CN104673662A - 一种培养瓶及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种培养瓶及其制备方法，该培养瓶包括瓶体、瓶盖、胶塞、液体培养基、吸附树脂、传感膜。其中，培养瓶瓶体为无色透明圆柱形塑料容器，内部为无菌环境，瓶内预分装有液体培养基，培养基中混悬有吸附树脂，培养瓶内置有混合气体，瓶体底部贴敷一层半透高分子传感膜，传感膜含有荧光指示剂及化学指示剂，本发明的培养瓶结构简单、使用方便，将仪器检测与人工目测合二为一，进行微生物培养时可在瓶外清晰观测微生物生长情况，也可通过仪器实现连续检测，提高了检测灵敏度，缩短了阳性检出时间。

Description

一种培养瓶及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，特别是指一种培养瓶，本发明还涉及一种培养瓶的制备方法及应用。

背景技术

病原菌能引起多种感染和传染病，对病原菌进行准确的检测和鉴定可以为疾病的诊断、治疗及流行病调查提供有效的依据。随着抗菌药物的大量使用，导致出现大量严重耐药菌株以及新的病原微生物的出现，给临床诊断和治疗带来了极大的困扰，这也给病原微生物的检测和诊断提出来更高的要求。对血液样本进行细菌培养和检测是诊断血液感染类疾病的必须措施。由微生物侵犯血液引起败血症和菌血症是临床上的危急病症，死亡率高达29％。据权威资料统计，近20年来血液感染的发生率明显增加，已由上世纪70年代的6％上升至21世纪初期的13％，目前仍处于上升趋势。对于血液感染性疾病患者，能否有效治愈，很大程度上决定于快速、及时、准确的细菌培养检测报告。过去一直沿用传统手工培养检测方法，静态培养、肉眼观察，存在微生物生长差、培养时间过长（7天甚至更长）、阳性率检出低、准确性差、污染率高等缺点，往往延误冶疗，已不能适应现代临床医疗的需要。

血培养主要通过监测培养基中的浑浊度、pH值、代谢终产物CO₂的浓度、荧光标记底物或代谢产物等的变化，定性地检测微生物的存在。当前得到应用的血培养方法有以下几种，一是检测培养基的导电性和电压改变：血培养基中因含有不同电解质而具有一定导电性。微生物在生长代谢的过程中可产生质子、电子和各种带电荷的原子团（例如在液体培养基内CO₂转变成HCO₃ ^－），通过电极检测培养基的导电性或电压可判断有无微生物生长，这一方法需要采用较精密的电学仪器进行检测。二是测定培养瓶内压力变化：许多细菌生长过程中，常伴有吸收或产生气体现象，如很多需氧菌在胰酶消化大豆肉汤中生长时，由于消耗培养瓶中的氧气而首先表现为吸收气体，而厌氧菌生长时最初均无吸收气体现象，仅表现为产生气体（主要为CO₂），因此可利用培养瓶内压力的改变检测微生物的生长情况，这一方法也需要采用压力测试设备进行。三是采用光电原理监测培养基pH改变：微生物在代谢过程中必然会产生终代谢产物CO₂，引起培养基pH值及氧化还原电位改变。利用光电比色检测血培养瓶中某些代谢产物量的改变，可判断有无微生物生长，这一方法检测相对复杂。四是采用同源荧光技术来监测微生物的生长：与培养基结合的荧光分子在最初具有一定荧光值，当有微生物存在时，其生长代谢过程中或产生CO₂、或发生pH值改变、或氧化还原使电位改变等，均可导致液体培养基内的荧光分子结构发生改变而成为无荧光的化合物，即发生荧光衰减。通过光电比色计检测荧光衰减水平，可判断有无微生物生长，该方法同样需要采用昂贵的自动检测仪。

综上所述的几种方法，均在检测方式，或者检测精度，以及检测的及时性上等，都存在不少问题，因此亟待提出一种新方法来解决这些问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基于荧光和化学传感膜技术的微生物培养瓶，既可以采用全自动检测仪进行检测，也可以通过目测来判断微生物生长，提高培养速度，灵敏度高、结构简单等。

本发明的另一个目的是提供一种基于荧光和化学传感膜技术的微生物培养瓶的制备方法，其制备方法简单，易于大规模生产。

本发明的另一个目的是提供一种培养瓶的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种培养瓶，包括瓶体、瓶盖、胶塞；其中，所述瓶体内预分装有液体培养基，所述液体培养基中混悬有吸附树脂，所述瓶体内部底端贴敷一层传感膜，所述传感膜含有荧光指示剂及化学指示剂，当瓶内微生物的生长繁殖时，不仅能使所述传感膜发生颜色变化，而且发生荧光改变。

优选的是，所述液体培养基为需氧菌、厌氧菌和真菌培养所需的胰酶大豆肉汤或脑心浸液等培养成分，并添加适当微生物促生长因子，使细菌快速繁殖生长，便于快速检测。

优选的是，所述吸附树脂为一种或多种非离子吸附树脂和弱酸性阳离子树脂，将所述吸附树脂混悬于所述液体培养基中，用以快速地吸附检测样本中所含有的抗生素，降低抗生素对血培养的负面影响，提高阳性检出率。

优选的是，所述传感膜，为高分子半透膜，其只允许分子量为200以下的物质通过，避免非相关物质的干扰。

优选的是，所述化学传感膜，采用高分子硅橡胶材料制备。

优选的是，所含荧光指示剂为荧光素类、罗丹明类、金属配合物类和卟啉类荧光物质的任一种；所含化学指示剂为百里酚蓝、酚红、甲酚红、溴百里酚蓝中的任一种或多种。

优选的是，所述荧光指示剂和所述化学指示剂的组合包括：

0.01%-0.05%的罗丹明101、0.1%-0.5%的百里酚蓝；

0.02%-0.04%的罗丹明B、0.2%-0.4%的百里酚蓝；

0.01%-0.03%的罗丹明101、0.01%-0.05%的溴百里酚蓝；

0.02%-0.06%的铕配合物、0.03%-0.08%的溴百里酚蓝；

0.03%-0.05%的钌配合物、0.02%-0.04%的甲酚红，以上含量均为各组分在所述传感膜中的质量百分比。

优选的是，所述培养瓶内密闭空间为无菌环境，并含有混合气体，。

优选的是，所述有混合气体，为氧气、氮气、氢气、二氧化碳中的两种或更多种气体，提供微生物生长的必须条件。

优选的是，所述培养瓶瓶体为无色透明圆柱形塑料容器，采用聚酯材料制备而成。

优选的是，所述培养瓶瓶盖为双层铝制，顶层设有不同颜色的喷涂层，从而通过用不同颜色喷涂以区分培养瓶的类别；而顶层的存在表示培养瓶尚未启封，不存在则表示已启封。

优选的是，所述培养瓶胶塞为丁基橡胶塞，用以确保培养瓶的气密性。

一种培养瓶的制备方法，包括如下步骤：

①传感膜的制备：

将荧光指示剂及化学指示剂分别用溶剂溶解稀释，分别适量加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气15-20分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经20-24小时室温固化；

②液体培养基的制备：

用纯化水按比例溶解所需的胰酶大豆肉汤或脑心浸液等培养成分，并添加适当微生物促生长因子，高压湿热灭菌处理，冷却后分装于已制备好传感膜的空瓶内，每瓶40ml；

③吸附树脂的分装：

将灭菌处理后的非离子吸附树脂和弱酸性阳离子树脂按照配比混匀，按照每瓶1-2克质量灌注于已分装液体培养基的培养瓶内；

④封装：

用设备注入内置混合气体，压上预先灭菌的胶塞和瓶盖，锁死密封。

优选地，所述步骤①中荧光和化学指示剂为罗丹明101和百里酚蓝，以其在传感膜中的质量百分数计，0.01%-0.05%的罗丹明101、0.1%-0.5%的百里酚蓝。

优选地，所述步骤①中荧光和化学指示剂也可以采用罗丹明B和百里酚蓝，以其在传感膜中的质量百分数计，0.02%-0.04%的罗丹明B、0.2%-0.4%的百里酚蓝。

优选地，所述步骤①中荧光和化学指示剂也可以采用罗丹明101和溴百里酚蓝，以其在传感膜中的质量百分数计，0.01%-0.03%的罗丹明101、0.01%-0.05%的溴百里酚蓝。

优选地所述步骤①中荧光和化学指示剂也可以采用金属铕配合物和溴百里酚蓝，以其在传感膜中的质量百分数计，0.02%-0.06%的铕配合物、0.03%-0.08%的溴百里酚蓝。

优选地，所述步骤①中荧光和化学指示剂也可以采用金属钌配合物和甲酚红，以其在传感膜中的质量百分数计，0.03%-0.05%的钌配合物、0.02%-0.04%的甲酚红。

根据以上制备方法制备的培养瓶在检测生物样品中的应用，检测对象为血液或体液中厌氧菌、需氧菌和真菌的含量。

本发明的所述培养瓶，基于荧光和化学传感膜技术，可以通过全自动血培养检测仪，自动检测瓶底所述传感膜因瓶中微生物生长繁殖产生的代谢产物，膜内的荧光指示剂和化学指示剂根据代谢产物的变化产生荧光强度和传感膜颜色的变化，检测仪据此变化判定微生物的生长。

本发明产生的有益效果是：本发明一方面提出一种基于荧光和化学传感膜技术的微生物所述培养瓶，同时实现传感膜颜色和荧光的变化，克服了仅靠颜色变化的传感膜微生物检测速度慢的问题，也克服了仅靠荧光变化不能目测、需依赖昂贵自动检测仪的问题，结构简单、使用方便，将仪器检测与人工目测合二为一，进行微生物培养时可在瓶外清晰观测微生物生长情况，也可通过仪器实现连续检测，大大提高了血培养的速度，具有灵敏度高、特异性好，缩短阳检出时间等优点；另一方面提出一种基于荧光和化学传感膜技术的微生物培养瓶的制备方法，其制备方法简单，易于大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种培养瓶结构示意图，图中1瓶体；2瓶盖；3胶塞；4液体培养基；5吸附树脂；6荧光和化学传感膜。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明总的技术方案如下：

如图1所示：一种培养瓶，包括瓶体1、瓶盖2、胶塞3、液体培养基4、吸附树脂5、传感膜6。其中，培养瓶瓶体1为无色透明圆柱形塑料容器，内部为无菌环境。瓶盖2为双层铝制，顶层用不同颜色喷涂以区分培养瓶的类别。顶层的存在表示培养瓶尚未启封，不存在则表示已启封。胶塞3为丁基橡胶塞，用以确保培养瓶的气密性。瓶内预分装有液体培养基4，液体培养基为需氧菌、厌氧菌和真菌培养所需的胰酶大豆肉汤或脑心浸液等培养成分，并添加适当微生物促生长因子，是细菌的快速繁殖生长，便于快速检测。培养基4中混悬有吸附树脂5，吸附树脂5为一种或多种非离子吸附树脂和弱酸性阳离子树脂，将吸附树脂5混悬于液体培养基4中，用以快速地吸附检测样本中所含有的抗生素，降低抗生素对血培养的负面影响，提高阳性检出率。培养瓶瓶底部贴敷传感膜6，为高分子半透膜，具体为采用高分子硅橡胶材料制备，其只允许分子量为200以下的物质通过，避免非相关物质的干扰。传感膜6含有荧光指示剂和化学指示剂，当瓶内微生物的生长繁殖时，不仅能使传感膜6发生颜色变化，而且发生荧光改变。培养瓶内置有混合气体，提供微生物生长的必须条件。

本发明可以通过全自动血培养检测仪，自动检测瓶底传感膜因瓶中微生物生长繁殖产生的代谢产物，传感膜6内的荧光指示剂和化学指示剂根据代谢产物的变化产生荧光强度和传感膜颜色的变化，检测仪据此变化判定微生物的生长。

一种培养瓶的制备方法，包括如下步骤：

①传感膜6的制备：

将荧光指示剂及化学指示剂分别用溶剂溶解稀释，分别适量加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气15-20分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经20-24小时室温固化；

②体培养基4的制备：

用纯化水按比例溶解所需的胰酶大豆肉汤或脑心浸液等培养成分，并添加适当微生物促生长因子，其具体的比例以及添加量应当根据所需检测微生物而进行最佳的设定，高压湿热灭菌处理，冷却后分装于已制备好传感膜的空瓶内，每瓶40ml；

③吸附树脂的分装：

将灭菌处理后的非离子吸附树脂和弱酸性阳离子树脂按照配比混匀，按照每瓶1-2克质量灌注于已分装液体培养基的培养瓶内；

④封装：

用专用设备注入内置混合气体，压上预先灭菌的胶塞和瓶盖，锁死密封。

在本发明中，荧光指示剂为荧光素类、罗丹明类、金属配合物类和卟啉类等荧光物质中的一种；所含化学指示剂为百里酚蓝、酚红、甲酚红、溴百里酚蓝中的一种或多种。本发明经过试验确定金属配合物类荧光指示剂的性能最优异，本发明中优选金属配合物类荧光材料，金属配合物为铕/钌配合物，金属配合物的激发光光谱范围为350-390nm，发射光波长范围为600-700nm。本发明经过试验确定溴百里酚蓝类化学指示剂的性能最优异，本发明中优选溴百里酚蓝为化学指示剂。

在本发明中，液体培养基、吸附树脂、硅橡胶等物质的量浓度、pH值及组分可以相同，可以不同，其均在本发明的保护范围之内，对于具体实施例中所列举出来的不同组分只是本发明人所做试验中的其中一些优选实施例。

一种基于荧光和化学传感膜技术的微生物培养瓶，培养瓶在检测生物样品中的应用，检测对象为血液或体液中厌氧菌、需氧菌和真菌的含量。

本发明的关键在于传感膜6和液体培养基4的制备，具体实施如下：

实施例1

传感膜6的制备，包括如下步骤：

将荧光指示剂和化学指示剂为罗丹明101和百里酚蓝，以质量百分数计，0.035%的罗丹明101、0.15%的百里酚蓝。分别用溶剂溶解稀释，分别加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气18分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经22小时室温固化，即为传感膜6。

实施例2

传感膜6的制备，包括如下步骤：

将荧光指示剂和化学指示剂为罗丹明B和百里酚蓝，以质量百分数计，0.028%的罗丹明B、0.34%的百里酚蓝。分别用溶剂溶解稀释，分别加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气20分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经24小时室温固化，即为传感膜6。

实施例3

传感膜6的制备，包括如下步骤：

将荧光指示剂和化学指示剂为罗丹明101和溴百里酚蓝，以质量百分数计，0.022%的罗丹明101、0.033%的溴百里酚蓝。分别用溶剂溶解稀释，分别加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气20分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经22小时室温固化，即为传感膜6。

实施例4

传感膜6的制备，包括如下步骤：

将荧光指示剂和化学指示剂为金属铕配合物和溴百里酚蓝，以质量百分数计，0.027%的铕配合物、0.046%的溴百里酚蓝。分别用溶剂溶解稀释，分别加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气20分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经22小时室温固化，即为传感膜6。

实施例5

传感膜6的制备，包括如下步骤：

将荧光指示剂和化学指示剂为金属钌配合物和甲酚红，以质量百分数计，0.045%的钌配合物、0.036%的甲酚红。分别用溶剂溶解稀释，分别加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气18分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经24小时室温固化，即为传感膜6。

实施例6

液体培养基4的制备，包括如下步骤：

称取胰酶大豆肉汤30g,加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中,胰酶大豆肉汤具体组分为酪蛋白（胰消化物）17g/L、大豆蛋白胨（消化物）3g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、右旋糖2.5g/L，并添加适当微生物促生长因子，121℃高压灭菌15分钟，冷却后分装于已制备好传感膜的空瓶内，每瓶40ml。

实施例7

液体培养基5的制备，包括如下步骤：

称取脑心浸液37g,加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中,脑心浸液的组分为蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，并添加适当微生物促生长因子，121℃高压灭菌15分钟，冷却后分装于已制备好传感膜的空瓶内，每瓶40ml。

本发明一方面提出一种基于荧光和化学传感膜技术的微生物培养瓶，同时实现传感膜颜色和荧光的变化，克服了仅靠颜色变化的传感膜微生物检测速度慢的问题，也克服了仅靠荧光变化不能目测、需依赖昂贵自动检测仪的问题，大大提高了血培养的速度，具有灵敏度高、特异性好和结构简单的优点；另一方面提出一种基于荧光和化学传感膜技术的微生物培养瓶的制备方法，其制备方法简单，易于大规模生产。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种培养瓶，包括瓶体、瓶盖、胶塞，其特征在于：所述瓶体内预分装有液体培养基，所述液体培养基中混悬有吸附树脂，所述瓶体内部底端贴敷一层传感膜，所述传感膜含有荧光指示剂及化学指示剂。

2.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征在于：所述液体培养基为需氧菌、厌氧菌和真菌培养所需的胰酶大豆肉汤或脑心浸液培养成分，并添加微生物促生长因子。

3.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征在于：所述吸附树脂为一种或多种非离子吸附树脂和弱酸性阳离子树脂。

4.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征在于，所述传感膜为只允许分子量为200以下的物质通过的高分子半透膜。

5.根据权利要求4所述的培养瓶，其特征在于，所述传感膜，采用高分子硅橡胶材料制备。

6.根据权利要求1所述的培养瓶，其特征在于：所述荧光指示剂为荧光素类、罗丹明类、金属配合物类和卟啉类荧光物质中的任一种；所述化学指示剂为百里酚蓝、酚红、甲酚红、溴百里酚蓝中的任一种或多种。

7.根据权利要求6中所述的培养瓶，其特征在于：所述荧光指示剂和所述化学指示剂的组合包括：

0.01%-0.05%的罗丹明101、0.1%-0.5%的百里酚蓝；

0.02%-0.04%的罗丹明B、0.2%-0.4%的百里酚蓝；

0.01%-0.03%的罗丹明101、0.01%-0.05%的溴百里酚蓝；

0.02%-0.06%的铕配合物、0.03%-0.08%的溴百里酚蓝；

0.03%-0.05%的钌配合物、0.02%-0.04%的甲酚红，以上含量均为各组分在所述传感膜中的质量百分比。

8.根据权利要求1中所述培养瓶，其特征在于：所述瓶体为无色透明圆柱形塑料容器，采用聚酯材料制备而成；所述胶塞为丁基橡胶塞；所述瓶盖为双层铝制，顶层设有不同颜色的喷涂层；所述瓶内密闭空间为无菌环境，并含有混合气体，所述混合气体为氧气、氮气、氢气、二氧化碳中的两种或多种气体。

9.一种制造如权利要求1-8任一项所述的培养瓶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①传感膜的制备：

将荧光指示剂及化学指示剂分别用溶剂溶解稀释，分别适量加入液体高分子硅橡胶中，搅匀均匀，真空脱气15-20分钟，用设备按照每瓶3-4克质量灌注于空培养瓶底部，经20-24小时室温固化；

②液体培养基的制备：

用纯化水按比例溶解所需的胰酶大豆肉汤或脑心浸液等培养成分，并添加适当微生物促生长因子，高压湿热灭菌处理，冷却后分装于已制备好传感膜的空瓶内，每瓶40ml；

③吸附树脂的分装：

将灭菌处理后的非离子吸附树脂和弱酸性阳离子树脂按照配比混匀，按照每瓶1-2克质量灌注于已分装液体培养基的培养瓶内；

④封装：

用专用设备注入内置混合气体，压上预先灭菌的胶塞和瓶盖，锁死密封。

10.一种权利要求9所述制备方法制备的培养瓶在检测生物样品中的应用，其特征在于，检测对象为血液或体液中厌氧菌、需氧菌和真菌的含量。