CN106544265A - 一种快速检测微生物的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测微生物的装置，此装置利用颜色指示剂的变色原理来检测微生物在生长过程中产生的代谢产物，从而实现微生物检测。此装置为一种可密封的容器，分上层、下层两部分：上层为培养区，内置特异性液体培养基，为样本中的目标微生物的生长提供适宜的营养条件；下层为检测区，内置采用有机硅材料和颜色指示剂溶液制成的传感器，传感器与特异性液体培养基直接接触。当培养区有目标微生物生长时，其小分子代谢产物渗透进入传感器中，改变传感器中颜色指示剂的颜色，以此来判定样本中是否存在目标微生物。本装置通过检测微生物的生长代谢产物来检测微生物，可大大缩短检测时间，还具有制作简单、成本低廉、检测结果可靠等优点。

Description

一种快速检测微生物的装置
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种快速检测微生物的装置。
背景技术
微生物检测是所有食品、药品、化妆品、水等产品在出厂时必检的项目，也是环境监控的重要环节。现行的检测技术主要是GB4789系列，该系列大部分为平板法，虽检测结果精准，但检测过程繁琐，耗时长，无法实时得到检测结果，满足不了企业对产品快速放行的需求。市场上并存的其他检测技术如纸片法，节约了培养基配置、玻璃仪器清洗等的人力、物力和时间，但整个微生物的检测时间并没有有效缩短。ATP生物荧光法主要是用于洁净度的检测，无法严格区分微生物和有机质，近年来也有部分用于检测细菌的产品问世，整个细菌的检测时间缩短了不少，但成本高昂，检测结果存在假阴性的可能性较大。流式细胞技术检测速度很快，但无法区分死细胞和活细胞，灵敏度不够且成本高。分子生物学方法如PCR在致病菌的检测方面特异性较强，技术较为前沿，但假阳性率较高，检测时间上优势不大。因此，市场亟需一种成本低廉、灵敏度高同时检测时间较短的用于检测微生物的装置。
国外在微生物快速检测方面的技术发展得较快，如专利申请号PCT/US2010/003242一文就公开了一种类似的快速检测微生物的装置。此装置是采用了酸碱指示剂的原理来检测微生物代谢产物二氧化碳。但它描述的承载酸碱指示剂的介质主要是琼脂，而琼脂在高于40℃条件下是半凝固状态或流动状态，这就不利于在气候炎热地区的运输保存，也不利于检测嗜热菌。而本发明中固定颜色指示剂的介质是有机硅材料，它耐高低温的范围很广，从-65℃到200℃都可保持完好的形态，因此稳定性会更好，适用性也更广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测微生物的装置，以缩短检测微生物所用的时间，本装置还具有制作简单、成本低廉、检测结果可靠等优点。为此，本发明还提供该快速检测微生物的装置的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种快速检测微生物的装置，该装置为一种可密封的容器，其包含上层、下层两部分：上层为培养区，内置特异性液体培养基；下层为检测区，内置传感器，所述传感器采用有机硅材料和颜色指示剂溶液制成，并与所述特异性液体培养基直接接触。
作为本发明优选的技术方案，所述的特异性培液体养基的作用是为目标微生物提供丰富的营养物质，促进其生长繁殖，同时抑制其它非目标微生物的生长；所述特异性液体培养基选自营养肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤、麦芽汁液体培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤、AC肉汤、布氏-哈斯肉汤、马铃薯葡萄糖肉汤、PA肉汤、RV肉汤以及其它对各种目标微生物具有促生长作用的培养液中的任意一种。
作为本发明优选的技术方案，所述的有机硅材料包括基础聚合物、交联剂和催化剂，其中基础聚合物是指含乙烯基（≡SiCH＝CH2）的有机聚硅氧烷；所述交联剂是指含硅氢键（≡SiH）的有机聚硅氧烷；所述催化剂是指有机锡类催化剂、铂系催化剂、或钛酸酯及其配合物催化剂；各组分的含量为：78wt%-99wt% 基础聚合物，0.5wt%-20wt% 交联剂，0.5wt%-2wt% 催化剂；所述颜色指示剂溶液中颜色指示剂的含量为0.01wt%-1wt%；所述有机硅材料与颜色指示剂溶液的重量比为3:(0.15-0.5)。
作为本发明优选的技术方案，所述基础聚合物为α,ω- 二乙烯基聚二甲基硅油、或甲基乙烯基MQ硅树脂；所述交联剂为线性甲基氢聚硅氧烷、环状甲基氢聚硅氧烷、或甲基氢MQ硅树脂；所述催化剂是二羟酸二烷基锡、二羧酸亚锡、铂-乙烯基硅氧烷配合物、醇改性氯铂酸催化剂、铂-炔烃基配合物、或单烷氧基型钛酸酯；所述颜色指示剂选自溴甲酚绿、酚酞、酚红、甲酚红、石蕊、百里酚蓝、溴百里酚蓝、邻本二酚紫、石蕊精、醌喹亚胺、亮黄、中性红、玫红酸、大黄苷、2，2′-二羟基苯乙烯酮、α-萘酚酞、甲酚红紫、姜黄素、二甲苯酚蓝以及其它颜色指示剂中的一种或多种。
作为本发明优选的技术方案，所述的传感器为不透明或半透明弹性固体，初始颜色为黑色、棕色、黑褐色、墨绿色或其它深颜色，因有机硅材料具有高透气性并有选择性的只让某些气体和小分子物质通过，而其它液体、固体和微生物都不能进入，因此可大幅度的排除样品的干扰，只有微生物生长代谢产物中的小分子物质（例如二氧化碳、小分子酸）才能渗透进入到传感器中导致传感器的颜色最终变为黄色、红色、橙红色或橙黄色，并使传感器的透光度或折光率增大；所述的传感器检测到的微生物小分子代谢产物越多，它变色所用的时间就越短，传感器的透光度或折光率越大。
作为本发明优选的技术方案，所述快速检测微生物的装置为圆柱体、正方体、长方体或其他合适形状的透明可密封容器。
此外，本发明还提供一种上述快速检测微生物的装置的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备传感器：首先制备颜色指示剂溶液，然后将有机硅材料和颜色指示剂溶液混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，分装于可密封容器底部，静置1-24小时后即凝固成型；
（2）灌装和灭菌液体培养基：将特异性液体培养基灌入传感器已凝固成型的可密封容器中，特异性液体培养基的体积为容器容积的1/3-9/10；密封容器后，将容器放入高压灭菌锅中按照特异性液体培养基的灭菌要求高温灭菌；取出后即可得成品。
作为本发明优选的技术方案，所述步骤（1）中，所述制备颜色指示剂溶液具体为：将颜色指示剂溶于乙醇溶液中或用蒸馏水加热溶解，即得；所述将有机硅材料和颜色指示剂溶液混合均匀，具体为：首先依次称取交联剂、基础聚合物、催化剂于容器中，然后按3：（0.15-0.5）的重量比称取颜色指示剂溶液于同一容器中，混合均匀。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明采用颜色指示剂的变色原理，通过使用含有颜色指示剂的传感器来检测目标微生物在生长过程中产生的代谢产物来实现对目标微生物的检测，以传感器的颜色变化来判断样品中有无目标微生物的存在。单个微生物个体需要经过相对较长的时间生长繁殖达到一定的数目，才能形成一个肉眼可见的菌落，而它们的生长代谢产物则是一直伴随着生长繁殖活动在不停地产生，在形成肉眼可见的菌落之前就能检测到。因此检测微生物的生长代谢产物比直接观察菌落形态所用的时间要短。本装置利用了有机硅材料的高透气性，将有机硅材料作为颜色指示剂的载体，使颜色指示剂均匀分布其中，只允许微生物生长代谢产物中的小分子物质（例如二氧化碳、小分子酸）渗透进入，接触颜色指示剂并使之颜色发生改变，同时排除了样品的干扰。此外本装置还具有制作简单、成本低廉、检测结果可靠等优点。
附图说明
图1是本发明一种快速检测微生物的装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但这些实施例只是用于说明本发明，而不是来限制本发明的范围。
实施例1
如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是营养肉汤，用来检测细菌总数。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：
1、制备传感器：
（1）制备颜色指示剂溶液：0.5wt%溴百里酚蓝，0.05wt%二甲苯酚蓝，溶于20%乙醇溶液中；
（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.24% 的线性甲基氢聚硅氧烷0.8g、α,ω- 二乙烯基聚二甲基硅油28.5g和10ppm铂-乙烯基硅氧烷配合物0.7g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.2的重量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。
2、灌装和灭菌液体培养基：
A.将营养肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，营养肉汤的体积为小瓶容积的2/3；
B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；
C.取出后即可得成品。
应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用无菌稀释液做一个合适比例的稀释，然后取1mL样品稀释匀液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有细菌存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所用的时间越短。
以下针对本发明与专利申请号PCT/US2010/003242所述装置进行了对比试验，主要对检测时间进行对比，具体结果见表1。
表1 本发明与专利申请号PCT/US2010/003242所述装置的数据对比表
样品 本发明检测所用时长 PCT/US2010/003242发明检测所用时长 GB4789.2-2010平板培养法检出来的菌落数和所用时长
菌液1 1.8 h 2.0 h 4.0×108 CFU/mL，48h
菌液2 2.5 h 2.7 h 3.2×107 CFU/mL，48h
菌液3 3.8 h 4.0 h 3.8×106CFU/mL，48h
菌液4 5.6 h 5.8 h 4.2×105 CFU/mL，48h
菌液5 6.9 h 7.0 h 3.6×104 CFU/mL，48h
菌液6 8.0 h 8.3 h 5.1×103 CFU/mL，48h
菌液7 10.5 h 11.3 h 4.5×102 CFU/mL，48h
菌液8 14.2 h 15.2 h 6.0×101 CFU/mL，48h
表1中的菌液是使用新鲜的平板计数琼脂平板上任意挑取的菌落用无菌生理盐水制成的10倍梯度稀释菌液，然后从每个梯度菌液分别取1mL各自加入PCT/US2010/003242所述装置和本发明所述装置，再同时放入带有新光源和光子探测器自动微生物培养检测系统中培养检测，得到上述表1中的数据。另每个菌液同时采用 GB4789.2-2010平板培养法来检测菌落数。如表1所示，与PCT/US2010/003242所述装置相比，本发明检测所用时间更短，可见本发明缩短了检测微生物所用的时间。
实施例2
如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是麦芽汁液体培养基，用来检测霉菌酵母菌。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：
1、制备传感器：
（1） 制备颜色指示剂溶液：0.2wt%溴百里酚蓝钠盐，0.3wt%酚红钠盐，溶于蒸馏水中加热溶解；
（2） 混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.8% 的线性甲基氢聚硅氧烷0.15g、α,ω- 二乙烯基聚二甲基硅油29.7g和30ppm醇改性氯铂酸催化剂0.15g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.3的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。
2、灌装和灭菌液体培养基：
A.将麦芽汁液体培养基灌入传感器已凝固成型的小瓶中，麦芽汁液体培养基的体积为小瓶容积的1/3；
B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；
C.取出后即可得成品。
应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用无菌稀释液做一个合适比例的稀释，然后取1mL样品稀释匀液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于28℃下培养1-48h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有霉菌酵母菌存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。
实施例3
如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是煌绿乳糖胆盐肉汤，用来检测大肠菌群。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：
1、制备传感器：
（1）制备颜色指示剂溶液：0.1wt%溴百里酚蓝，0.01wt%甲酚红，溶于20%乙醇溶液中；
（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.32% 的环状甲基氢聚硅氧烷0.48g、甲基乙烯基MQ硅树脂29.25g和30ppm铂-炔烃基配合物0.27g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.5的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，并分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。
2、灌装和灭菌液体培养基：
A.将煌绿乳糖胆盐肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，煌绿乳糖胆盐肉汤的体积为小瓶容积的9/10；
B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；
C.取出后即可得成品。
应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用适量的液体培养基进行增菌，然后取0.1-1mL样品增菌液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有大肠菌群的存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。
实施例4
如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是RV肉汤，用来检测沙门氏菌。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：
1、传感器的制备：
（1）制备颜色指示剂溶液：1wt%溴百里酚蓝，0.1wt%二甲苯酚蓝，溶于20%乙醇溶液中；
（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.02% 的甲基氢MQ硅树脂6g、α,ω- 二乙烯基聚二甲基硅油23.4g和30ppm铂-炔烃基配合物0.6g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.15的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，并分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。
2、灌装和灭菌液体培养基：
A.将RV肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，RV肉汤的体积为小瓶容积的7/10；
B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；
C.取出后即可得成品。
应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用适量的液体培养基进行增菌，然后取0.1-1mL样品增菌液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀瓶中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有沙门氏菌的存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。
实施例5
如图1所示，本发明一种快速检测微生物的装置，包括瓶盖1和瓶身2，瓶身2分为上层、下层两个部分：上层为培养区21，内含特异性液体培养基；下层为检测区22，内置传感器。所述的特异性液体培养基，此处具体可以是煌绿乳糖胆盐肉汤，用来检测大肠菌群。所述快速检测微生物的装置制备过程如下：
1、制备传感器：
（1）制备颜色指示剂溶液：0.65wt%溴百里酚蓝，溶于20%乙醇溶液中；
（2）混合有机硅材料与颜色指示剂溶液：首先依次称取含氢量为0.32% 的线性甲基氢聚硅氧烷0.48g、α,ω- 二乙烯基聚二甲基硅油29.25g和30ppm铂-炔烃基配合物0.27g于塑料杯中，然后按有机硅材料：颜色指示剂溶液=3:0.22的质量比称取颜色指示剂溶液于同一塑料杯中，混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，并分装于带盖的小瓶底部，约1cm厚度，静置1-24小时后即凝固成型。
2、灌装和灭菌液体培养基：
A.将煌绿乳糖胆盐肉汤灌入传感器已凝固成型的小瓶中，煌绿乳糖胆盐肉汤的体积为小瓶容积的4/5；
B.盖上瓶盖后，将小瓶放入高压灭菌锅按营养肉汤的灭菌要求灭菌；
C.取出后即可得成品。
应用：使用这种微生物检测装置时，首先将样品用适量的液体培养基进行增菌，然后取0.1-1mL样品增菌液加入到该装置中，拧紧瓶盖混匀管中液体正置于36℃下培养1-24h。该装置底部的传感器变黄，表示加进去的样品稀释匀液中有大肠菌群的存在。加入该装置中的样品所含目标微生物的数量越多，传感器变色所使用的时间越短。

Claims (8)

1.一种快速检测微生物的装置，其特征在于，所述装置为一种可密封的容器，其包含上层、下层两部分：
a.上层为培养区，内置特异性液体培养基；
b.下层为检测区，内置传感器，所述传感器采用有机硅材料和颜色指示剂溶液制成，并与所述特异性液体培养基直接接触。
2.按照权利要求1所述的一种快速检测微生物的装置，其特征在于：所述的培养区内的特异性液体培养基的作用是：为目标微生物提供丰富的营养物质，促进其生长繁殖，同时抑制其它非目标微生物的生长；所述特异性液体培养基采用营养肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤、麦芽汁液体培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤、AC肉汤、布氏-哈斯肉汤、马铃薯葡萄糖肉汤、PA肉汤、RV肉汤以及其它对各种目标微生物具有促生长作用的培养液中的任意一种。
3.按照权利要求1所述一种微生物检测方法，其特征在于：所述的有机硅材料包括基础聚合物、交联剂和催化剂，其中基础聚合物是指含乙烯基的有机聚硅氧烷；所述交联剂是指含硅氢键的有机聚硅氧烷；所述催化剂是指有机锡类催化剂、铂系催化剂、或钛酸酯及其配合物催化剂；各组分的含量为：78wt%-99wt% 基础聚合物，0.5wt%-20wt% 交联剂，0.5wt%-2wt% 催化剂；所述颜色指示剂溶液中颜色指示剂的含量为0.01wt%-1wt% ；所述有机硅材料与颜色指示剂溶液的重量比为3:(0.15-0.5)。
4.按照权利要求3所述的一种快速检测微生物的装置，其特征在于：所述基础聚合物为α,ω- 二乙烯基聚二甲基硅油、或甲基乙烯基MQ硅树脂；所述交联剂为线性甲基氢聚硅氧烷、环状甲基氢聚硅氧烷、或甲基氢MQ硅树脂；所述催化剂是二羟酸二烷基锡、二羧酸亚锡、铂-乙烯基硅氧烷配合物、醇改性氯铂酸催化剂、铂-炔烃基配合物、或单烷氧基型钛酸酯；所述颜色指示剂选自溴甲酚绿、酚酞、酚红、甲酚红、石蕊、百里酚蓝、溴百里酚蓝、邻本二酚紫、石蕊精、醌喹亚胺、亮黄、中性红、玫红酸、大黄苷、2，2′-二羟基苯乙烯酮、α-萘酚酞、甲酚红紫、姜黄素、二甲苯酚蓝以及其它颜色指示剂中的一种或多种。
5.按照权利要求3所述的一种快速检测微生物的装置，其特征在于：所述的传感器为不透明或半透明弹性固体，初始颜色为黑色、棕色、黑褐色、墨绿色或其它深颜色，因有机硅材料具有高透气性并有选择性的只让某些气体和小分子物质通过，而其它液体、固体和微生物都不能进入，因此可大幅度的排除样品的干扰，只有微生物生长代谢产物中的小分子物质才能渗透进入到传感器中导致传感器的颜色最终变为黄色、红色、橙红色或橙黄色，并使传感器的透光度或折光率增大；所述的传感器检测到的微生物小分子代谢产物越多，它变色所用的时间就越短，传感器的透光度或折光率越大。
6.按照权利要求1所述的一种快速检测微生物的装置，其特征在于：所述快速检测微生物的装置为圆柱体、正方体、长方体或其他合适形状的透明可密封容器。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的快速检测微生物的装置的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）制备传感器：首先制备颜色指示剂溶液，然后将有机硅材料和颜色指示剂溶液混合均匀，使指示剂均匀分散在有机硅材料中，分装于可密封容器底层，静置1-24小时后即凝固成型；
（2）灌装和灭菌液体培养基：将特异性液体培养基灌入传感器已凝固成型的可密封容器中，特异性液体培养基的体积为容器容积的1/3-9/10；密封容器后，将容器放入高压灭菌锅中按照特异性液体培养基的灭菌要求高温灭菌；取出后即可得成品。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述制备颜色指示剂溶液具体为：将颜色指示剂溶于乙醇溶液中或用蒸馏水加热溶解，即得；所述将有机硅材料和颜色指示剂溶液混合均匀，具体为：首先依次称取交联剂、基础聚合物、催化剂于容器中，然后按3：（0.15-0.5）的重量比称取颜色指示剂溶液于同一容器中，混合均匀。
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