CN112680499A - 一种厌氧微生物的体外检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，涉及生物化学检测技术领域，该试剂盒包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；所述培养液包括胰蛋白胨、明胶蛋白胨、脑心浸液、L‑精氨酸、L‑半胱氨酸盐酸盐、活性增效调节剂、枸橼酸钠、磷酸二氢钾和维生素C。该试剂盒能够有效地中和抗生素，为微生物提供更有利的生长条件，进而提高厌氧微生物的阳性检出率并缩短检出时间。

Description

一种厌氧微生物的体外检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物化学检测技术领域，具体涉及一种厌氧微生物的体外检测试剂盒。

背景技术

菌血症是指外界的细菌经由体表的入口或是感染的伤口进入血液系统，并在人体血液内繁殖并随血流在全身播散。菌血症多是细菌由局部病灶入血，全身无中毒症状，但血液中可查到细菌，主要发生在炎症的早期阶段。败血症是指致病菌或条件致病菌侵入血循环，并在血中生长繁殖，产生毒素而发生的急性全身性感染。由于败血症绝大多数继发于各种感染，又缺乏特异的临床表现，故易造成漏诊或误诊。常用血培养的方法来进行以上病症的诊断。血培养是将新鲜离体的血液标本接种于营养培养基上，在一定温度、湿度等条件下，使对营养要求较高的细菌生长繁殖并对其进行鉴别，从而确定病原菌的一种培养法。

中国专利CN104450506B公开了一种厌氧血培养基、培养瓶及培养瓶的制备方法，该发明在培养基中新增加了葡萄糖氧化酶和过氧化物酶这两种物质，该物质能去除培养基中的氧气以及代谢过程中产生的对细菌有毒害的过氧化氢及其它细胞毒性物质，解决了传统方法中存在的阳性检出率低，生产复杂，成本高的问题。但该发明中主要采用诸如聚茴香脑磺酸钠、葡萄糖氧化酶和过氧化物酶等成分，有效地中和了抗生素，减少了抗生素对于血培养基的影响，但总体而言，阳性检出率仍相对较低，有一定的局限性。

中国专利CN102925344A公开了一种改良厌氧双相血培养瓶，固相由CDC厌氧肉汤、琼脂粉、酵母浸粉、核酸、谷氨酸钠、维生素C按一定重量配比，添加去离子水混合配制而成。液相由CDC厌氧肉汤、酵母浸粉、SPS、辅酶I，维生素B6、维生素K3、维生素B12、L-谷氨酰胺、L-胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、精氨酸、腺嘌呤硫酸盐、鸟嘌呤盐酸盐、维生素C、异维生素C，按一定重量配比，添加去离子水混合配制而成。该发明中合理的配方比例和完善的营养成分以及更适宜厌氧菌生长的环境条件更有利于各种厌氧菌的生长。并能大大提高阳性检出率和检出时间。但该发明中未指明具体的厌氧菌种类，故而并不知晓该血培养瓶对于厌氧菌的检测是否具有普适性，同时，也未具体说明检出率与检出时间，因此难以判断该血培养瓶的实际效果。

针对现有技术存在的效果不明确以及普适性不明确等问题，应寻找一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，使得该试剂盒能够普遍适用于多种厌氧菌的检测，同时具有较高的检出率以及较短的检出时间。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，该试剂盒能够有效地中和抗生素，为微生物提供更有利的生长条件，进而提高厌氧微生物的阳性检出率并缩短检出时间。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；

所述培养液包括胰蛋白胨、明胶蛋白胨、脑心浸液、L-精氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、活性增效调节剂、枸橼酸钠、磷酸二氢钾和维生素C。

进一步地，所述培养液包括：1-10g/L胰蛋白胨、1-10g/L明胶蛋白胨、1-10g/L脑心浸液、1-10g/L L-精氨酸、1-10g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.08-0.3g/L活性增效调节剂、0.2-0.5g/L枸橼酸钠、0.2-0.5g/L磷酸二氢钾和0.8-2g/L维生素C。

优选地，所述培养液包括：5g/L胰蛋白胨、5g/L明胶蛋白胨、5g/L脑心浸液、3.8g/LL-精氨酸、2.4g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.2g/L活性增效调节剂、0.3g/L枸橼酸钠、0.3g/L磷酸二氢钾和1.2g/L维生素C。

进一步地，所述活性增效调节剂包括植物甾醇和氯化血红素。值得说明的是，本发明中使用的植物甾醇均为水溶性植物甾醇。

优选地，所述植物甾醇和氯化血红素的重量比为1-2:3-5，进一步优选为1:4。

进一步地，所述植物甾醇包括谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的一种或多种。

进一步地，所述吸附树脂为阴离子交换树脂和大孔吸附树脂，二者可以以任意比例配合使用。

进一步地，所述感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料。

进一步地，所述培养液使用双蒸水进行配制。

本发明还提供了上述试剂盒在非诊断目的体外检测厌氧微生物中的应用。

进一步地，所述厌氧微生物包括溶组织梭菌、脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌。

本发明所取得的技术效果是：

1.本发明中产品的液体培养基中加入多种营养成分，可以供多种微生物的生长培养，各个原料之间通过相互配合，能够达到极佳的效果，研究发现，本发明通过活性增效调节剂的加入有着近似生长因子的作用效果，其中少量植物甾醇的添加与氧化血红素配合使用时，同时与其他原料相互协同，在一定程度上非但不会抑制菌群生长，反而具有一定促生长功效，有利于提高菌群活性。培养瓶中充入无菌气体，为微生物提供生长条件，从而达到不同营养需求的微生物的生长需要。加入树脂，可以中和抗生素，减少抗生素对血培养结果的影响。

2.细菌在代谢过程中会释放出二氧化碳等产物，二氧化碳与培养瓶底部含有荧光染料的感受器反应，使感受器内结合二氧化碳的荧光物质被激发出荧光，全自动血培养仪检测系统每10min自动检测一次荧光水平，通过电脑数据系统处理得出培养结果，并以声、光等信号报告。

具体实施方式

值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

实施例1

一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，其特征在于：包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；

其中，培养液包括1g/L胰蛋白胨、1g/L明胶蛋白胨、1g/L脑心浸液、1g/L L-精氨酸、1g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.08g/L活性增效调节剂、0.2g/L枸橼酸钠、0.2g/L磷酸二氢钾和0.8g/L维生素C。活性增效调节剂包括重量比为1:3的谷甾醇和氯化血红素。上述培养液使用双蒸水进行配制。

另外，吸附树脂为体积比为1:1的阴离子交换树脂和大孔吸附树脂混合，感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料。

实施例2

一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，其特征在于：包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；

其中，培养液包括10g/L胰蛋白胨、10g/L明胶蛋白胨、10g/L脑心浸液、10g/L L-精氨酸、10g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.3g/L活性增效调节剂、0.5g/L枸橼酸钠、0.5g/L磷酸二氢钾和2g/L维生素C。活性增效调节剂包括重量比为2:5的豆甾醇和氯化血红素。上述培养液使用双蒸水进行配制。

另外，吸附树脂为体积比为1:1的阴离子交换树脂和大孔吸附树脂混合，感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料。

实施例3

一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，其特征在于：包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；

其中，培养液包括5g/L胰蛋白胨、5g/L明胶蛋白胨、5g/L脑心浸液、3.8g/L L-精氨酸、2.4g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.2g/L活性增效调节剂、0.3g/L枸橼酸钠、0.3g/L磷酸二氢钾和1.2g/L维生素C。活性增效调节剂包括重量比为1:4的菜油甾醇和氯化血红素。上述培养液使用双蒸水进行配制。

另外，吸附树脂为体积比为1:1的阴离子交换树脂和大孔吸附树脂混合，感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料。

对比例1

与实施例1的区别仅在于，培养液包括：0.8g/L胰蛋白胨、12g/L明胶蛋白胨、0.8g/L脑心浸液、12g/L L-精氨酸、0.8g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.4g/L活性增效调节剂、0.1g/L枸橼酸钠、0.6g/L磷酸二氢钾和0.5g/L维生素C。

对比例2

与实施例1的区别仅在于，不加入活性增效剂。

对比例3

与实施例1的区别仅在于，植物甾醇和氯化血红素的重量比为3:2(二者的总重量与实施例1一致)。

试验1：本发明中试剂盒的普适性

样本要求：

1.采用正确医用技术收集的动脉血或其他无菌体液样本。

2.样本收集过程中需要特别注意无菌操作。

3.血培养瓶应该在2h之内送到实验室。不推荐将瓶子置于室温数小时，血培养瓶不应该在接种后冷藏或冷冻；因为这样可能会杀死一些微生物，而且还可能会破碎冷冻装有液体的瓶子，裂解-离心法收集的血培养标本也不应该放置超过8h；标本放置时间过长可能会降低阳性率或延缓某些细菌的生长。

检测方法：

1.检查培养瓶有无污染，破损。

2.启下透明塑料盖，用酒精棉球或碘酒对橡胶盖进行消毒。

3.严格无菌操作，获取患者样本(建议成人采血5-10mL，婴幼儿采血1-3mL)，并在无菌条件下将其接种入培养瓶将培养瓶运送到微生物室，多次倾斜培养瓶，立即放入全自动检测仪器或培养箱中培养。

产品性能指标：

1.外观：培养瓶应无裂缝、无漏液、渗液；瓶内的液体无浑浊、无絮状沉淀、澄清透明。

2.无菌性：取5瓶培养瓶置35℃-37℃培养7天，无菌生长。

3.生长试验：

将实施例1-3中培养瓶接种菌悬液浓度为100cfu/mL-1000cfu/mL质控菌株(溶组织梭菌、脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌)，35℃-37℃培养24h-72h。

注意事项：

1.该培养瓶仅用于体外诊断。

2.该培养瓶为一次性使用产品，使用后的培养瓶不可回收再利用。

3.该培养瓶内已经添加了血液抗凝剂，无须另外添加。

4.在进行静脉穿刺和培养瓶接种时，要注意采取措施，以防患者样本的污染。

5.所用接种后的血培养瓶，样品采集针和抽血用具应视为具有传染性物质，必须按照当地实验室操作步骤及规范进行处理。

6.培养瓶应在外包装标示的有效期内使用。

结果判读情况：

人工目测判读结果：培养瓶倾斜后直立于35℃-37℃培养箱内培养24h-72h，若有以下现象：培养液出现溶血，颜色变暗或固相有菌落长出等，即为阳性，可进一步进行菌种鉴定和药敏实验。每日观察，若没有上述现象，可继续培养，如一周内仍未出现上述现象进行镜检、盲传确认，确认无菌后作阴性结果报告。

仪器检测判读结果：培养瓶通过扫描后放于仪器中，如果培养阳性仪器会自动报警，即为阳性，可进一步进行菌种鉴定和药敏试验。5天内仪器没有报警，镜检、盲传确认无菌后作阴性结果报告。

表1

由表1可知，在经由本发明中实施例1-3的试剂盒进行培养后，各类菌种的人工目测结果以及仪器检测判读结果均为有菌生长，报阳。可见本发明中试剂盒对于上述各个菌种检测的有效性、普适性。

试验2：本发明中试剂盒的准确性

随机挑选三种厌氧菌(溶组织梭菌、脆弱拟杆菌和普通拟杆菌)，采用不同实例中的试剂盒进行检测，每种各测试20组，统计阳性检出率(菌悬液浓度为100cfu/mL)，计算检测出阳性的平均检出时间，得到表2和表3。

表2

表3

由表2和表3可知，本发明的试剂盒能够有效地缩短溶组织梭菌、脆弱拟杆菌以及普通拟杆菌的检出时间，提高阳性检出率，其中，实施例1-3中试剂盒对于各菌种的检出时间介于9-14h，阳性检出率达100％。相比较而言，各组对比例由于培养液中原料组成成分的选择以及配比情况未达到合适状态，最终检出时间较长，阳性检出率也未达到期许值。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种厌氧微生物的体外检测试剂盒，其特征在于：包括培养液、吸附树脂、培养瓶瓶体、瓶盖和感受器；

所述培养液包括胰蛋白胨、明胶蛋白胨、脑心浸液、L-精氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、活性增效调节剂、枸橼酸钠、磷酸二氢钾和维生素C。

2.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述培养液包括：1-10g/L胰蛋白胨、1-10g/L明胶蛋白胨、1-10g/L脑心浸液、1-10g/L L-精氨酸、1-10g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.08-0.3g/L活性增效调节剂、0.2-0.5g/L枸橼酸钠、0.2-0.5g/L磷酸二氢钾和0.8-2g/L维生素C。

3.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述活性增效调节剂包括植物甾醇和氯化血红素。

4.根据权利要求3所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述植物甾醇和氯化血红素的重量比为1-2:3-5。

5.根据权利要求3所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述植物甾醇包括谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述吸附树脂为阴离子交换树脂和大孔吸附树脂。

7.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述感受器位于培养瓶瓶体底部，含有荧光染料。

8.根据权利要求1所述的体外检测试剂盒，其特征在于：所述培养液使用双蒸水进行配制。

9.如权利要求1-8任一项所述的试剂盒在非诊断目的体外检测厌氧微生物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述厌氧微生物包括溶组织梭菌、脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌。