，厌氧指示剂0.00005克，蒸馏水900ml，L-半胱氨酸0.05克，碳酸氢钠0.3克。
在本实施例中，所述蛋白胨为大豆蛋白胨；所述抗凝剂为对氨基苯甲酸；所述厌氧指示剂为亚甲基蓝（美兰）。
上述厌氧增菌培养基的配置方法，包括以下步骤：
（1）准备原料：蛋白胨20克，酵母浸粉2.5克，脑心浸液肉汤0.5克，葡萄糖0.6克，硫代乙醇酸钠2.5克，氯化血红素0.003克，抗凝剂0.3克，厌氧指示剂0.00005克，L-半胱氨酸0.05克，碳酸氢钠0.3克。
（2）将步骤（1）中的原料放入烧杯中，加入蒸馏水900ml，搅拌混均，调节pH值7.0；然后加热煮沸，以驱逐液体中的氧气；通入氮气至培养基冷却；
（3）将步骤（2）中冷却后的培养基转移到厌氧管中，此过程应避免引入氧气；转移完成后，还应继续通入氮气10秒；然后封闭厌氧管，使其避免进入氧气；
（4）将步骤（3）中装有培养基的厌氧管进行灭菌处理；
（5）在步骤（4）中灭菌后的培养基中加入0.0003克的维生素K1，该培养基即可使用。
在本实施例中，步骤（2）中所述调节pH值是使用1mol/L的NaOH溶液进行调整；所述煮沸时间为8分钟。
在本实施例中，步骤（4）中所述灭菌处理是在110℃ 下，进行湿热灭菌25分钟。
实施例3
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨28克，酵母浸粉4克，脑心浸液肉汤1.5克，葡萄糖2.5克，硫代乙醇酸钠4克，氯化血红素0.008克，维生素K1为0.0008克，抗凝剂0.5克，厌氧指示剂0.0003克，蒸馏水1100ml，L-半胱氨酸0.15克，碳酸氢钙0.6克。
在本实施例中，所述蛋白胨为多价胨；所述抗凝剂为硫酸镁；所述厌氧指示剂为刃天青。
上述厌氧增菌培养基的配置方法，包括以下步骤：
（1）准备原料：蛋白胨28克，酵母浸粉4克，脑心浸液肉汤1.5克，葡萄糖2.5克，硫代乙醇酸钠4克，氯化血红素0.008克，抗凝剂0.5克，厌氧指示剂0.0003克，L-半胱氨酸0.15克，碳酸氢钙0.6克。
（2）将步骤（1）中的原料放入烧杯中，加入蒸馏水1100ml，搅拌混均，调节pH值6.8；然后加热煮沸，以驱逐液体中的氧气；通入氮气至培养基冷却；
（3）将步骤（2）中冷却后的培养基转移到厌氧瓶中，此过程应避免引入氧气；转移完成后，还应继续通入氮气20秒；然后封闭厌氧瓶，使其避免进入氧气；
（4）将步骤（3）中装有培养基的厌氧瓶进行灭菌处理；
（5）在步骤（4）中灭菌后的培养基中加入0.0008 克的维生素K1，该培养基即可使用。
在本实施例中，步骤（2）中所述调节pH值是使用1mol/L的NaOH溶液进行调整；所述煮沸时间为13分钟。
在本实施例中，步骤（4）中所述灭菌处理是在125℃ 下，进行湿热灭菌18分钟。
实施例4
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨22克，酵母浸粉1.7克，脑心浸液肉汤0.7克，葡萄糖0.8克，硫代乙醇酸钠2.7克，氯化血红素0.004克，维生素K1为0.0004克，抗凝剂0.32克，厌氧指示剂0.00007克，蒸馏水1000ml，L-半胱氨酸0.07克，碳酸氢钾0.35克。
在本实施例中，所述蛋白胨为胰蛋白胨和大豆蛋白胨的混合物；所述抗凝剂为吸附抗生素复合树脂；所述厌氧指示剂为美兰。
上述厌氧增菌培养基的配置方法，包括以下步骤：
（1）准备原料：蛋白胨22克，酵母浸粉1.7克，脑心浸液肉汤0.7克，葡萄糖0.8克，硫代乙醇酸钠2.7克，氯化血红素0.004克，抗凝剂0.32克，厌氧指示剂0.00007克，L-半胱氨酸0.07克，碳酸氢钾0.35克。
（2）将步骤（1）中的原料放入烧杯中，加入蒸馏水1000ml，搅拌混均，调节pH值7.0；然后加热煮沸，以驱逐液体中的氧气；通入氮气至培养基冷却；
（3）将步骤（2）中冷却后的培养基转移到厌氧管中，此过程应避免引入氧气；转移完成后，还应继续通入氮气12秒；然后封闭厌氧管，使其避免进入氧气；
（4）将步骤（3）中装有培养基的厌氧管进行灭菌处理；
（5）在步骤（4）中灭菌后的培养基中加入0.0004克的维生素K1，该培养基即可使用。
在本实施例中，步骤（2）中所述调节pH值是使用1mol/L的NaOH溶液进行调整；所述煮沸时间为9分钟。
在本实施例中，步骤（4）中所述灭菌处理是在115℃ 下，进行湿热灭菌22分钟。
实施例5
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨27克，酵母浸粉3克，脑心浸液肉汤1.2克，葡萄糖2.3克，硫代乙醇酸钠3.5克，氯化血红素0.006克，维生素K1为0.0006克，抗凝剂0.4克，厌氧指示剂0.0002克，蒸馏水1000ml，L-半胱氨酸0.14克，碳酸氢铵0.5克。
在本实施例中，所述蛋白胨为胰蛋白胨；所述抗凝剂为聚茴香脑磺酸钠；所述厌氧指示剂为刃天青。
上述厌氧增菌培养基的配置方法，包括以下步骤：
（1）准备原料：蛋白胨27克，酵母浸粉3克，脑心浸液肉汤1.2克，葡萄糖2.3克，硫代乙醇酸钠3.5克，氯化血红素0.006克，抗凝剂0.4克，厌氧指示剂0.0002克， L-半胱氨酸0.14克，碳酸氢铵0.5克。
（2）将步骤（1）中的原料放入烧杯中，加入蒸馏水1000ml，搅拌混均，调节pH值6.8；然后加热煮沸，以驱逐液体中的氧气；通入氮气至培养基冷却；
（3）将步骤（2）中冷却后的培养基转移到厌氧瓶中，此过程应避免引入氧气；转移完成后，还应继续通入氮气18秒；然后封闭厌氧瓶，使其避免进入氧气；
（4）将步骤（3）中装有培养基的厌氧瓶进行灭菌处理；
（5）在步骤（4）中灭菌后的培养基中加入0.00056克的维生素K1，该培养基即可使用。
在本实施例中，步骤（2）中所述调节pH值是使用1mol/L的NaOH溶液进行调整；所述煮沸时间为12分钟。
在本实施例中，步骤（4）中所述灭菌处理是在121℃ 下，进行湿热灭菌20分钟。
实施例6
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨24克，酵母浸粉1.8克，脑心浸液肉汤0.9克，葡萄糖1克，硫代乙醇酸钠3.2克，氯化血红素0.004克，维生素K1为0.0007克，抗凝剂0.42克，厌氧指示剂0.00015克，蒸馏水1000克，L-半胱氨酸0.12克，碳酸氢钠0.35克。
在本实施例中，所述蛋白胨为胰蛋白胨；所述抗凝剂为聚茴香脑磺酸钠；所述厌氧指示剂为刃天青。
实施例7
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨21克，酵母浸粉2.5克，脑心浸液肉汤0.8克，葡萄糖1.5克，硫代乙醇酸钠2.8克，氯化血红素0.004克，维生素K1为0.0004克，抗凝剂0.33克，厌氧指示剂0.00025克，蒸馏水1000克，L-半胱氨酸0.13克，碳酸氢钾0.35克。
在本实施例中，所述蛋白胨为大豆蛋白胨；所述抗凝剂为聚茴香脑磺酸钠；所述厌氧指示剂为美兰。
实施例8
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨24克，酵母浸粉3.5克，脑心浸液肉汤1.4克，葡萄糖2.4克，硫代乙醇酸钠3.6克，氯化血红素0.006克，维生素K1为0.0006克，抗凝剂0.42克，厌氧指示剂0.0002克，蒸馏水1000克，L-半胱氨酸0.15克，碳酸氢钠0.3克。
在本实施例中，所述蛋白胨为胰蛋白胨；所述抗凝剂为硫酸镁；所述厌氧指示剂为刃天青。
实施例9
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨28克，酵母浸粉1.5克，脑心浸液肉汤1.5克，葡萄糖0.6克，硫代乙醇酸钠4.0克，氯化血红素0.003克，维生素K1为0.0008克，抗凝剂0.3克，厌氧指示剂0.0003克，蒸馏水1000克，L-半胱氨酸0.05克，碳酸氢钙0.6克。
在本实施例中，所述蛋白胨为多价胨；所述抗凝剂为吸附抗生素复合树脂；所述厌氧指示剂为刃天青。
实施例10
一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨20克，酵母浸粉4克，脑心浸液肉汤0.5克，葡萄糖1.5克，硫代乙醇酸钠2.5克，氯化血红素0.008克，维生素K1为0.0003克，抗凝剂0.5克，厌氧指示剂0.0003克，蒸馏水1000克，L-半胱氨酸0.05克，碳酸氢钙0.6克。
在本实施例中，所述蛋白胨为胰蛋白胨；所述抗凝剂为聚茴香脑磺酸钠；所述厌氧指示剂为刃天青。
Claims (10)
1.一种厌氧增菌培养基，其包含：蛋白胨20-28份，酵母浸粉1.5-4.0份，脑心浸液肉汤0.5-1.5份，葡萄糖0.6-2.5份，硫代乙醇酸钠2.5-4.0份，氯化血红素0.003-0.008份，维生素K1为0.0003-0.0008 份，抗凝剂0.3-0.5份，厌氧指示剂0.00005- 0.0003份，蒸馏水900-1100份。
2.如权利要求1所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，还包含含量为 0.05-0.15份的L-半胱氨酸或维生素C。
3.如权利要求1或2所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，还包含碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的任一种或几种混合物，含量为0.3-0.6份。
4.如权利要求1所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，包含蛋白胨25份，酵母浸粉2份，脑心浸液肉汤1份，葡萄糖2份，硫代乙醇酸钠3份，氯化血红素0.005份，维生素K1为0.0005 份，抗凝剂0.35份，厌氧指示剂0.0001份，蒸馏水1000份。
5.如权利要求4所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，还包含含量为0.1份的L-半胱氨酸或维生素C。
6.如权利要求4或5所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，还包含碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙和碳酸氢铵中的任一种或几种混合物，含量为0.4份。
7.如权利要求1或4所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，所述蛋白胨为多价胨。
8.如权利要求1或4所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，所述蛋白胨为胰蛋白胨和/或大豆蛋白胨。
9.如权利要求1或4所述的厌氧增菌培养基，其特征在于，所述抗凝剂为聚茴香脑磺酸钠、对氨基苯甲酸、硫酸镁、吸附抗生素复合树脂中的任一种或几种混合。
10.一种如权利要求1所述的厌氧增菌培养基的配置方法，包括以下步骤：
（1）准备原料：蛋白胨20-28份，酵母浸粉1.5-4.0份，脑心浸液肉汤0.5-1.5份，葡萄糖0.6-2.5份，硫代乙醇酸钠2.5-4.0份，氯化血红素0.003-0.008份，抗凝剂0.3-0.5份，厌氧指示剂0.00005- 0.0003份；
（2）将步骤（1）中的原料放入烧杯中，加入蒸馏水900-1100份，搅拌混均，调节pH值6.8-7.0；然后加热煮沸，通入氮气至培养基冷却；
（3）将步骤（2）中冷却后的培养基转移到厌氧瓶或厌氧管中，转移完成后，还应继续通入氮气10-20秒；然后封闭厌氧瓶或厌氧管；
（4）将步骤（3）中装有培养基的厌氧瓶或厌氧管进行灭菌处理；
（5）在步骤（4）中灭菌后的培养基中加入0.0003-0.0008 份的维生素K1。
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